JPH0685716B2 - 固定化酵素 - Google Patents
固定化酵素Info
- Publication number
- JPH0685716B2 JPH0685716B2 JP27469885A JP27469885A JPH0685716B2 JP H0685716 B2 JPH0685716 B2 JP H0685716B2 JP 27469885 A JP27469885 A JP 27469885A JP 27469885 A JP27469885 A JP 27469885A JP H0685716 B2 JPH0685716 B2 JP H0685716B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- amylase
- immobilized enzyme
- immobilized
- maltotetraose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 「技術分野」 本発明は、マルトテトラオースを生産する際に用いる固
定化酵素に関する。
定化酵素に関する。
「従来技術およびその問題点」 マルトテトラオースは、現在臨床診断薬としてヒト血清
中並びに尿中のα−アミラーゼ活性測定用基質として用
いられている。また、砂糖の1/5以下の甘味度を有し、
低粘度で、保湿性、難老化性にも優れているため、各種
澱粉質食品の物性改良剤としての用途、消化吸収性も良
いことから病人の流動食、カロリー補給剤としての用
途、さらに酒類に添加してマイルド感を付与するため、
ウイスキーやワイン等の酒類のボディ補強剤としての用
途が検討されている。
中並びに尿中のα−アミラーゼ活性測定用基質として用
いられている。また、砂糖の1/5以下の甘味度を有し、
低粘度で、保湿性、難老化性にも優れているため、各種
澱粉質食品の物性改良剤としての用途、消化吸収性も良
いことから病人の流動食、カロリー補給剤としての用
途、さらに酒類に添加してマイルド感を付与するため、
ウイスキーやワイン等の酒類のボディ補強剤としての用
途が検討されている。
マルトテトラオースの生産に関して、シュードモナス・
シュトッツェリ菌の生産する菌体外マルトテトラオース
生成アミラーゼ（以下、G4−アミラーゼと略称する）が
澱粉またはアミロースに作用してマルトテトラオースを
生成することは古くから知られている（J.F.Robyt and
R.J.Ackerman,Arch.Biochem.Biophys.,145.105.197
1）。
シュトッツェリ菌の生産する菌体外マルトテトラオース
生成アミラーゼ（以下、G4−アミラーゼと略称する）が
澱粉またはアミロースに作用してマルトテトラオースを
生成することは古くから知られている（J.F.Robyt and
R.J.Ackerman,Arch.Biochem.Biophys.,145.105.197
1）。
G4−アミラーゼは、一般の市販アミラーゼに比べて生産
性が低く、この酵素を用いて回分法によりマルトテトラ
オースを生産する場合、酵素コストの占める割合が高く
なることが予想される。このため、現在、マルトテトラ
オースは試薬グレード品が少量生産されているに過ぎな
い。したがって、G4−アミラーゼを用いてマルトテトラ
オースを生産する場合には、G4−アミラーゼを効率的に
使用することが重要になり、その一つの手段としてG4−
アミラーゼを固定化して使用することが考えられる。
性が低く、この酵素を用いて回分法によりマルトテトラ
オースを生産する場合、酵素コストの占める割合が高く
なることが予想される。このため、現在、マルトテトラ
オースは試薬グレード品が少量生産されているに過ぎな
い。したがって、G4−アミラーゼを用いてマルトテトラ
オースを生産する場合には、G4−アミラーゼを効率的に
使用することが重要になり、その一つの手段としてG4−
アミラーゼを固定化して使用することが考えられる。
これまで、マルトトリオース以上の重合度を有するマル
トオリゴ等を生産するアミラーゼの固定化例としては、
マルトヘキサオース生成アミラーゼをポリアクリルアミ
ドに放射線重合法によって包括固定化する方法（T.Naka
kuki et al.Biotechnol.Bioeng.25,1095,1983）が知ら
れているに過ぎない。しかし、この方法は、酵素の固定
化率は高いが、大量生産が困難であり、かつ、固定化酵
素の重量あたりの活性が低いという欠点を有している。
トオリゴ等を生産するアミラーゼの固定化例としては、
マルトヘキサオース生成アミラーゼをポリアクリルアミ
ドに放射線重合法によって包括固定化する方法（T.Naka
kuki et al.Biotechnol.Bioeng.25,1095,1983）が知ら
れているに過ぎない。しかし、この方法は、酵素の固定
化率は高いが、大量生産が困難であり、かつ、固定化酵
素の重量あたりの活性が低いという欠点を有している。
「発明の目的」 本発明の目的は、G4−アミラーゼを簡単に効率良く固定
化することができ、かつ、固定化酵素の重量あたりの活
性も工業的に充分な値を有し、長時間にわたって活性が
保持されるようにした固定化酵素を提供することにあ
る。
化することができ、かつ、固定化酵素の重量あたりの活
性も工業的に充分な値を有し、長時間にわたって活性が
保持されるようにした固定化酵素を提供することにあ
る。
「発明の構成」 本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結
果、G4−アミラーゼを特定の担体に固定化することによ
り、優れた固定化酵素が得られることを見出し、本発明
を完成するに至った。
果、G4−アミラーゼを特定の担体に固定化することによ
り、優れた固定化酵素が得られることを見出し、本発明
を完成するに至った。
すなわち、本発明の固定化酵素は、マルトテトラオース
生成アミラーゼをオキシシラン−アクリルビーズに固定
化したことを特徴とする。
生成アミラーゼをオキシシラン−アクリルビーズに固定
化したことを特徴とする。
以下、本発明をより具体的に説明する。
本発明で使用するG4−アミラーゼは、シュードモナス・
シュトッツェリ（Pseudomonas stutzeri）菌（NRRL B 3
389保存菌株）を用い、可溶性澱粉等を含有する液体培
地にて培養し、その培養液から各種の方法で分離するこ
とができる。なお、本発明において、酵素活性は、可溶
性澱粉を基質としてPH8.0、30℃の反応条件で１分間に
１μmoleのグルコシド結合を切断する酵素量を１単位
（IU.国際単位）として表わすことにする。
シュトッツェリ（Pseudomonas stutzeri）菌（NRRL B 3
389保存菌株）を用い、可溶性澱粉等を含有する液体培
地にて培養し、その培養液から各種の方法で分離するこ
とができる。なお、本発明において、酵素活性は、可溶
性澱粉を基質としてPH8.0、30℃の反応条件で１分間に
１μmoleのグルコシド結合を切断する酵素量を１単位
（IU.国際単位）として表わすことにする。
本発明においては、上記酵素を固定化するための担体と
して、ポリアクリルアミドにエポキシ基を付与した材質
からなる多孔質のビーズであるオキシラン−アクリルビ
ーズを用いる。このオキシラン−アクリルビーズとして
は、例えば「オイパーギットＣ」（商品名、ローム・フ
ァーマ社製、フナコシ薬品（株）販売）を用いることが
できる。このビーズは、親水性でマトリックス構造をと
っており、PH2〜９で安定である。このビーズは、通常
の固定化用担体（例えば各種吸着樹脂やイオン交換樹脂
など）と比較して、酵素蛋白との結合力が強く、機械的
強度が高く、化学的安定性にも優れている。なお、この
オキシラン−アクリルビーズは、孔径0.1〜３μｍ、粒
径100〜200μｍであるが、本発明において、孔径および
粒径は特に限定されるものではない。
して、ポリアクリルアミドにエポキシ基を付与した材質
からなる多孔質のビーズであるオキシラン−アクリルビ
ーズを用いる。このオキシラン−アクリルビーズとして
は、例えば「オイパーギットＣ」（商品名、ローム・フ
ァーマ社製、フナコシ薬品（株）販売）を用いることが
できる。このビーズは、親水性でマトリックス構造をと
っており、PH2〜９で安定である。このビーズは、通常
の固定化用担体（例えば各種吸着樹脂やイオン交換樹脂
など）と比較して、酵素蛋白との結合力が強く、機械的
強度が高く、化学的安定性にも優れている。なお、この
オキシラン−アクリルビーズは、孔径0.1〜３μｍ、粒
径100〜200μｍであるが、本発明において、孔径および
粒径は特に限定されるものではない。
G4−アミラーゼをオキシラン−アクリルビーズに吸着固
定化する方法は、緩衝液中にて両者を接触させる方法が
採用できる。例えばオキシラン−アクリルビーズ20mgを
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で充分に平衡化した後、G4
−アミラーゼ（比活性65単位/mg蛋白）100〜1200単位を
同緩衝液1mlに溶解して添加し、充分に混合する。次
に、室温で0.5〜48時間放置した後、ガラスフィルター
でろ過し、続いて1M NaCl水溶液50mlと、5mMとなるよう
にCaCl2を溶解した20mM Tris-HCl緩衝液（PH7.5）50ml
で洗浄することにより、本発明の固定化酵素を得ること
ができる。
定化する方法は、緩衝液中にて両者を接触させる方法が
採用できる。例えばオキシラン−アクリルビーズ20mgを
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で充分に平衡化した後、G4
−アミラーゼ（比活性65単位/mg蛋白）100〜1200単位を
同緩衝液1mlに溶解して添加し、充分に混合する。次
に、室温で0.5〜48時間放置した後、ガラスフィルター
でろ過し、続いて1M NaCl水溶液50mlと、5mMとなるよう
にCaCl2を溶解した20mM Tris-HCl緩衝液（PH7.5）50ml
で洗浄することにより、本発明の固定化酵素を得ること
ができる。
上記のような方法で得られた本発明の固定化酵素の見か
け上の固定化率は50〜80％であり、固定化酵素の発現活
性は担体湿潤重量1g当り50〜300単位であった。なお、
見かけ上の固定化率は、次式で算出した値である。
け上の固定化率は50〜80％であり、固定化酵素の発現活
性は担体湿潤重量1g当り50〜300単位であった。なお、
見かけ上の固定化率は、次式で算出した値である。
なお、酵素の添加量は、蛋白量として、担体重量1gに対
し約10〜1000mgが適当であり、さらには担体重量1gに対
し50〜150mgが好ましい。また、酵素の固定化方法は、
担体と酵素溶液とを混合した後、上記のように静置して
もよいが、攪拌あるいは振とうしながら行なってもよ
い。さらに、担体をカラムに充填し、酵素溶液を下降法
または上昇法で通液しても良い。固定化をバッチ法で行
なう場合、接触時間は0.5〜48時間程度が適当である
が、好ましくは１〜24時間がよい。
し約10〜1000mgが適当であり、さらには担体重量1gに対
し50〜150mgが好ましい。また、酵素の固定化方法は、
担体と酵素溶液とを混合した後、上記のように静置して
もよいが、攪拌あるいは振とうしながら行なってもよ
い。さらに、担体をカラムに充填し、酵素溶液を下降法
または上昇法で通液しても良い。固定化をバッチ法で行
なう場合、接触時間は0.5〜48時間程度が適当である
が、好ましくは１〜24時間がよい。
このように、本発明の固定化酵素は、担体への酵素の固
定化が極めて容易であり、かつ、発現活性も充分実用に
耐えるものである。
定化が極めて容易であり、かつ、発現活性も充分実用に
耐えるものである。
本発明の固定化酵素を用いてマルトテトラオースを生産
する場合には、回分式またはカラム充填方式いずれによ
っても可能であるが、好ましくはカラム充填方式が採用
される。
する場合には、回分式またはカラム充填方式いずれによ
っても可能であるが、好ましくはカラム充填方式が採用
される。
「発明の実施例」 可溶性澱粉（メルク社製）１重量％、トリプトン（Difc
o社製）１重量％、酵母エキス（Difco社製）0.5重量
％、K2HPO40.28重量％、KH2PO40.10重量％を含有する液
体培地（PH7.0）20に、シュードモナス・シュトッツ
ェリ（Pseudomonas stutzeri）菌（NRRL B 3389保存菌
株）を種菌し、ジャーファーメンター（30）で30℃で
48時間培養した。培養後、遠心分離機により除菌し、培
養上清を得た。そして、この培養上清からG4−アミラー
ゼをコーンスターチを用いた澱粉吸着法（S.Kobayashi
et al.Carbohydr.Res.61 229-238,1978）により回収
し、凍結乾燥により粉末化した。この粉末酵素の活性
は、５×104IU（国際単位）/gであった。
o社製）１重量％、酵母エキス（Difco社製）0.5重量
％、K2HPO40.28重量％、KH2PO40.10重量％を含有する液
体培地（PH7.0）20に、シュードモナス・シュトッツ
ェリ（Pseudomonas stutzeri）菌（NRRL B 3389保存菌
株）を種菌し、ジャーファーメンター（30）で30℃で
48時間培養した。培養後、遠心分離機により除菌し、培
養上清を得た。そして、この培養上清からG4−アミラー
ゼをコーンスターチを用いた澱粉吸着法（S.Kobayashi
et al.Carbohydr.Res.61 229-238,1978）により回収
し、凍結乾燥により粉末化した。この粉末酵素の活性
は、５×104IU（国際単位）/gであった。
オキシラン−アクリルビーズ「オイパーギットＣ」（商
品名、ローム・ファーマ社製、フナコシ薬品（株）販
売）5gを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で充分に平衡化
し、さらに同緩衝液50mlに溶解したG4−アミラーゼ（５
×104単位）を添加して混合した後、室温にて24時間放
置した。次いで、ガラスフィルターでろ別した後、1M N
aCl水溶液と、5mMとなるようにCaCl2を溶解した20mMTri
s-HCl緩衝液（PH7.5）とで洗浄し、本発明の固定化酵素
を得た。この固定化酵素の見かけ上の固定化率は50％で
あり、発現活性は固定化酵素湿潤重量1g当り300単位で
あった。
品名、ローム・ファーマ社製、フナコシ薬品（株）販
売）5gを0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）で充分に平衡化
し、さらに同緩衝液50mlに溶解したG4−アミラーゼ（５
×104単位）を添加して混合した後、室温にて24時間放
置した。次いで、ガラスフィルターでろ別した後、1M N
aCl水溶液と、5mMとなるようにCaCl2を溶解した20mMTri
s-HCl緩衝液（PH7.5）とで洗浄し、本発明の固定化酵素
を得た。この固定化酵素の見かけ上の固定化率は50％で
あり、発現活性は固定化酵素湿潤重量1g当り300単位で
あった。
この固定化酵素と可溶性酵素のPH安定性を測定した結果
を第１図に示す。また、この固定化酵素と可溶性酵素の
温度安定性を測定した結果を第２図に示す。第１図およ
び第２図中、□−□は固定化酵素であり、●−●は可溶
性酵素である。第１図に示すように、固定化酵素におい
ては、可溶性酵素に比べて、酸性側およびアルカリ側に
PH安定領域が増加した。また、第２図に示すように、固
定化酵素においては、可溶性酵素に比べて温度安定性も
約10℃増加した。なお、固定化酵素は、可溶性酵素と比
べて至適PHおよび至適温度はほとんど変化しなかった。
を第１図に示す。また、この固定化酵素と可溶性酵素の
温度安定性を測定した結果を第２図に示す。第１図およ
び第２図中、□−□は固定化酵素であり、●−●は可溶
性酵素である。第１図に示すように、固定化酵素におい
ては、可溶性酵素に比べて、酸性側およびアルカリ側に
PH安定領域が増加した。また、第２図に示すように、固
定化酵素においては、可溶性酵素に比べて温度安定性も
約10℃増加した。なお、固定化酵素は、可溶性酵素と比
べて至適PHおよび至適温度はほとんど変化しなかった。
この固定化酵素を内径0.5cm、外径12cmのカラムに2ml充
填し、45℃、流速35ml/hr（SV＝17.5）の条件で0.5％
（W/V）の可溶性澱粉（PH8.0）を連続通液し、酵素の相
対活性の変動を測定した。その結果を第３図に示す。相
対活性が50％になる時間を半減期とすると、半減期は10
0日以上となった。また、生成物をペーパークロマトグ
ラフィによって確認したところ、マルトテトラオースの
スポットと、ペーパークロマトグラムの原点に残る高分
子デキストリンのスポットのみが観察された。
填し、45℃、流速35ml/hr（SV＝17.5）の条件で0.5％
（W/V）の可溶性澱粉（PH8.0）を連続通液し、酵素の相
対活性の変動を測定した。その結果を第３図に示す。相
対活性が50％になる時間を半減期とすると、半減期は10
0日以上となった。また、生成物をペーパークロマトグ
ラフィによって確認したところ、マルトテトラオースの
スポットと、ペーパークロマトグラムの原点に残る高分
子デキストリンのスポットのみが観察された。
「発明の効果」 以上説明したように、本発明によれば、G4−アミラーゼ
をオキシラン−アクリルビーズに固定化したことによ
り、酵素活性を低下させずに、酵素の安定性を向上させ
ることができ、マルトテトラオースの工業的な生産が可
能となる。また、酵素の固定化方法が簡単であり、固定
化酵素の大量生産も容易である。
をオキシラン−アクリルビーズに固定化したことによ
り、酵素活性を低下させずに、酵素の安定性を向上させ
ることができ、マルトテトラオースの工業的な生産が可
能となる。また、酵素の固定化方法が簡単であり、固定
化酵素の大量生産も容易である。
第１図は固定化酵素と可溶性酵素のPH安定性を比較して
示す図表、第２図は固定化酵素と可溶性酵素の温度安定
性を比較して示す図表、第３図はフローリアクターによ
る固定化酵素の安定性を示す図表である。
示す図表、第２図は固定化酵素と可溶性酵素の温度安定
性を比較して示す図表、第３図はフローリアクターによ
る固定化酵素の安定性を示す図表である。
Claims (1)
- 【請求項１】マルトテトラオース生成アミラーゼを、ポ
リアクリルアミドにエポキシ基を付与した材質からなる
多孔質のビーズであるオキシラン−アクリルビーズに固
定化したことを特徴とする固定化酵素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27469885A JPH0685716B2 (ja) | 1985-12-06 | 1985-12-06 | 固定化酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27469885A JPH0685716B2 (ja) | 1985-12-06 | 1985-12-06 | 固定化酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62134088A JPS62134088A (ja) | 1987-06-17 |
| JPH0685716B2 true JPH0685716B2 (ja) | 1994-11-02 |
Family
ID=17545316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27469885A Expired - Lifetime JPH0685716B2 (ja) | 1985-12-06 | 1985-12-06 | 固定化酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0685716B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2660836B2 (ja) * | 1987-07-08 | 1997-10-08 | 株式会社 林原生物化学研究所 | マルトテトラオース生成アミラーゼ活性を有するポリペプチドとその用途 |
| DE69514056T2 (de) * | 1994-03-29 | 2000-06-08 | Citizen Watch Co., Ltd. | Stromversorgungsgerät für elektrische apparate |
-
1985
- 1985-12-06 JP JP27469885A patent/JPH0685716B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62134088A (ja) | 1987-06-17 |
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