JPH0338834B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵素及び微生物の新規な反応方法に関
する。更に詳しくは本発明は２種類以上の物質が
関与する酵素反応或いは微生物反応において、酵
素や微生物を自由に通過させない多孔性材料（例
えば膜）２枚で仕切られた内側の空間（酵素室）
に、これら酵素や微生物を存在させ、２枚の多孔
性材料の膜に接する両外側の空間には反応に関与
する物質を存在させて、これら物質が多孔性材料
の膜を界して内側の空間へ透過し、中央の酵素室
で反応し、生成物がまた多孔性材料の膜を界して
外側の空間へ透過して、効率良く、酵素或いは微
生物反応とともに生成物の分離も行いうる様にし
たバイオリアクターを用いる酵素及び微生物の反
応方法に関する。

〔従来の技術及び問題点〕

周知のように、酵素反応や微生物反応では２種
類以上の基質を必要としたり、或いは活性化剤と
して基質以外の物質を必要とする場合が多く、単
一物質のみが関与する反応は少い。また反応生成
物においても単一の場合だけではなく、２種類以
上の生成物を生産することが非常に多い。このよ
うに酵素反応や微生物反応では、反応基質だけで
なく、反応生成物においても２種類以上の物質が
関与する反応は非常に多い。しかし、例えば、反
応生成物が２種類以上となる場合には、反応終了
後、目的の生産物を得るにはこれら反応生成物の
分離操作が必要である。また２種類以上の基質を
要する反応の場合には、時として基質のうちのい
ずれかが酵素或いは微生物の阻害要因や失活要因
となる場合もある。また反応生成物自身が阻害要
因となる場合もある。

これらのことを考えると、阻害要因物質を酵素
反応系、或いは微生物反応系へ与える量をコント
ロールしたり、或いは阻害要因を系内から速やか
に除去することができれば更に効率良く酵素反
応、微生物反応を行うことができると考えられ
る。また反応と同時に生成物の分離も可能となる
ようなリアクターを用いれば、生産物の分離工程
を省略できる可能性がある。一方酵素は一般に非
常に高価なものであり、これを再利用することは
生産コストを下げる上で欠くべからざる条件であ
る。バイオリアクターを考える際には、当然酵素
や微生物を反応系内から簡単に取出して、再利用
できることが重要なポイントとなる。

従来これらの課題全てを満足するバイオリアク
ターは未だ開発されていない。例えば固定化酵素
や固定化微生物では反応系からの酵素、微生物の
容易な分離、或いは、酵素、微生物の再利用とい
つた課題は解決できるかも知れないが、反応と分
離の同時操作や、阻害物質の制御といつた問題の
解決は不可能である。最近、固定化酵素や固定化
微生物の固定化担体に生成物分離機能（吸着能）
をもたせるという試みもあるが、これとて種々の
問題点を持つている。例えば阻害要因或いは失活
要因となる物質が反応に必要な場合、この方法で
はこの物質の量をコントロールすることは難し
い。また担体の吸着能を利用する場合には、生成
物質を吸着させるのに非常に多量の担体を必要と
し、工業化の面では大きな障害となる。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはこのような種々の課題をもつ酵素
或いは微生物反応のリアクターについて鋭意検討
の結果、これらの課題を解決することができる画
期的なリアクターを開発した。

即ち本発明は２種類以上の物質が関与する酵素
反応或いは微生物反応において、これら酵素ある
いは微生物が通過できない多孔性材料２枚を１組
とし、これらの多孔性材料にはさまれた内側の空
間部に酵素または微生物、或いは、固定化酵素或
いは固定化微生物を存在させ、２枚の多孔性材料
の両外側の空間には上記反応に関与する物質を
夫々存在させて、多孔性材料を界してこれらの物
質を透過させ上記内側空間部で反応を行なわせる
ことを特徴とする酵素及び微生物反応方法に関す
るものである。

本発明による反応方法は、酵素や微生物を自由
に通過させない多孔性材料の膜２枚を１組とし、
これらで仕切られた空間に、酵素や微生物を存在
させ、反応物質が多孔性材料を通過して、中央の
空間で、酵素或いは微生物反応を受け、反応後の
生成物をまた、多孔性材料を通過せしめて、酵素
反応系或いは微生物反応系から除去することを特
徴とするものである。

〔作用〕

本発明を更に詳しく、本発明の好適実施態様を
示した図面に基いて説明する。一例としてリパー
ゼによる油脂分解反応のように、Ａ＋Ｂ→Ｃ＋Ｄ
（Ａ，Ｂは反応に関与する物質で、以下基質とい
う。Ｃ，Ｄは生成物。リパーゼ反応では、Ａ＝
油、Ｂ＝水、Ｃ＝脂肪酸、Ｄ＝グリセリン）で表
わされる酵素反応系について、第１図を用いて説
明すると、１及び２の多孔性材料で仕切られた内
側の空間４（酵素室）に酵素を存在させ、一方の
外側の空間３（反応物質室）に基質Ａを、他方の
外側の空間５（反応物質室）に基質Ｂを存在させ
る。多孔性材料１，２は酵素を通過させず、また
基質Ａが多孔性材料１を通過し、また基質Ｂが多
孔性材料２を通過し得る様に構成されている。従
つて第１図のリアクターでは、夫々の反応物質室
３，５から酵素室４へ通過した基質Ａ，Ｂは、酵
素室４に存在する酵素により酵素反応を受けて生
成物ＣとＤになる。ここで多孔性材料１は基質Ａ
は通すが、Ｂは通さず、また反応生成物Ｃ，Ｄの
うちのいずれか一方のみ（仮にＣとする）を通す
ものを選択する。多孔性材料２は逆に基質Ｂのみ
を通すが、Ａは通さず、また反応生成物のうちの
Ｄのみを通すものを選択する。これらの性質を多
孔性材料に付与するには、多孔性材料の材質及び
孔径を適当に選択すれば良い。例えばリパーゼの
反応においては、基質の油と反応生成物の脂肪酸
のみを通す多孔性材料としては、ポリプロピレン
やポリエチレン等の疎水性材料を選択すれば良
く、また水及びグリセリンのみを通す材料として
は酢酸セルロースなどのセルロース材料、アクリ
ロニトリル重合物等に代表される親水性材料を選
択すれば良い。また一般に多孔性材料の細孔径は
酵素や微生物を通さない大いさであることが必要
であつて、酵素の大きさは数十〜数百オングスト
ロームと言われているからこの程度の細孔が必要
であることになるが、反応系によつてはこれ程微
細な細孔を要しない場合もある。例えば、リパー
ゼの油脂分解反応では、多孔性材料で仕切られた
空間４での反応状態をみてみると、油／水エマル
ジヨンが形成され、このエマルジヨン表面に酵素
が存在するような状態となつている。従つてこの
エマルジヨンを通さない孔径であれば良く、0.1
〜数μｍの孔径で酵素の通過を阻止できる。また
固定化酵素や、固定化微生物を用いれば、当然の
ことながら微細な細孔は必要ない。

従つて本発明に於ては多孔性材料の材質、細孔
径については特に限定するものではなく、上記の
様な基準に従つて適当に選択される。

多孔性材料で仕切られた空間４に存在させる酵
素或いは微生物は、粉末のまま存在させても良い
し、また酵素や微生物を失活させない溶媒に溶か
すか、或いは懸濁させて存在させても良い。本発
明の実施に当つては酵素が一部に片寄るのを防ぐ
ため、スペーサを空間４に設け、酵素或いは微生
物をこの上に散布、或いは流延させるのが一つの
好ましいやり方である。また或いは、後述するよ
うに酵素液或いは微生物液をポンプでこの空間、
即ち酵素室４へ循環させても良い。なお、空間４
に設けるスペーサの材質、形態等については特に
限定するものではなく、例えば、スペーサとして
酵素を吸着させるような性質を有する材、例え
ば、イオン交換繊維のようなものを用いれば、そ
の上に酵素を固定化することもでき、又この場合
の様にこのスペーサに何らかの新たな機能を付加
させることもできる。

第１図の反応物質室３及び５に存在する基質は
濃度拡散により酵素室４へ拡散し、また反応生成
物も濃度拡散により酵素室４から反応物質室３或
いは５へ拡散する。しかし、濃度拡散だけでは拡
散速度が遅く、十分な反応速度が得られない場合
は、拡散を促進する力、例えば圧力や温度をそれ
ぞれの室に与えて拡散を促進することも出来る。
或いはまた、酵素反応、微生物反応を阻害せず、
且つ多孔性材料を通過しない第３物質をそれぞれ
の室に添加して、この物質の浸透圧差を拡散の促
進力とすることも可能である。

本発明に使用されるバイオリアクターは種々の
酵素反応、微生物反応に適用でき、前述したリパ
ーゼによる油脂分解反応以外にも、リパーゼによ
るトリグリセリドの合成、トリグリセリドのエス
テル交換反応、ホスホリパーゼによるリン脂質の
分解反応、ホスホリラーゼによる多糖類の加リン
酸分解反応に代表される転移酵素（トランスフエ
ラーゼ）群による一連の反応、フマラーゼによる
リンゴ酸の合成反応、ホスフアターゼ、ヌクレオ
チオダーゼ等の加水分解酵素群の一連の反応、或
いは、アルコールデヒドロゲナーゼやアミノ酸酸
化還元酵素等に代表される酸化還元酵素群の反応
等、２種類以上の物質が関与する酵素反応系に使
用できる。また微生物反応系においては、反応基
質以外にも、微生物の生育に数多くの物質を必要
とすることから、殆どの微生物反応に本リアクタ
ーは適用できる。例えば、Corynebacterium
glutamicum等によるグルタミン酸発酵では、基
質のグルコースからグルタミン酸を発酵生産する
が、本菌の生育にはビオチンを必要とし、ビオチ
ン量によつてグルタミン酸生産量の増減がみられ
る。このように微生物反応では、反応基質以外に
ビオチンなどのビタミン類、無機塩、アミノ酸等
を必要とする場合が多く、本リアクターはこれら
微生物反応の殆どに適用できる。

本発明で用いる酵素或いは微生物は、必ずしも
高度に精製されているものである必要はなく、抽
出液や部分精製品、また或いは発酵液も用いるこ
とができる。

本発明によるバイオリアクターで効率的に反応
を行うには、第２図に示したように酵素室７をは
さんで多孔性材料９，１０を多数組、同種の多孔
性材料が相互に相対して、一方の多孔性材料９の
間には反応物質室５が、又他方の多孔性材料１０
の間には反応物質室６が形成される様セツトし、
反応に関与する物質を夫々ポンプ３ａ，３ｂで
夫々の反応物質室５，６へ循環させる様にするの
が良い。第２図に於てはまた、酵素或いは微生物
もポンプ３で酵素室７へ循環可能にしてある。第
２図に於て１，２は反応物質貯留容器、４は酵素
或いは微生物液貯留容器、８は外枠である。尚、
酵素、微生物は前述のように酵素室７内に設けた
スペーサ上に散布するか流延することによつて静
置して存在させても良い。

尚本発明の方法に用いるリアクターの形態は、
第１図及び第２図に示したような平膜型に限られ
ず、第３図のような管型、第４図のようなスパイ
ラル型など種々の形態が可能であり、特にその形
態について限定するものではない。第３図の管型
リアクターでは、１，２が多孔性材料で、これら
の間に酵素室４があり、多孔性材料の管状膜１の
内側に反応物質室３が、又多孔性材料の管状膜２
の外側に反応物質室５があり、６は外枠である。
第４図のスパイラル型リアクターでは、多孔性材
料の膜１，３にはさまれた空間に酵素が置かれた
スペーサ２が挾まれて、これが酵素室を形成して
いる。そして多孔性材料の膜１，３を２枚の外枠
４がはさんでおり、これらがスパイラル状に巻か
れており、外枠４と多孔性材料の膜１，３の夫々
との間に反応物質室を形成している。

本発明の一つの特徴は固定化酵素と同様に、反
応系から酵素や微生物を容易に除去できる一方、
酵素や微生物を多孔性材料に固定化していないた
め、酵素や微生物が失活した場合、多孔性材料を
交換することなく、酵素や微生物のみを交換する
ことができることである。従つて高価な多孔性材
料のロスを防げる。また前述したように酵素や微
生物に対して阻害物があれば、多孔性材料の膜の
材質、細孔径をコントロールすることにより、こ
れら阻害物を酵素反応系あるいは微生物反応系へ
与える量をコントロールしたり、また生成物が阻
害する場合は、この生成物を反応系から速やかに
除くことが可能となる。従つて酵素、微生物の失
活を抑え、これらを再利用することが可能とな
る。例えば、リパーゼによる油脂分解反応では、
反応基質の水がリパーゼの失活要因となり、水の
量が多くなりすぎると酵素は著しく失活する。従
つて多孔性材料の水透過量をコントロールするこ
とにより反応に必要な量の水だけを反応系に与え
ることができる。従つてこれによりリパーゼの失
活を抑制することができる。

本発明の方法のもう一つの大きな特徴として
は、反応生成物の分離が反応と同時に行いうるこ
とがあげられる。例えばリパーゼによる油脂分解
反応では、反応生成物である脂肪酸とグリセリン
の分離は反応と同時に行いうる。

また本発明によるバイオリアクターにおける酵
素反応或いは微生物反応の速度は、基質（反応物
質）等の多孔性材料の膜を透過する透過速度と、
多孔性材料の膜の表面積に大きく依存する。従つ
て反応速度を上げるには、基質等の透過速度の速
い材質の多孔性材料を選ぶことが重要である。ま
た多孔性材料の膜の表面積が反応速度に大きく関
与することから、表面積を増大させることにより
反応時間を大巾に短縮することも可能である。

以上述べてきたように、本発明によるバイオリ
アクターは酵素や微生物をマクロに多孔性材料間
に固定化する方法であり、酵素や微生物が反応系
内から容易に除去できる一方、酵素、微生物の再
利用、失活防止、また反応と分離の同時操作が可
能となるなど、従来の固定化酵素を利用する方法
にみられなかつた利点をも併せ持つた全く新しい
反応方法であり、その工業的有用性は非常に大き
いものである。

〔実施例〕

以下本発明の実施例について説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例 １ 面積0.02m²をもつポリアクリロニトリルの多孔
質膜（限外過膜、分画分子量20000）及びテフ
ロンの多孔質膜（ポアサイズ0.1μ）を10枚ずつ用
意した。油脂分解酵素（リパーゼ）２ｇを少量の
大豆油に懸濁し、約1/10ずつ両膜間のスペーサ上
に流延し、両膜でこれをはさむようにしてセツト
し、第２図に示したような平膜型反応器を作成し
た。但し、第２図の酵素液はポンプで循環してい
るが、ここではスペーサ上に流延して静置する方
法をとつた。

大豆油400ｇ、水400ｇを大豆油はテフロン膜と
接するように、水はポリアクリロニトリル膜と接
するように循環送液した。温度は恒温槽で30℃に
保持して大豆油のリパーゼによる分解反応を行つ
た。

24時間後、大豆油の分解率は70％、一方水中の
グリセリン濃度は７％であつた。また油中のグリ
セリン及び水中の脂肪酸はそれぞれ0.1％以下で
あつた。

この結果より、大豆油及び水は多孔質膜を透過
して中央の酵素室で反応し、反応後の脂肪酸は油
側へ、グリセリンは水側へ、再び多孔質膜を透過
して拡散分離されたことがわかる。このように反
応と分離の同時操作も可能であつた。

実施例 ２ 実施例１で使用した酵素をそのままにして、反
応後の脂肪酸溶液及びグリセリン水溶液を抜き出
した後フレツシユな大豆油400ｇ、及び水400ｇを
実施例１と全く同様に送液した。24時間後の大豆
油分解率は実施例１と同じ70％が得られた。

更に同様に酵素をそのままにして、再びフレツ
シユな大豆油、水を400ｇずつ送液した。３回目
も全く同様に24時間後の大豆油分解率70％が得ら
れた。

このように本バイオリアクターでは酵素の失活
は無かつた。

また一方、酵素はそのままにして単に液を抜き
出し、フレツシユな油、水を送液するだけで、効
率よく反応が行なえた。

このように酵素を系内から分離する工程は必要
ないことがわかる。

実施例 ３ 実施例１と同様の条件だが、油に接する多孔質
膜としてポアサイズ2.5μのポリ塩化ビニル系膜
（表面積0.02m²）10枚を用いた。水に接する多孔
質膜は実施例１と同じポリアクリロニトリル膜を
用いた。実施例１と同様の条件で、大豆油400ｇ、
水400ｇを循環送液し、油脂分解反応を行つた。
なお、塩ビ系膜では、油側への水の拡散が認めら
れたので、油側に約0.03Kg／cm²の差圧をかけて、
油側への水の侵入を防いだ。

24時間後の大豆油分解率は80％、水中のグリセ
リン濃度8.1％が得られた。また48時間後の大豆
油分解率90％、水中のグリセリン濃度９％が得ら
れた。

このように実施例１と比較すると、膜材質、孔
径によつて反応速度に差がみられることがわかつ
た。

実施例 ４ 実施例１と同様の多孔質膜を用い、膜枚数をそ
れぞれ５枚とした。大豆油400ｇ、水400ｇを同様
にして送液したところ24時間後の分解率44％が得
られた。

このように反応速度は膜面積に大きく依存して
いることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に使用される装置の構成を示す
図であり、１，２は多孔性材料、３，５は反応物
質室、４は酵素室、６は外枠である。第２図は本
発明に用いられる平膜型リアクターの説明図、第
３図は管型リアクター、第４図はスパイラル型リ
アクターの略示図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ２種類以上の物質が関与する酵素反応或いは
   微生物反応において、これら酵素あるいは微生物
   が通過できない多孔性材料２枚を１組とし、これ
   らの多孔性材料にはさまれた内側の空間部に酵素
   または微生物、或いは、固定化酵素或いは固定化
   微生物を存在させ、２枚の多孔性材料の両外側の
   空間には上記反応に関与する物質を夫々存在させ
   て、多孔性材料を界してこれらの物質を透過させ
   上記内側空間部で反応を行なわせることを特徴と
   する酵素及び微生物反応方法。 ２ ２枚の多孔性材料が、１枚は反応に関与する
   物質のうちの１部のみを及び反応後の生成物のう
   ちの１部のみを通過させ易く、他の１枚は反応に
   関与する物質のうちの残りの物質及び残りの反応
   生成物のみを通過させ易い性質をもつものである
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ ２枚１組の多孔性材料の複数組が同種の多孔
   性材料が向い合う様に順次配列されている特許請
   求の範囲第１項または第２項記載の方法。 ４ 反応に関与する物質が水及び油であり、酵素
   反応が酵素としてリパーゼを用いる油脂の加水分
   解反応である特許請求の範囲第１項、第２項また
   は第３項記載の方法。