JPH0338B2 - - Google Patents
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- JPH0338B2 JPH0338B2 JP61217339A JP21733986A JPH0338B2 JP H0338 B2 JPH0338 B2 JP H0338B2 JP 61217339 A JP61217339 A JP 61217339A JP 21733986 A JP21733986 A JP 21733986A JP H0338 B2 JPH0338 B2 JP H0338B2
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Description
本発明は糖類を基質とする酵素の固定化酵素複
合体の製造方法に関する。更に詳細には、酵素を
粒状ケイソウ土の担体上で固定化する。 現実には蛋白性であり、そして通常水溶性であ
る酵素は生体触媒として作用し、生体内で生じる
多くの化学的反応を制御する。また酵素は単離さ
れ、そして分析、医学及び工業的用途に使用し得
る。例えば、これらのものは食料例えばチーズ及
びパンの製造並びにアルコール飲料の製造に使用
される。 酵素は通常水溶性であり、並びに一般に不安定
であるため、これらのものは失活し、そしてこれ
らのものが使用される溶液から再使用のために回
収することが困難である。これらの困難さにより
しばしばこれらのものを交換する必要があり、商
業的規模での操作に使用する際に経費が増大す
る。高い酵素交換の経費を減ずるために、その使
用前の種々の酵素の固定化（しばしば不溶化と称
する）方法が考案された。この酵素の固定化は、
そうしなければ失活するかまたは使用される反応
媒質中に失なわれるであろう酵素の再使用を可能
にする。これらの固定化された酵素系は生体触媒
的に反応される基質の特性に依存して種々の反応
器系、例えば充てんカラム及び撹拌されたタンク
反応器中で使用し得る。 いくつかの一般的方法並びにその多くの改良法
が記載され、これにより酵素の固定化を行い得
る。例えば、酵素または酵素を含む細胞の固定化
に有用な物質は英国特許第1444539号に開示され
る。好ましくは、酵素または細胞を水混和性溶媒
例えばアセトンで処理し、乾燥し、次にポリエチ
レンイミン及びグルタルアルデヒドで処理し、水
に不溶性の構造体乃至成形体を製造する。 更に詳細には、米国特許第3796634号にポリア
ミンをコロイド状の大きさの粒子の表面上を吸収
することを含む固定化方法が開示される。ポリア
ミンを通常のアミン反応性交差結合剤例えばグル
タルアルデヒドで交差結合させ、そして生じる反
応生成物をNaBH4で処理してアルデヒド基を減
少させ、これによりアルデヒド基と酵素のアミノ
基間の共有結合を防止する。次に、酵素をコロイ
ド状吸着剤が酵素分子のものと反対の正味の電荷
を持ちイオン結合が非共有結合的な結合力となる
ようなPHで、処理された粒子の表面上に吸着させ
る。この特許は直径約50〜約20000Å、好ましく
は約100〜200Åの範囲の大きさの吸着剤粒子を記
載し、その際に吸着剤物質は活性炭、ヒドロキシ
アパタイト、アルミナＣガンマ、及びベントナイ
トである。この系は酵素を処理された粒子への結
合を際の電荷相互作用に依存する。この結合のタ
イプは共有結合の生成より望ましくなく、その理
由はイオン性相互作用はこのタイプの結合に対す
る周囲の条件、例えばPH、イオン強度及び温度に
影響されるからである。 リユウ（Liu）らは粒状炭素上へのラクターゼ
の固定化方法をBiotechnol.Bioeng，17，1695〜
1696，1975に開示し、このものは炭素にｐ−アミ
ノフエノールまたは１−フエノール−２−アミノ
−４−スルホン酸を吸収することを含む。これら
の吸収された化合物はグルタルアルデヒドと反応
し、そしてまた酵素を結合するアミノ基を与え
る。上記の化合物を含むアミノ基はポリエチレン
イミンの如きポリアミンと異なる化学的及び物理
的特性を持つ単量体である。 また他の研究者の群［チヨー（Cho）ら、活性
炭上への酵素の固定化：固定化されたグルコアミ
ラーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコノラ
クトンの特性（Immobilization of Enzymes on
Activated Carbon：Properties of Immobilized
Glucoamylase，Glucose Oxidase and
Gluconolactonase），Biotecnol.Bioeng.201651〜
1665，1978は共有結合により粒状炭素上に酵素を
固定化した。この方法において炭素は酵素により
置換されて酵素−炭素複合体を生成し得るカルボ
ジイミドにより活性化される。 米国特許第4141857号に細孔直径的100〜約
55000Å及び表面積約100〜500m2／ｇを有するガ
ンマーアルミナの如き無機多孔性担体物質を水溶
性ポリアミンの溶液で処理し、そして処理された
担体物質を二管能性単量体物質例えばグルタルア
ルデヒドの溶液と接触させることを含む酵素の固
定化方法が開示されている。この処理により酵素
及び側鎖状（pendant）アルデヒド基間に共有結
合を生じるように酵素と反応する際に適する処理
された担体物質が残る。この特許の実施例２にお
いて、多孔性アルミナ球体を順次ポリエチレンイ
ミン、グルタルアルデヒド及びグルコアミラーゼ
で処理することによる固定化された酵素結合体の
製造が記載されている。 米国特許第4438196号に酵素を活性化された粒
状炭素上に固定化する方法が開示されている。こ
の方法には炭素を側鎖付アミノ基を有するポリア
ミン化合物で処理して炭素に結合するポリアミン
を生じさせ、更に反応する余地を有する側鎖アミ
ン基が残る。遊離のアミン基はアミン反応性部分
を有する二官能性化合物で処理することにより誘
導され、従つて酵素の遊離のアミン基はアミン反
応性化合物を介してポリアミンに共有結合し得
る。 本発明は、糖類を基質とする酵素の固定化酵素
複合体の製造方法において、 ａ 多孔性、粒状ケイソウ土担体を側基状アミン
基を有するポリアミン化合物の溶液と接触させ
てポリアミンをケイソウ土に結合させる工程； ｂ 溶媒及びそれに分散している未結合のポリア
ミンを接触するケイソウ土から除去し、そして
かくて処理されたケイソウ土担体を多官能性ア
ルデヒドの溶液と接触させてアルデヒド基の一
つを該側基状アミン基と反応させて、且つ更に
反応に利用できるアルデヒド基を残留させる工
程、及び； ｃ 溶媒及びそれに溶解している未反応の多官能
性アルデヒドを接触するケイソウ土担体から除
去し、そして該担体を少なくとも１つの固定化
される酵素の溶液と接触させ、酵素のアミン基
と該未反応のアルデヒド基とを反応させて両者
間の共有結合を生成させ、それにより酵素を固
定化する工程からなる、ことを特徴とする方
法、を提供する。 いずれのGDE（粒状ケイソウ土）も本発明に使
用し得る。極めて適当なGDEは好ましくは米国
ふるい系において約−16〜＋48メツシユの粒径を
有する。細孔径は好ましくは半径で約35〜1000Å
の範囲であり、そして表面積は好ましくは約20〜
60m2／ｇの範囲である。 下の実施例に使用される多孔性粒状ケイソウ土
［イーグル・ビツチヤー工業社（Eagle Pitcher
Ind.Inc.）製］はかなり安価であり、そして良好
な機械的強度並びに熱及び酸性または塩基性溶液
に曝した際の安定性を有する。その物理的及び化
学的特性は次の通りである： 物理的特性（代表的） 粒径 −16〜＋48メツシユ かさ比重 575Kg／m3（38ポンド／ft3） 形状 本質的には球形 破壊強さ 17.6〜18.6Kg／cm2（約250psi） １ポンド当たりの粒子 （24／48メツシユ）13000000 １ポンド当たりの粒子 （16／24メツシユ） 1000000 色調 淡黄かつ色 平均表面積 40m2／ｇ 平均細孔容積 0.16ml／ｇ 平均細孔直径 155Å 化学的特性（概略） シリカ（SiO2） 90％ アルミナ（Al2O3） 6.5％ 酸化鉄（Fe2O3） 2.3％ ライム（CaO） 0.2％ マグネシア（MgO） 0.3％ 他の酸化物 0.3％ 発火損失（105℃の 水分に加えて） 0.4％ 溶液中のPH 6.5〜7.0 含水量 1.0％より小 構造 主に無定形ケイソウ土 化学的安定性、物理的強度及び低い経費のため
に、この多孔性GDEはカラム反応器に用いる際
に優れた担体である。 本発明に用いる際に適するポリアミンの特定の
例にはポリエチレンジアミン、ポリエチレンイミ
ン例えばポリジエチレントリアミン、ポリトリエ
チレンテトラミン、ポリペンタエチレンヘキサミ
ンまたはポリヘキサメチレンジアミンが含まれ
る。また、Betz1180を使用し得る。これはエピ
ハロヒドリン及びポリアミンの水溶性共重合体で
あり、そしてベツツ・ラボラトリーズ社（Betz
Laboratories，Inc.）、トレボース（Trevose），
ペンシルバニアにより市販されている。他の適当
なポリアミンにはポリメチレンジシクロヘキシル
アミン、ポリメチレンジアニリン、ポリテトラエ
チレンペンタミン及びポリフエニレンジアミンが
ある。ポリアミンの分子量は臨界的ではないが、
500〜100000の範囲の分子量を有する重合体が好
ましい。水溶性であるこれらのポリアミンはそれ
らの水溶液からGDEに適用され、一方非水溶性
重合体は有機溶媒から適用する。適当な溶媒には
メチルアルコール、エチルアルコール、プロピル
アルコール、イソプロピルアルコール、ｔ−ブチ
ルアルコール、アセトン、メチルエーテル、エチ
ルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエ
ーテル、トルエン、ベンゼン、キシレン、ヘキサ
ン、シクロペンタン及びシクロヘキサンが含まれ
るが、これに限定されない。 正確な機構はわからないが、通常１の溶媒に
約１〜100ｇのポリアミンの濃度であるポリアミ
ン溶液とGDEを接触させると、ポリアミンは、
GDE粒子の表面に付着し、そして多分GDE粒子
の細孔中に捕捉されると考えられる。かくて、重
合体の一部はGDE粒子の表面に付着するが、一
部は多孔性担体の細孔中に吸引され、大分子は細
孔から伸び出し、反応に役立つ可能基（アミノ
基）が外に残る。この方法は炭素粒子をポリエチ
レンイミンの溶液で処理してその表面電荷を変
え、これにより改質化された担体に対して酵素を
吸着される米国特許第3796634号に記載される従
来の方法と対照的である。この従来の方法は本発
明の方法で生じる共有結合より望ましくない電荷
相互作用に依存する。処理されたGDEは例えば
デカンテーシヨンまたは濾過により接触するポリ
アミン溶液から除去され、そして好ましくは上の
節で挙げられる溶媒例えば脱イオン化（DI）水
で洗浄していずれの付着していない重合体も除去
する。 ポリアミン処理されたGDEを次に多官能性ア
ルデヒドを好ましくは１当り約１〜100ｇ含む
溶液と接触させて処理する。水溶性である多官能
性アルデヒドは水溶液として、一方非水溶性の重
合体は有機溶媒溶液として用いる。適当な溶媒に
はメチルアルコール、エチルアルコール、プロピ
ルアルコール、イソプロピルアルコール、ｔ−ブ
チルアルコール、アセトン、メチルエーテル、エ
チルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピル
エーテル、トルエン、ベンゼン、キシレン、ヘキ
サン、シクロペンタン及びシクロヘキサンが含ま
れるが、これに限定されない。多官能性アルデヒ
ドがポリアミンの遊離のアミン基を誘導体化する
に十分な時間反応を進めた後、処理したGDEを
多官能性アルデヒドの溶液から除去し、そして好
ましくは脱イオン化水で数回洗浄する。本明細書
に用いる際に、「誘導体化する」なる用語はGDE
に結合するポリアミン分子のアミノ官能基及び多
官能性アルデヒドのアルデヒド基間の反応生成物
の生成を表す。 アルデヒド基と反応し得るアミノ基を含むいず
れかの酵素をこの方法により固定化し得る。ま
た、２種またはそれ以上の酵素を共に固定化し得
る。グルコアミラーゼ、ベーターアミラーゼ、プ
ルラナーゼ、トランスグルコシダーゼ、ラクター
ゼ、ヘキソキナーゼ、グルコースイソメラーゼ、
インベルターゼ、アルフアアミラーゼまたはグル
コースオキシダーゼなどの糖類を基質とする酵素
が含まれる。誘導体化されたGDEを酵素の溶液
と混合し、酵素固定化を完了する。酵素は水溶液
及び／または酵素と適合する溶媒中にあり得る。
固定化はバツチ式か、または工業規模であること
ができ、固定化はカラム反応器中で行い得る。好
ましくは水洗いに続いての酵素溶液からのGDE
の除去は生物触媒的転化に用いる際に適する
GDE固定化された酵素を与える。 本発明の酵素固定化方法の予期せぬ観察の１つ
に一般にこれらのものは米国特許第4438196号に
より製造される炭素固定された酵素より長い寿命
及び良好な熱安定性を示すことからGDE固定化
された酵素が優れていることがある。不均一生体
触媒を考える場合に極めて重要であるこの特性は
次の実施例により説明する。 この固定化方法の他の望ましい特徴は既に用い
たGDE担体を塩基−酸洗浄を含む簡単な方法に
よる再生後に固定化に再使用し得ることである。
代表的には、使用済み担体は(1)水、(2)0.5N
NaOH、(3)水、(4)0.5N HCl、次に(5)水にスラリ
ー化させる。本法のこの特性は使用者に対して廃
棄物の問題を除去し、そして潜在的な経済上の節
約も与えるために重要である。 他の望ましい寄与には下の実施例５及び６に示
すように１種より多い酵素の共固定化を含む具体
例がある。 好ましくは本発明を実施する際に、ケイソウ土
は透明になるまで水で洗浄し、次に吸引脱気す
る。次に水溶液中のポリアミン、好ましくはポリ
エチレンイミン（分子量500〜100000）を好まし
くはポリエチレンイミン（PEI）水溶液約50mlに
対してGDE約10mlの比で洗浄されたGDEに加え
る。約0.1〜0.5％（重量／容量）間のPEI水溶液
の濃度を有利に使用し、そしてより好ましくは約
0.15〜0.20％（PH9.0〜9.9で測定）のPEI（分子量
40000〜60000）水溶液をGDEに加える。効果的
な反応時間は温和に撹拌して約20〜30℃で約0.5
乃至８時間の間の範囲であることができ、室温で
約２〜５時間の間の反応時間が好ましい。過剰の
PEI溶液はデカンテーシヨンを行い、そしてアミ
ン処理されたGDEを水で洗浄することにより除
去し得る。交差結合剤としてグルタルアルデヒド
を用いる場合、このものは代表的にはPEIとほぼ
同じ容量比でPEI処理されたGDEに加える。この
固定化方法には約0.1〜1.0％（重量／容量）のグ
ルタルアルデヒド濃度が有効である。好適な濃度
は約7.9〜8.3の望ましいPH値に対する0.05M炭酸
水素ナトリウムを含む約0.25〜0.7％（重量／容
量）のグルタルアルデヒド水溶液である。交差結
合反応は温和に撹拌しながら約20〜30℃で約0.5
〜20時間、好ましくは室温で約２時間行う。いず
れかの過剰のグルタルアルデヒド溶液はデカンテ
ーシヨンを行い、そして処理されたGDEを水で
洗浄することにより除去し得る。酵素固定化は温
和に撹拌しながら約４乃至30℃間にて固定化され
る特定の酵素に適するPH値で約１〜10時間行い得
る。好適な条件には室温での４時間の撹拌が含ま
れる。かくて得られた固定化酵素は使用するまで
に好ましくは冷蔵庫で冷却して、より好ましくは
１〜10℃で、そして更に好ましくは４℃で水また
は適当な緩衝溶液中に貯蔵し得る。 本発明の触媒担体は一般に酵素の固定化に十分
適することが見出だされた。本発明により固定化
される酵素は可溶化された酵素または米国特許第
4438196号により固定化される酵素より実質的に
熱的に安定であり、そしてかくて最も重要なこと
に、本発明は熱に不安定な酵素と用いることが殊
に適している。 担体１ml当たりの固定化された酵素活性は担体
の粒径及び酵素の担持の度合により変え、そして
制御し得る。 固定化方法により酵素及び極めて安定である粒
状ケイソウ土に吸収される重合体間に結合が生
じ、そして液化されたトウモロコシでん粉の粗製
溶液を固定化された酵素の床に通す場合にケイソ
ウ土粒子は蛋白質または他の物質により被覆され
ず、そして汚染されないことが見出だされた。 本発明を次の実施例により更に説明するが、そ
の際にすべてのメツシユ径は米国標準ふるい系を
ベースとする。この実施例は好適な具体例を説明
するものであり、そしてこれにより本発明を限定
するものではない。 実施例において特記せぬ限り、固定化される
か、または可溶化されるかのいずれかの酵素また
は複数の酵素の活性は次のように測定された。分
析は基質としてグレイン・プロセシング社
（Grain Processing Company）、［ムスカチン
（Muscatine）、アイオワ］から得られた10％重
量／容量Maltrin−150（デキストロース当量10〜
12）トウモロコシでん粉50mlを用いて0.05M酢酸
塩緩衝液中でPH4.2にて50℃で行つた。分析を行
うために、基質及び酵素を振盪ラスコに入れ、そ
して30分間培養した。生じるグルコースの量はグ
ルコストレート法（Glucostrate Methad）［一般
的診断学（General Diagnostics）］により推定
され、これにより１分間当たり生じるグルコース
の初期割合（初期速度とも呼ぶ）を回帰
（regression）分析から求める。酵素活性の１単
位は各々の酵素分析の条件下で１分間に１ミクロ
モルのグルコース（またはグルコース等価物）を
生じさせる酵素の量を表し、そしてＵ／ml（担体
１ml当たりの活性の単位）で表す。 実施例において、生じる糖の量はグイセン
（Ghuysen）らによる酵素学における方法
（Methods in Enzymology），第巻，685項、
アカデミツク出版（Academic Press），ニユー
ヨーク（1966）に記載されるフエリシアナミド法
により測定され、その際にグルコースを対照とし
て用いた。 実施例 １ PEI誘導体化された多孔性粒状ケイソウ土上で
のグルコアミラーゼの固定化 固定化に用いる前に、粒状ケイソウ土（GDE）
を次のように洗浄した： １ −20〜＋24メツシユ（米国ふるい）の多孔性
粒状ケイソウ土（イーグル・ピツチヤー工業
社）100mlを脱イオン化水と混合した。ケイソ
ウ土を完全に浸漬するに十分な水を用いた。 ２ ケイソウ土が沈澱した後、上澄液をデカンテ
ーシヨンで除去した。 ３ 次にケイソウ土を吸引脱気し、そして残留水
をデカンテーシヨンで除去した。 グルコアミラーゼ（AG）を次の方法により室
温で固定化した： １ 9.8で測定されたPH値を有するPEI−600［コル
ドバ化学会社（Cordova Chemical
Company）、ムスケゴン（Muskegon）、ミシ
ガン、ポリエチレンイミン分子量範囲40000〜
60000］の0.2％重量／容量水溶液500mlを１
入りのエルレンマイヤーフラスコ中で洗浄され
たケイソウ土の試料100mlに加え、そして４時
間温和に振盪した。 ２ 次に過剰のポリエチレンイミン溶液をデカン
テーシヨンで除去し、そして処理したケイソウ
土を多量の水で洗浄した。 ３ ケイソウ土に結合した重合体の側鎖状アミン
基を8.2のPH値を生じる0.05M炭酸水素ナトリ
ウムで調節された0.5％重量／容量グルタルア
ルデヒド溶液500mlを添加することによりグル
タルアルデヒドで誘導体化した。フラスコを室
温で２時間温和に撹拌した。 ４ グルタルアルデヒド溶液をデカンテーシヨン
で除去し、そして処理されたケイソウ土を脱イ
オン化水で洗浄して未反応のグルタルアルデヒ
ドを除去した。ケイソウ土、ポリエチレンイミ
ン及びグルタルアルデヒドからなる担体が生じ
た。 ５ 0.02Mリン酸塩緩衝液でPH7.0に調節した
12000単位のグルコアミラーゼ［Diazyme Ｌ
−200、マイルス・ラボラトリーズ社（Miles
Laboratories，Inc.）、エルクハート
（Elkhart）、インデイアナの商標］を含む溶液
500mlを誘導体化された担体に加え、そして室
温で４時間温和に撹拌した。 ６ 液体をデカンテーシヨンで除去し、そして固
定化酵素を脱イオン化水で洗浄した。 固定化されたグルコアミラーゼは担体１ml当り
110単位の活性を含むことが見い出された。 高デキストローズシロツプを生成するための粒
状ケイソウ土固定化されたグルコアミラーゼの
使用 かくて調製された固定化グルコアミラーゼの50
mlの試料を直径2.5cm及び高さ100cmのジヤケツト
付きガラスカラム中に充てんした。5mM酢酸塩
でPH4.2に緩衝化され、30％酵素液化されたでん
粉（40DE）［23.63％グルコース、10.99％マルト
ース、０％イソマルトース；重合の程度：
DP313.10％、DP47.10％、DP4より大45.18％）を
種々の流速でカラムに連続的に供給した。カラム
の温度を50℃に保持した。生成物をHPLC（高速
液体グロマトグラフイー）及びGC（ガスクロマト
グラフイー）により分析した。結果を次の表に示
す。
合体の製造方法に関する。更に詳細には、酵素を
粒状ケイソウ土の担体上で固定化する。 現実には蛋白性であり、そして通常水溶性であ
る酵素は生体触媒として作用し、生体内で生じる
多くの化学的反応を制御する。また酵素は単離さ
れ、そして分析、医学及び工業的用途に使用し得
る。例えば、これらのものは食料例えばチーズ及
びパンの製造並びにアルコール飲料の製造に使用
される。 酵素は通常水溶性であり、並びに一般に不安定
であるため、これらのものは失活し、そしてこれ
らのものが使用される溶液から再使用のために回
収することが困難である。これらの困難さにより
しばしばこれらのものを交換する必要があり、商
業的規模での操作に使用する際に経費が増大す
る。高い酵素交換の経費を減ずるために、その使
用前の種々の酵素の固定化（しばしば不溶化と称
する）方法が考案された。この酵素の固定化は、
そうしなければ失活するかまたは使用される反応
媒質中に失なわれるであろう酵素の再使用を可能
にする。これらの固定化された酵素系は生体触媒
的に反応される基質の特性に依存して種々の反応
器系、例えば充てんカラム及び撹拌されたタンク
反応器中で使用し得る。 いくつかの一般的方法並びにその多くの改良法
が記載され、これにより酵素の固定化を行い得
る。例えば、酵素または酵素を含む細胞の固定化
に有用な物質は英国特許第1444539号に開示され
る。好ましくは、酵素または細胞を水混和性溶媒
例えばアセトンで処理し、乾燥し、次にポリエチ
レンイミン及びグルタルアルデヒドで処理し、水
に不溶性の構造体乃至成形体を製造する。 更に詳細には、米国特許第3796634号にポリア
ミンをコロイド状の大きさの粒子の表面上を吸収
することを含む固定化方法が開示される。ポリア
ミンを通常のアミン反応性交差結合剤例えばグル
タルアルデヒドで交差結合させ、そして生じる反
応生成物をNaBH4で処理してアルデヒド基を減
少させ、これによりアルデヒド基と酵素のアミノ
基間の共有結合を防止する。次に、酵素をコロイ
ド状吸着剤が酵素分子のものと反対の正味の電荷
を持ちイオン結合が非共有結合的な結合力となる
ようなPHで、処理された粒子の表面上に吸着させ
る。この特許は直径約50〜約20000Å、好ましく
は約100〜200Åの範囲の大きさの吸着剤粒子を記
載し、その際に吸着剤物質は活性炭、ヒドロキシ
アパタイト、アルミナＣガンマ、及びベントナイ
トである。この系は酵素を処理された粒子への結
合を際の電荷相互作用に依存する。この結合のタ
イプは共有結合の生成より望ましくなく、その理
由はイオン性相互作用はこのタイプの結合に対す
る周囲の条件、例えばPH、イオン強度及び温度に
影響されるからである。 リユウ（Liu）らは粒状炭素上へのラクターゼ
の固定化方法をBiotechnol.Bioeng，17，1695〜
1696，1975に開示し、このものは炭素にｐ−アミ
ノフエノールまたは１−フエノール−２−アミノ
−４−スルホン酸を吸収することを含む。これら
の吸収された化合物はグルタルアルデヒドと反応
し、そしてまた酵素を結合するアミノ基を与え
る。上記の化合物を含むアミノ基はポリエチレン
イミンの如きポリアミンと異なる化学的及び物理
的特性を持つ単量体である。 また他の研究者の群［チヨー（Cho）ら、活性
炭上への酵素の固定化：固定化されたグルコアミ
ラーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコノラ
クトンの特性（Immobilization of Enzymes on
Activated Carbon：Properties of Immobilized
Glucoamylase，Glucose Oxidase and
Gluconolactonase），Biotecnol.Bioeng.201651〜
1665，1978は共有結合により粒状炭素上に酵素を
固定化した。この方法において炭素は酵素により
置換されて酵素−炭素複合体を生成し得るカルボ
ジイミドにより活性化される。 米国特許第4141857号に細孔直径的100〜約
55000Å及び表面積約100〜500m2／ｇを有するガ
ンマーアルミナの如き無機多孔性担体物質を水溶
性ポリアミンの溶液で処理し、そして処理された
担体物質を二管能性単量体物質例えばグルタルア
ルデヒドの溶液と接触させることを含む酵素の固
定化方法が開示されている。この処理により酵素
及び側鎖状（pendant）アルデヒド基間に共有結
合を生じるように酵素と反応する際に適する処理
された担体物質が残る。この特許の実施例２にお
いて、多孔性アルミナ球体を順次ポリエチレンイ
ミン、グルタルアルデヒド及びグルコアミラーゼ
で処理することによる固定化された酵素結合体の
製造が記載されている。 米国特許第4438196号に酵素を活性化された粒
状炭素上に固定化する方法が開示されている。こ
の方法には炭素を側鎖付アミノ基を有するポリア
ミン化合物で処理して炭素に結合するポリアミン
を生じさせ、更に反応する余地を有する側鎖アミ
ン基が残る。遊離のアミン基はアミン反応性部分
を有する二官能性化合物で処理することにより誘
導され、従つて酵素の遊離のアミン基はアミン反
応性化合物を介してポリアミンに共有結合し得
る。 本発明は、糖類を基質とする酵素の固定化酵素
複合体の製造方法において、 ａ 多孔性、粒状ケイソウ土担体を側基状アミン
基を有するポリアミン化合物の溶液と接触させ
てポリアミンをケイソウ土に結合させる工程； ｂ 溶媒及びそれに分散している未結合のポリア
ミンを接触するケイソウ土から除去し、そして
かくて処理されたケイソウ土担体を多官能性ア
ルデヒドの溶液と接触させてアルデヒド基の一
つを該側基状アミン基と反応させて、且つ更に
反応に利用できるアルデヒド基を残留させる工
程、及び； ｃ 溶媒及びそれに溶解している未反応の多官能
性アルデヒドを接触するケイソウ土担体から除
去し、そして該担体を少なくとも１つの固定化
される酵素の溶液と接触させ、酵素のアミン基
と該未反応のアルデヒド基とを反応させて両者
間の共有結合を生成させ、それにより酵素を固
定化する工程からなる、ことを特徴とする方
法、を提供する。 いずれのGDE（粒状ケイソウ土）も本発明に使
用し得る。極めて適当なGDEは好ましくは米国
ふるい系において約−16〜＋48メツシユの粒径を
有する。細孔径は好ましくは半径で約35〜1000Å
の範囲であり、そして表面積は好ましくは約20〜
60m2／ｇの範囲である。 下の実施例に使用される多孔性粒状ケイソウ土
［イーグル・ビツチヤー工業社（Eagle Pitcher
Ind.Inc.）製］はかなり安価であり、そして良好
な機械的強度並びに熱及び酸性または塩基性溶液
に曝した際の安定性を有する。その物理的及び化
学的特性は次の通りである： 物理的特性（代表的） 粒径 −16〜＋48メツシユ かさ比重 575Kg／m3（38ポンド／ft3） 形状 本質的には球形 破壊強さ 17.6〜18.6Kg／cm2（約250psi） １ポンド当たりの粒子 （24／48メツシユ）13000000 １ポンド当たりの粒子 （16／24メツシユ） 1000000 色調 淡黄かつ色 平均表面積 40m2／ｇ 平均細孔容積 0.16ml／ｇ 平均細孔直径 155Å 化学的特性（概略） シリカ（SiO2） 90％ アルミナ（Al2O3） 6.5％ 酸化鉄（Fe2O3） 2.3％ ライム（CaO） 0.2％ マグネシア（MgO） 0.3％ 他の酸化物 0.3％ 発火損失（105℃の 水分に加えて） 0.4％ 溶液中のPH 6.5〜7.0 含水量 1.0％より小 構造 主に無定形ケイソウ土 化学的安定性、物理的強度及び低い経費のため
に、この多孔性GDEはカラム反応器に用いる際
に優れた担体である。 本発明に用いる際に適するポリアミンの特定の
例にはポリエチレンジアミン、ポリエチレンイミ
ン例えばポリジエチレントリアミン、ポリトリエ
チレンテトラミン、ポリペンタエチレンヘキサミ
ンまたはポリヘキサメチレンジアミンが含まれ
る。また、Betz1180を使用し得る。これはエピ
ハロヒドリン及びポリアミンの水溶性共重合体で
あり、そしてベツツ・ラボラトリーズ社（Betz
Laboratories，Inc.）、トレボース（Trevose），
ペンシルバニアにより市販されている。他の適当
なポリアミンにはポリメチレンジシクロヘキシル
アミン、ポリメチレンジアニリン、ポリテトラエ
チレンペンタミン及びポリフエニレンジアミンが
ある。ポリアミンの分子量は臨界的ではないが、
500〜100000の範囲の分子量を有する重合体が好
ましい。水溶性であるこれらのポリアミンはそれ
らの水溶液からGDEに適用され、一方非水溶性
重合体は有機溶媒から適用する。適当な溶媒には
メチルアルコール、エチルアルコール、プロピル
アルコール、イソプロピルアルコール、ｔ−ブチ
ルアルコール、アセトン、メチルエーテル、エチ
ルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエ
ーテル、トルエン、ベンゼン、キシレン、ヘキサ
ン、シクロペンタン及びシクロヘキサンが含まれ
るが、これに限定されない。 正確な機構はわからないが、通常１の溶媒に
約１〜100ｇのポリアミンの濃度であるポリアミ
ン溶液とGDEを接触させると、ポリアミンは、
GDE粒子の表面に付着し、そして多分GDE粒子
の細孔中に捕捉されると考えられる。かくて、重
合体の一部はGDE粒子の表面に付着するが、一
部は多孔性担体の細孔中に吸引され、大分子は細
孔から伸び出し、反応に役立つ可能基（アミノ
基）が外に残る。この方法は炭素粒子をポリエチ
レンイミンの溶液で処理してその表面電荷を変
え、これにより改質化された担体に対して酵素を
吸着される米国特許第3796634号に記載される従
来の方法と対照的である。この従来の方法は本発
明の方法で生じる共有結合より望ましくない電荷
相互作用に依存する。処理されたGDEは例えば
デカンテーシヨンまたは濾過により接触するポリ
アミン溶液から除去され、そして好ましくは上の
節で挙げられる溶媒例えば脱イオン化（DI）水
で洗浄していずれの付着していない重合体も除去
する。 ポリアミン処理されたGDEを次に多官能性ア
ルデヒドを好ましくは１当り約１〜100ｇ含む
溶液と接触させて処理する。水溶性である多官能
性アルデヒドは水溶液として、一方非水溶性の重
合体は有機溶媒溶液として用いる。適当な溶媒に
はメチルアルコール、エチルアルコール、プロピ
ルアルコール、イソプロピルアルコール、ｔ−ブ
チルアルコール、アセトン、メチルエーテル、エ
チルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピル
エーテル、トルエン、ベンゼン、キシレン、ヘキ
サン、シクロペンタン及びシクロヘキサンが含ま
れるが、これに限定されない。多官能性アルデヒ
ドがポリアミンの遊離のアミン基を誘導体化する
に十分な時間反応を進めた後、処理したGDEを
多官能性アルデヒドの溶液から除去し、そして好
ましくは脱イオン化水で数回洗浄する。本明細書
に用いる際に、「誘導体化する」なる用語はGDE
に結合するポリアミン分子のアミノ官能基及び多
官能性アルデヒドのアルデヒド基間の反応生成物
の生成を表す。 アルデヒド基と反応し得るアミノ基を含むいず
れかの酵素をこの方法により固定化し得る。ま
た、２種またはそれ以上の酵素を共に固定化し得
る。グルコアミラーゼ、ベーターアミラーゼ、プ
ルラナーゼ、トランスグルコシダーゼ、ラクター
ゼ、ヘキソキナーゼ、グルコースイソメラーゼ、
インベルターゼ、アルフアアミラーゼまたはグル
コースオキシダーゼなどの糖類を基質とする酵素
が含まれる。誘導体化されたGDEを酵素の溶液
と混合し、酵素固定化を完了する。酵素は水溶液
及び／または酵素と適合する溶媒中にあり得る。
固定化はバツチ式か、または工業規模であること
ができ、固定化はカラム反応器中で行い得る。好
ましくは水洗いに続いての酵素溶液からのGDE
の除去は生物触媒的転化に用いる際に適する
GDE固定化された酵素を与える。 本発明の酵素固定化方法の予期せぬ観察の１つ
に一般にこれらのものは米国特許第4438196号に
より製造される炭素固定された酵素より長い寿命
及び良好な熱安定性を示すことからGDE固定化
された酵素が優れていることがある。不均一生体
触媒を考える場合に極めて重要であるこの特性は
次の実施例により説明する。 この固定化方法の他の望ましい特徴は既に用い
たGDE担体を塩基−酸洗浄を含む簡単な方法に
よる再生後に固定化に再使用し得ることである。
代表的には、使用済み担体は(1)水、(2)0.5N
NaOH、(3)水、(4)0.5N HCl、次に(5)水にスラリ
ー化させる。本法のこの特性は使用者に対して廃
棄物の問題を除去し、そして潜在的な経済上の節
約も与えるために重要である。 他の望ましい寄与には下の実施例５及び６に示
すように１種より多い酵素の共固定化を含む具体
例がある。 好ましくは本発明を実施する際に、ケイソウ土
は透明になるまで水で洗浄し、次に吸引脱気す
る。次に水溶液中のポリアミン、好ましくはポリ
エチレンイミン（分子量500〜100000）を好まし
くはポリエチレンイミン（PEI）水溶液約50mlに
対してGDE約10mlの比で洗浄されたGDEに加え
る。約0.1〜0.5％（重量／容量）間のPEI水溶液
の濃度を有利に使用し、そしてより好ましくは約
0.15〜0.20％（PH9.0〜9.9で測定）のPEI（分子量
40000〜60000）水溶液をGDEに加える。効果的
な反応時間は温和に撹拌して約20〜30℃で約0.5
乃至８時間の間の範囲であることができ、室温で
約２〜５時間の間の反応時間が好ましい。過剰の
PEI溶液はデカンテーシヨンを行い、そしてアミ
ン処理されたGDEを水で洗浄することにより除
去し得る。交差結合剤としてグルタルアルデヒド
を用いる場合、このものは代表的にはPEIとほぼ
同じ容量比でPEI処理されたGDEに加える。この
固定化方法には約0.1〜1.0％（重量／容量）のグ
ルタルアルデヒド濃度が有効である。好適な濃度
は約7.9〜8.3の望ましいPH値に対する0.05M炭酸
水素ナトリウムを含む約0.25〜0.7％（重量／容
量）のグルタルアルデヒド水溶液である。交差結
合反応は温和に撹拌しながら約20〜30℃で約0.5
〜20時間、好ましくは室温で約２時間行う。いず
れかの過剰のグルタルアルデヒド溶液はデカンテ
ーシヨンを行い、そして処理されたGDEを水で
洗浄することにより除去し得る。酵素固定化は温
和に撹拌しながら約４乃至30℃間にて固定化され
る特定の酵素に適するPH値で約１〜10時間行い得
る。好適な条件には室温での４時間の撹拌が含ま
れる。かくて得られた固定化酵素は使用するまで
に好ましくは冷蔵庫で冷却して、より好ましくは
１〜10℃で、そして更に好ましくは４℃で水また
は適当な緩衝溶液中に貯蔵し得る。 本発明の触媒担体は一般に酵素の固定化に十分
適することが見出だされた。本発明により固定化
される酵素は可溶化された酵素または米国特許第
4438196号により固定化される酵素より実質的に
熱的に安定であり、そしてかくて最も重要なこと
に、本発明は熱に不安定な酵素と用いることが殊
に適している。 担体１ml当たりの固定化された酵素活性は担体
の粒径及び酵素の担持の度合により変え、そして
制御し得る。 固定化方法により酵素及び極めて安定である粒
状ケイソウ土に吸収される重合体間に結合が生
じ、そして液化されたトウモロコシでん粉の粗製
溶液を固定化された酵素の床に通す場合にケイソ
ウ土粒子は蛋白質または他の物質により被覆され
ず、そして汚染されないことが見出だされた。 本発明を次の実施例により更に説明するが、そ
の際にすべてのメツシユ径は米国標準ふるい系を
ベースとする。この実施例は好適な具体例を説明
するものであり、そしてこれにより本発明を限定
するものではない。 実施例において特記せぬ限り、固定化される
か、または可溶化されるかのいずれかの酵素また
は複数の酵素の活性は次のように測定された。分
析は基質としてグレイン・プロセシング社
（Grain Processing Company）、［ムスカチン
（Muscatine）、アイオワ］から得られた10％重
量／容量Maltrin−150（デキストロース当量10〜
12）トウモロコシでん粉50mlを用いて0.05M酢酸
塩緩衝液中でPH4.2にて50℃で行つた。分析を行
うために、基質及び酵素を振盪ラスコに入れ、そ
して30分間培養した。生じるグルコースの量はグ
ルコストレート法（Glucostrate Methad）［一般
的診断学（General Diagnostics）］により推定
され、これにより１分間当たり生じるグルコース
の初期割合（初期速度とも呼ぶ）を回帰
（regression）分析から求める。酵素活性の１単
位は各々の酵素分析の条件下で１分間に１ミクロ
モルのグルコース（またはグルコース等価物）を
生じさせる酵素の量を表し、そしてＵ／ml（担体
１ml当たりの活性の単位）で表す。 実施例において、生じる糖の量はグイセン
（Ghuysen）らによる酵素学における方法
（Methods in Enzymology），第巻，685項、
アカデミツク出版（Academic Press），ニユー
ヨーク（1966）に記載されるフエリシアナミド法
により測定され、その際にグルコースを対照とし
て用いた。 実施例 １ PEI誘導体化された多孔性粒状ケイソウ土上で
のグルコアミラーゼの固定化 固定化に用いる前に、粒状ケイソウ土（GDE）
を次のように洗浄した： １ −20〜＋24メツシユ（米国ふるい）の多孔性
粒状ケイソウ土（イーグル・ピツチヤー工業
社）100mlを脱イオン化水と混合した。ケイソ
ウ土を完全に浸漬するに十分な水を用いた。 ２ ケイソウ土が沈澱した後、上澄液をデカンテ
ーシヨンで除去した。 ３ 次にケイソウ土を吸引脱気し、そして残留水
をデカンテーシヨンで除去した。 グルコアミラーゼ（AG）を次の方法により室
温で固定化した： １ 9.8で測定されたPH値を有するPEI−600［コル
ドバ化学会社（Cordova Chemical
Company）、ムスケゴン（Muskegon）、ミシ
ガン、ポリエチレンイミン分子量範囲40000〜
60000］の0.2％重量／容量水溶液500mlを１
入りのエルレンマイヤーフラスコ中で洗浄され
たケイソウ土の試料100mlに加え、そして４時
間温和に振盪した。 ２ 次に過剰のポリエチレンイミン溶液をデカン
テーシヨンで除去し、そして処理したケイソウ
土を多量の水で洗浄した。 ３ ケイソウ土に結合した重合体の側鎖状アミン
基を8.2のPH値を生じる0.05M炭酸水素ナトリ
ウムで調節された0.5％重量／容量グルタルア
ルデヒド溶液500mlを添加することによりグル
タルアルデヒドで誘導体化した。フラスコを室
温で２時間温和に撹拌した。 ４ グルタルアルデヒド溶液をデカンテーシヨン
で除去し、そして処理されたケイソウ土を脱イ
オン化水で洗浄して未反応のグルタルアルデヒ
ドを除去した。ケイソウ土、ポリエチレンイミ
ン及びグルタルアルデヒドからなる担体が生じ
た。 ５ 0.02Mリン酸塩緩衝液でPH7.0に調節した
12000単位のグルコアミラーゼ［Diazyme Ｌ
−200、マイルス・ラボラトリーズ社（Miles
Laboratories，Inc.）、エルクハート
（Elkhart）、インデイアナの商標］を含む溶液
500mlを誘導体化された担体に加え、そして室
温で４時間温和に撹拌した。 ６ 液体をデカンテーシヨンで除去し、そして固
定化酵素を脱イオン化水で洗浄した。 固定化されたグルコアミラーゼは担体１ml当り
110単位の活性を含むことが見い出された。 高デキストローズシロツプを生成するための粒
状ケイソウ土固定化されたグルコアミラーゼの
使用 かくて調製された固定化グルコアミラーゼの50
mlの試料を直径2.5cm及び高さ100cmのジヤケツト
付きガラスカラム中に充てんした。5mM酢酸塩
でPH4.2に緩衝化され、30％酵素液化されたでん
粉（40DE）［23.63％グルコース、10.99％マルト
ース、０％イソマルトース；重合の程度：
DP313.10％、DP47.10％、DP4より大45.18％）を
種々の流速でカラムに連続的に供給した。カラム
の温度を50℃に保持した。生成物をHPLC（高速
液体グロマトグラフイー）及びGC（ガスクロマト
グラフイー）により分析した。結果を次の表に示
す。
【表】
を含んでいた。
かくて、96.6％の最大グルコース濃度を達成す
ることができ、可溶性グルコアミラーゼ糖化と同
様のデキストローズ濃度が得られることが証明さ
れた。30％DSでのこの高濃度のデキストローズ
は酵素が粒子の表面またはその極めて近くにあ
り、内部拡散が反応に影響を与える大きな因子で
ないことを示す。また、高い糖フラクシヨン（＞
DP3）は固定化酵素により容易に加水分解するこ
とができ、更に立体障害が殆んどないか、または
基質が酵素活性部位に容易に接近することを示
す。 実施例 ２ 粒状ケイソウ土固定化されたグルコアミラーゼ
と炭素固定化されたグルコアミラーゼの比較 熱安定性： 可溶性グルコアミラーゼ、米国特許第4438196
号の実施例１による炭素固定化されたグルコアミ
ラーゼ、及び上の実施例１で調製されたGDE固
定化されたグルコアミラーゼの熱安定性試験を基
質を存在させずに60℃及びPH4.2（0.1M酢酸塩緩
衝液）で行つた。結果を第−Ａ表に示す。
かくて、96.6％の最大グルコース濃度を達成す
ることができ、可溶性グルコアミラーゼ糖化と同
様のデキストローズ濃度が得られることが証明さ
れた。30％DSでのこの高濃度のデキストローズ
は酵素が粒子の表面またはその極めて近くにあ
り、内部拡散が反応に影響を与える大きな因子で
ないことを示す。また、高い糖フラクシヨン（＞
DP3）は固定化酵素により容易に加水分解するこ
とができ、更に立体障害が殆んどないか、または
基質が酵素活性部位に容易に接近することを示
す。 実施例 ２ 粒状ケイソウ土固定化されたグルコアミラーゼ
と炭素固定化されたグルコアミラーゼの比較 熱安定性： 可溶性グルコアミラーゼ、米国特許第4438196
号の実施例１による炭素固定化されたグルコアミ
ラーゼ、及び上の実施例１で調製されたGDE固
定化されたグルコアミラーゼの熱安定性試験を基
質を存在させずに60℃及びPH4.2（0.1M酢酸塩緩
衝液）で行つた。結果を第−Ａ表に示す。
【表】
表に示されるように、多孔性粒状ケイソウ土上
でのグルコアミラーゼの固定化により酵素の熱安
定性が改善された。 安定性及び生産性： 上の実施例１で調製された固定化グルコアミラ
ーゼ１をジヤケツト付きのガラスカラム（５cm
×100cm）に充てんした。カラムを50℃で連続的
に運転し、基質として30％DS（乾燥固体）二重
（dual）酵素液化されたトウモロコシでん粉
（35DE）を2.5mM酢酸塩でPH4.2に調整され、そ
して250ppmSO2を含む条件で供給した。また基質
を５℃で冷却して貯蔵し、次に粒状ケイソウ土の
みを充てんした小さな70℃のカラムに通し、酵素
カラムに入れる前のチエツクフイルターとして用
いた。生成物中のグルコース量は94〜96％間の範
囲であつた。このカラムに対する半減期は約125
日間であり、生産性は固定化グルコアミラーゼ１
ml当り約153ｇDSであつた。 比較のために、米国特許第4438196号の実施例
により調製した炭素固定化されたグルコアミラー
ゼを上の節に記載される方法と同様に（DSが25
％であることを除いて）カラム中で試験した。低
いDSではより完全なでん粉の転化が得られるこ
とが望ましく、かくて収率は良好であるできであ
るが、生成物中のグルコース量は92〜93間の範囲
であつた。このカラムの半減期は約67日間であ
り、生産性は固定化グルコアミラーゼ１ml当り約
107ｇDSであつた。 各々のカラムを通る種々の流速での炭水化物分
布（profile）の結果を下の第−Ｂ表に要約す
る。
でのグルコアミラーゼの固定化により酵素の熱安
定性が改善された。 安定性及び生産性： 上の実施例１で調製された固定化グルコアミラ
ーゼ１をジヤケツト付きのガラスカラム（５cm
×100cm）に充てんした。カラムを50℃で連続的
に運転し、基質として30％DS（乾燥固体）二重
（dual）酵素液化されたトウモロコシでん粉
（35DE）を2.5mM酢酸塩でPH4.2に調整され、そ
して250ppmSO2を含む条件で供給した。また基質
を５℃で冷却して貯蔵し、次に粒状ケイソウ土の
みを充てんした小さな70℃のカラムに通し、酵素
カラムに入れる前のチエツクフイルターとして用
いた。生成物中のグルコース量は94〜96％間の範
囲であつた。このカラムに対する半減期は約125
日間であり、生産性は固定化グルコアミラーゼ１
ml当り約153ｇDSであつた。 比較のために、米国特許第4438196号の実施例
により調製した炭素固定化されたグルコアミラー
ゼを上の節に記載される方法と同様に（DSが25
％であることを除いて）カラム中で試験した。低
いDSではより完全なでん粉の転化が得られるこ
とが望ましく、かくて収率は良好であるできであ
るが、生成物中のグルコース量は92〜93間の範囲
であつた。このカラムの半減期は約67日間であ
り、生産性は固定化グルコアミラーゼ１ml当り約
107ｇDSであつた。 各々のカラムを通る種々の流速での炭水化物分
布（profile）の結果を下の第−Ｂ表に要約す
る。
【表】
【表】
第−Ｂ表から、GDEに結合するグルコアミ
ラーゼは粒状炭素に結合するグルコアミラーゼよ
りでん粉を完全に加水分解し得ることが測定でき
た。GDEに結合するグルコアミラーゼによつて
約96％の最大デキストローズが、そして炭素に結
合するグルコアミラーゼで約95％の量が達成され
た。増加したデキストローズ収率によりGDEに
結合したAGは立体障害が少ないが、または粒子
のより表面で結合し、基質が拡散抵抗が少なくな
ることが示され得る。他にGDEに結合するグル
コアミラーゼに関する少ない拡散抵抗は各々のデ
キストローズ濃度で生ずるイソマルトースの低い
濃度であることが示された。 実施例 ３ GDEの粒径、及びグルコアミラーゼの量に対
するグルコアミラーゼの活性を比較するために固
定化されるグルコアミラーゼの量を変えて実施例
１と同様の方法でグルコアミラーゼの固定化をく
り返して行つた。 下記の表に報告されるデータは粒径及び酵素担
持量の効果はモデル系としてグルコアミラーゼを
用いる酵素担体複合体の活性にあることを示す。
ラーゼは粒状炭素に結合するグルコアミラーゼよ
りでん粉を完全に加水分解し得ることが測定でき
た。GDEに結合するグルコアミラーゼによつて
約96％の最大デキストローズが、そして炭素に結
合するグルコアミラーゼで約95％の量が達成され
た。増加したデキストローズ収率によりGDEに
結合したAGは立体障害が少ないが、または粒子
のより表面で結合し、基質が拡散抵抗が少なくな
ることが示され得る。他にGDEに結合するグル
コアミラーゼに関する少ない拡散抵抗は各々のデ
キストローズ濃度で生ずるイソマルトースの低い
濃度であることが示された。 実施例 ３ GDEの粒径、及びグルコアミラーゼの量に対
するグルコアミラーゼの活性を比較するために固
定化されるグルコアミラーゼの量を変えて実施例
１と同様の方法でグルコアミラーゼの固定化をく
り返して行つた。 下記の表に報告されるデータは粒径及び酵素担
持量の効果はモデル系としてグルコアミラーゼを
用いる酵素担体複合体の活性にあることを示す。
【表】
第表から担持量が増大するに従つて担持量ま
での活性は−16〜＋24メツシユの粒径に対しては
200単位／ml、そして−24〜＋48メツシユの粒径
に対しては300単位／mlに達し、次に活性は横ば
いになる。 実施例 ４ 大豆ベーターアミラーゼ［ハイ−マルトシン
（Hi−maltosin Ｓ）、ハンキユー・キヨーエイ・
ブツサン株式会社（Hankyu Kyoei Bussan
Co.，Ltd.）、大阪、日本］を固定化するために実
施例１のようなPEI−グルタルアルデヒド誘導体
化されたGDE（−24〜＋48メツシユGDEで製造）
100mlを用いた。誘導体化されたGDEを処理する
際に用いる酵素溶液はPH7.0の0.02Mリン酸塩緩
衝液500ml中の大豆ベーターアミラーゼ１ｇ
（40000単位／ｇ）であつた。固定化方法は実施例
１の通りに行つた。かくて得られた固定化ベータ
ーアミラーゼは担体１ml当り134単位で分析した
（PH5.5）。 高マルトースシロツプを生成させるための粒状
ケイソウ土固定化されたベーターアミラーゼの
使用 高マルトースシロツプを生成させるためにPH
5.0の0.05M酢酸塩溶液中の30％DSMaltrin−150
［グレイン・プロセツシング社（Grain
Processing Corp.）］各々50mlの試料をかくて得
られた種々の量の固定化ベーターアミラーゼを用
いて振盪フラスコ中にて50℃で24時間消化した。
生成物をHPLCにより炭水化物組成に対して分析
した。結果を次の表に示す。
での活性は−16〜＋24メツシユの粒径に対しては
200単位／ml、そして−24〜＋48メツシユの粒径
に対しては300単位／mlに達し、次に活性は横ば
いになる。 実施例 ４ 大豆ベーターアミラーゼ［ハイ−マルトシン
（Hi−maltosin Ｓ）、ハンキユー・キヨーエイ・
ブツサン株式会社（Hankyu Kyoei Bussan
Co.，Ltd.）、大阪、日本］を固定化するために実
施例１のようなPEI−グルタルアルデヒド誘導体
化されたGDE（−24〜＋48メツシユGDEで製造）
100mlを用いた。誘導体化されたGDEを処理する
際に用いる酵素溶液はPH7.0の0.02Mリン酸塩緩
衝液500ml中の大豆ベーターアミラーゼ１ｇ
（40000単位／ｇ）であつた。固定化方法は実施例
１の通りに行つた。かくて得られた固定化ベータ
ーアミラーゼは担体１ml当り134単位で分析した
（PH5.5）。 高マルトースシロツプを生成させるための粒状
ケイソウ土固定化されたベーターアミラーゼの
使用 高マルトースシロツプを生成させるためにPH
5.0の0.05M酢酸塩溶液中の30％DSMaltrin−150
［グレイン・プロセツシング社（Grain
Processing Corp.）］各々50mlの試料をかくて得
られた種々の量の固定化ベーターアミラーゼを用
いて振盪フラスコ中にて50℃で24時間消化した。
生成物をHPLCにより炭水化物組成に対して分析
した。結果を次の表に示す。
【表】
第−Ａ表から約55％の最大デキストローズ量
を達成し得ることを求め得る。 粒状ケイソウ土固定化ベーターアミラーゼの熱
安定性 可溶性β−アミラーゼ、米国特許第4438196号
の実施例４により調製された炭素固定化β−アミ
ラーゼ、及び本発明で調製されたGDEに結合す
るβ−アミラーゼの熱安定性試験を基質を存在さ
せずに酢酸塩緩衝液（0.1M、PH5.5）中にて60℃
で行つた。結果を第−Ｂ表に示す。
を達成し得ることを求め得る。 粒状ケイソウ土固定化ベーターアミラーゼの熱
安定性 可溶性β−アミラーゼ、米国特許第4438196号
の実施例４により調製された炭素固定化β−アミ
ラーゼ、及び本発明で調製されたGDEに結合す
るβ−アミラーゼの熱安定性試験を基質を存在さ
せずに酢酸塩緩衝液（0.1M、PH5.5）中にて60℃
で行つた。結果を第−Ｂ表に示す。
【表】
GDEに結合するβ−アミラーゼの熱安定性は
激的に増大した。１時間後、GDE固定化酵素に
対して活性の本質的な損失は観察されなかつた
が、60％より少ない炭素固定化酵素活性及び20％
より少ない可溶性酵素活性が残留した。60℃で３
時間後でさえも45％より少ない炭素固定化酵素及
び５％より少ない可溶性酵素と比較してGDE固
定化β−アミラーゼの85％以上が活性のままであ
つた。 実施例 ５ 共固定化されたグルコアミラーゼ／プルラナー
ゼの製造 実施例１のように（−24〜＋48メツシユで製
造）誘導体化されたGDE100mlを固定化に用い
た。誘導体化されたGDEをグルコアミラーゼ
（Diazyme Ｌ−200、マイルズ・ラボラトリーズ
社）12000単位及びプルラナーゼ［Promozyme
200L、ノボ工業社（Novo Ind.， Inc.）］
12000単位を含むPH6.0緩衝溶液（0.1M酢酸塩）
500mlで処理し、これにより実施例１に記載の方
法で酵素を多孔性GDE担体上に共固定化させた。
かくて得られた共固定化グルコアミラーゼ−プル
ラナーゼ複合体を基質として１％（重量／容量）
を用いてグルコアミラーゼ活性54.5単位／ml及び
プルラナーゼ活性12.3単位／mlで分析した。 高デキストローズシロツプを生成させるための
共固定化グルコアミラーゼ／プルラナーゼの使
用 かくて調製された個々の量の共固定化グルコア
ミラーゼ−プルラナーゼ複合体を用いて振盪フラ
スコ中にてPH4.2の0.05M酢酸塩中で50℃で24時
間30％DS酵素消化されたトウモロコシでん粉
（40DE）の試料50mlを消化させることにより高デ
キストローズシロツプを調製した。炭水化物分布
を次の表に示す。
激的に増大した。１時間後、GDE固定化酵素に
対して活性の本質的な損失は観察されなかつた
が、60％より少ない炭素固定化酵素活性及び20％
より少ない可溶性酵素活性が残留した。60℃で３
時間後でさえも45％より少ない炭素固定化酵素及
び５％より少ない可溶性酵素と比較してGDE固
定化β−アミラーゼの85％以上が活性のままであ
つた。 実施例 ５ 共固定化されたグルコアミラーゼ／プルラナー
ゼの製造 実施例１のように（−24〜＋48メツシユで製
造）誘導体化されたGDE100mlを固定化に用い
た。誘導体化されたGDEをグルコアミラーゼ
（Diazyme Ｌ−200、マイルズ・ラボラトリーズ
社）12000単位及びプルラナーゼ［Promozyme
200L、ノボ工業社（Novo Ind.， Inc.）］
12000単位を含むPH6.0緩衝溶液（0.1M酢酸塩）
500mlで処理し、これにより実施例１に記載の方
法で酵素を多孔性GDE担体上に共固定化させた。
かくて得られた共固定化グルコアミラーゼ−プル
ラナーゼ複合体を基質として１％（重量／容量）
を用いてグルコアミラーゼ活性54.5単位／ml及び
プルラナーゼ活性12.3単位／mlで分析した。 高デキストローズシロツプを生成させるための
共固定化グルコアミラーゼ／プルラナーゼの使
用 かくて調製された個々の量の共固定化グルコア
ミラーゼ−プルラナーゼ複合体を用いて振盪フラ
スコ中にてPH4.2の0.05M酢酸塩中で50℃で24時
間30％DS酵素消化されたトウモロコシでん粉
（40DE）の試料50mlを消化させることにより高デ
キストローズシロツプを調製した。炭水化物分布
を次の表に示す。
【表】
かくて得られたシロツプは実施例１で得られた
ものよりグルコースが高く、そしてイソマルトー
スが低かつた。グルコアミラーゼ／プルラナーゼ
の組合せは理論的にグルコアミラーゼ及びプルラ
ナーゼの組合せの作用によりグルコアミラーゼ自
体とは異なつた加水分解特性を有している。 実施例 ６ 共固定化ベータ−アミラーゼ／プルラナーゼの
製造 実施例１のように誘導体化された多孔性GDE
（−24〜＋48メツシユGDEで製造）100mlを固定
化して用いた。PH5.5の0.005M酢酸塩緩衝液中で
ベータ−アミラーゼ（Hi−Maltorin Ｓ）１ｇ及
びプルラナーゼ［Pulluzyme 750L、ABMケミ
カルズ・リミテツド・オブ・ウツドレー・ストツ
クポート・シエシアイアー（ABM Chemicals
Limited of Woodley Stockport Cheshire）、イ
ギリス］20mlを混合することにより溶液を調製し
た。次にベータ−アミラーゼ及びプルラナーゼを
実施例１に示す方法により多孔性GDEに共固定
化した。 高マルトースシロツプを生成させるための粒状
ケイソウ土共固定化ベータ−アミラーゼ／プル
ラナーゼの使用 かくして調製された種々の量の共固定化ベータ
−アミラーゼ／プルラナーゼを用いて振盪フラス
コ中にてPH5.5の0.05M酢酸塩中で50℃で24時間
30％DS Maltorin−150の試料50mlを加水分解す
ることにより高マルトースシロツプを生成させ
た。 生成物のHPLC糖分布を次の表に示す。
ものよりグルコースが高く、そしてイソマルトー
スが低かつた。グルコアミラーゼ／プルラナーゼ
の組合せは理論的にグルコアミラーゼ及びプルラ
ナーゼの組合せの作用によりグルコアミラーゼ自
体とは異なつた加水分解特性を有している。 実施例 ６ 共固定化ベータ−アミラーゼ／プルラナーゼの
製造 実施例１のように誘導体化された多孔性GDE
（−24〜＋48メツシユGDEで製造）100mlを固定
化して用いた。PH5.5の0.005M酢酸塩緩衝液中で
ベータ−アミラーゼ（Hi−Maltorin Ｓ）１ｇ及
びプルラナーゼ［Pulluzyme 750L、ABMケミ
カルズ・リミテツド・オブ・ウツドレー・ストツ
クポート・シエシアイアー（ABM Chemicals
Limited of Woodley Stockport Cheshire）、イ
ギリス］20mlを混合することにより溶液を調製し
た。次にベータ−アミラーゼ及びプルラナーゼを
実施例１に示す方法により多孔性GDEに共固定
化した。 高マルトースシロツプを生成させるための粒状
ケイソウ土共固定化ベータ−アミラーゼ／プル
ラナーゼの使用 かくして調製された種々の量の共固定化ベータ
−アミラーゼ／プルラナーゼを用いて振盪フラス
コ中にてPH5.5の0.05M酢酸塩中で50℃で24時間
30％DS Maltorin−150の試料50mlを加水分解す
ることにより高マルトースシロツプを生成させ
た。 生成物のHPLC糖分布を次の表に示す。
【表】
この結果、共固定化ベータ−アミラーゼ／プル
ラナーゼにより調製された高マルトースシロツプ
の組成物は固定化ベータ−アミラーゼのみにより
生成されたもの（実施例４）より良好であり、即
ちマルトースが高く、そして高分子量糖が少な
い。実施例５のように、このことは理論的にベー
タ−アミラーゼ及びプルラナーゼの組合わさつた
作用によるものである。 実施例 ７ 実施例１のようにプルラナーゼ
（Pulluzyme750L）を固定化するためにPEI−グ
ルタルアルデヒド誘導体化されたGDE（−24〜＋
48メツシユGDEで製造）100mlを用いた。固定化
方法は実施例１のように行つた。かくて得られた
固定化されたプルラナーゼを担体１ml当り32単位
で分析した（PH6.0）。 固定化プルラナーゼの熱安定性 可溶性プルラナーゼ及びかくて調製された
GDEに結合するプルラナーゼの熱安定性試験を
基質を存在させずに60℃及びPH6.0（0.1M酢酸塩）
で行つた。結果を第表に示す。
ラナーゼにより調製された高マルトースシロツプ
の組成物は固定化ベータ−アミラーゼのみにより
生成されたもの（実施例４）より良好であり、即
ちマルトースが高く、そして高分子量糖が少な
い。実施例５のように、このことは理論的にベー
タ−アミラーゼ及びプルラナーゼの組合わさつた
作用によるものである。 実施例 ７ 実施例１のようにプルラナーゼ
（Pulluzyme750L）を固定化するためにPEI−グ
ルタルアルデヒド誘導体化されたGDE（−24〜＋
48メツシユGDEで製造）100mlを用いた。固定化
方法は実施例１のように行つた。かくて得られた
固定化されたプルラナーゼを担体１ml当り32単位
で分析した（PH6.0）。 固定化プルラナーゼの熱安定性 可溶性プルラナーゼ及びかくて調製された
GDEに結合するプルラナーゼの熱安定性試験を
基質を存在させずに60℃及びPH6.0（0.1M酢酸塩）
で行つた。結果を第表に示す。
【表】
第表に見られるように、固定化プルラナーゼ
は可溶性酵素よりもかなり熱的に安定であつた。
0.5時間後に、GDE固定化プルラナーゼはまだ50
％以上の活性を保持し、その際に可溶性プルラナ
ーゼは既に20％以下の活性であつた。２時間まで
に、GDE固定化プルラナーゼはまだ約42％の活
性を保持するが、可溶性プルラナーゼは既に０％
活性に降下していた。 実施例 ８ 固定化プルラナーゼの調製 実施例１のようにラクターゼを固定化するため
にPEI−グルタルアルデヒド誘導体化されたGDE
（−24〜＋48メツシユで製造）100mlを用いた。イ
ネ（A.oryzae）からのラクターゼ１ｇ（20000単
位）を0.02Mリン酸ナトリウム緩衝溶液（PH7.0）
500mlに溶解させ、そして実施例１に与える方法
と同様にGDEに固定した。基質として５％（重
量／容量）ラクトースを用いてラクターゼ活性を
50℃及びPH4.5で分析した。放出されるグルコー
スをグルコストレート法により求めた。ラクター
ゼ活性１単位は50℃及びPH4.5で１分間当り
1μmolのグルコースを生成させる酵素の量として
定義される。かくて得られた固定化ラクターゼを
担体１ml当り106.7単位で分析した。 ラクトースを加水分解するための粒状ケイソウ
土固定化ラクターゼの使用 GDEに結合する固定化ラクターゼを用いる15
％（重量／容量）ラクトース（0.05M酢酸ナトリ
ウムPH4.5）の試料50mlの加水分解を振盪フラス
コ中にて50℃で24時間行つた。加水分解された生
成物のHPLC糖分布を次の表に示す。
は可溶性酵素よりもかなり熱的に安定であつた。
0.5時間後に、GDE固定化プルラナーゼはまだ50
％以上の活性を保持し、その際に可溶性プルラナ
ーゼは既に20％以下の活性であつた。２時間まで
に、GDE固定化プルラナーゼはまだ約42％の活
性を保持するが、可溶性プルラナーゼは既に０％
活性に降下していた。 実施例 ８ 固定化プルラナーゼの調製 実施例１のようにラクターゼを固定化するため
にPEI−グルタルアルデヒド誘導体化されたGDE
（−24〜＋48メツシユで製造）100mlを用いた。イ
ネ（A.oryzae）からのラクターゼ１ｇ（20000単
位）を0.02Mリン酸ナトリウム緩衝溶液（PH7.0）
500mlに溶解させ、そして実施例１に与える方法
と同様にGDEに固定した。基質として５％（重
量／容量）ラクトースを用いてラクターゼ活性を
50℃及びPH4.5で分析した。放出されるグルコー
スをグルコストレート法により求めた。ラクター
ゼ活性１単位は50℃及びPH4.5で１分間当り
1μmolのグルコースを生成させる酵素の量として
定義される。かくて得られた固定化ラクターゼを
担体１ml当り106.7単位で分析した。 ラクトースを加水分解するための粒状ケイソウ
土固定化ラクターゼの使用 GDEに結合する固定化ラクターゼを用いる15
％（重量／容量）ラクトース（0.05M酢酸ナトリ
ウムPH4.5）の試料50mlの加水分解を振盪フラス
コ中にて50℃で24時間行つた。加水分解された生
成物のHPLC糖分布を次の表に示す。
【表】
ラクトース加水分解の度合は97％以上であり、
GDEに結合する固定化ラクターゼはある程度活
性であることが示された。 固定化ラクターゼの熱安定性 可溶性ラクターゼ及びかくて調製された多孔性
GDEに結合するラクターゼの熱安定性試験を基
質を存在させずに60℃及びPH4.5（0.1M酢酸ナト
リウム）で行つた。結果を第−Ｂ表に示す。
GDEに結合する固定化ラクターゼはある程度活
性であることが示された。 固定化ラクターゼの熱安定性 可溶性ラクターゼ及びかくて調製された多孔性
GDEに結合するラクターゼの熱安定性試験を基
質を存在させずに60℃及びPH4.5（0.1M酢酸ナト
リウム）で行つた。結果を第−Ｂ表に示す。
【表】
実施例 ９
固定化トランスグルコシダーゼの調製
実施例１のようにトランスグルコシダーゼを固
定化するためにPEI−グルタルアルデヒド誘導体
化されたGDE（−24〜＋48メツシユで製造）100
mlを用いた。アオカビ（Talaromyces duponti）
からの精製された熱安定性トランスグルコシダー
ゼ500単位を含むPH5.5の0.05M酢酸500mlを用い
た。実施例１に与えられる方法と同様に固定化を
行つた。かくて得られた固定化トランスグルコシ
ダーゼを担体１ml当り2.6単位で分析した。トラ
ンスグルコース性生成物、即ちPH4.5及び60℃で
の酵素及びマルトースの培養混合物中のパノース
の液体クロマトグラフイー定量測定によりトラン
スグルコシダーゼ活性を分析した。トランスグル
コシダーゼ活性の１単位は20％マルトース溶液か
らPH4.5及び60℃で１時間当り1μmolのパノース
を生成する酵素の量とし定義される。 非発酵糖を生成させるための粒状ケイソウ土固
定化トランスグルコシダーゼの使用 かくて調製された固定化トランスグルコシダー
ゼ10mlを用いて30％DSマルトース溶液PH4.5，
0.05M酢酸塩）50mlを振盪フラスコ中にて60℃で
５日間消化することにより非発酵糖（主にパノー
ス及びイソマルトース）を生成させた。生成物の
GC分析により次の糖分布が示された：グルコー
ス28.3％、マルトース34.8％、イソマルトース7.4
％、パノース22.1％及び高級糖7.5％、本実施例
で生成される非発酵糖（α1〜６結合）の全量は
約37％であつた。
定化するためにPEI−グルタルアルデヒド誘導体
化されたGDE（−24〜＋48メツシユで製造）100
mlを用いた。アオカビ（Talaromyces duponti）
からの精製された熱安定性トランスグルコシダー
ゼ500単位を含むPH5.5の0.05M酢酸500mlを用い
た。実施例１に与えられる方法と同様に固定化を
行つた。かくて得られた固定化トランスグルコシ
ダーゼを担体１ml当り2.6単位で分析した。トラ
ンスグルコース性生成物、即ちPH4.5及び60℃で
の酵素及びマルトースの培養混合物中のパノース
の液体クロマトグラフイー定量測定によりトラン
スグルコシダーゼ活性を分析した。トランスグル
コシダーゼ活性の１単位は20％マルトース溶液か
らPH4.5及び60℃で１時間当り1μmolのパノース
を生成する酵素の量とし定義される。 非発酵糖を生成させるための粒状ケイソウ土固
定化トランスグルコシダーゼの使用 かくて調製された固定化トランスグルコシダー
ゼ10mlを用いて30％DSマルトース溶液PH4.5，
0.05M酢酸塩）50mlを振盪フラスコ中にて60℃で
５日間消化することにより非発酵糖（主にパノー
ス及びイソマルトース）を生成させた。生成物の
GC分析により次の糖分布が示された：グルコー
ス28.3％、マルトース34.8％、イソマルトース7.4
％、パノース22.1％及び高級糖7.5％、本実施例
で生成される非発酵糖（α1〜６結合）の全量は
約37％であつた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 糖類を基質とする酵素の固定化酵素複合体の
製造方法において、 ａ 多孔性、粒状ケイソウ土担体を側基状アミン
基を有するポリアミン化合物の溶液と接触させ
てポリアミンをケイソウ土に結合させる工程； ｂ 溶媒及びそれに分散している未結合のポリア
ミンを接触するケイソウ土から除去して、そし
てかくて処理されたケイソウ土担体を多管能性
アルデヒドの溶液と接触させてアルデヒド基の
一つを該側基状アミン基と反応させて、且つ更
に反応に利用できるアルデヒド基を残留させる
工程、及び； ｃ 溶媒及びそれに溶解している未反応の多管能
性アルデヒドを接触するケイソウ土担体から除
去し、そして該担体を少なくとも１つの固定化
される酵素の溶液と接触させ、酵素のアミン基
と該未反応のアルデヒド基とを反応させて両者
間の共有結合を生成させ、それにより酵素を固
定化する工程からなる、ことを特徴とする方
法。 ２ ポリアミンをポリエチレンジアミン、ポリエ
チレンイミン、ポリヘキサメチレンジアミン、ポ
リメチレンジシクロヘキシルアミン、ポリメチレ
ンジアニリン、ポリテトラエチレンペンタミン、
ポリフエニレンジアミン、並びにエポハロヒドリ
ン及びポリアミンの共重合体よりなる群から選
ぶ、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ ポリエチレンイミンがポリジエチレントリア
ミン、ポリトリエチレンテトラミン、ポリペンタ
エチレン−ヘキサミンまたはポリヘキサメチレン
ジアミンである、特許請求の範囲第２項記載の方
法。 ４ ポリアミンが500〜100000の分子量範囲を有
する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 多管能性アルデヒドがグルタルアルデヒドで
ある、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ６ 酵素がグルコアミラーゼ、ベーターアミラー
ゼ、プルラナーゼ、トランスグルコシダーゼ、ラ
クターゼ、ヘキソキナーゼ、グルコースイソメラ
ーゼ、インベルターゼ、アルフアアミラーゼまた
はグルコースオキシターゼである、特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ７ ケイソウ土担体が米国ふるい系上で約−16〜
＋48メツシユの粒径、半径35〜1000Åの細孔径、
及び20〜60m2／ｇの表面積を有する、特許請求の
範囲第６項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US779053 | 1985-09-23 | ||
| US06/779,053 US4713333A (en) | 1985-09-23 | 1985-09-23 | Immobilization of biocatalysts on granular diatomaceous earth |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6274286A JPS6274286A (ja) | 1987-04-06 |
| JPH0338B2 true JPH0338B2 (ja) | 1991-01-07 |
Family
ID=25115177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61217339A Granted JPS6274286A (ja) | 1985-09-23 | 1986-09-17 | 粒状ケイソウ土を担体とする粒状固定化酵素複合体の製造方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4713333A (ja) |
| EP (1) | EP0216272B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6274286A (ja) |
| CN (1) | CN1008536B (ja) |
| DE (1) | DE3688493T2 (ja) |
| DK (2) | DK172669B1 (ja) |
| FI (1) | FI92074C (ja) |
| MX (1) | MX163680B (ja) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4713333A (en) * | 1985-09-23 | 1987-12-15 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of biocatalysts on granular diatomaceous earth |
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