JPH0339519B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は強力な抗菌活性を示す新規なペプチド
に関する。 正常蚕に非経口的に不活性化大腸菌等の異物を
投与することにより蚕体液中にある腫の抗菌活性
物質が誘導されることが知られている〔蚕におけ
る生体防禦機構1.死菌ワクチン接種による抗菌物
質の誘導、肥山良之他、日本動物学会第49回大
会、一般講演集、379（1978）；同・蚕体液中の
抗菌活性物質の精製とその生物学的性状、大森和
則他同、380（1978）参照〕。 本明細書において、活性蚕体液とは上記のよう
にして抗菌活性物質が誘導された蚕体液をいい、
蚕の種及び投与する異物等には特に制限はない。 またアミノ酸等に関与して略号で表示する場合
はIUPAC、IUBの規定或いは当該分野における
慣用に従うものとして、その例を次に挙げる。 Asp：アスパラギン酸 Trp：トリプトフアン Ser：セリン Glu：グルタミン酸 Gly：グリシン Ala：アラニン Val：バリン Ile：イソロイシン Leu：ロイシン Met：メチオニン Phe：フエニルアラニン Lgs：リジン Hyl：δ−ヒドロキシリジン Asn：アスパラギン Arg：アルギニン Pro：プロリン 本発明者らは、活性蚕体液について更に研究を
重ねる過程において、著しく抗菌活性が強く、グ
ラム陽性菌およびグラム陰性菌に対し広い抗菌ス
ペクトルを示す物質の存在を認め、該物質を分離
することに成功した。本発明はこの知見に基づい
て完成されたものであり、即ち一般式(1) Ｈ−Arg−Trp−Lys−Ile−Phe−Lys−Lys−
Ile−Glu−Lys−Met−Gly−Arg−Asn−Ile−
Arg−Asp−Gly−Ile−Val−Ａ−Ala−Gly−
Pro−Ala−Ile−Glu−Val−Leu−Gly−Ser−
Ala−Lys−Ala−Ile−NH₂ 〔式中、ＡはLys又はHylを示す〕 で表わされるペプチド及びその塩に系る。上記一
般式(1)で表わされる本発明物質は抗菌活性を有
し、人及び動物用の抗菌剤として有用である。 本発明の上記物質を合成するに際してはこの種
ペプチドの合成に適用される通常のペプチド合成
法に従つて製造すれば良い。 また本発明の物質は例えば活性蚕体液より下記
に示す方法により製造される。 活性蚕体液としては、特に制限がなく、通常公
知の方法によつて得られる活性蚕体液をいずれも
使用することができる。 活性蚕体液より物質を分離精製するに際して
は、蛋白を分離するため通常行なわれている手段
を広く採用でき、例えば加熱処理、塩析等電点沈
殿、有機溶媒による分別沈殿等の蛋白質の溶解度
差を利用する方法、電気泳動法、イオン交換法等
の電気化学的性質差を利用する方法、超遠心分離
法等の質量差を利用する方法等の化学的乃至物理
的方法を適宜用いることができる。 より具体的にはまず活性蚕体液を熱処理し、次
に遠心分離して上清を得、この上清を塩析及びゲ
ル過して抗菌活性を有する２つのフラクシヨン
を得る。ここで分子量の大きいフラクシヨンをフ
ラクシヨンとし、また分子量の小さいフラクシ
ヨンをフラクシヨンとする。 次にフラクシヨンを、陽イオン交換体例えば
CMセフアデツクス、QAEセフアデツクス、CM
セルロース等を用いるイオン交換クロマトグラフ
に付し、抗菌活性を示すフラクシヨン（以下「フ
ラクシヨン」という）を得る。 次にフラクシヨンを塩析する。塩析に際して
は例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリムウ、硫
酸マグネシウム等の通常の塩析剤を用いることが
できる。斯かる塩析剤の使用量としては通常最終
濃度が20〜80％、好ましくは30〜70％となる程度
がよい。斯くして得られる塩析物を蒸留水、生理
食塩水、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、酢
酸緩衝液等の適当な緩衝液中に溶解し、脱塩処理
する。この脱塩処理はゲル過支持体例えばセフ
アデツクスＧ−10、Ｇ−25、Ｇ−50、バイオーゲ
ルＰ−２、Ｐ−４、Ｐ−６等を用いてゲル過す
ることにより容易に行なわれ、斯くして抗菌活性
を示す本発明物質を得る。これは更に、上記と同
様の操作をくり返して精製してもよく、またこれ
を蛋白分離用ゲル過カラムにより更に分離精製
することもできる。この場合高速液体クロマトを
用いるのが好ましく、例えばGPCゲル2000SW、
3000SW〔東洋曹達(株)製〕、プロテインカラム−
125〔ウオーターズ社製〕等が例示出来る。 上記で得られる本発明物質はこれを凍結乾燥す
ることにより白色粉末状として得ることができ
る。 本発明の物質は両性化合物であり、通常の医薬
として許容される酸性化合物又は塩基性化合物と
容易に塩を形成させることができる。 該酸性化合物としては例えば、塩酸、硫酸、リ
ン酸、臭化水素酸等の無機酸、シユウ酸、マレイ
ン酸、フマール酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン
酸、安息香酸等の有機酸をあげることができ、又
該塩基性化合物としては、例えば水酸化ナトリウ
ム、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化カ
ルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸
カリウム等の水酸化物及び炭酸化物及びアンモニ
ア、エチルアミン、ジエチルアミン等のアミン類
を例示できる。 本発明の一般式(1)で表わされるペプチド及びそ
の塩は、これを抗菌剤として用いるに当り、その
ままで又はこれらを有効成分として慣用の製剤担
体と共に、人及び動物に投与することができる。
その際投与経路及び投与単位形態は、特に制限さ
れず、例えば錠剤、顆粒剤、経口用溶液剤等の経
口剤、クリーム、軟膏剤などの非経口局所投与剤
や注射剤等の非経口剤度として、経口的にもしく
は非経口的に投与できる。有効成分の投与量は、
投与経路、投与単位形態、所望の薬理効果等に応
じて適宜決定される。通常１日当り体重１Kg当り
の有効成分投与量は、約0.1〜50mgとすればよく、
これは１日１回乃至３回に分けて投与できる。ま
た単位形態中に配合される有効成分量は約１〜
500mgとするのが適当である。上記の投与単位形
態は、常法に従い容易に製造され、その際用い得
る担体も通常のものでよい。例えば錠剤は、有効
成分を、ゼラチン、澱粉、乳糖、ステアリン酸マ
グネシウム、滑石、アラビアゴム等の賦形剤と混
合して賦形される。カプセル剤は有効成分を不活
性の製剤充填剤もしくは希釈剤と混合し、硬質ゼ
ラチンカプセル、軟質カプセル等に充填される。
また注射等の非経口投与用薬剤は有効成分を滅菌
した液状担体に溶解又は懸濁して製造される。好
ましい担体は水又は生理食塩水である。 以下、参考例、実施例及び抗菌活性試験を挙
げ、更に詳述するが、本発明はこれに限定される
ものではない。 参考例 蚕（鐘秋×鐘和、５令３日目）５千頭に３％ホ
ルマリンで殺菌処理した大腸菌（E.coli NIHJ）
の生理食塩懸濁液（10⁹個／ml）を0.05ml／頭の
割合で体腔内に注入する。注入後30時間後に蚕の
足を切断して体液を集め、活性蚕体液1500mlを得
る。 実施例 参考例で得た活性蚕体液500mlを100℃の湯浴上
にて10分間加熱し遠心分離する。上清を更に上記
と同様の熱処理及び遠心分離操作に付し、得られ
た上清を最終濃度20％の硫酸アンモニウムで塩析
する。塩析物を遠心分離し、その上清を最終濃度
70％の硫酸アンモニウムで塩析する。得られた塩
析物を蒸留水30mlに溶解し、セフアデツクスＧ−
25（2.5×80cm、脱イオン水）に付し、ゲル過す
る。各10mlのフラクシヨンを分取し抗菌活性のあ
るフラクシヨンNo.36〜39を集める（フラクシヨン
とする）。 このフラクシヨンを８mlに濃縮し、これを
CMセフアデツクスＣ−25（1.3×45cm）に付し、
０〜1Mの食塩水の濃度勾配溶出を行ない、各2.3
mlのフラクシヨンに分取した。該溶出パターンを
第１図に示す。第１図中タテ軸は280nｍにおけ
る吸光度を、横軸はフラクシヨンNo.を示す。 フラクシヨンNo.81〜95を集め、これを凍結乾燥
し、４％酢酸水溶液５mlに溶解してセフアデツク
スＧ−10（1.8×43cm、４％酢酸水溶液）に付し、
各３mlのフラクシヨンに分取した。 該溶出パターンを第２図に示す。第２図中タテ
軸は280nｍにおける吸光度を横軸はフラクシヨ
ンNo.を示す。 該フラクシヨンNo.12〜19を集め、これを凍結乾
燥して白色粉末状の物質8.2mgを得る。 かくして得られる本発明物質の各種性状を挙げ
れば以下の通りである。 Γ 紫外線吸収スペクトル； 約281nｍに極大吸収を有する。そのチヤー
トを第３図に示す。 Γ 呈色反応； ニンヒドリン反応が陽性である。 Γ 溶解性； 水に易溶、エーテル、クロロホルムに不溶で
ある。 Γ 薄層クロマトグラフイー（TLC）； 担体キーゼルゲル60（メルク社）において展
開溶媒（ブタノール：酢酸：水＝４：１：２）
では展開されず、（ブタノール：ピリジン：酢
酸：水＝50：23：27：40）においてRf値0.57を
示す。 Γ アミノ酸分析； ４％チオグリコール酸を含む6N−Hclにて、
110℃、20時間加水分解後、日立835型アミノ酸
アナライザーにて分析した結果を下記に示す。

〔抗菌活性試験〕

グラム陰性菌及びグラム陽性菌に対する本発明
物質の抗菌作用を調べるため、液体希釈法によつ
て最少増殖阻止濃度（MIC）を求めた「抗生物
質の基礎知識」南山堂、1970年１月25日発行、
P45〜55、改訂第３版参照〕。得られる結果を第
１表に示す。尚、各種菌は１×10⁵菌数／ml（ハ
ートインフエージヨンブロス（デイフコ社）に調
製した。第１表より本発明の物質の強い抗菌作用
が明らかである。

【表】 製剤例 １ 本発明の物質 500mg ブドウ糖 250mg注射用蒸留水 適量 全 量 ５ml 注射用蒸留水に本発明物質及びブドウ糖を溶解
させた、５mlのアンプルに注入する。 窒素で置
換後滅菌して注射剤を得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明物質を汚性蚕体液から製造する
過程に於いて生成する物質の溶出パターンを、ま
た第２図は同じく生成する他の物質の溶出パター
ンを示すグラフであり、第３図は本発明物質の紫
外線吸収スペクトルである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 Ｈ−Arg−Trp−Lys−Ile−Phe−Lys−Lys−
   Ile−Glu−Lys−Met−Gly−Arg−Asn−Ile−
   Arg−Asp−Gly−Ile−Val−Ａ−Ala−Gly−
   Pro−Ala−Ile−Glu−Val−Leu−Gly−Ser−
   Ala−Lys−Ala−Ile−NH₂ 〔式中、ＡはLys又はHylを示す〕 で表わされるペプチド及びその塩。