JPH0339080B2 - - Google Patents
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- JPH0339080B2 JPH0339080B2 JP58115753A JP11575383A JPH0339080B2 JP H0339080 B2 JPH0339080 B2 JP H0339080B2 JP 58115753 A JP58115753 A JP 58115753A JP 11575383 A JP11575383 A JP 11575383A JP H0339080 B2 JPH0339080 B2 JP H0339080B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は血液分別法、更に詳しく言えば血液凝
固因子：Ｃの製造方法に関する。 血液凝固の過程は正常全血の中に見出される多
数の物質を含む複雑な生理学的活動である。血液
凝固機構と関連したある種の因子がある個人では
ひどく欠乏していることが知られている。このよ
うに、古典的血友病に罹つている患者において
は、抗血友病因子Ａ（AHF，因子）が欠乏して
いる。血友病Ｂに罹つている患者においては血漿
トロンボプラスチン成分（PTC、因子）が血
液から欠けている。血友病の小百分率もまた因子
の不可欠成分であるいわゆるホン・ビレブラン
ド因子を欠いている。 血漿因子は明らかに異なる機能、生化学的お
よび免疫学的性質、および発生学的調節を有する
二つの成分の複合体であるということが現在一般
に認識されている。因子複合体の一成分は抗血
友病因子前凝固剤活性を有し、通常は因子：Ｃ
と称される。他の大きい方の成分は大部分タンパ
ク質集団からなり、第一次の止血を増進する仕方
で血小板と相互作用し、そして通常は因子Ｒ
（リストセチン補足因子またはホン・ビレブラン
ド抗原）と呼ばれる。 Ｘ−クロモソーム遺伝により伝達された因子
：Ｃ欠乏を有する患者（血友病Ａ患者）は正常
な因子Ｒ合成と機能を有する。従つて、このよ
うな患者は止血の維持のために因子Ｒの外因的
投与を必要とせず、因子Ｒを含まない因子：
Ｃの濃縮物が十分であり、ある場合には好ましく
さえある。 因子複合体およびその二つの成分の構造と機
能に関する更に詳しく背景の情報は次の三つの最
近の概観記事、それぞれホイヤー（Hoyer）、J.
Amer.Soc.of Hematol.58(1)，１−13（1981）、ハ
リス（Harris）等、Biochem.Biophys.Acta
668，456−470（1981）、およびフアルチヤー
（Fulcher）等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，
1648−1652（1982）を参照すれば得られる。 因子濃縮物の臨床的重要性およびその十分な
供給源に対する重大な要望はこのような血液画分
の改良製造法を開発する動機を与えた。従来の低
温で行なわねばならない血液分別のコーン
（Cohn）アルコール法に代わるものとして、普通
の室温（とり巻いている温度）で使用できる分別
剤を使用する種々な他の方法が開発された。一つ
のこのような方法は、例えば米国特許第3631018
号、第3652530号、および第3682881号明細書に記
載の通り、重合体ポリエチレングリコール
（PEG）を用いている。しかし、これら特許に記
載された研究方法論は、更に冷却沈殿工程を使用
しており、これは低温装置の使用を必要としまた
因子の活性の実質量を失なう結果ともなつてい
る。 これらPEG／冷却沈殿分別法の種々な段階に
おいて、因子の収量を増加させるためのヘパリ
ン添加が米国特許第3803115号、再発行第29698
号、第4203891号、および第4289691号明細書に示
唆された。これら特許明細書における最初の二つ
においては、ヘパリンを冷却沈殿工程の後で添加
しているのに対し、後の二つの特許明細書におい
てはヘパリンを冷却沈殿工程前で添加している。 ポリエチレングリコール冷却沈殿、およびヘパ
リンの使用による因子の上記の従来の製造法
は、因子複合体から区別されるように、因子
：Ｃ濃縮物を与えるようには報告されていな
い。しかし、ヘパリンは、米国特許第4210580号
および第4278594号明細書によれば、低温沈殿お
よびクロマトグラフイーによるAHF、ホン・ビ
レブランドリストセチン補足因子およびフイブロ
ネクチンの分離のための分別方法論において、血
漿への添加が示唆されている。 従来のコーンアルコール血液分別法に勝るもう
一つの改良法は、例えば米国特許第3554985号、
第3555001号、第4118554号及び第4157431号明細
書に、またエイ・ジエイ・ジヨンソン（A.J.
Johnson）等、J.Lab.Clin.Med.92(a)、194−210
（1978）により記述されているように、水不溶性
の橋かけ結合された高分子電解質共重合体吸着剤
を使用するものある。これら重合体物質は、因子
Ｒを実質的に含まない因子：Ｃ濃縮物を製造
するためジチオトレイトール、セフアロースCL
−4BおよびセフアデツクスＧ−100といつた他の
薬剤と組み合わせて使用された。ハリス
（Harris）等、Biochim.Biophys.Acta 668 456
−470（1981）。 異なる濃度およびPHレベルにおいて、二つの異
なる水不溶性、橋かけ結合高分子電解質共重合体
を使用する一続きの吸着工程で、各々外因的ヘパ
リンの存在下室温において、因子：Ｃの濃縮物
を血漿から高収量で分別しうることがここに発見
された。本発明によると、因子：Ｃのこのよう
な濃縮物は、 (イ) 血漿またはその濃縮物を、7.0から8.5までの
PHにおいて、３モル％から10モル％までの低級
アルキルイミノビス（低級アルキルアミン）で
橋かけ結合されそして90モル％から100モル％
までのペンダントジ低級アルキルアミノ低級ア
ルキルイミド官能基を含むエチレンと無水マレ
イン酸との水不溶性高分子電解質共重合体0.01
％から0.1重量％までと外因的ヘパリンの存在
下に混合し、 (ロ) 生じた吸着血漿画分から上澄を分離し、 (ハ) 前記上澄を5.5から6.5までのPHにおいて、３
モル％から10モル％までの低級アルキルイミノ
ビス（低級アルキルアミン）で橋かけ結合さ
れ、３モル％から７モル％までのペンダントジ
低級アルキルアミノ低級アルキルイミド官能基
を含み、実質的にすべての残存遊離カルボキシ
ル部位または無水物部位がアルコキシアルキル
アミンで封鎖されているという点で特徴づけら
れるエチレンと無水マレイン酸との水不溶性高
分子電解質共重合体１％から10重量％までと外
因的ヘパリン存在下に混合し、 (ニ) その結果生じた吸着血漿画分を上澄から分離
し、吸着剤からの溶離により因子：Ｃの濃縮
物を採取し、そして、 (ホ) 前記アルキルおよびアルコキシが１から４炭
素原子までを有する、 ことからなる方法により得られる。 なお、外因的ということは、本発明方法に付さ
れる血漿およびその濃縮物を外部かな導入するこ
とを意味する。 ここで用いるヘパリンの特に適当な濃度は血漿
１ml当り0.01から２単位まで、そして最も好まし
くは血漿１ml当り0.1から１単位までにわたる。
ここで用いる高分子電解質の特に適当な濃度は吸
着工程(イ)においては0.03％から0.04％までそして
吸着工程(ハ)においては５％から６％までにわた
る。 本明細書で用いたヘパリン１単位とは、1U.S.
P.（米国薬局方）単位を意味すると定義する。ヘ
パリンの米国薬局方単位はクエン酸添加羊血漿
1.0mlを、１：100CaCl2溶液0.2mlの添加後１時間
凝血から防止する量である。ヘパリンは一般に肝
臓および肺といつたマスト細胞を含む哺乳類の組
織からの単離により得られる。本明細書中で用い
た「ヘパリン」という用語はその製薬上容認しう
る水溶性塩、例えばナトリウム塩を含むことも意
味する。市販ヘパリンナトリウム製品の適当な例
は、リポ−ヘピン （Lipo−Hepin ）〔リツカ
−・ラボラトリイズ（Riker Laboratories）〕、
リクアミン ナトリウム（Liquaemin Sodium）
〔オルガノン（Organon）〕、およびパンヘプリン
（Panbeprin ）〔アボツト・ラボラトリイズ
（Abbott Laboratories）〕である。 ヘパリンの凝固防止剤の性質は1922年における
ハウエル（Howell）の発見以来公知である。
Amer.J.Physol.63，434−435（1922）。ヘパリン
が血漿補足因子により間接的に凝固防止剤として
作用することは現在公知である。ヘパリン補足因
子、アンチトロンビンはα2−グロブリンおよび
セリンプロテアーゼ阻害剤で、後者はセリンプロ
テアーゼを凝血因子の不活性化から防止する。ア
ンチトロンビンはトロンビンと複合体を形成
し、結果として、両方のタンパク質が不活性化さ
れる。ヘパリンはその速度を著しく加速はするが
この反応の程度を促進することはない。低濃度の
ヘパリンはアンチトロンビンの活性を増加し、
これが治療剤としてのヘパリンの投与の基礎をな
す。 供血者血液の収集および保存のための血液への
ヘパリン添加は、例えばバツトン（Button）等、
Transfusion ３，37−40（1963）から明らかな
ように、よく知られている。また、トロンビンに
よる因子の不活性化を防止するため貯蔵血液へ
ヘパリンを添加できることも公知である。リツザ
（Rizza）等、Nature（ロンドン）180，143（1957）
およびスチーベ（Stibbe）等、Thromb.Diath.
Haemorrh.27，43−58（1972）。しかし、供血者
血液は、今では一般に、赤血球延命の目的のため
ヘパリンの代りにACD、CPDまたはCPD＋アデ
ニン（CPDA−１）凝固防止剤に集められる。更
にまた、ヘパリン添加血液は種々な試験、例えば
補体、イソアグルチニン、または赤血球脆弱性を
含む試験に対して不適当である。それ故に、この
ような試験に用いようとする血液はヘパリン凝固
防止剤の除去または中和を必要とするであろう。 これまでヘパリンは本発明に用いた型の高分子
電解質重合体を使用する血液分別法と関連して用
いられて来たけれども、ヘパリンを吸着剤からの
溶離液へ添加し、次にこれをポリエチレングリコ
ールで分別して因子、、および（プロト
ロンビン複合体）が得られている。エイ・ジエ
イ・ジヨンソン（A.J.Johnson）等、J.Lad.Clin.
MEd.92(a)，194−210（1978）。活性化された凝血
因子を抑制するため、ヘパリン−活性化アンチト
ロンビンを提供するためにエイ・ジエイ・ジヨ
ンソンにより報告されたように、ポリエチレング
リコール沈殿によるプロトトロンビン複合体の製
造にヘパリンが使われた。Thromb.Diath.
Haemorrh.34，N2，589（1975）を見よ。以前の
技術において、本明細書に定義された因子：Ｃ
濃縮物を高収量で得るため、高分子電解質重合体
を用いる血液分別順序において、ヘパリンを使用
することは何等示唆されたことがない。 本発明によりヘパリンと組み合わせて使用され
る高分子電解質重合体は公知の化合物であり、米
国特許第3554985号、第3555001号、第4118554号、
および第4157431号明細書記載の方法により製造
することができる。例えば、エチレンと無水マレ
イン酸（EMA）のベース共重合体はエチレンお
よび無水マレイン酸を適当な溶媒媒質中過酸化物
触媒の存在下に反応させることによりつくりう
る。共重合体は、なるべくは実質的に等モル量の
エチレン残基および無水物残基を含むのがよい。 ベースEMA共重合体は２個の第一アミン基を
有し橋かけ結合したEMA共重合体へと導く低級
アルキルイミノビス（低級アルキルアミン）と反
応させることができる。EMA共重合体は３モル
％から10モル％までの橋かけ結合剤と反応させる
べきである。このようにして、望むペンダントジ
低級アルキルアミノ低級アルキルイミド官能基を
橋かけ結合共重合体の中へ、EMA共重合体の残
存遊離無水物基の一部または全部とジ低級アルキ
ルアミノ低級アルキルアミンとの反応により、少
なくとも３モル％のレベルまで導入することがで
きる。本発明に係る工程(イ)で用いる高分子電解質
重合体吸着剤の製造に対しては90モル％から100
モル％までのジ低級アルキルアミノ低級アルキル
アミンを用いるのがよく、それに対して本発明に
係るその後の工程(ハ)で用いる吸着剤を製造するに
はなるべくは３モル％から７モル％までを用いる
のがよい。後者の高分子電解質重合体吸着剤の場
合には、米国特許第4157431号明細書に記載のよ
うに、実質的にすべての残存遊離カルボキシル部
位または無水物部位をアルコキシアルキルアミン
で封鎖する。 本発明に用いる高分子電解質重合体材料はまた
米国特許第4118554号明細書に記載の凝集工程を
用いる方法により製造できる。 特に適当なジ低級アルキルアミノ低級アルキル
イミド官能基はジメチルアミノプロピルイミドで
あり、特に適当な橋かけ結合剤はメチルイミノビ
スプロピルアミンであり、そして特に適当なアル
コキシアルキルアミン封鎖剤はメトキシプロピル
アミンである。 高分子電解質重合体吸着剤の上記製造法は説明
を目的としているだけであること、および本発明
方法によりこれら物質を用いて血液を分別する方
法はその特定の製造法に限定されないことは明ら
かであろう。 本発明の一面にとつて、高分子電解質重合体を
用いる両方の吸着工程の間に外因的ヘパリンを使
用することは現在重要であると考えられるが、そ
れは第一の吸着工程が該媒質へ外因的に添加され
たとき実質的量のヘパリンを血漿媒質から吸着す
ることもありうるからである。一般に、第二の吸
着工程に先立ち、添加されるヘパリンの量は第一
吸着工程により除去される量と等価であろう。ヘ
パリンは最初に血液収集過程で加えることができ
るし、あるいはACD、CPDまたはCPDAと言つ
た他の凝固防止剤中に集められた血液へ添加する
こともできる。 本発明のもう一つの面によれば、血液を重合体
で処理する前に高分子電解質重合体と共に直接へ
パリンを添加することもできる。後者の場合、ヘ
パリンはまたイオン結合により重合体へ拘束され
て、高分子電解質重合体／ヘパリン複合体を形成
する。この高分子電解質重合体／ヘパリン複合体
は、ヘパリンおよび重合体を水性懸濁液中で混合
し、続いて、生じた複合体を分離し、そして乾燥
することにより便利につくりうる。 出発の血漿材料は全血の血漿でもよいし、ある
いは、例えば、冷却沈殿濃縮物のよなな因子：
Ｃを含むことが判つている濃縮物でもよい。 血液分別法の吸着工程は水性懸濁液中で、なる
べくは生理食塩水中で行なわれる。望む塩基性ま
たは酸性レベルの適当なPH調節は、それぞれ、本
法の吸着工程(イ)においては7.0から8.5までの範囲
にPHを上げるためにNaOHを用いて、そして本
法の吸着工程(ハ)においては5.5から6.5までの範囲
にPHを下げるためにHCl、酢酸またはなるべくは
クエン酸を用いて血漿媒質を処理することにより
なされる。 各吸着工程後それぞれの上澄からの吸着血漿画
分の分離は過、遠心および同様な分離手続きに
より行ないうる。望む因子：Ｃ濃縮物の溶離
は、最後の吸着剤を、１から３モルのNaCl、な
るべくは1.5から1.8モルNaClを用いて、また他の
このような生理学的に容認しうる溶離剤を用いて
洗浄することにより行なうことができる。 因子：Ｃ濃縮物は、部分的脱塩および濃縮
（例えば、膜限外過）、無菌過（例えば、細孔
寸法４ミクロンを有する半多孔性膜を通しての
過により）およびその後の凍結乾燥を用いること
により、生理学上適当な無菌固体形に変えること
ができる。 最終の採取生成物における因子：Ｃ活性は活
性化された部分的トロンボプラスチン時間
（PTT）の測定を用いる通常の一段階または二段
階検定法により決定できる。これらの試験におい
ては、試験血漿への部分的トロンボプラスチンの
添加は種種な血漿因子の不足と釣合いをとること
になるであろう。クイツク（Quick）により開発
された公知の一段階プロトロビン時間試験が特に
よい。一段階検定試験についての背景となる情報
を求めるには、クイツク，“Hemarrhagic
Diseases”、リー＆フエビガー（Lea＆Febiger）、
フイラデルフイア、ペンシルバニア、1957；ラン
グデル（Langdell）等、J.Lab.Clin.Med.41，637
（1953）；およびハーデイスチイ（Hardisty）等、
Thromb.Diath.Haemorrh.７，215（1962）を見
よ。 最終生成物中の因子Ｒ活性の存在は抗生物質
リストセチンに暴露したときの凝集および免疫電
気泳動あるいは放射性免疫検による測定により決
定できる。このような適当な検定手順はハリス
（Harris）等、Biochim.Biophys.Acta 668，
456−470（1981）により、またフルチヤー
（Fulcher）等、Proc.Natl Acad.Sci.USA 79，
1648−1652（1982）により記述されている。 ここではヒト血液を特に記述しているが、他の
動物血、例えば牛、豚、馬および羊の血液も本発
明方法により同様に分別できることは明らかであ
ろう。 下記の例により更に本発明を説明するが、本発
明はこれら特定の例あるいはそこに再び引用され
た詳細事項に制限されないことは理解されるであ
ろう。 例 １ ヒト供血者血液をCPDA−１凝固防止剤を含む
プラスチツク製の血液収集バツグに引出す。収集
後４時間以内に冷凍遠心により血清から血漿を分
離する。血漿の40単位を貯蔵し、300ml単位の移
動バツグに分け（200ml）、これを次に冷凍し、−
20℃で貯える。 新鮮な冷凍血漿を、二つの異なる水不溶性の橋
かけ結合した高分子電解質樹脂を用いる一連の吸
着工程で外因的ヘパリン存在下室温において分別
する。これらの樹脂は５モル％のメチルイミノビ
スプロピルアミンで橋かけ結合されたペンダント
ジメチルアミノプロピルイミドペンダント基を含
む実質的に等モル量のエチレンと無水マレイン酸
との共重合体である。第一の樹脂、樹脂Ａ、は90
モル％のこれらペンダント基を含むのに対し、第
二の樹脂、樹脂Ｂ、は５モル％の該ペンダント基
を含む。樹脂Ｂにおいては、すべての遊離カルボ
キシル基または無水物基が更にメトキシプロピル
アミンで封鎖されている。 使用に先立ち、樹脂Ｂを次のように前調整す
る。樹脂12グラムを0.1％牛血清アルブミン
（BSA）を含む0.154M NaCl200ml中に分散する。 （BSAの代りにヒト血清アルブミンも使用で
きる）。PHを1.0Mクエン酸で4.0に調節し分散を
促進する（かきまぜながら約３〜５分）。遊離液
を過し、液を捨てる。漏れた樹脂塊を再び
200mlのNaCl／BSA溶液に分散させる。かきま
ぜながらPHを1.0M NaOHで5.8に調節し、かき
まぜを更に10分間続ける。浮遊液を過し、湿塊
をその後の分別に使用するため保存する。 分別に用いるすべての溶離剤および洗浄溶液も
また望むタンパク質の拘束を最小にしかつ因子
：Ｃの安定剤として更に使用させるため0.1％
BSAを含む。 豚ヘパリン（ナトリウム塩）を約200単位／ml
を含む溶液が得られるように生理食塩水
（0.9NaCl）に溶かすことによりこの分別に用い
る。 分別過程は次のように行なわれる： 新鮮な凍結血漿の１バツグ（即ち、200ml）を
37℃でかきまぜた水浴中に置くことにより迅速に
融かす。ヘパリンを添加する試験に対しては、１
mlのヘパリン溶液（即ち、200単位）をビーカー
中の融かした血漿へ加え、混合物を３〜５分かき
まぜる。血漿の試料を凝固検定のため採取する。
体積および時間を記録する。ヘパリンを血漿へ添
加せず、その以外は試験実験と同一である対照実
験を行なう。 樹脂Ａ（70mg）を血漿（またはヘパリン添加血
漿）へ加え、PHを1M NaOHで8.0に調節し、か
きまぜながらこのPHに20分解保つ。次に、これを
過する。液は因子：Ｃ活性の大部分を含
む。濡れた樹脂塊を20mlの蒸留水に再懸濁し、５
分間かきまぜ、過し、次にこれら二つの液を
合わせ、因子：Ｃ活性を検定するための試料を
採取する。存在する全凝固単位の計画ができるよ
うに体積を記録する。 次に前整調した樹脂Ｂ（12ｇ）を液（または
ヘパリン添加液）に加え、PHを1Mクエン酸で
5.8に調節し、PHを5.8に保ちつつ懸濁液を20分間
かきまぜる。次に、これを過し、塊を200ml
の0.002M NaClで洗浄する。合わせた液をア
ルブミンおよびガンマーグロブリン血漿画分の採
取のため保持する。塊を200mlの0.3M NaCl中
に分散し、PHを5.8に調節し、懸濁液を５分間か
きまぜる。懸濁液を再び過し、他の200mlの
0.3M NaClで過器上で洗浄し、液を捨てる。 次に塊を、塩化ナトリウム（1.5M）、リジン
（0.1M）（安定剤として）、および牛血清アルブミ
ン（0.1％）を含む溶離剤溶液200ml中に分散させ
る。PHを6.0に調節し、懸濁液を20分かきまぜる。
懸濁液を過し、ケーキを約20mlの溶離剤溶液で
任意に洗浄し、合わせた液の体積を記録し、下
記表１に示したように凝固検定のための試料を採
る。 次に、本来の因子：Ｃ凝固活性の40〜70％を
精製された形で含む液をそれ以上濃縮し、かつ
部分的な脱塩を果すために処理することができ
る。これは例えば望む分子の保持のため適当な分
子量カツトオフを有するポリスルホン繊維半透膜
を備えたミリポア・ペリコン カセツト
（Millipore Pellicon Cassette）過系あるいは
アミコン（Amicon）DH4中空繊維器系を使用す
ることにより達成できる。次に、濃縮された溶液
を凍結乾燥し、貯蔵のため包装する。しかし、こ
れらのこれ以上の濃縮および処理工程はこの特別
な例１においては行なわなかつた。 下記の表１は貯留されたCPDA−安定化血漿お
よび上記方法を用いる幾つかの分別実験の結果を
示している。これらの結果は高分子電解質重合体
分別と組み合わせた貯留血漿へのヘパリン添加の
有益な効果を実証する。これらは因子複合体を
取り除く樹脂Ａ処理後の因子：凝固活性の回収
および吸着および樹脂Ｂからの溶離後の全活性回
収（もとの血漿におけるレベルに基づく）におけ
る再現性のある改善を例証している。 因子：Ｃ測定はMLAエレクトラ凝固タイマ
ー〔メデイカル・ラボラトリイー・オートメーシ
ヨン社（Medical Laboratory Automation，
Inc.）〕での通常の一段階PTT検定方式により行
なう。この装置は凝固過程の開始を示すため光学
的感覚を用いている。このものは凝固速度の二次
微分（即ち、凝固速度の変化速度）を測る。この
検定はデード・ダイアグノステツクス社（Dade
Diagnostics，Inc.）により商業的に供給される
試薬キツトと手順を用いて行ない、該キツトには
米国特許第3486981号明細書に記載のように、因
子欠乏血漿およびエラグ酸活性化体が含まれて
いる。凝固時間は試験試料（分別された試料）の
連続希釈に対して測定し、その結果をもとの貯留
血漿試料におけるレベルに基づき因子：Ｃ活性
の回収のパーセントとして表わす。これら実験に
おいて、貯留血漿は因子：Ｃ凝固活性１単位／
mlを含むと仮定する。それ故に各実験は合計200
凝固単位で開始した。各樹脂処理後の累積単位お
よび活性回収パーセントを示す。 【表】 ＊ 最初の血漿レベルに基づく
例 ２ 上記例１と同様に追加の分別実験を行なうが、
ただし、三つの異なる濃度のヘパリン（1.0単
位／ml、0.5単位／ml、および0.1単位／ml）を樹
脂Ａによる吸着に先立ち工程(イ)における最初の血
漿へそしてまた樹脂Ｂによる吸着に先立ち工程(ハ)
における流出液（液）へ添加する。 下記の表２はこれら分別実験の結果を、もとの
貯留血漿が１単位／mlを含むと仮定した因子：
Ｃ活性の回収パーセントとして示す。 【表】 ＊ １回の実験のみ
例 ３ 本例においては、上記例１のそれぞれの樹脂Ａ
および樹脂Ｂ生成物をヘパリンナトリウムの水溶
液と接触させ、生じた複合体を乾燥することによ
り最初に高分子電解質重合体／ヘパリン複合体を
調製する。次に、これら樹脂／ヘパリン複合体を
用いて、ヘパリン溶液のこれ以上の外因的追加な
しに例１の手順に従い血液を分別する。 最初に、豚ヘパリン、ナトリウム塩（水50ml中
に溶解した1003単位）を (A) 水100ml中に懸濁した樹脂A300mg、および (B) 水200ml中に懸濁した樹脂B50ｇの各々へ加
える。 各場合において、通常の室温（約22〜25℃）で
かきまぜを１時間保つ。樹脂／ヘパリン複合体は
ホワツトマン＃54セルロース紙（製造業者によ
れば20〜25ミクロンで98％保持効力）上で過
し、続いて100mlずつの水で三回洗浄して未結合
ヘパリンを除去することにより単離される。次に
樹脂／ヘパリン複合体を血液分別過程で使用する
前に乾燥する。 血漿を例１で記述したのと実質的に同様に分別
するが、ただし樹脂／ヘパリン複合体を対応する
樹脂の代りに使用し、それ以上の外因的ヘパリン
添加を省く。 本例においては、樹脂Ａ／ヘパリン複合体処理
後の因子：Ｃ凝固活性の回収が、通常の実験誤
差の範囲内で定量的であつた（117％）。吸着およ
び樹脂Ｂ／ヘパリン複合体からの溶離後の全回収
はこの特別な例におけるもとの血漿のレベルの
78.4％であつた。 上記例１〜３において、樹脂Ａは米国特許第
4097473号および第4118554号明細書の例１ならび
に米国特許第4157431号明細書の例12に記載の反
応体およびモル割合を用いる方法に実質的に従つ
てつくつた。樹脂Ｂは米国特許第4157431号明細
書の例１に記載された反応体およびモル割合を用
いる方法に実質的に従つてつくつた。 例 ４ ジエチルアミノエチルアミンを等モル量のジメ
チルアミノプロピルアミンの代りに使用すると
き、そして（または）エチルイミノビスエチルア
ミンを等モル量のメチルイミノビスプロピルアミ
ンの代りに使用するとき、そして（または）エト
キシエチルアミンを、前記例１〜３における等モ
ル量のメチルプロピルアミンの代りに使用すると
き、上記例１〜３で得られたのと実質的に同様な
結果が得られる。 本発明の発表を読んだ後は、各種の他の例が本
発明の主旨と範囲からずれることなく当業者にと
つて明らかになるであろうが、すべてこのような
他の例は特許請求の範囲の中に包含されるものと
する。
固因子：Ｃの製造方法に関する。 血液凝固の過程は正常全血の中に見出される多
数の物質を含む複雑な生理学的活動である。血液
凝固機構と関連したある種の因子がある個人では
ひどく欠乏していることが知られている。このよ
うに、古典的血友病に罹つている患者において
は、抗血友病因子Ａ（AHF，因子）が欠乏して
いる。血友病Ｂに罹つている患者においては血漿
トロンボプラスチン成分（PTC、因子）が血
液から欠けている。血友病の小百分率もまた因子
の不可欠成分であるいわゆるホン・ビレブラン
ド因子を欠いている。 血漿因子は明らかに異なる機能、生化学的お
よび免疫学的性質、および発生学的調節を有する
二つの成分の複合体であるということが現在一般
に認識されている。因子複合体の一成分は抗血
友病因子前凝固剤活性を有し、通常は因子：Ｃ
と称される。他の大きい方の成分は大部分タンパ
ク質集団からなり、第一次の止血を増進する仕方
で血小板と相互作用し、そして通常は因子Ｒ
（リストセチン補足因子またはホン・ビレブラン
ド抗原）と呼ばれる。 Ｘ−クロモソーム遺伝により伝達された因子
：Ｃ欠乏を有する患者（血友病Ａ患者）は正常
な因子Ｒ合成と機能を有する。従つて、このよ
うな患者は止血の維持のために因子Ｒの外因的
投与を必要とせず、因子Ｒを含まない因子：
Ｃの濃縮物が十分であり、ある場合には好ましく
さえある。 因子複合体およびその二つの成分の構造と機
能に関する更に詳しく背景の情報は次の三つの最
近の概観記事、それぞれホイヤー（Hoyer）、J.
Amer.Soc.of Hematol.58(1)，１−13（1981）、ハ
リス（Harris）等、Biochem.Biophys.Acta
668，456−470（1981）、およびフアルチヤー
（Fulcher）等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，
1648−1652（1982）を参照すれば得られる。 因子濃縮物の臨床的重要性およびその十分な
供給源に対する重大な要望はこのような血液画分
の改良製造法を開発する動機を与えた。従来の低
温で行なわねばならない血液分別のコーン
（Cohn）アルコール法に代わるものとして、普通
の室温（とり巻いている温度）で使用できる分別
剤を使用する種々な他の方法が開発された。一つ
のこのような方法は、例えば米国特許第3631018
号、第3652530号、および第3682881号明細書に記
載の通り、重合体ポリエチレングリコール
（PEG）を用いている。しかし、これら特許に記
載された研究方法論は、更に冷却沈殿工程を使用
しており、これは低温装置の使用を必要としまた
因子の活性の実質量を失なう結果ともなつてい
る。 これらPEG／冷却沈殿分別法の種々な段階に
おいて、因子の収量を増加させるためのヘパリ
ン添加が米国特許第3803115号、再発行第29698
号、第4203891号、および第4289691号明細書に示
唆された。これら特許明細書における最初の二つ
においては、ヘパリンを冷却沈殿工程の後で添加
しているのに対し、後の二つの特許明細書におい
てはヘパリンを冷却沈殿工程前で添加している。 ポリエチレングリコール冷却沈殿、およびヘパ
リンの使用による因子の上記の従来の製造法
は、因子複合体から区別されるように、因子
：Ｃ濃縮物を与えるようには報告されていな
い。しかし、ヘパリンは、米国特許第4210580号
および第4278594号明細書によれば、低温沈殿お
よびクロマトグラフイーによるAHF、ホン・ビ
レブランドリストセチン補足因子およびフイブロ
ネクチンの分離のための分別方法論において、血
漿への添加が示唆されている。 従来のコーンアルコール血液分別法に勝るもう
一つの改良法は、例えば米国特許第3554985号、
第3555001号、第4118554号及び第4157431号明細
書に、またエイ・ジエイ・ジヨンソン（A.J.
Johnson）等、J.Lab.Clin.Med.92(a)、194−210
（1978）により記述されているように、水不溶性
の橋かけ結合された高分子電解質共重合体吸着剤
を使用するものある。これら重合体物質は、因子
Ｒを実質的に含まない因子：Ｃ濃縮物を製造
するためジチオトレイトール、セフアロースCL
−4BおよびセフアデツクスＧ−100といつた他の
薬剤と組み合わせて使用された。ハリス
（Harris）等、Biochim.Biophys.Acta 668 456
−470（1981）。 異なる濃度およびPHレベルにおいて、二つの異
なる水不溶性、橋かけ結合高分子電解質共重合体
を使用する一続きの吸着工程で、各々外因的ヘパ
リンの存在下室温において、因子：Ｃの濃縮物
を血漿から高収量で分別しうることがここに発見
された。本発明によると、因子：Ｃのこのよう
な濃縮物は、 (イ) 血漿またはその濃縮物を、7.0から8.5までの
PHにおいて、３モル％から10モル％までの低級
アルキルイミノビス（低級アルキルアミン）で
橋かけ結合されそして90モル％から100モル％
までのペンダントジ低級アルキルアミノ低級ア
ルキルイミド官能基を含むエチレンと無水マレ
イン酸との水不溶性高分子電解質共重合体0.01
％から0.1重量％までと外因的ヘパリンの存在
下に混合し、 (ロ) 生じた吸着血漿画分から上澄を分離し、 (ハ) 前記上澄を5.5から6.5までのPHにおいて、３
モル％から10モル％までの低級アルキルイミノ
ビス（低級アルキルアミン）で橋かけ結合さ
れ、３モル％から７モル％までのペンダントジ
低級アルキルアミノ低級アルキルイミド官能基
を含み、実質的にすべての残存遊離カルボキシ
ル部位または無水物部位がアルコキシアルキル
アミンで封鎖されているという点で特徴づけら
れるエチレンと無水マレイン酸との水不溶性高
分子電解質共重合体１％から10重量％までと外
因的ヘパリン存在下に混合し、 (ニ) その結果生じた吸着血漿画分を上澄から分離
し、吸着剤からの溶離により因子：Ｃの濃縮
物を採取し、そして、 (ホ) 前記アルキルおよびアルコキシが１から４炭
素原子までを有する、 ことからなる方法により得られる。 なお、外因的ということは、本発明方法に付さ
れる血漿およびその濃縮物を外部かな導入するこ
とを意味する。 ここで用いるヘパリンの特に適当な濃度は血漿
１ml当り0.01から２単位まで、そして最も好まし
くは血漿１ml当り0.1から１単位までにわたる。
ここで用いる高分子電解質の特に適当な濃度は吸
着工程(イ)においては0.03％から0.04％までそして
吸着工程(ハ)においては５％から６％までにわた
る。 本明細書で用いたヘパリン１単位とは、1U.S.
P.（米国薬局方）単位を意味すると定義する。ヘ
パリンの米国薬局方単位はクエン酸添加羊血漿
1.0mlを、１：100CaCl2溶液0.2mlの添加後１時間
凝血から防止する量である。ヘパリンは一般に肝
臓および肺といつたマスト細胞を含む哺乳類の組
織からの単離により得られる。本明細書中で用い
た「ヘパリン」という用語はその製薬上容認しう
る水溶性塩、例えばナトリウム塩を含むことも意
味する。市販ヘパリンナトリウム製品の適当な例
は、リポ−ヘピン （Lipo−Hepin ）〔リツカ
−・ラボラトリイズ（Riker Laboratories）〕、
リクアミン ナトリウム（Liquaemin Sodium）
〔オルガノン（Organon）〕、およびパンヘプリン
（Panbeprin ）〔アボツト・ラボラトリイズ
（Abbott Laboratories）〕である。 ヘパリンの凝固防止剤の性質は1922年における
ハウエル（Howell）の発見以来公知である。
Amer.J.Physol.63，434−435（1922）。ヘパリン
が血漿補足因子により間接的に凝固防止剤として
作用することは現在公知である。ヘパリン補足因
子、アンチトロンビンはα2−グロブリンおよび
セリンプロテアーゼ阻害剤で、後者はセリンプロ
テアーゼを凝血因子の不活性化から防止する。ア
ンチトロンビンはトロンビンと複合体を形成
し、結果として、両方のタンパク質が不活性化さ
れる。ヘパリンはその速度を著しく加速はするが
この反応の程度を促進することはない。低濃度の
ヘパリンはアンチトロンビンの活性を増加し、
これが治療剤としてのヘパリンの投与の基礎をな
す。 供血者血液の収集および保存のための血液への
ヘパリン添加は、例えばバツトン（Button）等、
Transfusion ３，37−40（1963）から明らかな
ように、よく知られている。また、トロンビンに
よる因子の不活性化を防止するため貯蔵血液へ
ヘパリンを添加できることも公知である。リツザ
（Rizza）等、Nature（ロンドン）180，143（1957）
およびスチーベ（Stibbe）等、Thromb.Diath.
Haemorrh.27，43−58（1972）。しかし、供血者
血液は、今では一般に、赤血球延命の目的のため
ヘパリンの代りにACD、CPDまたはCPD＋アデ
ニン（CPDA−１）凝固防止剤に集められる。更
にまた、ヘパリン添加血液は種々な試験、例えば
補体、イソアグルチニン、または赤血球脆弱性を
含む試験に対して不適当である。それ故に、この
ような試験に用いようとする血液はヘパリン凝固
防止剤の除去または中和を必要とするであろう。 これまでヘパリンは本発明に用いた型の高分子
電解質重合体を使用する血液分別法と関連して用
いられて来たけれども、ヘパリンを吸着剤からの
溶離液へ添加し、次にこれをポリエチレングリコ
ールで分別して因子、、および（プロト
ロンビン複合体）が得られている。エイ・ジエ
イ・ジヨンソン（A.J.Johnson）等、J.Lad.Clin.
MEd.92(a)，194−210（1978）。活性化された凝血
因子を抑制するため、ヘパリン−活性化アンチト
ロンビンを提供するためにエイ・ジエイ・ジヨ
ンソンにより報告されたように、ポリエチレング
リコール沈殿によるプロトトロンビン複合体の製
造にヘパリンが使われた。Thromb.Diath.
Haemorrh.34，N2，589（1975）を見よ。以前の
技術において、本明細書に定義された因子：Ｃ
濃縮物を高収量で得るため、高分子電解質重合体
を用いる血液分別順序において、ヘパリンを使用
することは何等示唆されたことがない。 本発明によりヘパリンと組み合わせて使用され
る高分子電解質重合体は公知の化合物であり、米
国特許第3554985号、第3555001号、第4118554号、
および第4157431号明細書記載の方法により製造
することができる。例えば、エチレンと無水マレ
イン酸（EMA）のベース共重合体はエチレンお
よび無水マレイン酸を適当な溶媒媒質中過酸化物
触媒の存在下に反応させることによりつくりう
る。共重合体は、なるべくは実質的に等モル量の
エチレン残基および無水物残基を含むのがよい。 ベースEMA共重合体は２個の第一アミン基を
有し橋かけ結合したEMA共重合体へと導く低級
アルキルイミノビス（低級アルキルアミン）と反
応させることができる。EMA共重合体は３モル
％から10モル％までの橋かけ結合剤と反応させる
べきである。このようにして、望むペンダントジ
低級アルキルアミノ低級アルキルイミド官能基を
橋かけ結合共重合体の中へ、EMA共重合体の残
存遊離無水物基の一部または全部とジ低級アルキ
ルアミノ低級アルキルアミンとの反応により、少
なくとも３モル％のレベルまで導入することがで
きる。本発明に係る工程(イ)で用いる高分子電解質
重合体吸着剤の製造に対しては90モル％から100
モル％までのジ低級アルキルアミノ低級アルキル
アミンを用いるのがよく、それに対して本発明に
係るその後の工程(ハ)で用いる吸着剤を製造するに
はなるべくは３モル％から７モル％までを用いる
のがよい。後者の高分子電解質重合体吸着剤の場
合には、米国特許第4157431号明細書に記載のよ
うに、実質的にすべての残存遊離カルボキシル部
位または無水物部位をアルコキシアルキルアミン
で封鎖する。 本発明に用いる高分子電解質重合体材料はまた
米国特許第4118554号明細書に記載の凝集工程を
用いる方法により製造できる。 特に適当なジ低級アルキルアミノ低級アルキル
イミド官能基はジメチルアミノプロピルイミドで
あり、特に適当な橋かけ結合剤はメチルイミノビ
スプロピルアミンであり、そして特に適当なアル
コキシアルキルアミン封鎖剤はメトキシプロピル
アミンである。 高分子電解質重合体吸着剤の上記製造法は説明
を目的としているだけであること、および本発明
方法によりこれら物質を用いて血液を分別する方
法はその特定の製造法に限定されないことは明ら
かであろう。 本発明の一面にとつて、高分子電解質重合体を
用いる両方の吸着工程の間に外因的ヘパリンを使
用することは現在重要であると考えられるが、そ
れは第一の吸着工程が該媒質へ外因的に添加され
たとき実質的量のヘパリンを血漿媒質から吸着す
ることもありうるからである。一般に、第二の吸
着工程に先立ち、添加されるヘパリンの量は第一
吸着工程により除去される量と等価であろう。ヘ
パリンは最初に血液収集過程で加えることができ
るし、あるいはACD、CPDまたはCPDAと言つ
た他の凝固防止剤中に集められた血液へ添加する
こともできる。 本発明のもう一つの面によれば、血液を重合体
で処理する前に高分子電解質重合体と共に直接へ
パリンを添加することもできる。後者の場合、ヘ
パリンはまたイオン結合により重合体へ拘束され
て、高分子電解質重合体／ヘパリン複合体を形成
する。この高分子電解質重合体／ヘパリン複合体
は、ヘパリンおよび重合体を水性懸濁液中で混合
し、続いて、生じた複合体を分離し、そして乾燥
することにより便利につくりうる。 出発の血漿材料は全血の血漿でもよいし、ある
いは、例えば、冷却沈殿濃縮物のよなな因子：
Ｃを含むことが判つている濃縮物でもよい。 血液分別法の吸着工程は水性懸濁液中で、なる
べくは生理食塩水中で行なわれる。望む塩基性ま
たは酸性レベルの適当なPH調節は、それぞれ、本
法の吸着工程(イ)においては7.0から8.5までの範囲
にPHを上げるためにNaOHを用いて、そして本
法の吸着工程(ハ)においては5.5から6.5までの範囲
にPHを下げるためにHCl、酢酸またはなるべくは
クエン酸を用いて血漿媒質を処理することにより
なされる。 各吸着工程後それぞれの上澄からの吸着血漿画
分の分離は過、遠心および同様な分離手続きに
より行ないうる。望む因子：Ｃ濃縮物の溶離
は、最後の吸着剤を、１から３モルのNaCl、な
るべくは1.5から1.8モルNaClを用いて、また他の
このような生理学的に容認しうる溶離剤を用いて
洗浄することにより行なうことができる。 因子：Ｃ濃縮物は、部分的脱塩および濃縮
（例えば、膜限外過）、無菌過（例えば、細孔
寸法４ミクロンを有する半多孔性膜を通しての
過により）およびその後の凍結乾燥を用いること
により、生理学上適当な無菌固体形に変えること
ができる。 最終の採取生成物における因子：Ｃ活性は活
性化された部分的トロンボプラスチン時間
（PTT）の測定を用いる通常の一段階または二段
階検定法により決定できる。これらの試験におい
ては、試験血漿への部分的トロンボプラスチンの
添加は種種な血漿因子の不足と釣合いをとること
になるであろう。クイツク（Quick）により開発
された公知の一段階プロトロビン時間試験が特に
よい。一段階検定試験についての背景となる情報
を求めるには、クイツク，“Hemarrhagic
Diseases”、リー＆フエビガー（Lea＆Febiger）、
フイラデルフイア、ペンシルバニア、1957；ラン
グデル（Langdell）等、J.Lab.Clin.Med.41，637
（1953）；およびハーデイスチイ（Hardisty）等、
Thromb.Diath.Haemorrh.７，215（1962）を見
よ。 最終生成物中の因子Ｒ活性の存在は抗生物質
リストセチンに暴露したときの凝集および免疫電
気泳動あるいは放射性免疫検による測定により決
定できる。このような適当な検定手順はハリス
（Harris）等、Biochim.Biophys.Acta 668，
456−470（1981）により、またフルチヤー
（Fulcher）等、Proc.Natl Acad.Sci.USA 79，
1648−1652（1982）により記述されている。 ここではヒト血液を特に記述しているが、他の
動物血、例えば牛、豚、馬および羊の血液も本発
明方法により同様に分別できることは明らかであ
ろう。 下記の例により更に本発明を説明するが、本発
明はこれら特定の例あるいはそこに再び引用され
た詳細事項に制限されないことは理解されるであ
ろう。 例 １ ヒト供血者血液をCPDA−１凝固防止剤を含む
プラスチツク製の血液収集バツグに引出す。収集
後４時間以内に冷凍遠心により血清から血漿を分
離する。血漿の40単位を貯蔵し、300ml単位の移
動バツグに分け（200ml）、これを次に冷凍し、−
20℃で貯える。 新鮮な冷凍血漿を、二つの異なる水不溶性の橋
かけ結合した高分子電解質樹脂を用いる一連の吸
着工程で外因的ヘパリン存在下室温において分別
する。これらの樹脂は５モル％のメチルイミノビ
スプロピルアミンで橋かけ結合されたペンダント
ジメチルアミノプロピルイミドペンダント基を含
む実質的に等モル量のエチレンと無水マレイン酸
との共重合体である。第一の樹脂、樹脂Ａ、は90
モル％のこれらペンダント基を含むのに対し、第
二の樹脂、樹脂Ｂ、は５モル％の該ペンダント基
を含む。樹脂Ｂにおいては、すべての遊離カルボ
キシル基または無水物基が更にメトキシプロピル
アミンで封鎖されている。 使用に先立ち、樹脂Ｂを次のように前調整す
る。樹脂12グラムを0.1％牛血清アルブミン
（BSA）を含む0.154M NaCl200ml中に分散する。 （BSAの代りにヒト血清アルブミンも使用で
きる）。PHを1.0Mクエン酸で4.0に調節し分散を
促進する（かきまぜながら約３〜５分）。遊離液
を過し、液を捨てる。漏れた樹脂塊を再び
200mlのNaCl／BSA溶液に分散させる。かきま
ぜながらPHを1.0M NaOHで5.8に調節し、かき
まぜを更に10分間続ける。浮遊液を過し、湿塊
をその後の分別に使用するため保存する。 分別に用いるすべての溶離剤および洗浄溶液も
また望むタンパク質の拘束を最小にしかつ因子
：Ｃの安定剤として更に使用させるため0.1％
BSAを含む。 豚ヘパリン（ナトリウム塩）を約200単位／ml
を含む溶液が得られるように生理食塩水
（0.9NaCl）に溶かすことによりこの分別に用い
る。 分別過程は次のように行なわれる： 新鮮な凍結血漿の１バツグ（即ち、200ml）を
37℃でかきまぜた水浴中に置くことにより迅速に
融かす。ヘパリンを添加する試験に対しては、１
mlのヘパリン溶液（即ち、200単位）をビーカー
中の融かした血漿へ加え、混合物を３〜５分かき
まぜる。血漿の試料を凝固検定のため採取する。
体積および時間を記録する。ヘパリンを血漿へ添
加せず、その以外は試験実験と同一である対照実
験を行なう。 樹脂Ａ（70mg）を血漿（またはヘパリン添加血
漿）へ加え、PHを1M NaOHで8.0に調節し、か
きまぜながらこのPHに20分解保つ。次に、これを
過する。液は因子：Ｃ活性の大部分を含
む。濡れた樹脂塊を20mlの蒸留水に再懸濁し、５
分間かきまぜ、過し、次にこれら二つの液を
合わせ、因子：Ｃ活性を検定するための試料を
採取する。存在する全凝固単位の計画ができるよ
うに体積を記録する。 次に前整調した樹脂Ｂ（12ｇ）を液（または
ヘパリン添加液）に加え、PHを1Mクエン酸で
5.8に調節し、PHを5.8に保ちつつ懸濁液を20分間
かきまぜる。次に、これを過し、塊を200ml
の0.002M NaClで洗浄する。合わせた液をア
ルブミンおよびガンマーグロブリン血漿画分の採
取のため保持する。塊を200mlの0.3M NaCl中
に分散し、PHを5.8に調節し、懸濁液を５分間か
きまぜる。懸濁液を再び過し、他の200mlの
0.3M NaClで過器上で洗浄し、液を捨てる。 次に塊を、塩化ナトリウム（1.5M）、リジン
（0.1M）（安定剤として）、および牛血清アルブミ
ン（0.1％）を含む溶離剤溶液200ml中に分散させ
る。PHを6.0に調節し、懸濁液を20分かきまぜる。
懸濁液を過し、ケーキを約20mlの溶離剤溶液で
任意に洗浄し、合わせた液の体積を記録し、下
記表１に示したように凝固検定のための試料を採
る。 次に、本来の因子：Ｃ凝固活性の40〜70％を
精製された形で含む液をそれ以上濃縮し、かつ
部分的な脱塩を果すために処理することができ
る。これは例えば望む分子の保持のため適当な分
子量カツトオフを有するポリスルホン繊維半透膜
を備えたミリポア・ペリコン カセツト
（Millipore Pellicon Cassette）過系あるいは
アミコン（Amicon）DH4中空繊維器系を使用す
ることにより達成できる。次に、濃縮された溶液
を凍結乾燥し、貯蔵のため包装する。しかし、こ
れらのこれ以上の濃縮および処理工程はこの特別
な例１においては行なわなかつた。 下記の表１は貯留されたCPDA−安定化血漿お
よび上記方法を用いる幾つかの分別実験の結果を
示している。これらの結果は高分子電解質重合体
分別と組み合わせた貯留血漿へのヘパリン添加の
有益な効果を実証する。これらは因子複合体を
取り除く樹脂Ａ処理後の因子：凝固活性の回収
および吸着および樹脂Ｂからの溶離後の全活性回
収（もとの血漿におけるレベルに基づく）におけ
る再現性のある改善を例証している。 因子：Ｃ測定はMLAエレクトラ凝固タイマ
ー〔メデイカル・ラボラトリイー・オートメーシ
ヨン社（Medical Laboratory Automation，
Inc.）〕での通常の一段階PTT検定方式により行
なう。この装置は凝固過程の開始を示すため光学
的感覚を用いている。このものは凝固速度の二次
微分（即ち、凝固速度の変化速度）を測る。この
検定はデード・ダイアグノステツクス社（Dade
Diagnostics，Inc.）により商業的に供給される
試薬キツトと手順を用いて行ない、該キツトには
米国特許第3486981号明細書に記載のように、因
子欠乏血漿およびエラグ酸活性化体が含まれて
いる。凝固時間は試験試料（分別された試料）の
連続希釈に対して測定し、その結果をもとの貯留
血漿試料におけるレベルに基づき因子：Ｃ活性
の回収のパーセントとして表わす。これら実験に
おいて、貯留血漿は因子：Ｃ凝固活性１単位／
mlを含むと仮定する。それ故に各実験は合計200
凝固単位で開始した。各樹脂処理後の累積単位お
よび活性回収パーセントを示す。 【表】 ＊ 最初の血漿レベルに基づく
例 ２ 上記例１と同様に追加の分別実験を行なうが、
ただし、三つの異なる濃度のヘパリン（1.0単
位／ml、0.5単位／ml、および0.1単位／ml）を樹
脂Ａによる吸着に先立ち工程(イ)における最初の血
漿へそしてまた樹脂Ｂによる吸着に先立ち工程(ハ)
における流出液（液）へ添加する。 下記の表２はこれら分別実験の結果を、もとの
貯留血漿が１単位／mlを含むと仮定した因子：
Ｃ活性の回収パーセントとして示す。 【表】 ＊ １回の実験のみ
例 ３ 本例においては、上記例１のそれぞれの樹脂Ａ
および樹脂Ｂ生成物をヘパリンナトリウムの水溶
液と接触させ、生じた複合体を乾燥することによ
り最初に高分子電解質重合体／ヘパリン複合体を
調製する。次に、これら樹脂／ヘパリン複合体を
用いて、ヘパリン溶液のこれ以上の外因的追加な
しに例１の手順に従い血液を分別する。 最初に、豚ヘパリン、ナトリウム塩（水50ml中
に溶解した1003単位）を (A) 水100ml中に懸濁した樹脂A300mg、および (B) 水200ml中に懸濁した樹脂B50ｇの各々へ加
える。 各場合において、通常の室温（約22〜25℃）で
かきまぜを１時間保つ。樹脂／ヘパリン複合体は
ホワツトマン＃54セルロース紙（製造業者によ
れば20〜25ミクロンで98％保持効力）上で過
し、続いて100mlずつの水で三回洗浄して未結合
ヘパリンを除去することにより単離される。次に
樹脂／ヘパリン複合体を血液分別過程で使用する
前に乾燥する。 血漿を例１で記述したのと実質的に同様に分別
するが、ただし樹脂／ヘパリン複合体を対応する
樹脂の代りに使用し、それ以上の外因的ヘパリン
添加を省く。 本例においては、樹脂Ａ／ヘパリン複合体処理
後の因子：Ｃ凝固活性の回収が、通常の実験誤
差の範囲内で定量的であつた（117％）。吸着およ
び樹脂Ｂ／ヘパリン複合体からの溶離後の全回収
はこの特別な例におけるもとの血漿のレベルの
78.4％であつた。 上記例１〜３において、樹脂Ａは米国特許第
4097473号および第4118554号明細書の例１ならび
に米国特許第4157431号明細書の例12に記載の反
応体およびモル割合を用いる方法に実質的に従つ
てつくつた。樹脂Ｂは米国特許第4157431号明細
書の例１に記載された反応体およびモル割合を用
いる方法に実質的に従つてつくつた。 例 ４ ジエチルアミノエチルアミンを等モル量のジメ
チルアミノプロピルアミンの代りに使用すると
き、そして（または）エチルイミノビスエチルア
ミンを等モル量のメチルイミノビスプロピルアミ
ンの代りに使用するとき、そして（または）エト
キシエチルアミンを、前記例１〜３における等モ
ル量のメチルプロピルアミンの代りに使用すると
き、上記例１〜３で得られたのと実質的に同様な
結果が得られる。 本発明の発表を読んだ後は、各種の他の例が本
発明の主旨と範囲からずれることなく当業者にと
つて明らかになるであろうが、すべてこのような
他の例は特許請求の範囲の中に包含されるものと
する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 血漿から因子：Ｃの濃縮物を製造する方法
において、 (イ) 血漿またはその濃縮物を、7.0から8.5までの
PHにおいて、水不溶性高分子電解質共重合体に
対して３モル％から10モル％までの低級アルキ
ルイミノビス（低級アルキルアミン）で橋かけ
結合されそして水不溶性高分子電解質共重合体
に対して90モル％から100モル％までのペンダ
ントジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミド
官能基を含むエチレンと無水マレイン酸との水
不溶性高分子電解質共重合体であつて、実質的
に等モル量のエチレン残基および無水マレイン
酸残基を含む水不溶性高分子電解質共重合体
0.01％から0.1重量％までと外因的ヘパリンの
存在下に混合し、 (ロ) その結果生じた吸着血漿画分から上澄を分離
し、 (ハ) 前記上澄を、5.5から6.5までのPHにおいて、
水不溶性高分子電解質共重合体に対して３モル
％から10モル％までの低級アルキルイミノビス
（低級アルキルアミン）で橋かけ結合され、水
不溶性高分子電解質共重合体に対して３モル％
から７モル％までのペンダントジ低級アルキル
アミノ低級アルキルイミド官能基を含み、更に
実質的にすべての残りの遊離カルボキシル部位
または無水物部位がアルコキシアルキルアミン
で封鎖されているという点で特徴づけられるエ
チレンと無水マレイン酸との水不溶性高分子電
解質共重合体であつて、実質的に等モル量のエ
チレン残基および無水マレイン酸残基を含む水
不溶性高分子電解質共重合体１％から10重量％
までと外因的ヘパリンの存在下に混合し、 (ニ) その結果生じた吸着血漿画分を上澄から分離
し、吸着剤からの溶離により因子：Ｃの濃縮
物を採取し、そして、 (ホ) 前記アルキルおよびアルコキシが１から４炭
素原子を有し、外因的ヘパリンが血漿１ml当た
り0.01から２単位までの範囲内にある ことを特徴とする上記方法。 ２ エチレンと無水マレイン酸との共重合体をメ
チルイミノビスプロピルアミンで橋かけ結合し、
ペンダントジ低級アルキルアミノ低級アルキルイ
ミド官能基がジメチルアミノプロピルイミドであ
る上記第１項の方法。 ３ 工程(イ)および(ハ)におけるヘパリン濃度が0.1
から１単位／mlである第１項の方法。 ４ 工程(イ)における高分子電解質共重合体の濃度
が0.03〜0.04％であり、工程(ハ)においては５〜６
％である上記第１項の方法。 ５ エチレンと無水マレイン酸との共重合体をメ
チルイミノビスプロピルアミンで橋かけ結合し、
ペンダントジ低級アルキルアミノ低級アルキルイ
ミド官能基がジメチルアミノプロピルイミドであ
り、工程(イ)と(ハ)におけるヘパリン濃度が0.1から
１単位／mlであり、そして工程(イ)における高分子
電解質共重合体の濃度が0.03〜0.04％また工程(ハ)
においては５〜６％である上記第１項の方法。 ６ 外因的ヘパリンを工程(イ)における血漿および
工程(ハ)における上澄みと共に溶液に添加する上記
第１項の方法。 ７ 外因的ヘパリンを工程(イ)における血漿および
工程(ハ)における上澄みと共に溶液に添加する上記
第５項の方法。 ８ 外因的ヘパリンを工程(イ)および(ハ)で使用する
高分子電解質共重合体と前複合化する上記第１項
の方法。 ９ 外因的ヘパリンを工程(イ)および(ハ)で使用する
高分子電解質共重合体と前複合化する上記第５項
の方法。
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