JPH0977799A - ヒト−マクロファージ遊走阻止因子（ヒト−ｍｉｆ）に対するモノクローナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】 特定のアミノ酸配列を有するヒト−ＭＩ
Ｆに対する新規モノクローナル抗体及び／又は一種以上
の異種動物−ＭＩＦに対しても反応する抗体及びその誘
導体；該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
細胞を培養又は増幅して該抗体を得、所望によりその誘
導体に転換することからなる該抗体及びその誘導体の製
造方法。 【効果】 上記モノクローナル抗体及びその誘導体の使
用により生物学的液体中及び細胞表面上のヒト−ＭＩＦ
並びに異種動物−ＭＩＦを定性的、定量的測定方法；そ
のための該モノクローナル抗体を含むキット及び感染
症、自己免疫疾患及び一次的慢性多発関節炎の抑制のた
めの医薬製剤が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、特定のアミノ酸
配列を有するヒト-ＭＩＦに対する新規なモノクローナ
ル抗体および／または一種以上の異種動物-ＭＩＦに対
しても反応する抗体およびその誘導体、該モノクローナ
ル抗体およびその誘導体の製造方法、生物学的液体中お
よび細胞表面上のヒト-ＭＩＦ並びに異種動物-ＭＩＦの
定性的および定量的測定のための前記モノクローナル抗
体およびその誘導体の使用、ヒト-ＭＩＦに対するモノ
クローナル抗体を含むキット、並びにヒト-ＭＩＦに対
するモノクローナル抗体またはその誘導体を含有する薬
剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト細胞からのヒト-ＭＩＦは従来活性
なものとしては知られているが、混合物として、そして
生物学的液体中の他のタンパク質と一緒に記載されてい
るに過ぎない。ＭＩＦはいわゆるリンフォカイン群に属
し、このリンフォカインは生物学的に活性な可溶性ポリ
ペプチドを含んで成り、このものはリンパ球および単球
またはマクロファージが抗原、マイトジェン等により刺
激された場合にこれらの細胞から分泌される。リンフォ
カインはタンパク質仲介物質として、細胞免疫の免疫調
節、炎症およびエフェクター機構において重要な役割を
演じる[S.コーエン等、「バイオテクノロジー・オブ・
ザ・リンホカインズ」、ニューヨーク、アカデミック・
プレス、511-576(1979)およびA.宮島等、「FASEBジャー
ナル」、38:2462-2473(1988)]。リンフォカインの他の
例として、免疫インターフェロン（γ−インターフェロ
ン）、インターロイキン1および2、並びにマクロファー
ジ活性化因子（ＭＡＦ）を挙げることができる。これら
のリンフォカインは、免疫系の種々の細胞タイプの分
化、活性化および増殖を制御する。

【０００３】最初に報告されたリンホカイン活性は、抗
原で感作し、活性化したモルモット・リンパ球の培養上
清で観察された。この活性は、インビトロで毛細血管か
らのモルモット・マクロファージの遊走を阻止し得るこ
とから遊走阻止因子（ＭＩＦ）と命名された[B.R.ブル
ーム等、「サイエンス」、153:80-82(1966)およびJ.R.
デビッド、「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユ
ナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ」、153:72-77
(1966)]。

【０００４】このＭＩＦ活性が最初に観察されて以来、
多数の刊行物が推定的ＭＩＦ分子の単離および同定を報
告している。例えば、P.S.パパゲオルジョウ等、「ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー」、108:494-504(1972)、
R.E.ロックリン等、 「セルラー・イムノロジー」、5:4
35(1972)、T.吉田等、「ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー」、117:548-554(1976)、H.G.リモールド等、「ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー」118:2015-2019(1977)、
L.H.ブロック等、「ジャーナル・オブ・エクスペリメン
タル・メディシン」、 147:541-553(1978)、G.ポッツア
ンツア等、「サイエンス」、205:300-301(1979)、P.N.
ディン等「ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサ
ーチ」、1:23 (1981)、W.Y.ワイザー等、「ジャーナル
・オブ・イムノロジー」、126:1958-1962(1981)、S.Z.
サラフディン等、「サイエンス」、223:703-707(198
4)、W.Y.ワイザー等、「セルラー・イムノロジー」、8
8:109-122(1984)、W.Y.ワイザー等、 「セルラー・イ
ムノロジー」、93:532-540(1985)、D.T.ウメツ等、「ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー」、140:4211-4216(198
8)およびG.ツバドロ等、「クリニカル・アンド・エクス
ペリメンタル・イムノロジ」、72:510-515(1988)参照。

【０００５】知られている技術的状況によれば、ヒト-
ＭＩＦは、マクロファージの遊走能力を阻害するポリペ
プチドの一群からなる。ヒト-ＭＩＦは活性化されたリ
ンパ球、T-およびB-細胞からのみならず、非リンパ性細
胞、例えば成長中の繊維芽細胞およびある種の腫瘍細胞
からも分泌される。ＭＩＦは、γ−インターフェロンマ
クロファージ活性化因子（ＭＡＦ）および他のリンフォ
カインから明確に区別される。

【０００６】しかしながら今まで、ヒト-細胞からのＭ
ＩＦを純粋に調製し、そしてその構造を解析することは
不可能であった。そしてヒト-ＭＩＦについて、これが
約8.5,18,27,36,45,および67kg/Mol（キロダルトン、k
D）の分子量および約pH5.1および2.9の等電点を有する
構造的に異なるポリペプチドの混合物らしいことが知ら
れていた [G.バウメイスター等、 「イムノ・バイオロ
ジー」、160:15(1981)]。さらに、ヒトーＭＩＦcDNAに
よりコードされるタンパク質の分子量が12.31793kDであ
り、116個のアミノ酸残基で構成されていることが明か
とされた [W.Y.ワイザー、「プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリ
カ」、86:7522-7526(1989)]。またグルタチオン（GSH）
を固定化したアフィニティーゲルにＭＩＦ様の一次構造
を持つタンパク質が結合することが発表され[F.A.ブロ
ッキ、「ネイチュアー」、360:269-270(1992)]、そして
グルタチオンへの特異的結合能を利用してヒトーＭＩＦ
を高純度に精製し、世界で初めて結晶化に成功し、その
ヒトーＭＩＦが分子量12.5kDの分子量およびpH5.0の等
電点を有するホモ2量体であることが明かとされた[J.西
平等、「バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・
バイオロジー・インターナショナル」31:841-850(199
3)]。

【０００７】ヒト-ＭＩＦは炎症反応（遅延型過敏症反
応）の初期において決定的な役割を演ずる。このものは
単球および無活動組織マクロファージが炎症性マクロフ
ァージに分化するのを誘導する。最近では、エンドトキ
シンショックが下垂体より放出されるＭＩＦにより増悪
し、さらに抗ＭＩＦ抗体により症状の軽減が認められる
という興味深い報告もなされている[A.セラミ等、「ネ
イチュアー」365:756-759(1993)]。従って、高純度に精
製されたヒト-ＭＩＦ並びにヒト-ＭＩＦを特異的に結合
してその活性を阻害するモノクローナル抗体は、免疫調
節疾患および慢性炎症疾患の診断および治療のために重
要である。

【０００８】ヒト-ＭＩＦを結合しそしてそれを阻害す
るモノクローナル抗体は、一次的慢性多発関節炎および
種々の自己免疫疾患（例えば、気管支喘息、全身性エリ
トマトーデス（SLE）、免疫グロブリン腎症など）の克
服のために有用である。精製されたヒト-ＭＩＦは感染
に対する耐性、例えば結核、らい病またはレーシュマニ
アに対する耐性、およびカンディダ症に対する耐性、並
びに腫瘍、例えば転移に対する耐性を上昇せしめる。

【０００９】診断および治療における抗体の用途の範囲
は最近まで非常に限定されていた。抗体は、種々のタン
パク質の複雑な混合物として動物の血清から非常に少量
得られた。免疫された各動物個体、および一つの個体で
さえ、反復して免疫された場合には、各場合に種々の組
成の抗体を含有する血清をもたらすので、抗体の標準化
は不可能であった。KoehlerおよびMilstein[G.コエラー
およびC.ミルステイン、「ネイチュアー」256:495 (197
5)]により開発された技法を用いて、今や均質な形の抗
体、すなわちいわゆるモノクローナル抗体を、細胞培養
により工業的な量において再現性を伴って得ることがで
きるようになった。

【００１０】適当な骨髄細胞と抗原により免疫された供
与体からの抗体産生リンパ球との融合により、無限の細
胞分裂および無限の増殖を行う能力と均一な抗体を産生
する能力とを共に有するハイブリドーマ細胞が生ずる。
従って、特定の抗原に対する生物の免疫応答を独立さ
せ、そしてハイブリドーマ細胞の連続的培養によりモノ
クローナル抗体を製造することが可能である。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】ハイブリドーマ技法に
より特定の抗体を製造するための多くの例が今まで知ら
れており、そして一般的手段が原理的に記載せれている
が、新しい例に特有の問題点は、特定の場合に技法を適
合させることが必要な点である。このような適合なくし
ては、所望のハイブリドーマを生成せしめること、安定
であること、およびこのようにして製造された抗体が所
望の特異性を有することが保証されない。原理的には、
供与体の免疫に使用する抗原の種類および純度、細胞融
合の技法、適当なハイブリドーマセルラインを選択する
ための手段、並びに抗体の単離および精製のための方式
および態様によってモノクローナル抗体製造の成功度が
左右される。

【００１２】均一なモノクローナル抗体の大量入手を前
提とする抗体の重要な用途、例えば今ハイブリドーマ技
法により可能となった用途はイムノアフィニティークロ
マトグラフィーである。この場合、所望の特異性を有す
る抗体を固体担体上に適用する。多数の異なる化合物を
含有する溶液から、抗体によって認識されそしてそれに
結合される構造因子（決定基、エピトープ）を有する化
合物が抗体に結合され、そして従って固体担体に結合さ
れる。不所望の化合物を含有する溶液を除去することに
よって担体から所望の化合物を溶出し、そして常法によ
り単離する。

【００１３】

【課題を解決するための手段】この発明は下記アミノ酸
配列を有するヒト-マクロファージ遊走阻止因子（ヒト-
ＭＩＦ）に対するモノクローナル抗体に関する。遺伝子
組換えで高純度に精製し、結晶化されたヒト-ＭＩＦお
よび／またはヒトーＭＩＦ含有溶液、例えばヒト細胞の
細胞抽出液、細胞培養上精液または細胞培養濾液を、所
望によりそれ自体公知の精製方法により精製したヒトー
ＭＩＦは、ヒト-ＭＩＦに対する抗体に認識されそして
結合されるエピトープを有する。精製されたヒト-ＭＩ
Ｆは12.5kDの分子量を有するホモ2量体のタンパク質で
ある。精製されたヒトーＭＩＦは、マクロファージの遊
走を測定する標準試験方法において活性である．精製さ
れたヒト-ＭＩＦの12.5kDの分子量のタンパク質は、タ
ンパク質分析の常用法、例えばSDS-PAGE（ドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ゲル
濾過HPLC（高速液体クロマトグラフィー）または／およ
び分析用超遠心法において均一な、マクロファージの遊
走を測定する標準的試験法において活性なタンパク質で
ある。

【００１４】精製されたヒト-ＭＩＦは12.5kDの分子量
を有し、そしてアミノ酸配列：Met-Pro-Met-Phe-Ile(5)
-Val-Asn-Thr-Asn-Val(10)-Pro-Arg-Ala-Ser-Val(15)-P
ro-Asp-Gly-Phe-Leu(20)-Ser-Glu-Leu-Thr-Gln(25)-Gln
-Leu-Ala-Gln-Ala(30)-Thr-Gly-Lys-Pro-Pro(35)-Gln-T
yr-Ile-Ala-Val(40)-His-Val-Val-Pro-Asp(45)-Gln-Leu
-Met-Ala-Phe(50)-Gly-Gly-Ser-Ser-Glu(55)-Pro-Cyc-A
la-Leu-Cyc(60)-Ser-Leu-His-Ser-Ile(65)-Gly-Lys-Ile
-Gly-Gly(70)-Ala-Gln-Asn-Arg-Ser(75)-Tyr-Ser-Lys-L
eu-Leu(80)-Cyc-Gly-Leu-Leu-Ala(85)-Glu-Arg-Leu-Arg
-Ile(90)-Ser-Pro-Asp-Arg-Val(95)-Tyr-Ile-Asn-Tyr-T
yr(100)-Asp-Met-Asn-Ala-Ala(105)-Ser-Val-Gly-Trp-A
sn(110)-Asn-Ser-Thr-Phe-Ala(115) を有する。

【００１５】この発明のモノクローナル抗体の抗原であ
る精製されたヒト-ＭＩＦおよびそのタンパク質の製造
方法は、ヒト-ＭＩＦおよび組換え体ヒト-ＭＩＦ含有溶
液、例えばヒト細胞の細胞抽出液、細胞培養上清液また
は細胞培養濾液を所望によりそれ自体公知の精製段階の
後で、 a)ヒト-ＭＩＦのグルタチオンへの特異的結合を利用し
て、グルタチオンを有する担体としてのアフィニティー
ゲル、例えばS-ヘキシルグルタチオンアフィニティーカ
ラム（商標）上に通し、その担体と接触せしめ、非結合
タンパク質および他の外来性物質を除去し、抗体に結合
したヒト-ＭＩＦを選択的に切り離し;および／または b)ヒト-ＭＩＦに特異的なモノクローナル抗体を有する
担体と接触せしめ、非結合タンパク質および他の外来性
物質を除去し、抗体に結合したヒト-ＭＩＦを選択的に
切り離し、そして単離することを特徴とする。

【００１６】この発明のモノクローナル抗体の抗原であ
るヒト-ＭＩＦを含有する溶液として、好ましくはヒト-
ＭＩＦcDNAでコードされた領域をそれ自体公知の方法で
あるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によるインビトロ
での遺伝子増幅を行い、遺伝子組換えで製造したヒト-
ＭＩＦを標準的な手順を用いて、発現ベクターを宿主細
胞に導入して生産する[J.西平等、「バイオケミストリ
ー・アンド・モレキュラー・バイオロジー・インターナ
ショナル」、31(5):841-850(1993)]。

【００１７】増幅したDNAはT7プロモーター発現プラス
ミドpET3のNdeIとBamHI断片中へ挿入し、このプラスミ
ドで変換したトランスフェクションされたE.ColiのBL21
（DE3）LysSを培養し、その培養上清からこの発明にお
けるモノクローナル抗体の抗原であるヒト-ＭＩＦが単
離される[J.西平等、「バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・レサーチ・コミュニケーション」、185:
1069-1077(1992)]。

【００１８】そして、ヒト-ＭＩＦを含有する液とし
て、例えばヒト細胞の細胞抽出液、細胞培養上清または
細胞培養濾液はそれ自体公知の方法により調製される。
適当なヒト細胞は例えば単核細胞であり、この細胞は、
クエン酸塩またはヘパリンを添加された静脈血を遠心す
る際に沈澱する白血球の層である「バフィーコート」か
ら、ロイカフェレス（leucapheresis）および／または
密度勾配中での遠心分離によって得ることができる。

【００１９】単核細胞は適当な助剤、例えばコンカナバ
リンAまたはフィトヘマグルチニンによりＭＩＦおよび
他のリンフォカインを産生するように刺激されそして常
法に従って約12〜約72時間、適当な培地、例えばRPMI 1
640培地（これには所望によりウシ胎児血清、緩衝剤お
よび／または抗生物質、例えばペニシリンもしくはスト
レプトマイシンが添加される）中で、約37℃において、
そして所望によりCO₂ガス通気のもとで培養される。

【００２０】ヒト-ＭＩＦを含有する溶液は、細胞また
は細胞培養上清液から、例えば抽出液、濾過および／ま
たはプロテアーゼ阻害剤の添加により安定化される。こ
のようなヒト-ＭＩＦ溶液を、段階a)および／または段
階b)において、担体に結合したグルタチオン（GSH）お
よび／または抗体と直接接触せしめることができ、しか
し好ましくは約6kDまたはこれより小分子量の分離限界
を有する膜上での限外濾過によりあらかじめ前精製し、
濃縮し、場合によっては透析し、そして所望によりクロ
マトグラフィー、例えばDEAE-セルロースまたはセファ
デックス（商標）によりさらに精製する。

【００２１】段階a)および／またはb)においては、ヒト
-ＭＩＦが溶液に含有されている他のタンパク質および
外来性物質から分離され、この場合、ヒト-ＭＩＦのグ
ルタチオンへの特異的結合および／またはヒト-ＭＩＦ
にたして特異的な抗体とヒト-ＭＩＦ上の認識される抗
原決定基との間の強性的な相互作用に基づく分離作用が
用いられる。このために、ＭＩＦ含有液を、それ自体公
知のイムノアフィニティークロマトグラフィー法に従っ
て、グルタチオン（GSH）および／またはヒトーＭＩＦ
に特異的なモノクローナル抗体を有する担体と接触せし
め、非結合タンパク質および他の外来性物質を除去し、
グルタチオン（GSH）および／または抗体の結合したヒ
ト-ＭＩＦを選択的に切り離し、そして単離する[C.P.D.
ツ等、「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー」、258:4659-4662(1983)]。

【００２２】グルタチオン（GSH）を有する担体として
のアフィニティーゲル、例えばS-ヘキシルグルタチオン
アフィニティーカラム（商標）を用いるか、および／ま
たは無機物または有機物を基礎とする適当な担体、例え
ば珪酸塩、架橋アガロース、デキストラン、または適当
に官能化された形のポリアクリルアミドに、それ自体公
知の方法により、後に詳細に記載するこの発明のモノク
ローナル抗体またはその誘導体を付加する。例えば、活
性化されたエステル官能基、例えばN-ヒドロキシサクシ
ンイミドエステル基を含有する担体を水性緩衝液に懸濁
し、モノクローナル抗体の溶液と混合し、そして担体の
ふさがれていない反応性部位を例えば第一級アミン 、
例えばエタノールアミンによりブロックする。

【００２３】担体を、適当な水性溶剤、例えば塩溶液、
例えばNaCl溶液、または緩衝液、例えば燐酸緩衝化NaCl
溶液、NaHCO₃溶液または3-（N-モルホリノ）プロパンス
ルホン酸溶液に懸濁し、そしてヒト-ＭＩＦを含有する
溶液と接触せしめる。例えば、クロマトグラムカラムに
充填し、そしてヒト-ＭＩＦ含有液を導入し、そして所
望により加圧を伴って、担体中にポンプ通過せしめる。
未結合タンパク質および他の汚染物を、水性液、例えば
約5〜約9のpHを有する緩衝液および／または塩溶液、例
えばNaCl溶液で洗浄除去する。

【００２４】担体上の抗体に結合したヒト-ＭＩＦを、
適当な水性液、例えば約2〜約5のpH範囲の緩衝液、例え
ばグリシン緩衝液、または種々の混合物もしくは塩溶
液、例えば濃NH₄ SCN溶液のpHグラジエントにより溶出
する。得られた精製ヒト-ＭＩＦ含有溶液を場合によっ
ては中和し、そしてそれ自体公知の方法により、例えば
セファデックス（商標）上でのクロマトグラフィー、電
気透析、電気泳動濃縮および／または真空濃縮により、
精製されたヒト-ＭＩＦを単離する。

【００２５】この発明はさらに、ヒト-マクロファージ
遊走阻止因子（ヒト-ＭＩＦ）に対する新規な抗体、お
よびその誘導体に関する。この発明のモノクローナル抗
体はヒト-ＭＩＦを結合し、そして／またはその生物学
的活性を阻害する。ヒト-ＭＩＦへのモノクローナル抗
体の結合はイムノアッセイにより便利に決定することが
でき、例えば固体担体上にヒト-ＭＩＦを適用し、この
被覆された担体をモノクローナル抗体溶液と共にインキ
ュベートし、そしてこれによって結合したモノクローナ
ル抗体をラジオアイソトープまたは酵素で標識した第2
の抗体により表示する方法により決定することができ
る。すなわち、ヒト-ＭＩＦに結合したモノクローナル
抗体を、放射能または酵素-基質反応の測定により決定
する。例えば、モノクローナル抗体を担体上に固定し、
ヒト-ＭＩＦ含有溶液と共にインキュベートし、そして
次にこの溶液の残留ヒト-ＭＩＦ活性を測定する方法も
また適当である。

【００２６】そしてこの発明のモノクローナル抗体はさ
らに、それ自体公知の方法により、ヒト-ＭＩＦと同様
に精製した一種以上の異種動物-ＭＩＦを結合し、そし
て／またはその生物学的活性を阻害する。ヒト-ＭＩＦ
へのモノクローナル抗体の結合はイムノアッセイにより
便利に決定することができ、上記と同様の方法により決
定することができる。すなわち、一種以上の異種動物-
ＭＩＦに結合したモノクローナル抗体を、放射能または
酵素-基質反応の測定により決定する。例えば、モノク
ローナル抗体を担体上に固定し、異種動物-ＭＩＦ含有
溶液と共にインキュベートし、そして次にこの溶液の残
留異種動物-ＭＩＦ活性を測定する方法もまた適当であ
る。

【００２７】溶液のヒト-ＭＩＦ活性は、それ自体公知
の方法により、適当に活性化されたヒト-マクロファー
ジの遊走に対する阻害作用を測定することにより、測定
することができる。例えば、96穴ケモタキシスチャンバ
ー（Neuro Probe, Model AB96）上の走化性因子溶液
（マクロファージの試験溶液）中での遊走距離を吸光度
で測定する試験方法を選択することができる。

【００２８】マウス／マウス-ハイブリドーマ細胞、お
よびラット／マウス-ハイブリドーマ細胞により産生さ
れる、ヒト-ＭＩＦに対するモノクローナル抗体が好ま
しい。

【００２９】モノクローナル抗体のこの発明の誘導体
は、例えば、ヒト-ＭＩＦの抗原決定基に対するその特
異性を保持している断片、例えば 、Fab, Fab′もしく
は F(ab′)₂断片；例えば放射性ヨウ素(¹²⁵I,¹³¹I)、炭
素(¹⁴C)、硫黄(³⁵S)、トリチウム(³H)もしくはこれらに
類似するものにより標識された放射性標識モノクローナ
ル抗体；ビオチンもしくはアビジンとのモノクローナル
抗体接合体；または酵素、例えばホースラディッシュ-
パーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β-D-
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコア
ミラーゼ、カーボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリ
ンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナー
ゼもしくはグルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナー
ゼとのモノクローナル抗体接合体である。好ましい誘導
体は¹²⁵Iで標識されたモノクローナル抗体、およびホー
スラディッシュ-パーオキシダーゼとの抗体接合体であ
る。

【００３０】この発明はさらに、ヒト-ＭＩＦに対する
モノクローナル抗体およびその誘導体のそれ自体公知の
製造法に関し、この方法は、前記の抗体を産生するハイ
ブリドーマ細胞を、 a)イン-ビトロ培養し、そして培養上清液からモノクロ
ーナル抗体を単離し、または b)適当な哺乳動物中でイン-ビボ増幅し、そして該哺乳
動物の体液からモノクローナル抗体を単離し、 c)そして所望により、得られたモノクローナル抗体をそ
の誘導体に転換する、ことを特徴とする。

【００３１】変法a)のイン-ビトロ培養のための適当な
培地は常用の標準培地、例えば、無血清のあるいはウシ
胎児血清が補充されている場合があるダルベッコ(Dulbe
cco)の変形イーグル(Eagle)培地またはRPMI 1640培地で
ある。モノクローナル抗体の単離のために、培養上清液
中のタンパク質を硫酸アンモニウムまたはこれに類似す
るものによって沈澱せしめ、そして常用のクロマトグラ
フ法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ー、DEAE-セルロースクロマトグラフィー、プロテインA
を用いたアフィニティクロマトグラフィーまたは免疫ア
フィニティークロマトグラフィーにより精製する。

【００３２】変法b)に従うハイブリドーマ細胞のイン-
ビボ増幅により目的とする抗体を多量に得ることができ
る。この目的のために、細胞クローンを哺乳動物、好ま
しくは同系(Syngeneic)哺乳動物に注射し、そして1〜3
週間後、モノクローナル抗体を該哺乳動物の体液から単
離する。例えば、BALB/cマウス由来のハイブリドーマ細
胞を、場合によってはプリスタンのごとき炭化水素によ
り1〜3週間前処理されたBALB/cマウスに腹腔内注射し、
そして1〜2週間後に該動物から腹水を採取する。

【００３３】目的とするモノクローナル抗体を該体液か
ら、それ自体公知の方法により、例えば塩化アンモニウ
ムまたはこれに類似するものによる沈澱、およびクロマ
トグラフ精製、例えばDEAE- セルロース、ヒドロキシル
アパタイト（HPHT,高速ヒドロキシアパタイトカラムク
ロマトグラフィー）、イオン交換樹脂によるクロマトグ
ラフィー、ゲル濾過、プロテインAを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーまたは免疫アフィニティークロ
マトグラフィーにより単離する。

【００３４】ヒト-ＭＩＦの抗原決定基に対する特異性
が保持されているこの発明のモノクローナル抗体断片、
例えば Fab, Fab′またはF(ab′)₂断片は、それ自体公
知の方法により製造することができ、例えば変法a)また
はb)により得られたモノクローナル抗体をペプシンもし
くはパパインのごとき酵素により処理し、そして／また
は化学還元によりジスルフィド結合を切断することによ
り製造することができる。

【００３５】ヨウ素（¹²⁵I, ¹³¹I）により放射性標識さ
れたモノクローナル抗体は、この発明のモノクローナル
抗体から、それ自体公知の方法により、例えば放射性ヨ
ウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウムと化学的酸化剤、
例えば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンTもしくはこ
れらに類似するもの、または酵素的酸化剤、例えばラク
トパーオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼとグルコ
ースとを用いて得られる。この発明の放射性標識された
モノクローナル抗体はまた、それ自体公知の方法によ
り、放射性標識された炭素 （¹⁴C）、トリチウム
（³H）、硫黄（³⁵S）またはこれらに類似するものを含
有する栄養素、例えばL-（¹⁴C)-ロイシン、L-（^{1 3}H）-
ロイシンまたはL-（³⁵S）-メチオニンをイン-ビトロ培
養のための培地に添加し、そして変法a)に従ってモノク
ローナル抗体を得ることにより製造することができる。

【００３６】酵素標識されたこの発明のモノクローナル
抗体はそれ自体公知の方法により得られ、この方法にお
いては変法a)またはb)によって製造されたモノクローナ
ル抗体と所望の酵素とを、カップリング剤、例えばグル
タルアルデヒド、過ヨウ素酸塩、N,N′-o-フェニレンジ
マレイミド、N-（m-マレイミドベンゾイルオキシ）-サ
クシンイミド、N-（3-（2′-ピリジルジチオ）-プロピ
オンオキシ）-サクシンイミドまたはこれらに類似する
ものと共に反応せしめる。

【００３７】同様に、この発明のモノクローナル抗体と
アビジンとの接合体が得られる。ビオチンとの接合体が
それ自体公知の方法により得られ、この方法においては
この発明のモノクローナル抗体を例えばビオチン-N-ヒ
ドロキシサクシンイミジルエステルと反応せしめる。

【００３８】この発明はさらに、ヒト-マクロファージ
遊走阻止因子（ヒト-ＭＩＦ）に対するモノクローナル
抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマセルラ
インに関する。

【００３９】マウス-骨髄腫セルラインとマウス-または
ラット-リンパ球との雑種である、ヒト-ＭＩＦに対して
向けられたモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マセルラインが好ましい。この発明のモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマセルラインはいずれも遺伝
的に安定であり、不変の特異性を有するモノクローナル
抗体を分泌し、そして凍結された培養物を解凍しそして
再クローン化することによって活性化され得る。

【００４０】この発明はさらに、ヒト-ＭＩＦに対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造の
ためのそれ自体公知の方法に関し、この方法は、適当な
哺乳動物を遺伝子組換えで製造したＭＩＦおよびＭＩＦ
含有タンパク質またはＭＩＦ接合体で免疫し、該哺乳動
物から取り出された抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合せ
しめ、得られたハイブリド細胞をクローン化し、そして
目的とするモノクローナル抗体を産生する細胞クローン
を選択することを特徴とする。

【００４１】抗原として遺伝子組換えで製造されたＭＩ
ＦおよびＭＩＦ含有タンパク質画分またはＭＩＦ接合体
のいずれをも使用することができ、好ましくは上記のよ
うにして得られた遺伝子組換え体のヒト-ＭＩＦを使用
する。

【００４２】抗原としてヒト-ＭＩＦおよび一種以上の
異種動物-ＭＩＦが同一のエピトープを示すことが、当
該動物、例えばラットやマウスのＭＩＦを含有するタン
パク質画分を使用するための前提である。

【００４３】接合体はそれ自体公知の方法により、例え
ばカルボジイミド、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒ
ド、Ｎ，Ｎ′-o-フェニレンジマレイミド、Ｎ-(m-マレ
イミドベンゾイルオキシ)-サクシンイミド、Ｎ-(3-(2′
-ピリジルジチオ)-プロピオンオキシ)サクシンイミドま
たはこれらに類似するものを用いるカップリングにより
製造することができる。免疫するために、グルタルアル
デヒドであらかじめ処理された羊赤血球とヒト細胞から
のＭＩＦ含有タンパク質画分との接合体が好ましい。

【００４４】ヒト-ＭＩＦにより免疫するための好まし
い哺乳動物はマウスまたはラットである。免疫操作はそ
れ自体公知の方法により行い、例えば抗原性ヒト-ＭＩ
Ｆ接合体を所望によりリンパ球産生刺激助剤、例えば完
全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジ
ュバントと共に、1〜10日の間隔で、4〜8回非経口的
に、例えば腹腔内または皮下に注射することにより行
う。さらに、動物を2〜4回の注射により前免疫し、そし
て8〜12カ月後にさらに注射を行うこともできる。

【００４５】免疫された動物の抗体産生細胞、好ましく
は脾臓細胞を、最後の免疫の2〜6日後に動物から取り出
し、そして融合促進剤の存在下で適当なセルラインの骨
髄腫細胞と融合せしめる。適当な融合のパートナーとし
て種々の異なる骨髄腫セルラインおよびそれから誘導さ
れたセルラインが知られている。酵素ヒポキチサンチン
-グアニン-ホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPR
T）または酵素チミジンキナーゼ（TK）が欠落してお
り、そしてそれ故にヒポキサンチン、アミノプテリンお
よびチミジンを含有する選択培地（HAT培地）、または
ヒポキサンチンおよびアザセリンを含有する選択培地中
で生存することができない骨髄腫細胞が好ましい。

【００４６】HAT培地またはヒポキサンチン／アザセリ
ン培地中に生存せず、そして免疫グロブリンまたはその
部分を分泌しない骨髄腫細胞およびそれから調製された
セルライン、例えばセルラインP3-X63-Ag8.653、および
Sp2/O-Ag14が特に好ましい。BALB/cマウス由来のセルラ
インP3-X63-Ag8.653はマウス、例えばBALB/cマウスのリ
ンパ球との融合に適当であるのみならず、ラットのリン
パ球との融合のためにも適当である。

【００４７】融合促進剤として、場合によってはUV不活
性化された形であるセンダイウイルスまたは他のパラミ
キソウイルス、カルシウムイオン、界面活性脂質、例え
ばリソレシチン、またはポリエチレングリコールを挙げ
ることができる。骨髄腫細胞と、2〜10倍過剰量の免疫
された動物からの脾臓細胞とを、約1000〜約6000の分子
量を有するポリエチレングリコールの約30〜約50％の溶
液中で融合せしめるのが好ましい。

【００４８】融合の後、細胞を分離し、そして選択用の
HAT培地またはヒポキサンチン／アザセリン培地中で培
養する。この際、ハイブリドーマ細胞は骨髄腫細胞由来
のイン-ビトロ生存能力、および免疫された動物の抗体
産生細胞由来のHGPRT遺伝子またTK遺伝子の欠落そして
それによる選択培地中での生存能力を兼備するため、ハ
イブリドーマ細胞のみが生存する。

【００４９】ハイブリドーマ細胞増殖のための適当な培
地は常用の標準的培地、例えばダルベッコの変形イーグ
ル培地またはRPMI 1640培地である。好ましくは細胞増
殖の最初にいわゆるフィーダー細胞、例えば正常な腹腔
性のマウス浸出細胞、脾細胞、骨髄マクロファージまた
はこれらに類似するものを添加する。ハイブリドーマ細
胞の上に通常の骨髄腫細胞が増殖するのを防止するため
に、規則的な間隔で上記の培地に選択用のHAT培地また
はヒポキサンチン／アザセリン培地を補充する。

【００５０】次に、ハイブリドーマ細胞の細胞培養上清
液を、それが目的モノクローナル抗体を含有するか否か
について試験する。このために好ましくは、すでに記載
されているように、ラジオイムノアッセイ、エンザイム
イムノアッセイ、および／またはＭＩＦ活性の決定を用
いる。このようにして選択した細胞クローンを常用の標
準的培地中で培養し、そして所望によりそれ自体公知の
方法で凍結し、そして／または限界希釈法によりもしく
は寒天上での分散により再クローン化する。

【００５１】この発明はさらに、特に生物学的液体中ま
たは細胞表面上のヒト-マクロファージ遊走阻止因子
（ヒト-ＭＩＦ）の定量的測定のためにヒト-ＭＩＦに対
するモノクローナル抗体を使用することに関する。例え
ば、この発明のモノクローナル抗体は、抗原（ヒト-Ｍ
ＩＦ）とモノクローナル抗体との間の結合相互作用を用
いるそれ自体公知のイムノアッセイ法のいずれかにおい
て使用する。このような測定方法の例として、ラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ、
免疫螢光試験、ラッテクス凝集試験、または血球凝集試
験を挙げることができる。

【００５２】この発明の抗体は、それ自体として、また
は放射性標識誘導体として、場合によっては他の標識抗
体および／またはタンパク質と組み合わせて、ラジオイ
ムノアッセイ（ＲＩＡ）において使用することができ
る。ＲＩＡの公知の変法のいずれか、例えば均一相中で
のＲＩＡ、固相もしくは不均一ＲＩＡ、またはシングル
ＲＩＡもしくはダブル（サンドイッチ）ＲＩＡを用いて
ヒト-ＭＩＦの直接または間接（競合法）測定を行うこ
とができる。

【００５３】好ましいＲＩＡにおいては、適当な担体、
例えばタイタープレートのプラスチック表面、または例
えばポリスチレン、ポリプロピレンもしくはポリ塩化ビ
ニル性の試験管、ガラス製もしくはプラスチック製のビ
ーズ、濾紙、デキストラン-、セルロアセテート-もしく
はニトロセルロース-シート、またはこれらに類似する
ものに、ヒト-ＭＩＦを含有する試験液または標準液
を、単純吸着によりまたは場合によっては担体を例えば
グルタルアルデヒドもしくはブロムシアンで活性化した
後に被覆し、そしてこの発明のモノクローナル抗体とイ
ンキュベートしそして次に第2の抗体溶液とインキュベ
ートする。

【００５４】この場合、第2の抗体、例えばラビット抗-
マウス免疫グロブリンがこの発明のモノクローナル抗体
を認識し、そしてこれと結合する。結合した第2の抗体
の量を、第2抗体が放射性標識されている場合には直接
に、またはこの第2抗体に対して高い親和性を有する放
射性標識されたタンパク質、例えばスタフィロコッカス
・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のプロテ
インAとの反応の後に、決定する。

【００５５】この発明のモノクローナル抗体はそれ自体
として、または酵素標識された誘導体としてエンザイム
イムノアッセイにおいて使用される。このようなイムノ
アッセイ法は、例えば、この発明のモノクローナル抗体
のエピトープを認識しそして結合するそれ自体公知の酵
素標識された抗体、または酵素標識されたこの発明のモ
ノクローナル抗体誘導体を使用する試験方法である。酵
素標識された抗体の他に、抗体-ビオチン接合体および
アビジン-酵素接合体も使用される。

【００５６】エンザイムイムノアッセイにおいて使用す
る酵素の例としてホースラディッシュ-パーオキシダー
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β-D-ガラクトシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カー
ボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラー
ゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、またはグ
ルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼを挙げるこ
とができる。

【００５７】ＥＬＩＳＡ法（エンザイム・リンクド・イ
ムノソルベント・アッセイ）が好ましく、この方法にお
いては、担体（これは例えばシグナルＲＩＡ試験につい
て前記したものであり、そして場合によっては赤血球が
付加されている）に単純吸着により、または場合によっ
ては担体もしくは担体に接合した赤血球をグルタルアル
デヒドにより活性化した後に、ヒト-ＭＩＦ含有試験液
または標準液を被覆し、あるいはヒト-ＭＩＦを測定す
べき細胞を付加し、そして次にこの担体をこの発明のモ
ノクローナル抗体と共にインキュベートしそして次にこ
の発明のモノクローナル抗体を認識しそして結合する酵
素標識された第2の担体の溶液と共にインキュベートす
る。この場合、結合した第2抗体、例えばパーオキシダ
ーゼで標識されたラビット抗-マウス免疫グロブリンの
量を、酵素基質を用いる発色により可視化し、そして決
定する。

【００５８】次のＥＬＩＳＡ法が特に好ましい。すなわ
ち、担体、例えばシングルＲＩＡ法について前記した担
体に、単純吸着により、または場合によっては担体をグ
ルタルアルデヒドもしくはブロムシアンにより活性化し
た後、この発明のモノクローナル抗体の溶液および／ま
たはヒト-ＭＩＦに特異的なポリクローナル抗体を被覆
し、次にこの担体をヒト-ＭＩＦ含有試験液または標準
液とインキュベートし、そして次にヒト-ＭＩＦの他の
エピトープを認識する場合がある酵素で標識されたこの
発明の抗体の溶液および／またはヒト-ＭＩＦに特異的
なポリクローナル抗体組成物と共にインキュベートする
か、あるいはビオチンと接合したこの発明の抗体の溶液
および／またはヒト-ＭＩＦに特異的なポリクローナル
抗体組成物と共にインキュベートしそして次にアビジン
-酵素接合体と共にインキュベートする。

【００５９】この際、結合した酵素標識またはビオチン
標識された担体が、酵素基質を用いる発色により可視化
されそして決定される。好ましくは、ホースラディッシ
ュパーオキシダーゼで標識されたこの発明の抗体の溶液
を用い、o-フェニレンジアミンを用いる発色により可視
化されそして決定される。

【００６０】この発明のエンザイムイムノアッセイにお
ける好ましい酵素基質は、5-アミノサリチル酸、o-フェ
ニレンジアミン、3,3′-ジメトキシベンジジン、3,3′,
5,5′-テトラメチルベンジジン、2,2′-アジノ-ビス-
（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）またはこ
れらに類似するものおよび過酸化水素により発色するこ
とができるホースラディッシュ-パーオキシダーゼ、並
びに酵素基質p-ニトロフェニルホスフェートからp-ニト
ロフェノールを遊離せしめるアルカリ性ホスファターゼ
である。

【００６１】ヒト-ＭＩＦの定性的または定量的測定の
ための、ヒト-ＭＩＦに対するモノクローナル抗体およ
びその誘導体のこの発明の使用には、前記以外のそれ自
体公知のイムノアッセイ、例えば螢光物質と抗体接合体
または抗原接合体を用いる免疫螢光法、抗体または抗原
で被覆されたラテックス粒子を用いるラテックス凝集
法、抗体または抗原で被覆された赤血球を用いる血球凝
集法、等が含まれる。

【００６２】そしてこの発明のモノクローナル抗体は、
ヒト-ＭＩＦに対する特異的結合と同様に一種以上の異
種動物-ＭＩＦにも特異的に結合するものもあり、該モ
ノクローナル抗体は前記のイムノアッセイにより異種動
物-ＭＩＦの定性的または定量的測定にも使用される。

【００６３】前記のイムノアッセイは、生物学的溶液、
特にヒトの血液中に存在するか、または固定された形で
細胞表面上に存在するヒト-ＭＩＦの量の決定に使用す
ることができ、そしてこれによって免疫調節障害を有す
る患者の診断が容易になる。例えば、特定の組織タイプ
および特定の病理状態においてのみ血液中にヒト-ＭＩ
Ｆが高濃度で存在したり、またはその量が正常状態での
平均値以上となる場合があり、病理組織中のヒト-ＭＩ
Ｆおよび病理状態の血液や関節液中のヒト-ＭＩＦの測
定により簡単な診断を可能にする。

【００６４】この発明のモノクローナル抗体の凍結組織
片への結合は下記のように検出された。

【００６５】結合が検出された正常組織 A）肝臓 B) 腎臓 C) 心臓 D) 肺 E) 脳 F) 胎盤結合が観察された病理組織 G）IgA腎症 H) 慢性関節リウマチ I) 腸炎ビブリオ（血清） J) SLE（血清） K) 気管支喘息（血清） この発明はさらに、ヒト−マクロファージ遊走阻止因子
（ヒト-ＭＩＦ）の定性的および定量的測定のための試
験キットに関し、このキットは、ヒト-ＭＩＦに対する
モノクローナル抗体および／またはその誘導体、並びに
場合によっては付属物を含んで成ることを特徴とする。

【００６６】ラジオイムノアッセイのためのこの発明の
試験キットは、例えば適当な担体、この発明のモノクロ
ーナル抗体または放射性標識されたこの発明のモノクロ
ーナル抗体誘導体の場合によっては凍結されたまたは濃
縮された溶液、放射性標識されている場合がある第2抗
体および／または場合によっては、スタフィロコッカス
・アウレウス由来の放射性標識されたプロテインＡ、精
製されたヒト-ＭＩＦまたはその個々のタンパク質の標
準溶液、緩衝液、グルタルアルデヒドを含有する固定
液、非特異的結合および凝集体形成を防止するための洗
剤、ピペット、反応器、換算曲線等を含む。

【００６７】エンザイムイムノアッセイのためのこの発
明のキットは、例えば適当な担体、この発明のモノクロ
ーナル抗体の場合によっては凍結されたまたは濃縮され
た溶液、酵素標識またはビオチン標識されているこの発
明の抗体誘導体、この発明のモノクローナル抗体を認識
そして結合する酵素標識された抗体の場合によっては凍
結されたまたは濃縮された溶液、アビジン-酵素接合体
の場合によっては凍結されたまたは濃縮された溶液、固
体の形または溶解した形の酵素基質、精製されたヒト-
ＭＩＦまたはその個々のタンパク質の標準溶液、緩衝
液、グルタルアルデヒドを含有する固定液、洗剤、ピペ
ット、反応器、換算曲線などを含む。

【００６８】この発明はさらに、ヒト-ＭＩＦを精製す
るための、ヒト-ＭＩＦに対するモノクローナル抗体お
よびその誘導体の使用に関する。例えば、モノクローナ
ル抗体とヒト-ＭＩＦの抗原決定基との間の結合相互作
用に基づく分離作用を利用するそれ自体公知の技法を用
いてヒト-ＭＩＦを分離することができる。好ましい分
離方法は、前に記載した免疫アフィニティークロマトグ
ラフィーである。

【００６９】この発明はさらに、医療的に有効な量の精
製されたヒト-ＭＩＦ、ヒト-ＭＩＦに対するモノクロー
ナル抗体またはこのようなモノクローナル抗体の誘導
体、および有意量の医薬担体を含んで成る医薬に関す
る。モノクローナル抗体の適当な誘導体は、ヒト-ＭＩ
Ｆの抗原決定基に対するその特異性を保持している断
片、例えばFab 、Fab′、またはF(ab′)₂断片である。

【００７０】この発明の医薬は、経腸投与により、例え
ば鼻内投与、直腸投与または経口投与により、そして好
ましくは非経腸投与により、例えば筋肉内投与、皮下投
与、または静脈内投与により、定温動物、例えばヒトに
投与される。意図される投与方法に依存して、この医薬
は単位投与形、例えばアンプル、バイアル、坐薬、糖衣
丸剤、錠剤、カプセル、または流体もしくは固体の形の
鼻内スプレーとして存在することができる。

【００７１】医療的に有効な化合物の投与すべき量は、
定温動物、例えばヒトの状態、例えば体重、疾患の種類
および重傷度、並びに一般的状態、さらには投与方法に
依存し、そして治療に当たる医師による評価に従う。

【００７２】この発明の医薬は常用の無機または有機の
固体または液体の医薬として許容される担体を、場合に
よっては他の医薬として活性な化合物および／または助
材と共に含有する。活性物質の溶液または懸濁液、特に
等張液または懸濁液、さらには使用直前に水に溶解する
凍結乾燥品が好ましい。医薬は殺菌することができ、そ
して／または緩衝剤、さらには他のタンパク質、例えば
ヒト-血清アルブミンまたはヒト-血漿標品を含有するこ
とができる。

【００７３】医薬として有効な量のヒト-ＭＩＦまたは
そのタンパク質を含有する水性分散体中リポゾームの形
の医薬が好ましい。特に、可能な限り均一な大きさの集
団からなり、約2.0×10^-8〜5.0×10^-6mの直径を有し、
リピド成分、例えば両親媒性リピド、例えばホスホリピ
ド、例えばレシチン、ケファリンまたはホスファチジル
酸、および場合によっては中性リピド、例えばコレステ
ロールからなる1または複数の2重層から構成されてお
り、そしてこの発明の精製されたヒト-ＭＩＦまたはそ
のタンパク質を含有する水性内部空間を包囲しているリ
ポゾームが好ましい。

【００７４】

【実施例】下記例によりこの発明をさらに詳細に説明す
るが、これによってこの発明の範囲を限定するものでは
ない。例において使用する略号は次の意味を有する。

【００７５】ELISA エンザイムアッセイ（エンザイム
リンクドイムノソルベントアッセイ） GSH グルタチオン HAT ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン HPLC 高速液体クロマトグラフィー HT ヒポキサンチン／チミジン KPB 燐酸カリウム緩衝液 LBAC アンピシリンＡとクロラムフェニコールＣを含む
LB培地 MIF マクロファージ遊走阻止因子 PBS 燐酸緩衝化生理的食塩水 PCR ポリメラーゼ連鎖反応 RIA ラジオイムノアッセイ SDS ドデシル硫酸ナトリウム SDS-PAGE SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 トリス（Tris） トリス-（ヒドロキシメチル）-アミノ
メタン rpm 回転数／分 BSA 牛血清アルブミン EDTA エチレンジアミン四酢酸例1. ヒト-ＭＩＦタンパク質の単離および精製 1.1 ヒト-ＭＩＦの製造 ＭＩＦの相補的DNA（cDNA）でコードされた領域をポリ
メラーゼ連鎖反応（PCR）法により以下のように増幅す
る。cDNAはCEM細胞、ヒトＴ細胞系からランダムヘキサ
ヌクレオチド（ファルマシア LKB バイオテクノロジ
ー）を用いて抽出した全RNAをもとに合成し、PCRの鋳型
として用いる。用いたプライマーは5′-CCATATGCCGATGT
TCATCGTAAACA（5′末端側でNdeI切断断片を含むＭＩＦ
のN末端と一致するセンス鎖）と5′-CGGGATCCTTAGGCGAA
GGTGGAGTTGTT（5′末端側でBamHI切断断片を含むＭＩＦ
のC末端と一致する抗-センス鎖）であった。94℃,1分
間、更に48℃,1分間、72℃,1分間で30サイクル行う。

【００７６】1.2 アミノ酸配列分析 増幅したDNAをT7プロモーター発現プラスミドpET3のNde
IとBamHI断片中へ挿入する。単離後のＭＩＦcDNAのヌク
レオチド配列はチェイン・ターミネーター（dideoxy te
rminator）法により確認する。

【００７７】すなわち、ヒト-ＭＩＦのアミノ酸配列
は、ヒトＴリンパ球のライブラリーからクローニングし
たcDNAの塩基配列から決定する。塩基配列の解析のチェ
インターミネーター（dideoxy terminator）は、蛍光標
識したジデオキシ・ポリヌクレオチドアデニリルトラン
スフェラーゼ（ddNTP）を用いてPCRを行い、反応停止側
を蛍光標識して検出する方法である ヒト-ＭＩＦ約1.0μg、プライマー（5´-CGGCAAGCCGGCA
CAGTACA-3´および／または 5´-GCTTGCTGTAGTTGCGGTTC
T-3´）0.5μg、およびプレミックス（TACS Buffer, dN
TP mix, DyeDeoxy^TMTerminators, Ampli Taqの混合物）
9.5μlを混合し、全量を20μlとした後、DNA Thermal C
ycler480（商標、パーキン・エルマー社）を用いて96
℃,30秒間、50℃,15秒間、および60℃,4分間を25サイク
ルでPCRを行う。PCR生成物を2度のフェノール／クロロ
ホルム抽出の後エタノール沈澱し、ホルムアミド：50mM
EDTA=5:1の溶液に溶解したものを92度,2分間熱変性さ
せて配列分析用試料とする。

【００７８】PCR生成物の試料の配列分析は373A DNA シ
ーケンス・システム(Sequencing System)（商標、アプラ
イド・バイオシステムズ社）を用い、30ワット,14時間
で泳動して行う。次のような明確なアミノ酸配列が見い
出される。

【００７９】Met-Pro-Met-Phe-Ile(5)-Val-Asn-Thr-Asn
-Val(10)-Pro-Arg-Ala-Ser-Val(15)-Pro-Asp-Gly-Phe-L
eu(20)-Ser-Glu-Leu-Thr-Gln(25)-Gln-Leu-Ala-Gln-Ala
(30)-Thr-Gly-Lys-Pro-Pro(35)-Gln-Tyr-Ile-Ala-Val(4
0)-His-Val-Val-Pro-Asp(45)-Gln-Leu-Met-Ala-Phe(50)
-Gly-Gly-Ser-Ser-Glu(55)-Pro-Cyc-Ala-Leu-Cyc(60)-S
er-Leu-His-Ser-Ile(65)-Gly-Lys-Ile-Gly-Gly(70)-Ala
-Gln-Asn-Arg-Ser(75)-Tyr-Ser-Lys-Leu-Leu(80)-Cyc-G
ly-Leu-Leu-Ala(85)-Glu-Arg-Leu-Arg-Ile(90)-Ser-Pro
-Asp-Arg-Val(95)-Tyr-Ile-Asn-Tyr-Tyr(100)-Asp-Met-
Asn-Ala-Ala(105)-Ser-Val-Gly-Trp-Asn(110)-Asn-Ser-
Thr-Phe-Ala(115) 1.3 プラスミドのE.Coliへの導入 ＭＩＦ遺伝子を挿入したプラスミドをE.Coli BL21(DE3)
LysSへ導入する。LBACを添加したプレートをあらかじめ
37℃に温めておく。冷凍保存されているE.Coli BL21(DE
3)LysSを氷中で融解し、100μlにＭＩＦのプラスミドを
1μl加え、穏やかに混合する。氷中,30分間、42℃,90
秒、再度氷中に戻し5分間おく。LB（1% トリプトン-0.0
5% イーストイクストラクト-0.1% NaCl）を1ml加え37
℃,1時間インキュベートし、5000rpm,3分間遠心する。
上清を50〜100μl残し、沈澱物を再懸濁する。LBACを添
加したプレートにそれを滴下してコンラージ棒で塗り広
げる。プレートを37℃インキュベーターに入れ一晩培養
する。菌が増殖した後、逆口フラスコ中の250mlのLB培
地中に移し0.5mM IPTG（イソプロピル-1-チオ-β-D-ガ
ラクトピラノシド）によりＭＩＦを誘導し、一晩振とう
培養する。

【００８０】1.4 培養細胞からのヒト-ＭＩＦの抽出 培養したE.Coliを回収し、洗浄し、加圧型細胞破壊装置
のフレンチプレス（SLM-Amicon）により1,000psiで粉砕
した後、その細胞溶液を105,000×g,1時間遠心分離し、
上清（細胞質ゾル）1lを得る。

【００８１】1.5 イムノアフィニティークロマトグラフ
ィー 例1.2からの上清1lを10mM KPB中で平衡化されたS-ヘキ
シルグルタチオンアフィニティーカラム（商標）上に通
す。非特異的に結合したタンパク質および随伴する物質
を、10mM KPBにより洗浄し、そして次にカラムサイズの
20倍の容量で20mMTris-HCl-0.2M NaCl（pH7.8）により1
5ml／時の流速で洗浄することによりカラムから溶出す
る。

【００８２】特異的に結合したヒト-ＭＩＦタンパク質
を20mM Tris-HCl-0.2M NaCl-15mM グルタチオン（pH7.
8）の溶液で溶出する。溶出液はフラクションコレクタ
ーで分画し、その際1M Tris（pH6.5）を入れた試験管で
採取し中和する。この溶出は280nmにおける吸収の測定
（日立 U1100）により監視する。

【００８３】1.6 ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）によるＭＩＦタンパク質の分
析 透析された濃縮物（例1.4）を、ウェバーとオスボーン
の方法[K.ウェバーおよびM.オスボーン、「バイオロジ
カル・ケミストリー」、244:4406-4412(1969)]に従っ
て、10%ポリアクリルアミドスラブゲル上での電気泳動
にかける。タンパク質バンドを、0.06% クマシーブリリ
アントブルーG 250（東京化成工業）（10%酢酸、40%メ
タノール）による染色および／または銀染色法[C.R.メ
リル「アナリティカル・バイオケミストリー」、110:20
1(1981)]により可視化する。これにより、分子量12.5kD
のヒト-ＭＩＦのみが単離精製されたことを示す。

【００８４】1.7 ゲル濾過 例1.3で集めたヒト-ＭＩＦタンパク質含有画分を100mM
燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）で平衡化したセファデ
ックス G-100カラム（内径2.7cm×長さ55cm）に共して
吸着させる。1時間18mlの流速で、3mlずつ分画する。分
子量マーカーとしてウシ・血清アルブミン（66.2kD）、
ニワトリ・オボアルブミン（45.0kD）、ウシ・カルボニ
ックアンヒドラーゼ（31.0kD）、およびシトクロムc（1
2.4kD）を用いる。平衡化に用いた緩衝液で溶出し、ヒ
ト-ＭＩＦが24.3kDの分子量を有する事が示され、その
ヒト-ＭＩＦタンパク質画分を集め、そして濃縮あるい
は凍結乾燥をする。以上の精製過程では、培養上清1lか
ら約10mgのヒト-ＭＩＦが精製される。例1.4の結果と合
わせ、未変性ＭＩＦはホモ二量体で存在していることが
示唆される。

【００８５】1.8 分析用超遠心法 未変性ＭＩＦの正確な分子量を測定するために、分析用
超遠心法を行う。超遠心沈降平衡法では、粒子が比較的
小さい場合、それは水面の近くにも分布し、下層になる
ほど濃度を増す。この状態は沈降平衡と呼ばれる。重力
場における粒子の沈降は、ブラウン運動による拡散と釣
り合っている。この濁りの度合の鉛直方向における分布
の評価を行って分子量を求める。

【００８６】日立の分析用超遠心機（モデル282）を用
いて未変性ＭＩＦの分子量の測定を行う。試験はそれ自
体公知の方法に従って、20±1℃、15,000rpm、16時間で
行う。ローターは100μlのＭＩＦ試料液と130μlの溶媒
が入るショートソルーションカラムを装備できる日立RA
-72TGを用いる。ＭＩＦの部分比容はアミノ酸組成から
0.73と算出される。全サンプルは燐酸ナトリウム緩衝液
（100mM, pH6.5, 密度=1.008）に対して透析を行う。

【００８７】分子量の算出は日立超遠心機プロセッサー
（モデルDA-7）を用いて行う。回転軸より距離Ｒにおけ
るタンパク質濃度（吸光度）をＹとして、Ｒ²に対するl
ogＹの値からＭＩＦの分子量を求める。未変性ＭＩＦの
濃度を0.3と0.4mg/mlとして二種の濃度より算出された
値、23.8kDと25.8kDの平均値の24.8kDと測定され、例1.
5のゲル濾過による結果と一致する。

【００８８】例2. ハイブリドーマ細胞の調製 2.1 ヒト-ＭＩＦ溶液の調製 例1で精製したヒト-ＭＩＦ20mgを蒸留水20ml中に溶解し
た状態で十分に凍結し、その後48時間凍結乾燥（FTS SY
STEM DUR-DRY）を行う。さらに、その凍結乾燥品のヒト
-ＭＩＦを生理的食塩水で1mg/mlのヒト-ＭＩＦ溶液に調
製し、-40℃で凍結保存しておく。

【００８９】この溶液を免疫処理のために使用する。

【００９０】2.2 免疫処理 BALB/cマウスを、0日目に、例2. 1からのヒト-ＭＩＦと
生理的食塩水100μl ずつを、200μlずつの完全フロイ
ントアジュバントと共に1回注射することにより免疫す
る。さらに、その後2週間毎に例2. 1からのヒト-ＭＩＦ
と生理的食塩水30μlずつを、60μlずつの不完全フロイ
ントアジュバントと共に3回注射することにより免疫す
る。この場合、注射量の全量を皮下（s.c.）注射する。
処理されたマウスの脾臓摘出日の4日前に再度、上記不
完全フロイントアジュバント-ヒト-ＭＩＦ液を注射する
ことにより追加免疫する。2カ月後に処理されたマウス
の脾臓を摘出する。

【００９１】2.3 細胞融合 KoehlerおよびMilsteinの方法[G.KoehlerおよびC.Milst
ein、「ネイチュアー」256:495(1975)]に従って、10⁸個
の脾臓リンパ球を、ダルベッコ変法イーグル培地中50％
ポリエチレングリコール1500（ベーリンガーマンハイ
ム）溶液 1ml中で2.1×10⁷個のマウス骨髄腫細胞P3-X6
3-Ag8. 653 [J.F.キールニー等（Kearney）、「ジャー
ナル・オブ・イムノロジー」123:1548(1979)]と混合す
る。

【００９２】融合の後、細胞をスマイロン・マルチ・ウ
ェル・プレイトMS-8096Fの1000個のウェルに播いて、そ
してベーリンガー・マンハイムのHAT培地（ヒポキサン
チンアミノプテリンチミジン標準培地）[J.W.リトルフ
ィールド「サイエンス」145:709(1974)]中でフィーダー
細胞としての骨髄マクロファージと共に培養する。HAT
培地中で9日間培養した後、HT培地中で5日間培養し、最
終的に、ダルベッコの変法イーグル培地９．５ｇに10%
ＮａＨＣＯ₃12-20ml、Ｌ−グルタミン0.584ｇおよび培
地の15%のウシ胎児血清が補充されているものの中で培
養を継続する。

【００９３】得られた融合細胞ＨＭＷ−６Ｌ２Ａを平成
７年８月３１日付で工業技術院の生命工学工業技術研究
所に寄託し、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１５０を得
た。

【００９４】例3. 抗体特異性についてのハイブリドー
マ細胞の試験 3.1 γ−グロブリンの検出 ハイブリドーマ細胞培養液の上清をＥＬＩＳＡ（エンザ
イム・リンクド・イムノソルベント・アッセイ）におい
て試験する。この方法においては、ラビットから得ら
れ、パーオキシダーゼと接合されており、そしてマウス
γ−グロブリンを認識し、そしてこれを結合する第2の
抗体を用いる。272個のハイブリドーマセルラインの内8
6個のクローンがγ-グロブリンを産生する。

【００９５】3.2 目的とする分子量12.5kDのヒト-ＭＩ
Ｆタンパク質に対する特異性 96穴イムノマイクロプレート（ヌンク社製）に分子量1
2.5kDのヒト-ＭＩＦ（例1）を50mM 炭酸緩衝液（pH9.
5）中25℃にて一晩インキュベートする。反復洗浄によ
って未結合タンパク質を除去し、そしてこのプレートに
0.2% BSA-1mM EDTA-0.05% Tween 20を含有する50mM 燐
酸緩衝液（pH7.0）を1ウェル当り300μl添加して4℃で
保存する。

【００９６】プレートをハイブリドーマ細胞培養上清液
とインキュベートし、そして次にホースラディッシュー
パーオキシダーゼと結合したラッビト抗-マウス免疫グ
ロブリン第2抗体とインキュベートし、そして過酸化水
素存在下でo-フェニレンジアミンにより発色せしめる。
この後に、3N 硫酸を加えて酵素反応を停止させ、最終
的に波長492nmに極大吸収を持つ物質に変換し、分光的
に検出する。このＥＬＩＳＡ法により、例1からのヒト-
ＭＩＦに結合するモノクローナル抗体が同定される。γ
−グロブリンを分泌する86個の細胞クローンの内21クロ
ーンがこの測定において結合されるモノクローナル抗体
を産生する。

【００９７】例4. ヒト-マクロファージ遊走阻止因子
についての試験（ＭＩＦ試験） 4.1 ＭＩＦ試験のための標的細胞の取得 ＭＩＦ試験は96穴ケモタキシスチャンバー（Neuro Prob
e, Model AB 96）を用いて以下の方法で行う。走化性因
子溶液および陰性対照（mixsol）をそれぞれ25μlずつb
ottomプレートのlowerウェルに満たし、あらかじめガス
ケットとメンブランフィルター（孔径:3μm）を装着し
たtopプレートをbottomプレートの上に載せて両プレー
トをネジで固定する。

【００９８】4.2 ＭＩＦ試験の実施 培養終了後にチャンバーから取り外したフィルターは、
37℃に温めたPBSで非付着細胞を洗い落とした後、フィ
ルター表面に付着している遊走細胞をDiff-Quik染色液
（国際試薬）で固定、染色する。なお、染色後に綿棒ま
たはscraperを用いてフィルターの非遊走面を清掃する
ことにより、非遊走細胞を除去する。

【００９９】4.3 遊走阻止性の評価 例4.2のメン
ブレンフィルターは、室温で風乾した後、マイクロプレ
ートリーダー（Bio-Rad,Model 2550 EIA reader,波長45
0-700nm）を用いて吸光度を測定する。実験はすべて3重
測定で行うことにより吸光度の平均値と標準誤差を求め
るとともに、3回以上繰り返して実験を行いデータの再
現性を確認する。

【０１００】例5. 腹水からのモノクローナル抗体の単
離および精製 BALB/c マウスを0.5mlのプリスタン（ジャンセン・キミ
カ））により腹腔内前処理する。2週間後、1〜2×10⁷個
のクローン化ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射する。各
マウスから反復して腹水を採取し、そして室温、2,500r
pmにて20分間遠心分離する。脂肪を吸引濾去し、そして
残った破片を含有しない上清液に、4℃にて撹伴しなが
ら、50％の濃度に達するまで、飽和硫酸アンモニウム溶
液をゆっくりと滴加する。こうして沈澱した粗免疫グロ
ブリン画分を、DEAE-Sephacel（商標、ファルマシア）
上で、0.0175M 燐酸緩衝液（pH6.8）を用いて、製造者
により特定された方法によりクロマトグラフ処理する。
活性画分を集めて、そしてセントリフローCF25（アミコ
ン）を用いて濃縮する。

【０１０１】例6. モノクローナル抗体の免疫グロブリ
ンサブクラスの同定 この発明のモノクローナル抗体の免疫グロブリンのサブ
クラスをMouse MonoAB-ID KIT(HRP)（商標、ザイメット
社）を用いてＥＬＩＳＡ法で同定する。

【０１０２】例7. ヒト-ＭＩＦに対するポリクローナ
ル抗体の製造 7.1 免疫処理 適当な哺乳動物、好ましくはウサギにヒト-ＭＩＦを免
疫し、ポリクローナル抗体を作製する。例1からの500μ
gのヒト-ＭＩＦを、2mlの完全アジュバンドと共に均一
な乳濁液とし、ウサギの背に皮下注射する。その後2週
間毎に100μgのヒト-ＭＩＦを、1ml不完全アジュバンド
と共に均一な乳濁液とし、同様に5回注射することによ
り免疫する。

【０１０３】7.2 目的とする分子量12.5kDのヒト-ＭＩ
Ｆタンパク質に対する特異性 例3.2からのヒト-ＭＩＦを固定したプレートを用いて行
う。プレートと免疫中のウサギの部分採血による血清を
生理的食塩水で100〜6400倍希釈した血清溶液とインキ
ュベートし、そして次にホースラディッシューパーオキ
シダーゼと結合したブタ抗-ラビット免疫グロブリン第2
抗体とインキュベートし、そして過酸化水素存在下でo-
フェニレンジアミンにより発色せしめる。この後に、3N
硫酸を加えて酵素反応を停止させ、最終的に波長492nm
に極大吸収を持つ物質に変換し、分光的に検出する。こ
のＥＬＩＳＡ法により、例1からのヒト-ＭＩＦに結合す
るポリクローナル抗体の抗体価を求める。

【０１０４】7.3 ウサギ血清からのポリクローナル抗
体の精製 抗体価が一定になったことを例7.2により確認した後、
全採血の4日前に、200μgのヒト-ＭＩＦを、2ml不完全
アジュバンドと共に均一な乳濁液とし、追加免疫を行
う。全採血によるウサギ血清は、例5と同様に50%飽和硫
安による塩析、0.0175M 燐酸緩衝液（pH6.8）に対する
透析、およびDEAE-Sephacel（商標、ファルマシア）上
で、0.0175M 燐酸緩衝液（pH6.8）を用いて、製造者に
より特定された方法によりクロマトグラフ処理する。活
性画分を集めて、そしてセントリフローCF25（アミコ
ン）を用いて濃縮する。

【０１０５】例8. ヒト-ＭＩＦの決定のためのエンザ
イムイムノアッセイ（ＭＩＦ-ＥＬＩＳＡ） 例7に従って精製されたヒト-ＭＩＦに対する抗ヒト-Ｍ
ＩＦウサギポリクローナル抗体溶液を50mM炭酸緩衝液
（pH9.5）中で10μg/mlの濃度とし、その溶液100μlを9
6穴イムノマイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェル
中で25℃にて一晩あるいは37℃にて1時間インキュベー
トする。PBS-Tween[0.05% ツイーン20が添加されている
PBS]により4回洗浄し、そしてプレート底のなお存在す
るタンパク質反応性結合部位を、ウェル当り300μlの50
mM PB-0.2% BSA-1mM EDTA緩衝液との25℃にて一晩ある
いは37℃にて1時間にわたるインキュベートにより飽和
する。

【０１０６】試験溶液の一連の希釈物100μlまたはヒト
-ＭＩＦを含有する標準溶液をイムノマイクロプレート
のウェル中で25℃にて1時間30分インキュベートする。
未結合部分をPBS-Tween 20緩衝液で4回洗浄して除去す
る。そして次に例6に従うモノクローナル抗体の免疫グ
ロブリンのサブクラスの同定においてIgG2aと同定され
た抗体HMW-6L2A（抗-ヒト-ＭＩＦ）をそれ自体公知の方
法であるマレイミド法[E.石川等、「ジャーナル・オブ
・イムノアッセイ」、4:209-327(1983)、S.吉武等、
「ジャーナル・オブ・イムノロジー」、10:81-86(197
9)、およびK.H.ルアン、「アナリティカル・レター
ズ」、17(B7):539-554(1984)]に従って、ホースラディ
ッシュパーオキシダーゼで標識化する（ホースラディッ
シュパーオキシダーゼとポリクローナル抗体とのモル比
＝2〜3：1）。そして Ultrogel AcA 44（商標、ファル
マシア社）上で精製された抗体HMW-6L2A-ホースラディ
ッシュパーオキシダーゼ接合体（10μg/ml）の0.1% BSA
-1mM EDTA-0.05% Tween 20を含有するPBS中溶液100μl
をウェル中で25℃にて1時間インキュベートする。

【０１０７】プレートをPBS-Tween 20緩衝液により4回
洗浄した後、o-フェニレンジアミン（試薬組成を後で記
載）100μlによる発色、さらに3N H2SO4を100μl添加し
反応を停止した後、492nmにおける吸光度計による測定
により、補足された酵素の量を測定する。

【０１０８】抗体HMW-6L2A-ホースラディッシュパーオ
キシダーゼ接合体（10μg/ml）の代わりに、IgG3と同定
された抗体HMW-7L3（抗-ヒト-ＭＩＦ）において同様に
して調製された抗体HMW-7L3-ホースラディッシュパーオ
キシダーゼ接合体（10μg/ml）を使用することができ
る。

【０１０９】例9. ＭＩＦ-ＥＬＩＳＡ用の試験キット 例8に記載したエンザイムイムノアッセイに使用するた
めの試験キットは次の物を含む。

【０１１０】構成試薬名；成分・分量 1.抗体固相プレート（96穴イムノマイクロプレート）；
10μg/ml抗ヒト-ＭＩＦウサギポリクローナル抗体 2.酵素標識抗体液；ホースラディッシュ-パーオキシダ
ーゼ標識抗ヒト-ＭＩＦモノクローナル抗体（ホースラ
ディッシュ-パーオキシダーゼとモノクローナル抗体と
のモル比＝2〜3：1, 10μ g/ml）11ml。

【０１１１】3.緩衝液；0.1% BSA-1mM EDTA-0.05% Twee
n 20を含有するPBS 20ml 4.発色剤（凍結乾燥粉末）；ｏ−フェニレンジアミン
0.2mg（11ml用） 5.発色剤溶解液；0.1Mクエン酸／燐酸緩 衝液-0.05% H
₂O₂（pH4.6） 20ml 6.反応停止液；3N H₂SO₄ 11ml 7.洗浄液；PBS-Tween 20緩衝液（0.05% Tween20を含有
するPBS） 100ml

【０１１２】

【配列表】

【０１１３】配列番号：１ 配列の長さ：１１５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val 5 10 15 Pro Asp Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala 20 25 30 Thr Gly Lys Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp 35 40 45 Gln Leu Met Ala Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cyc Ala Leu Cyc 50 55 60 Ser Leu His Ser Ile Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Ser 65 70 75 Tyr Ser Lys Leu Leu Cyc Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile 80 85 90 Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala 95 100 105 Ser Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr Phe Ala 110 115

【０１１４】配列番号：２ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類：他の種類 合成DNA 配列 CCATATGCCGATGTTCATCGTAAACA

【０１１５】配列番号：３ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類：他の種類 合成DNA 配列 CGGGATCCTTAGGCGAAGGTGGAGTTGTT

【０１１６】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類：他の種類 合成DNA 配列 CGGCAAGCCGGCACAGTACA

【０１１７】配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類：他の種類 合成DNA 配列 GCTTGCTGTAGTTGCGGTTCT

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ // Ｃ０７Ｈ 21/04 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記アミノ酸配列： Met Pro Met Phe Ile Val Asn Thr Asn Val Pro Arg Ala Ser Val 5 10 15 Pro Asp Gly Phe Leu Ser Glu Leu Thr Gln Gln Leu Ala Gln Ala 20 25 30 Thr Gly Lys Pro Pro Gln Tyr Ile Ala Val His Val Val Pro Asp 35 40 45 Gln Leu Met Ala Phe Gly Gly Ser Ser Glu Pro Cyc Ala Leu Cyc 50 55 60 Ser Leu His Ser Ile Gly Lys Ile Gly Gly Ala Gln Asn Arg Ser 65 70 75 Tyr Ser Lys Leu Leu Cyc Gly Leu Leu Ala Glu Arg Leu Arg Ile 80 85 90 Ser Pro Asp Arg Val Tyr Ile Asn Tyr Tyr Asp Met Asn Ala Ala 95 100 105 Ser Val Gly Trp Asn Asn Ser Thr Phe Ala 110 115 を有するヒト-マクロファージ遊走阻止因子（ヒト-ＭＩ
   Ｆ）に対するモノクローナル抗体、およびその誘導体。
2. 【請求項２】 ヒト-ＭＩＦに結合し、そして／または
   その生物学的活性を阻害する、請求項１に記載のモノク
   ローナル抗体、およびその誘導体。
3. 【請求項３】 実質的に他の哺乳類タンパク質の随伴が
   無い形態の12.5kDの分子量のヒト-ＭＩＦおよびヒト-Ｍ
   ＩＦを含むと考えられるサンプル中に存在するヒト-Ｍ
   ＩＦに特異的に結合する、請求項１または２に記載のモ
   ノクローナル抗体およびその誘導体。
4. 【請求項４】 一種以上の異種動物組織から単離精製さ
   れた異種動物マクロファージ遊走阻止因子、およびそれ
   ら異種動物-ＭＩＦが含まれていると考えられるサンプ
   ル中に存在する異種動物-ＭＩＦにも特異的に結合する
   請求項１および２に記載のモノクローナル抗体およびそ
   の誘導体。
5. 【請求項５】 マウス脾臓細胞およびマウスのミエロー
   マ細胞に由来するハイブリドーマ細胞により生産され
   る、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
6. 【請求項６】 ラット脾臓細胞およびマウスのミエロー
   マ細胞に由来するハイブリドーマ細胞により生産され
   る、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
7. 【請求項７】 請求項１のヒト-マクロファージ遊走阻止
   因子（ヒト-ＭＩＦ）に対するモノクローナル抗体およ
   びその誘導体の製造方法であって、該モノクローナル抗
   体を産生するハイブリドーマ細胞を、 a) イン-ビトロ培養し、そして培養上清液からモノク
   ローナル抗体を単離し、または b) 適当な哺乳動物中でイン-ビボ増幅し、そして該哺
   乳動物の体液からモノクローナル抗体を単離し、 c) そして所望により、得られたモノクローナル抗体を
   その誘導体に転換する、ことを特徴とする方法。
8. 【請求項８】 請求項１ないし４のいずれかに記載のヒ
   ト-ＭＩＦに対するモノクローナル抗体およびその誘導
   体を使用することを特徴とする、ヒト-マクロファージ
   遊走阻止因子（ヒト-ＭＩＦ）および異種動物-ＭＩＦの
   定性的および定量的測定のための方法。
9. 【請求項９】 請求項１ないし４のいずれかに記載のヒ
   ト-ＭＩＦに対するモノクローナル抗体および／または
   その誘導体、並びに場合によっては付属物を含むことを
   特徴とする、ヒト-ＭＩＦおよび一種以上の異種動物-Ｍ
   ＩＦの定性および定量測定のためのキット。
10. 【請求項１０】 ヒト-ＭＩＦに対するモノクローナル
    抗体またはその誘導体の療法的有効量を有意量の医薬助
    剤と共に含んで成る、感染症、自己免疫疾患および一次
    的慢性多発関節炎の抑制のための医薬製剤。