JPH0339680B2 - - Google Patents
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- JPH0339680B2 JPH0339680B2 JP56193324A JP19332481A JPH0339680B2 JP H0339680 B2 JPH0339680 B2 JP H0339680B2 JP 56193324 A JP56193324 A JP 56193324A JP 19332481 A JP19332481 A JP 19332481A JP H0339680 B2 JPH0339680 B2 JP H0339680B2
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
本発明はヒトIgE（ヒト免疫グロブリンＥ）の
製造法に関する。 ヒト免疫グロブリンはIgA、IgD、IgE、IgGお
よびIgMの５種類に分類される。これらのうち
IgG、IgAおよびIgMの正常人血清中での濃度は
IgE、IgDにくらべて比較的高い。しかし、IgEの
正常人血清中での濃度は0.01−0.07mg／dlとさ
れ、IgG（1000−1400mg／dl）などに比較して極
めて低く、正常人血清よりIgEを精製することは
極めて困難であつた。IgEは通常肥満細胞および
好塩基球に固着しており、抗原と反応することに
より、それらの細胞からヒスタミンなどの生物活
性を有する物質を放出させＩ型アレルギーなどを
引き起こす。このようにして惹起されるアレルギ
ーの予防や治療の研究あるいは診断用試薬の調製
などには高純度のヒトIgEが必要とされている。
しかしながら、ヒトIgEはIgEが高濃度に含有さ
れている骨髄腫患者血清から硫安塩析、イオン交
換クロマトグラフイーおよびゲル過などを組み
合わせる方法により精製されており、現状では、
随時、同一種の標品を任意の量取得することは不
可能である。 本発明者らは、株化ヒト骨髄腫細胞の培養によ
り大量のヒトIgEを生成させ、これを採取するこ
とに成功し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、ヒトIgE産性能を有する
株化ヒト骨髄腫細胞を培養し、培養液中にヒト
IgEを生成蓄積せしめ、アミノ酸結合水不溶性担
体を用いてアフイニテイークロマトグラフイーを
行なつてヒトIgEを分離、採取することを特徴と
するヒトIgEの製造法である。 本発明に用いるヒトIgE産性能を有する株化ヒ
ト骨髄腫細胞は例えば、ヒトIgEが検出される骨
髄腫患者のヒト血液を材料に自体公知の方法〔例
えば、クリニカルアンドクスペリメンタル・イム
ノロジー、第７巻、477頁（1970年）参照〕によ
り作製することができる。すなわち、例えばヘパ
リンを添加した上記ヒト血液を試験管内に入れ、
垂直に約1.5時間保ち、赤血球を沈澱させた後、
白血球を含む血漿部分を吸引採取し、約1000回転
で約10分間遠心して細胞を集める。この細胞を培
地、例えば10％子ウシ胎児血清、ペニシリン
100IE／ml、ストレプトマイシン50μｇ／mlおよ
びアンフオテリシンB1.25μｇ／mlを含む栄養培
地Ｆ−10に浮遊させ、グリツド上に作製したスポ
ンジ状のゼラチンの上に播種した。増殖した細胞
を50〜100ml容のエーレンマイヤーフラスコ内の
上記培地に移し、RIST法〔Radio immuno
sorbent test（イムノロジー、第14巻、265頁
（1968年））〕によりIgEの産生を観察しつつ、グ
リツド培養開始から３〜４カ月培養して株化ヒト
骨髄腫細胞を作製する。 本発明のヒトIgEの製造にはこのようにして作
製した株化ヒト骨髄腫細胞を用いることができる
が、とりわけ株化ヒト骨髄腫細胞Ｕ−266を用い
ることが好ましい。なおＵ−266は文献記載の株
化細胞である（イムノロジー、第38巻、63頁
（1979年））。 ヒトIgE産生能を有する細胞の培養に際して用
いられる培地は該細胞が生育増殖してヒトIgEを
蓄積し得るものであればどのようなものでもよ
い。望ましくは培地中に抗生物質および緩衝液を
添加する。 培地成分としては、例えば種々の動物血清を用
いることができるが、ウシ胎児血清が好ましく通
常５〜20％となるように培地に添加する。抗生物
質としては、例えばカナマイシン、ペニシリン、
ストレプトマイシンが挙げられ、これらを通常
0.05〜１mg／mlの濃度となるように加える。緩衝
液として、例えばＮ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−N′−２−エタンスルホン酸を５〜100ｍ
Ｍとなるように加えることもできる。 培養は、ローラーボトルやスピンナーフラスコ
を用いて行なうが、ローラーボトルで培養した後
スピンナーフラスコで培養してこの培養物をヒト
IgEの分離、採取に共するのが好ましい。この方
法によれば、細胞の増殖能およびヒトIgE産生能
を低下させることなく有利に継代培養することが
できる。 すなわち、例えば、まず該細胞を0.5×105〜10
×105／mlの細胞濃度でローラーボトル内の培地
に接種し、ボトルを0.5〜５回転／分で回転させ、
２〜10日間培養した後、培養物を同培地により１
〜５倍に希釈し、この一部をスピンナーフラスコ
に移し、ボトル内の回転子を30〜150回転／分で
回転させて３〜12日間培養する。培養温度はいず
れの場合も15〜40℃が好ましい。 ヒトIgE産生能を有する細胞を培養して得られ
る培養物中にはヒトIgEが生成蓄積される。ヒト
IgEは主として培養液中に分泌されるので、培養
液を一旦遠心分離して細胞を除去したあとの上清
液からアミノ酸結合水不溶性担体を用いるアフイ
ニテイークロマトグラフイーを行なつてヒトIgE
を分離、採取する。遠心上清液からのヒトIgEの
分離、採取は、ヒトIgEの物理化学的特性にもと
づいて種々の方法を上記アフイニテイークロマト
グラフイーに組み合わせることにより行ない得
る。すなわち、例えば硫安塩析、アミノ酸結合水
不溶性担体を用いるアフイニテイクロマトグラフ
イー、イオン交換カラムクロマトグラフイー、ゲ
ル過および抗ウシ血清抗体結合水不溶性担体を
用いるアフイニテイークロマトグラフイーなどの
分離、精製手段から適宜選択し、組み合わせて使
用することができるが、とりわけ上記記載のこれ
らの手段をこの順番に用いるのがよい。 硫安塩析は通常行なわれている手段を適応すれ
ばよく、例えば硫安40〜55％飽和で沈澱する画分
を遠心分離により採取し、リン酸緩衝液−食塩水
に溶解した後、同緩衝液に対して20〜40時間透析
する。緩衝液は途中で交換することが好ましい。
これらの操作は通常低温（０〜10℃）で行なわれ
る。 アミノ酸結合水不溶性担体を用いるアフイニテ
イークロマトグラフイーにおいてはリジン、グリ
シンなど各種アミノ酸類を用いることができる
が、リジンを用い、例えばカトレカサスの方法
〔プロシーデイングスオブザナシヨナルアカデミ
ーオブサイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A）、第61巻、636頁（1968年）〕によりリジン結
合水不溶性担体が調製される。クロマトグラフイ
ーは公知の手段によつて行なわれるが、用いる緩
衝液に10〜40％の糖類、例えばデキストロース、
マルトースなどを含有させてもよい。得られたヒ
トIgEを含む画分は、通常の手段、例えば限外
過膜を用いる方法、あるいは凍結乾燥により濃縮
すれば容易に後処理、例えばトリスーリン酸緩衝
液に対する透析、に付することができる。 イオン交換カラムクロマトグラフイーにおいて
はDEAE−セルロースなど市販のクロマトグラフ
イー担体を用いることができる。緩衝液としては
トリスーリン酸緩衝液などを用い、得られたヒト
IgEを含む画分の濃縮には限外過膜などを用い
ることができる。 ゲル過は、例えばセフアクリルカラムを用い
て公知の手段を適用して実施される。ヒトIgEを
含む画分を、例えば限外過膜を用いる方法によ
り濃縮後さらに濃縮液を、例えばセフアクリルカ
ラムにかけ、リサイクリングクロマトグラフイー
を実施することが好ましい。しかし、上記のゲル
過において長いカラム（３〜４ｍ）を用いるこ
とによりこのリサイクリングクロマトグラフイー
を省略することもできる。 抗ウシ血清抗体結合水不溶性担体を用いるアフ
イニテイークロマトグラフイーにおいては、例え
ばカトレカサスの方法（前記した同著者の文献参
照）により調製した抗ウシ血清ウサギIgG結合セ
フアロースカラムなどを用いることができる。溶
出に用いる緩衝液、としてはリン酸緩衝液−食塩
水などが挙げられるが、同緩衝液に糖類、例えば
マルトース、デキストロースなどを10〜40％とな
るように添加して用いることが好ましい。得らえ
たヒトIgEを含む画分は限外過膜などにより濃
縮する。必要に応じてこのクロマトグラフイーを
２〜５回繰り返す。なお、用いたカラムは公知の
手段により再生することができる。 本発明により得られるヒトIgEを含む画分を凍
結乾燥することにより、ヒトIgEを長期間安定に
保存することができる。本操作を実施するに際
し、ヒトIgEを含む画分に糖類、例えばマルトー
ス、デキストロースなどを添加することが好まし
い。 以上、ヒトIgE産生能を有する株化ヒト骨髄腫
細胞を大量に培養し、得られた培養液からアミノ
酸結合水不溶性担体を用いるアフイニテイークロ
マトグラフイーを行なつてヒトIgEを分離、採取
するヒトIgEの製造法について詳述した。 本発明によつて得られる高純度のヒトIgEは公
知の方法によりヒト血清から得られるヒトIgEと
同様に血中IgE濃度を測定するためのキツトの標
準品として使用でき、また、アレルギーの予防や
治療に関する研究にも広く応用できる。さらに、
本発明によつて得られるヒトIgEを免疫原として
抗ヒトIgE血清あるいは抗ヒトIgEモノクローナ
ル抗体を作製することもできる。 すなわち、該ヒトIgEを公知の方法〔例えば、
イムノロジー、第13巻、381頁（1967年）参照〕
により哺乳動物に接種、免疫することにより抗ヒ
トIgE抗血清を製造することができる。 とりわけ、本発明により得られるヒトIgEでヤ
ギを免疫することにより高力価の抗ヒトIgE抗血
清を得ることができる。 また、抗ヒトIgEモノクローナル抗体は次のよ
うにして作製できる。 すなわち、例えば該ヒトIgEを必要によりアジ
ユバント、例えばフロイント、コンプリートアジ
ユバントと共に、マウスに２〜６週間にわたつ
て、３〜４回皮下に接種する。但し、最終免疫は
ヒトIgEのみを静脈内に接種することが望まし
い。免疫されたマウスの脾細胞をとり出しこの細
胞と８−アザグアニン抵抗性マウスミエローマ細
胞株、例えばP3−×63・Ag8・U1などとをポリ
エチレングリコール、例えばポリエチレングリコ
ール6000などを用いて融合させる。常法に従い、
得られた細胞懸濁液の一定量をHAT（ヒポキサ
ンチン、アミノプテリンおよびチミジン）含有培
地を含むマルチデイツシユの各ウエルに播種し
て、融合細胞のみを選択的に増殖させる。増殖の
みられたウエルの培養上清の抗ヒトIgE抗体産生
量を、ラジオノムノアツセイ法等により測定し
て、高い抗体価を示したウエル中のハイブリドー
マ細胞を限界希釈法によりクローニングする。単
一細胞由来の細胞群として増殖させた後、再び抗
体価の測定を行い、抗体価の高いクローンを選ぶ
ことができる。得られたハイブリドーマ細胞を同
系マウス腹腔内に接種し、細胞を腹水中で増殖さ
せることにより、腹水中に抗ヒトIgE抗体を、生
成蓄積させる。採取した腹水から硫安塩析、
DEAE−セルロースカラムクロマトグラフイーな
どにより抗ヒトIgEモノクローナル抗体を容易に
取得できる。 以上のようにして得られる抗ヒトIgE抗血清お
よび抗ヒトIgEモノクローナル抗体はアレルギー
診断用試薬の材料として使うこともできるが、さ
らに以下に述べるように、これらを水不溶性担体
に化学的に結合させることによりヒトIgEの精製
にも利用できる。 すなわち、抗ヒトIgEモノクローナル抗体を、
例えば水不溶性担体に結合させ、抗ヒトIgEモノ
クローナル抗体結合水不溶性担体カラムを調製し
て、通常のアフイニテイークロマトグラフイーに
よりヒトIgE含有物、例えばヒトIgE産生能を有
する細胞株の培養物からのヒトIgEの分離、精製
に供することができる。クロマトグラフイーの溶
出溶媒としては酢酸−食塩水、プロピオン酸−食
塩水、グリシン−塩酸−食塩水などが通常用いら
れるが、該溶媒は必要により糖類、例えばマルト
ース、デキストロースなどを含んでいてもよい。
抗ヒトIgEモノグローナル抗体結合水不溶性担体
カラムによるアフイニテイークロマトグラフイー
によれば、手軽に高純度のヒトIgEが得られ、抗
ヒトIgEモノクローナル抗体はヒトIgEの分離、
精製に極めて有効に利用できる。 以下に本発明を実施例および参考例により具体
的に説明する。 実施例 (1) 株化ヒト骨髄腫細胞Ｕ−266を40本のローラ
ーボトルRC−94（長さ50cm、直径11cm、N.B.S.
社〔米国〕製）内のＮ−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸25ｍ
Ｍ、カナマイシン（明治製菓製）100μｇ／ml
およびウシ胎児血清（ミクロバイオロジカルア
ソシエート社〔米国〕製）10％を含むRPMI−
1640培地〔ジヤーナルオブアメリカンメデカル
アソシエーシヨン、第199巻、519頁（1967年）〕
500mlに2.0×105〜2.5×105／mlの細胞濃度とな
るように接種して37℃で１分間当り１回転ボト
ルを回転させながら４〜５日間培養した。細胞
濃度が４×105〜５×105／mlに達した時上記の
培地で約２倍に希釈して、細胞数を2.5×105〜
2.5×105／mlとした。得られた細胞懸濁希釈液
のうち、20は細胞の継代に使用するために再
びローラーボトルを用い同一条件で培養した。
残りの20は培養容量８および15のスピン
ナーフラスコ（ベルコグラス社〔米国〕製）に
移し、ボトル内の回転子を75回転／分で回転さ
せて５〜６日間37℃で培養した。培養物をトミ
ー連続遠心機を用いて連続遠心（3000回転／
分；流量120ml／分）してヒトIgEを含む培養
上清を得た。 (2) 前記２回の培養で得られた培養上清40の硫
安塩析（硫安40〜55％飽和）は５℃で行ない、
生じた沈澱をベツクマン遠心機Ｊ−6Bを用い
て遠心分離（J.S−4.2ローター；4000回転／
分；60分）することにより採取した。沈澱物を
リン酸緩衝液−食塩水（PBS；8.1ｍ
MNaH2PO4、1.5ｍMKH2PO4、2.7ｍMKCl、
13.7ｍMNaCl、pH7.2）1000mlに溶解したの
ち、溶解液の硫安を除くために同緩衝液10に
対して５℃で40時間透析した。なお、途中で１
回緩衝液を交換した。 (3) カトレカサスらの方法（前記した同著者の文
献参照）により調製したリジン−セフアロース
4Bカラム（3.6×25.5cm）を0.1％Tween20を含
むPBSにより平衡化して、(2)で得られた透析
内液の1/6量（200ml）を同カラムにかけたの
ち、同緩衝液400mlおよび20％デキストロース
を含む同緩衝液2000mlを用いてカラムからヒト
IgEを溶出した。ついで、ヒトIgEを含む画分
を限外過膜（ダイアフロー膜PM−10、アミ
コン・フアー・イースト社〔米国〕製）により
濃縮した。この操作を６回繰り返して得られた
全濃縮液340mlを4000mlの60ｍＭトリスーリン
酸緩衝液（pH8.0）に対して５℃で40時間透析
した。なお、途中で１回緩衝液を交換した。 (4) (3)で得られた透析内液340mlを蒸留水で６倍
に希釈し、希釈液の半量1020mlをあらかじめ10
ｍＭトリスーリン酸緩衝液（pH8.0）で平衡化
したDEAE−セフアセルカラム（4.8×28cm）
にかけた。カラムを1600mlの同緩衝液で洗浄
後、ミキシングチエンバーに同緩衝液2400mlを
入れ、リザーバーには70ｍＭトリスーリン酸緩
衝液（pH8.0）2400mlを入れて作製した直線濃
度勾配によりヒトIgEを溶出した。ヒトIgEを
含む画分2000mlをすみやかに集め、10倍濃度の
PBS100mlを加え限外過膜（ダイアフロー膜
PM−10）を用いて30mlに濃縮した。残りの希
釈液を同様に処理して合計60mlの濃縮液を得
た。 (5) あらかじめPBSで平衡化したセフアクリル
Ｓ−300カラム（５×95cm）に(4)で得られた濃
縮液60mlをかけ、同緩衝液を用いてヒトIgEを
溶出した。ヒトIgEを含む溶出画分を限外過
膜（ダイアフロー膜PM−10）を用いて40mlに
濃縮した。 (6) (5)で得られた濃縮液40mlを再度(5)で用いたセ
フアクリルＳ−300カラムにかけた。カラムか
らの溶出液の280nｍにおける吸光度を紫外線
検出器（ユピコードＳ紫外線吸収計、LKB社
〔スエーデン〕製）を用いてモニターしながら、
溶出液をカラムに２回循環させたのち、ヒト
IgEを含む画分をフラクシヨンコレクターによ
り集めた（リサイクリングクロマトグラフイ
ー）。ヒトIgEを含む画分は限外過膜（ダイ
アフロー膜PH−10）により26mlに濃縮した。 (7) カトレカサスらの方法（前記した同著者の文
献参照）により調製した抗ウシ血清ウサギIgG
結合セフアロース4Bカラム（1.8×30cm）を
PBSで平衡化して(6)で得られた濃縮液26mlを
カラムにかけた。カラムを素通りする画分を集
め、さらに20％マルトースを含む同緩衝液300
mlでカラムを洗浄した。ヒトIgEを含む画分を
集めて、限外過膜（ダイアフロー膜PH−
10）により15mlに濃縮した。この吸収操作を３
回繰り返した。本カラムは5MNaSCN150ml、
ついでPBS200mlで洗浄することにより再生し
た。 (8) 精製したヒトIgEを長期間安定に保存するた
め(7)で得られた濃縮液を２ml容のバイアルビン
に１mlづつそのまま分注して凍結乾燥を行なつ
た。溶媒として用いた緩衝液にマルトース20％
を含ませた。 (9) (8)で得られたヒトIgEの純度をドデシル硫酸
ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル電気
泳動〔ラエムリの方法〔ネーチヤー、第227巻、
680頁（1970年）〕〕により調べた結果、99％以
上であつた。本標品中に含まれるウシIgG、ウ
シIgAなどの培地由来の夾雑蛋白質はオクタロ
ニー法〔プログレスインアレルギー、第５巻、
11頁（1958年）〕および一元平板拡散法〔イム
ノケムストリー、第２巻、235頁（1965年）〕な
どの免疫化学的方法で検出限度以下（0.2％以
下）であつた。なお、培養上清液からのヒト
IgEの収率は29％（RIST法）であつた。得ら
れたヒトIgE最終標品の物理化学的性質は下記
のとおりであつた。 () 分子量： 220000±30000 分子量は前述のラエムリのポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により測定した。なお、分子
量測定用標準蛋白質としてバイオーラツド
（Bio−Rad）社（米国）製のSDS−PAGEスタ
ンダード、ハイモレキユラーウエイトを使用し
た。ヒトIgEは標準蛋白質ミオシン（分子量
200000）よりも相対易動度の小さい位置に単一
バンドあるいは泳動条件によつては２本のバン
ドとして検出された。 () 紫外部スペクトル： 吸収極大は280nｍに、また吸収極小は251n
ｍに存在した。 () 等電点： 7.4付近 等電点はクロマトフオーカシング法により測
定した。 () アミノ酸組成（表１）： ヒトIgEに定沸点塩酸を加え、110℃で24時
間加水分解したのち、日立製835型高速アミノ
酸自動分析装置によりアミノ酸分析した。シス
チンおよびシステインの定量はハースの方法
〔メソドインエンザイモロジー、第11巻、197頁
（1967年）〕により、ヒトIgEを過ギ酸酸化しシ
ステイン酸として定量した。
製造法に関する。 ヒト免疫グロブリンはIgA、IgD、IgE、IgGお
よびIgMの５種類に分類される。これらのうち
IgG、IgAおよびIgMの正常人血清中での濃度は
IgE、IgDにくらべて比較的高い。しかし、IgEの
正常人血清中での濃度は0.01−0.07mg／dlとさ
れ、IgG（1000−1400mg／dl）などに比較して極
めて低く、正常人血清よりIgEを精製することは
極めて困難であつた。IgEは通常肥満細胞および
好塩基球に固着しており、抗原と反応することに
より、それらの細胞からヒスタミンなどの生物活
性を有する物質を放出させＩ型アレルギーなどを
引き起こす。このようにして惹起されるアレルギ
ーの予防や治療の研究あるいは診断用試薬の調製
などには高純度のヒトIgEが必要とされている。
しかしながら、ヒトIgEはIgEが高濃度に含有さ
れている骨髄腫患者血清から硫安塩析、イオン交
換クロマトグラフイーおよびゲル過などを組み
合わせる方法により精製されており、現状では、
随時、同一種の標品を任意の量取得することは不
可能である。 本発明者らは、株化ヒト骨髄腫細胞の培養によ
り大量のヒトIgEを生成させ、これを採取するこ
とに成功し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、ヒトIgE産性能を有する
株化ヒト骨髄腫細胞を培養し、培養液中にヒト
IgEを生成蓄積せしめ、アミノ酸結合水不溶性担
体を用いてアフイニテイークロマトグラフイーを
行なつてヒトIgEを分離、採取することを特徴と
するヒトIgEの製造法である。 本発明に用いるヒトIgE産性能を有する株化ヒ
ト骨髄腫細胞は例えば、ヒトIgEが検出される骨
髄腫患者のヒト血液を材料に自体公知の方法〔例
えば、クリニカルアンドクスペリメンタル・イム
ノロジー、第７巻、477頁（1970年）参照〕によ
り作製することができる。すなわち、例えばヘパ
リンを添加した上記ヒト血液を試験管内に入れ、
垂直に約1.5時間保ち、赤血球を沈澱させた後、
白血球を含む血漿部分を吸引採取し、約1000回転
で約10分間遠心して細胞を集める。この細胞を培
地、例えば10％子ウシ胎児血清、ペニシリン
100IE／ml、ストレプトマイシン50μｇ／mlおよ
びアンフオテリシンB1.25μｇ／mlを含む栄養培
地Ｆ−10に浮遊させ、グリツド上に作製したスポ
ンジ状のゼラチンの上に播種した。増殖した細胞
を50〜100ml容のエーレンマイヤーフラスコ内の
上記培地に移し、RIST法〔Radio immuno
sorbent test（イムノロジー、第14巻、265頁
（1968年））〕によりIgEの産生を観察しつつ、グ
リツド培養開始から３〜４カ月培養して株化ヒト
骨髄腫細胞を作製する。 本発明のヒトIgEの製造にはこのようにして作
製した株化ヒト骨髄腫細胞を用いることができる
が、とりわけ株化ヒト骨髄腫細胞Ｕ−266を用い
ることが好ましい。なおＵ−266は文献記載の株
化細胞である（イムノロジー、第38巻、63頁
（1979年））。 ヒトIgE産生能を有する細胞の培養に際して用
いられる培地は該細胞が生育増殖してヒトIgEを
蓄積し得るものであればどのようなものでもよ
い。望ましくは培地中に抗生物質および緩衝液を
添加する。 培地成分としては、例えば種々の動物血清を用
いることができるが、ウシ胎児血清が好ましく通
常５〜20％となるように培地に添加する。抗生物
質としては、例えばカナマイシン、ペニシリン、
ストレプトマイシンが挙げられ、これらを通常
0.05〜１mg／mlの濃度となるように加える。緩衝
液として、例えばＮ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−N′−２−エタンスルホン酸を５〜100ｍ
Ｍとなるように加えることもできる。 培養は、ローラーボトルやスピンナーフラスコ
を用いて行なうが、ローラーボトルで培養した後
スピンナーフラスコで培養してこの培養物をヒト
IgEの分離、採取に共するのが好ましい。この方
法によれば、細胞の増殖能およびヒトIgE産生能
を低下させることなく有利に継代培養することが
できる。 すなわち、例えば、まず該細胞を0.5×105〜10
×105／mlの細胞濃度でローラーボトル内の培地
に接種し、ボトルを0.5〜５回転／分で回転させ、
２〜10日間培養した後、培養物を同培地により１
〜５倍に希釈し、この一部をスピンナーフラスコ
に移し、ボトル内の回転子を30〜150回転／分で
回転させて３〜12日間培養する。培養温度はいず
れの場合も15〜40℃が好ましい。 ヒトIgE産生能を有する細胞を培養して得られ
る培養物中にはヒトIgEが生成蓄積される。ヒト
IgEは主として培養液中に分泌されるので、培養
液を一旦遠心分離して細胞を除去したあとの上清
液からアミノ酸結合水不溶性担体を用いるアフイ
ニテイークロマトグラフイーを行なつてヒトIgE
を分離、採取する。遠心上清液からのヒトIgEの
分離、採取は、ヒトIgEの物理化学的特性にもと
づいて種々の方法を上記アフイニテイークロマト
グラフイーに組み合わせることにより行ない得
る。すなわち、例えば硫安塩析、アミノ酸結合水
不溶性担体を用いるアフイニテイクロマトグラフ
イー、イオン交換カラムクロマトグラフイー、ゲ
ル過および抗ウシ血清抗体結合水不溶性担体を
用いるアフイニテイークロマトグラフイーなどの
分離、精製手段から適宜選択し、組み合わせて使
用することができるが、とりわけ上記記載のこれ
らの手段をこの順番に用いるのがよい。 硫安塩析は通常行なわれている手段を適応すれ
ばよく、例えば硫安40〜55％飽和で沈澱する画分
を遠心分離により採取し、リン酸緩衝液−食塩水
に溶解した後、同緩衝液に対して20〜40時間透析
する。緩衝液は途中で交換することが好ましい。
これらの操作は通常低温（０〜10℃）で行なわれ
る。 アミノ酸結合水不溶性担体を用いるアフイニテ
イークロマトグラフイーにおいてはリジン、グリ
シンなど各種アミノ酸類を用いることができる
が、リジンを用い、例えばカトレカサスの方法
〔プロシーデイングスオブザナシヨナルアカデミ
ーオブサイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A）、第61巻、636頁（1968年）〕によりリジン結
合水不溶性担体が調製される。クロマトグラフイ
ーは公知の手段によつて行なわれるが、用いる緩
衝液に10〜40％の糖類、例えばデキストロース、
マルトースなどを含有させてもよい。得られたヒ
トIgEを含む画分は、通常の手段、例えば限外
過膜を用いる方法、あるいは凍結乾燥により濃縮
すれば容易に後処理、例えばトリスーリン酸緩衝
液に対する透析、に付することができる。 イオン交換カラムクロマトグラフイーにおいて
はDEAE−セルロースなど市販のクロマトグラフ
イー担体を用いることができる。緩衝液としては
トリスーリン酸緩衝液などを用い、得られたヒト
IgEを含む画分の濃縮には限外過膜などを用い
ることができる。 ゲル過は、例えばセフアクリルカラムを用い
て公知の手段を適用して実施される。ヒトIgEを
含む画分を、例えば限外過膜を用いる方法によ
り濃縮後さらに濃縮液を、例えばセフアクリルカ
ラムにかけ、リサイクリングクロマトグラフイー
を実施することが好ましい。しかし、上記のゲル
過において長いカラム（３〜４ｍ）を用いるこ
とによりこのリサイクリングクロマトグラフイー
を省略することもできる。 抗ウシ血清抗体結合水不溶性担体を用いるアフ
イニテイークロマトグラフイーにおいては、例え
ばカトレカサスの方法（前記した同著者の文献参
照）により調製した抗ウシ血清ウサギIgG結合セ
フアロースカラムなどを用いることができる。溶
出に用いる緩衝液、としてはリン酸緩衝液−食塩
水などが挙げられるが、同緩衝液に糖類、例えば
マルトース、デキストロースなどを10〜40％とな
るように添加して用いることが好ましい。得らえ
たヒトIgEを含む画分は限外過膜などにより濃
縮する。必要に応じてこのクロマトグラフイーを
２〜５回繰り返す。なお、用いたカラムは公知の
手段により再生することができる。 本発明により得られるヒトIgEを含む画分を凍
結乾燥することにより、ヒトIgEを長期間安定に
保存することができる。本操作を実施するに際
し、ヒトIgEを含む画分に糖類、例えばマルトー
ス、デキストロースなどを添加することが好まし
い。 以上、ヒトIgE産生能を有する株化ヒト骨髄腫
細胞を大量に培養し、得られた培養液からアミノ
酸結合水不溶性担体を用いるアフイニテイークロ
マトグラフイーを行なつてヒトIgEを分離、採取
するヒトIgEの製造法について詳述した。 本発明によつて得られる高純度のヒトIgEは公
知の方法によりヒト血清から得られるヒトIgEと
同様に血中IgE濃度を測定するためのキツトの標
準品として使用でき、また、アレルギーの予防や
治療に関する研究にも広く応用できる。さらに、
本発明によつて得られるヒトIgEを免疫原として
抗ヒトIgE血清あるいは抗ヒトIgEモノクローナ
ル抗体を作製することもできる。 すなわち、該ヒトIgEを公知の方法〔例えば、
イムノロジー、第13巻、381頁（1967年）参照〕
により哺乳動物に接種、免疫することにより抗ヒ
トIgE抗血清を製造することができる。 とりわけ、本発明により得られるヒトIgEでヤ
ギを免疫することにより高力価の抗ヒトIgE抗血
清を得ることができる。 また、抗ヒトIgEモノクローナル抗体は次のよ
うにして作製できる。 すなわち、例えば該ヒトIgEを必要によりアジ
ユバント、例えばフロイント、コンプリートアジ
ユバントと共に、マウスに２〜６週間にわたつ
て、３〜４回皮下に接種する。但し、最終免疫は
ヒトIgEのみを静脈内に接種することが望まし
い。免疫されたマウスの脾細胞をとり出しこの細
胞と８−アザグアニン抵抗性マウスミエローマ細
胞株、例えばP3−×63・Ag8・U1などとをポリ
エチレングリコール、例えばポリエチレングリコ
ール6000などを用いて融合させる。常法に従い、
得られた細胞懸濁液の一定量をHAT（ヒポキサ
ンチン、アミノプテリンおよびチミジン）含有培
地を含むマルチデイツシユの各ウエルに播種し
て、融合細胞のみを選択的に増殖させる。増殖の
みられたウエルの培養上清の抗ヒトIgE抗体産生
量を、ラジオノムノアツセイ法等により測定し
て、高い抗体価を示したウエル中のハイブリドー
マ細胞を限界希釈法によりクローニングする。単
一細胞由来の細胞群として増殖させた後、再び抗
体価の測定を行い、抗体価の高いクローンを選ぶ
ことができる。得られたハイブリドーマ細胞を同
系マウス腹腔内に接種し、細胞を腹水中で増殖さ
せることにより、腹水中に抗ヒトIgE抗体を、生
成蓄積させる。採取した腹水から硫安塩析、
DEAE−セルロースカラムクロマトグラフイーな
どにより抗ヒトIgEモノクローナル抗体を容易に
取得できる。 以上のようにして得られる抗ヒトIgE抗血清お
よび抗ヒトIgEモノクローナル抗体はアレルギー
診断用試薬の材料として使うこともできるが、さ
らに以下に述べるように、これらを水不溶性担体
に化学的に結合させることによりヒトIgEの精製
にも利用できる。 すなわち、抗ヒトIgEモノクローナル抗体を、
例えば水不溶性担体に結合させ、抗ヒトIgEモノ
クローナル抗体結合水不溶性担体カラムを調製し
て、通常のアフイニテイークロマトグラフイーに
よりヒトIgE含有物、例えばヒトIgE産生能を有
する細胞株の培養物からのヒトIgEの分離、精製
に供することができる。クロマトグラフイーの溶
出溶媒としては酢酸−食塩水、プロピオン酸−食
塩水、グリシン−塩酸−食塩水などが通常用いら
れるが、該溶媒は必要により糖類、例えばマルト
ース、デキストロースなどを含んでいてもよい。
抗ヒトIgEモノグローナル抗体結合水不溶性担体
カラムによるアフイニテイークロマトグラフイー
によれば、手軽に高純度のヒトIgEが得られ、抗
ヒトIgEモノクローナル抗体はヒトIgEの分離、
精製に極めて有効に利用できる。 以下に本発明を実施例および参考例により具体
的に説明する。 実施例 (1) 株化ヒト骨髄腫細胞Ｕ−266を40本のローラ
ーボトルRC−94（長さ50cm、直径11cm、N.B.S.
社〔米国〕製）内のＮ−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−N′−２−エタンスルホン酸25ｍ
Ｍ、カナマイシン（明治製菓製）100μｇ／ml
およびウシ胎児血清（ミクロバイオロジカルア
ソシエート社〔米国〕製）10％を含むRPMI−
1640培地〔ジヤーナルオブアメリカンメデカル
アソシエーシヨン、第199巻、519頁（1967年）〕
500mlに2.0×105〜2.5×105／mlの細胞濃度とな
るように接種して37℃で１分間当り１回転ボト
ルを回転させながら４〜５日間培養した。細胞
濃度が４×105〜５×105／mlに達した時上記の
培地で約２倍に希釈して、細胞数を2.5×105〜
2.5×105／mlとした。得られた細胞懸濁希釈液
のうち、20は細胞の継代に使用するために再
びローラーボトルを用い同一条件で培養した。
残りの20は培養容量８および15のスピン
ナーフラスコ（ベルコグラス社〔米国〕製）に
移し、ボトル内の回転子を75回転／分で回転さ
せて５〜６日間37℃で培養した。培養物をトミ
ー連続遠心機を用いて連続遠心（3000回転／
分；流量120ml／分）してヒトIgEを含む培養
上清を得た。 (2) 前記２回の培養で得られた培養上清40の硫
安塩析（硫安40〜55％飽和）は５℃で行ない、
生じた沈澱をベツクマン遠心機Ｊ−6Bを用い
て遠心分離（J.S−4.2ローター；4000回転／
分；60分）することにより採取した。沈澱物を
リン酸緩衝液−食塩水（PBS；8.1ｍ
MNaH2PO4、1.5ｍMKH2PO4、2.7ｍMKCl、
13.7ｍMNaCl、pH7.2）1000mlに溶解したの
ち、溶解液の硫安を除くために同緩衝液10に
対して５℃で40時間透析した。なお、途中で１
回緩衝液を交換した。 (3) カトレカサスらの方法（前記した同著者の文
献参照）により調製したリジン−セフアロース
4Bカラム（3.6×25.5cm）を0.1％Tween20を含
むPBSにより平衡化して、(2)で得られた透析
内液の1/6量（200ml）を同カラムにかけたの
ち、同緩衝液400mlおよび20％デキストロース
を含む同緩衝液2000mlを用いてカラムからヒト
IgEを溶出した。ついで、ヒトIgEを含む画分
を限外過膜（ダイアフロー膜PM−10、アミ
コン・フアー・イースト社〔米国〕製）により
濃縮した。この操作を６回繰り返して得られた
全濃縮液340mlを4000mlの60ｍＭトリスーリン
酸緩衝液（pH8.0）に対して５℃で40時間透析
した。なお、途中で１回緩衝液を交換した。 (4) (3)で得られた透析内液340mlを蒸留水で６倍
に希釈し、希釈液の半量1020mlをあらかじめ10
ｍＭトリスーリン酸緩衝液（pH8.0）で平衡化
したDEAE−セフアセルカラム（4.8×28cm）
にかけた。カラムを1600mlの同緩衝液で洗浄
後、ミキシングチエンバーに同緩衝液2400mlを
入れ、リザーバーには70ｍＭトリスーリン酸緩
衝液（pH8.0）2400mlを入れて作製した直線濃
度勾配によりヒトIgEを溶出した。ヒトIgEを
含む画分2000mlをすみやかに集め、10倍濃度の
PBS100mlを加え限外過膜（ダイアフロー膜
PM−10）を用いて30mlに濃縮した。残りの希
釈液を同様に処理して合計60mlの濃縮液を得
た。 (5) あらかじめPBSで平衡化したセフアクリル
Ｓ−300カラム（５×95cm）に(4)で得られた濃
縮液60mlをかけ、同緩衝液を用いてヒトIgEを
溶出した。ヒトIgEを含む溶出画分を限外過
膜（ダイアフロー膜PM−10）を用いて40mlに
濃縮した。 (6) (5)で得られた濃縮液40mlを再度(5)で用いたセ
フアクリルＳ−300カラムにかけた。カラムか
らの溶出液の280nｍにおける吸光度を紫外線
検出器（ユピコードＳ紫外線吸収計、LKB社
〔スエーデン〕製）を用いてモニターしながら、
溶出液をカラムに２回循環させたのち、ヒト
IgEを含む画分をフラクシヨンコレクターによ
り集めた（リサイクリングクロマトグラフイ
ー）。ヒトIgEを含む画分は限外過膜（ダイ
アフロー膜PH−10）により26mlに濃縮した。 (7) カトレカサスらの方法（前記した同著者の文
献参照）により調製した抗ウシ血清ウサギIgG
結合セフアロース4Bカラム（1.8×30cm）を
PBSで平衡化して(6)で得られた濃縮液26mlを
カラムにかけた。カラムを素通りする画分を集
め、さらに20％マルトースを含む同緩衝液300
mlでカラムを洗浄した。ヒトIgEを含む画分を
集めて、限外過膜（ダイアフロー膜PH−
10）により15mlに濃縮した。この吸収操作を３
回繰り返した。本カラムは5MNaSCN150ml、
ついでPBS200mlで洗浄することにより再生し
た。 (8) 精製したヒトIgEを長期間安定に保存するた
め(7)で得られた濃縮液を２ml容のバイアルビン
に１mlづつそのまま分注して凍結乾燥を行なつ
た。溶媒として用いた緩衝液にマルトース20％
を含ませた。 (9) (8)で得られたヒトIgEの純度をドデシル硫酸
ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル電気
泳動〔ラエムリの方法〔ネーチヤー、第227巻、
680頁（1970年）〕〕により調べた結果、99％以
上であつた。本標品中に含まれるウシIgG、ウ
シIgAなどの培地由来の夾雑蛋白質はオクタロ
ニー法〔プログレスインアレルギー、第５巻、
11頁（1958年）〕および一元平板拡散法〔イム
ノケムストリー、第２巻、235頁（1965年）〕な
どの免疫化学的方法で検出限度以下（0.2％以
下）であつた。なお、培養上清液からのヒト
IgEの収率は29％（RIST法）であつた。得ら
れたヒトIgE最終標品の物理化学的性質は下記
のとおりであつた。 () 分子量： 220000±30000 分子量は前述のラエムリのポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により測定した。なお、分子
量測定用標準蛋白質としてバイオーラツド
（Bio−Rad）社（米国）製のSDS−PAGEスタ
ンダード、ハイモレキユラーウエイトを使用し
た。ヒトIgEは標準蛋白質ミオシン（分子量
200000）よりも相対易動度の小さい位置に単一
バンドあるいは泳動条件によつては２本のバン
ドとして検出された。 () 紫外部スペクトル： 吸収極大は280nｍに、また吸収極小は251n
ｍに存在した。 () 等電点： 7.4付近 等電点はクロマトフオーカシング法により測
定した。 () アミノ酸組成（表１）： ヒトIgEに定沸点塩酸を加え、110℃で24時
間加水分解したのち、日立製835型高速アミノ
酸自動分析装置によりアミノ酸分析した。シス
チンおよびシステインの定量はハースの方法
〔メソドインエンザイモロジー、第11巻、197頁
（1967年）〕により、ヒトIgEを過ギ酸酸化しシ
ステイン酸として定量した。
【表】
() 糖組成（表２）：
フエノール硫酸法〔アナリテイカルケミスト
リー、第28巻、350頁（1956年）〕により測定し
たヒトIgEの中性糖含有量は、ガラクトースに
換算して4.8±0.6％であつた。中性糖およびア
ミノ糖の個別定量はヤング、箱守らの方法〔ジ
ヤーナルオブバイオロジカルケミストリー、第
246巻、1192頁（1971年）〕により日立製Ｋ−53
型ガスクロマトグラフを用いて分析した。シア
ル酸は過ヨウ素酸レゾルシノール法〔ジヤーナ
ルオブバイオロジカルケミストリー、第246巻、
430頁（1971年）〕により測定した。
リー、第28巻、350頁（1956年）〕により測定し
たヒトIgEの中性糖含有量は、ガラクトースに
換算して4.8±0.6％であつた。中性糖およびア
ミノ糖の個別定量はヤング、箱守らの方法〔ジ
ヤーナルオブバイオロジカルケミストリー、第
246巻、1192頁（1971年）〕により日立製Ｋ−53
型ガスクロマトグラフを用いて分析した。シア
ル酸は過ヨウ素酸レゾルシノール法〔ジヤーナ
ルオブバイオロジカルケミストリー、第246巻、
430頁（1971年）〕により測定した。
【表】
参考例 １
(1) 抗ヒトIgEモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマの作製 実施例で得られたヒトIgE50μｇをフロイン
ドコンプリートアジユバントと混合し、６〜７
週令の雌性BALB／Ｃマウスの皮下に接種し
た。２週後、ヒトIgE50μｇをフロインドコン
プリートアジユバントと混合して再度皮下に接
種した。さらに２週間後、ヒトIgE35μｇを生
理食塩水に溶解し、静脈内に接種して、３日後
常法に従つて脾細胞を採取した。得られた脾細
胞１×108個およびBALB／Ｃマウス由来の８
−アザグアニン抵抗性ミエローマ細胞株P3−
X63 Ag8.Ul １×107個を45％ポリエチレング
リコール6000（PEG6000）を含むMEM培地
（日水製薬製）0.3ml中、37℃で７分間静置して
反応させた。PEG6000を希釈するため細胞懸
濁液にMEM培地をできるだけゆつくりと滴下
して加え、最終的に12mlとした。遠心分離によ
り細胞を集め、細胞を37℃であらかじめ保温し
た10％ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地50ml
に懸濁した。得られた細胞懸濁液を１mlづつマ
ルチデイツシユ（リンプロ社〔米国〕製）の48
ウエルに播種した。24時間後に上清を半分す
て、37℃に保温しておいたHAT培地を加え、
以後同様の操作を２〜３日ごとにくり返した。
マルチデイツシユに細胞を播種し14日後、各ウ
エルの上清の抗ヒトIgE抗体活性を測定した。
抗ヒトIgE抗体陽性を示したウエルの細胞を限
界希釈法によりウエル当り0.2個の割合でマル
チデイツシユに播種し、クローニングして、抗
ヒトIgE抗体産生ハイブリドーマ細胞31株を得
た。 (2) 抗ヒトIgEモノクローナル抗体の精製 上記のようにして得られた抗ヒトIgE産生ハ
イブリドーマ（E235 I63株）１×106個を６週
令の雌性BALB／Ｃマウスの腹腔内に接種し
て、14日後に腹水を採取した。５匹のマウスよ
り得られた腹水18mlに硫安を47％飽和となるよ
うに添加して、遠心分離により沈澱物を集め
た。得られた沈澱物を20ｍＭトリスー塩酸緩衝
液（pH7.9）−0.05M食塩６mlに溶解し、溶解液
を同緩衝液２に対して５℃で16時間透析し
た。透析内液15mlをあらかじめ同緩衝液で平衡
化したDEAE−セルロースカラム（1.6×12cm）
にかけ、同緩衝液により溶出して、抗ヒトIgE
モノクローナル抗体65mlを得た。 参考例 ２ 抗ヒトIgE抗体結合水不溶性担体を用いるアフ
イニテイークロマトグラフイーによるヒトIgEの
精製 参考例１(2)で得られた抗ヒトIgEモノクローナ
ル抗体15mgを水不溶性担体アフイ・ゲル１０（バ
イオーラツド社（米国）製）１mlに結合させ抗ヒ
トIgEモノクローナル抗体−アフイ・ゲル１０を
調製した。結合方法は、公知のアフイ・ゲル１０
に蛋白質を結合させる際に用いられている方法に
従つた。あらかじめPBSで平衡化した抗ヒトIgE
モノクローナル抗体−アフイ・ゲル１０カラム１
mlに実施例(2)で得られた透析内液10mlをかけた。
20％デキストロースを含むPBS60mlを用いてカ
ラムを洗浄し、ついで0.2M酢酸−0.15MNaCl10
mlを用いてヒトIgEをカラムから溶出し、溶出液
をただちに中和したのちPBS1に対して５℃で
40時間透析した。但し、途中で１回緩衝液を交換
した。得られた透析内液をドデシル硫酸ナトリウ
ムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り分析したところ、本標品の純度は90％以上であ
り、実施例で得たヒトIgEと同一の易動度を示し
た。アフイニテイーカラムクロマトグラフイーで
のヒトIgEの回収率は70％であつた（RIST法）。
ドーマの作製 実施例で得られたヒトIgE50μｇをフロイン
ドコンプリートアジユバントと混合し、６〜７
週令の雌性BALB／Ｃマウスの皮下に接種し
た。２週後、ヒトIgE50μｇをフロインドコン
プリートアジユバントと混合して再度皮下に接
種した。さらに２週間後、ヒトIgE35μｇを生
理食塩水に溶解し、静脈内に接種して、３日後
常法に従つて脾細胞を採取した。得られた脾細
胞１×108個およびBALB／Ｃマウス由来の８
−アザグアニン抵抗性ミエローマ細胞株P3−
X63 Ag8.Ul １×107個を45％ポリエチレング
リコール6000（PEG6000）を含むMEM培地
（日水製薬製）0.3ml中、37℃で７分間静置して
反応させた。PEG6000を希釈するため細胞懸
濁液にMEM培地をできるだけゆつくりと滴下
して加え、最終的に12mlとした。遠心分離によ
り細胞を集め、細胞を37℃であらかじめ保温し
た10％ウシ胎児血清含有RPMI−1640培地50ml
に懸濁した。得られた細胞懸濁液を１mlづつマ
ルチデイツシユ（リンプロ社〔米国〕製）の48
ウエルに播種した。24時間後に上清を半分す
て、37℃に保温しておいたHAT培地を加え、
以後同様の操作を２〜３日ごとにくり返した。
マルチデイツシユに細胞を播種し14日後、各ウ
エルの上清の抗ヒトIgE抗体活性を測定した。
抗ヒトIgE抗体陽性を示したウエルの細胞を限
界希釈法によりウエル当り0.2個の割合でマル
チデイツシユに播種し、クローニングして、抗
ヒトIgE抗体産生ハイブリドーマ細胞31株を得
た。 (2) 抗ヒトIgEモノクローナル抗体の精製 上記のようにして得られた抗ヒトIgE産生ハ
イブリドーマ（E235 I63株）１×106個を６週
令の雌性BALB／Ｃマウスの腹腔内に接種し
て、14日後に腹水を採取した。５匹のマウスよ
り得られた腹水18mlに硫安を47％飽和となるよ
うに添加して、遠心分離により沈澱物を集め
た。得られた沈澱物を20ｍＭトリスー塩酸緩衝
液（pH7.9）−0.05M食塩６mlに溶解し、溶解液
を同緩衝液２に対して５℃で16時間透析し
た。透析内液15mlをあらかじめ同緩衝液で平衡
化したDEAE−セルロースカラム（1.6×12cm）
にかけ、同緩衝液により溶出して、抗ヒトIgE
モノクローナル抗体65mlを得た。 参考例 ２ 抗ヒトIgE抗体結合水不溶性担体を用いるアフ
イニテイークロマトグラフイーによるヒトIgEの
精製 参考例１(2)で得られた抗ヒトIgEモノクローナ
ル抗体15mgを水不溶性担体アフイ・ゲル１０（バ
イオーラツド社（米国）製）１mlに結合させ抗ヒ
トIgEモノクローナル抗体−アフイ・ゲル１０を
調製した。結合方法は、公知のアフイ・ゲル１０
に蛋白質を結合させる際に用いられている方法に
従つた。あらかじめPBSで平衡化した抗ヒトIgE
モノクローナル抗体−アフイ・ゲル１０カラム１
mlに実施例(2)で得られた透析内液10mlをかけた。
20％デキストロースを含むPBS60mlを用いてカ
ラムを洗浄し、ついで0.2M酢酸−0.15MNaCl10
mlを用いてヒトIgEをカラムから溶出し、溶出液
をただちに中和したのちPBS1に対して５℃で
40時間透析した。但し、途中で１回緩衝液を交換
した。得られた透析内液をドデシル硫酸ナトリウ
ムを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り分析したところ、本標品の純度は90％以上であ
り、実施例で得たヒトIgEと同一の易動度を示し
た。アフイニテイーカラムクロマトグラフイーで
のヒトIgEの回収率は70％であつた（RIST法）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒトIgE産生能を有する株化ヒト骨髄腫細胞
を培養し、培養液中にヒトIgEを生成蓄積せし
め、アミノ酸結合水不溶性担体を用いるアフイニ
テイークロマトグラフイーを行なつてヒトIgEを
分離、採取することを特徴とするヒトIgEの製造
法。 ２ ローラボトル培養装置およびスピンナーフラ
スコ培養装置を用いて培養することを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ ウシ胎児血清含有培地で培養することを特徴
とする特許請求の範囲第１項の記載の製造法。 ４ ヒトIgEを分離、採取するに際し、硫安塩
析、アミノ酸結合水不溶性担体を用いるアフイニ
テイークロマトグラフイー、イオン交換カラムク
ロマトグラフイー、ゲル過についで抗ウシ血清
抗体結合水不溶性担体を用いるアフイニテイーク
ロマトグラフイーを行なうことを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載製造法。 ５ ヒトIgEを分離、採取するに際して実施する
アフイニテイークロマトグラフイーにおいて、糖
類添加緩衝液を用いることを特徴とする特許請求
の範囲第４項記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56193324A JPS5896028A (ja) | 1981-11-30 | 1981-11-30 | ヒトＩｇＥの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56193324A JPS5896028A (ja) | 1981-11-30 | 1981-11-30 | ヒトＩｇＥの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5896028A JPS5896028A (ja) | 1983-06-07 |
| JPH0339680B2 true JPH0339680B2 (ja) | 1991-06-14 |
Family
ID=16306004
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56193324A Granted JPS5896028A (ja) | 1981-11-30 | 1981-11-30 | ヒトＩｇＥの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5896028A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2226575C (en) * | 1995-07-27 | 2011-10-18 | Genentech, Inc. | Stabile isotonic lyophilized protein formulation |
| JP2014148555A (ja) * | 1995-07-27 | 2014-08-21 | Genentech Inc | タンパク質の処方 |
-
1981
- 1981-11-30 JP JP56193324A patent/JPS5896028A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5896028A (ja) | 1983-06-07 |
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