JPH0340832B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 血清、尿などの体液に含まれる薬物あるいは各
種疾患に由来する微量成分の分析は病気の診断あ
るいは治療経過の判定などに非常に有意義であ
り、日常の臨床検査に活用されている。本発明は
この微量成分を測定する方法に関するものであ
る。

（従来の技術） 血液等の体液には多種多様の成分が含まれてお
り、そのなかには、分子量の近似した物質、生理
活性の似た物質あるいは構造の近似した物質など
も含まれていることも多い。そこで、この分析法
は特異性が高く、かつ微少量まで定量しうること
が要求される。さらに、日常検査として利用され
るために、簡単かつルーチン化しうることが望ま
しい。

血液のこれらの微量成分を検出する方法が種々
開発されているが、感度、特異性、大量検体の短
時間処理などの点にすぐれる酵素免疫測定法が賞
用されている。しかしながら、従来の酵素免疫測
定法の場合には、未だ感度が充分とはいえず、ま
た洗浄操作が繁雑であつたり、チユーブの移しか
えが必要であつたりして正確な濃度を求めること
が容易でなかつた。

そこで、本発明者らはさらに感度を高めかつ繁
雑な操作の少ない分析方法を開発するべく検討を
行ない、測定対象の抗原決定基具有物質に対する
抗体と酵素に対する抗体との結合物を利用する方
法を開発した。この方法は、この結合物に対して
測定対象の抗原決定基具有物質と酵素を競争反応
させその後この酵素の活性を測定することによつ
て抗原決定基具有物質を定量する方法（特願昭58
−38975号、特開昭59−164960号公報）である。
その際、この抗原決定基具有物質に対する抗体と
反応する抗体あるいは酵素に対する抗体と反応す
る抗体をさらに競争反応させる方法（特願昭58−
51494号、特開昭59−178360号）、あるいは抗原決
定基具有物質と高分子化合物との結合物又は抗原
決定基具有物質の重合物を競争反応させる方法
（特願昭58−51495号、特開昭59−178361号）も併
せて開発した。そして、その後さらに検討を進
め、この技術に近縁の種々の抗原決定基具有物質
測定法を次々と開発して特許出願を行なつた。そ
のなかに、測定対象の抗原決定基具有物質にその
抗体と水に不溶性の高分子物質に作用しうる酵素
との結合物を作用させてその後結合物の酵素活性
を測定する方法（特願昭58−231241号、特開昭60
−123767号）があつた。また、測定対象の抗原決
定基具有物質にこの抗原決定基具有物質の一の抗
原決定基に対する抗体とアミラーゼとの結合物及
びこの抗原決定基具有物質の他の抗原決定基に対
する抗体を接触させてその後結合物のアミラーゼ
活性等を測定する方法（特願昭59−143801号、特
開昭61−23970号）もあつた。

（発明が解決しようとする問題点） 前者の方法に比し後者の方法は測定感度がさら
に１桁ないし２桁高くなる点ですぐれていたが、
後者の方法は血清などの検体にはアミラーゼが含
まれているところから検体中のアミラーゼに特異
的に作用するアミラーゼインヒビターを添加する
必要があつた。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、この後者の発明を拡張するものであ
り、アミラーゼのかわりに他の酵素のうち水に不
溶性の高分子物質に作用しうる酵素を用いること
によつても抗原決定基具有物質を高感度で測定で
きるという知見に基いている。この酵素のうち検
体に含まれていない酵素を用いれば特に酵素阻害
物質などを用いなくとも測定できるという利点が
ある。

すなわち、本発明は、検体に含まれる２以上の
抗原決定基を具有する物質を測定する方法におい
て、該抗原決定基具有物質に、この抗原決定基具
有物質の一の抗原決定基に対する抗体と水に不溶
性の高分子物質に作用しうる酵素との結合物及び
他の抗原決定基に対する抗体を接触せしめて反応
させ、さらに前記の高分子物質に前記の結合物を
接触せしめて酵素反応させ、酵素活性を測定する
ことを特徴とする抗原決定基具有物質の測定方法
に関するものである。

本発明における測定対象は検体に含まれる抗原
決定基具有物質である。検体の種類は限定されな
いが、例えば血清、尿などである。血清、尿など
の場合には、通常は特別な前処理を必要とせず、
そのまま測定を行うことができる。

抗原決定基具有物質（以下リガンドという。）
は抗原決定基を二以上有しているものであり、例
えば、各種内分泌腺に由来するホルモン類、免疫
グロブリン、アルブミン、フエリチン等の血漿蛋
白質、HB抗原等のウイルス、バクテリア類、α
−フエトプロテイン、癌胎児性抗原等の各種臓器
あるいは血中、尿中に存在する抗原などである。

結合物を構成している抗体はリガンドと反応す
るものでなければならない。この抗体にはＦ
（ab′）₂、Fab′、Fabなどのフラグメントも含まれ
る。

抗体の製造方法としては、リガンド又はリガン
ドと蛋白との結合物を兎、山羊、馬、モルモツ
ト、ニワトリなどの温血動物に体重１Kgあたり
0.3〜２mgを１〜数回背中皮下、フツトパツド、
大腿筋等にアジユバントとともに注射して当該動
物の体内に形成させる。この抗体は各種の抗原決
定基を認識する抗体の混合物であるからこれを分
離して用いる。分離方法にはアフイニテイークロ
マトグラフイーを用いるのがよく、例えば、リガ
ンドを酵素あるいは化学試薬により分解してゲル
過、イオン交換クロマトグラフイーなどで分離
し、この各抗原フラクシヨンを不溶化したアフイ
ニテイーカラムを作製し、このカラムを用いて前
記の抗体混合物を分離することができる。また、
この抗体は市販品も存在する。本発明の方法にお
いては、抗体は単一抗体に分離しなくともよく、
少なくとも２群に分割すれば足りる。

一方、この抗体はモノクローナル抗体として取
得することもできる。その場合には、マウスに前
記のいずれかの抗原をアジユバントとともに数回
腹腔等に注射し、脾臓細胞を取り出してポリエチ
レングリコール等を用いてマウスミエローマ細胞
と融合させる。そして、この融合細胞のなかから
当該抗体を産生するものをクローニングによつて
モノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによつて単一抗体、すなわちモ
ノクローナル抗体を大量に製造することができ
る。

結合物を構成している酵素は水に不溶性の高分
子化合物に作用しうるものであるが、そのなかで
は活性の測定方法が容易なものがよい。このよう
な酵素は、例えばアミラーゼ、デキストラナー
ゼ、セルラーゼ、コラーゲナーゼ、マンナーゼ、
プロテアーゼ、エラスターゼ、リパーゼ、などで
ある。

酵素と抗体との結合方法は双方の官能基を考慮
して決定すればよい。官能基は、アミノ基、カル
ボキシル基、水酸基、チオール基、イミダゾール
基、フエニル基などを利用することができ、例え
ばアミノ基相互間を結合させる場合には、ジイソ
シアネート法、グルタルアルデヒド法、ジフルオ
ロベンゼン法、ベンゾキノン法等数多く知られて
いる。また、アミノ基とカルボキシル基との間を
結合させる方法としては、カルボキシル基をサク
シンイミドエステル化する方法のほかカルボジイ
ミド法、ウツドワード試薬法等が知らており、ア
ミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法
（Nakane法）もある。チオール基を利用する場
合には、例えばもう一方の側のカルボキシル基を
サクシンイミドエステル化してこれにシステイン
を反応させてチオール基を導入し、チオール基反
応性二価架橋試薬を用いて双方を結合することが
できる。フエニル基を利用する方法としてはジア
ゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこ
れらの例示に限られるものではなく、このほか例
えば（Method in Immunology and
Immunochemistry」あるいは「酵素免疫測定法」
等の成書に記載されている方法のなかから適宜選
択して利用することができる。結合比は１：１に
限らず、目的に応じて任意の比率をとることがで
きるということはいうまでもない。反応後は、ゲ
ル過法、イオン交換クロマトグラフイー、アフ
イニテイークロマトグラフイーなどを適宜組み合
わせて精製を行い、必要により凍結乾燥法等で乾
燥する。

この結合物の抗体とともにリガンドに作用させ
る抗体は結合物の抗体が反応する抗原決定基と異
なる抗原決定基に対して反応するものである。こ
の抗体はIgG、IgMあるいはIgAであり、Ｆ
（ab′）₂、Fabなどのフラグメントであつてもよ
く、また、例えばDNP化、アセチル化、ビオチ
ニル化、ニトロ化などの化学修飾が施されたもの
であつてもよい。この抗体は１種類に限られるも
のではなく、２種類以上あつてもよい。

この異なる抗原決定基を認識する抗体は前述の
細胞融合法によるモノクローナル抗体を製造する
方法により容易に取得することができる。また、
前述の温血動物を利用して抗体群を産生させ、こ
れを分離してもよい。その場合には単一抗体まで
分離しなくともよく、例えば２群に分割してその
一方を前述の酵素と結合させ、もう一方をこの抗
体に利用してもよい。また、この抗体は完全に分
離しなくともよく、測定を阻害しない程度に他方
の抗体が混入していてもよい。

この抗体には水溶性高分子を結合させたほうが
感度を高める点で好ましい場合がある。水溶性高
分子は分子量が1000以上のものであり、例えばア
ルブミン、ヘモシアニン等の蛋白質、ポリサツカ
ライド、ポリエチレングリコール、ポリヌクレオ
チド等である。結合方法は前述の酵素に抗体を結
合させる方法のなかから適宜選択すればよい。

同様に、この抗体にさらにこの抗体に対する抗
体を反応させて高分子化してもよい。この第２抗
体は例えばヤギIgGに対するウサギIgGなどであ
り、第１抗体あるいは第１抗体とリガンドの結合
物を抗原として前述の抗体の取得方法に準じて取
得することができる。この第２抗体を接触させる
時期は第１抗体をリガンドに接触させる前であつ
ても後であつてもよいが、同時に加えることが操
作上簡便である。

測定対象のリガンドに、前記一つの抗原決定基
に対する抗体と酵素との結合物及び他の抗原決定
基に対する抗体を溶液中で接触させる。その際、
溶液の温度は20〜45℃程度、そしてPHは通常４〜
8.5程度が適当である。PHを一定に保つために、
必要により、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩
衝液を用いてもよい。その際、結合物及び抗体の
適当な量は、その種類、リガンドの種類、あるい
は接触時の条件などによつて異なるので予め試験
をして定めるのがよい。リガンドへの結合物及び
抗体の接触順序は問うところではなく、いずれが
先であつてもまた両方同時であつてもよい。

一方、結合物の酵素と同種の酵素が検体に含ま
れている場合には、この検体中の酵素を阻害する
程度が前記の結合物に結合されている酵素の活性
を阻害する程度より大きい酵素阻害物質を接触さ
せるのがよい。

この酵素阻害物質は検体に含まれている酵素を
完全に失活させかつ結合物に結合されている酵素
を全く阻害しないものが最も望ましいことはいう
までもないが、実用上は要は測定時においてブラ
ンク値を上昇させなければよく、測定後に酵素阻
害物質が失活するなどしてこの酵素活性が回復し
てもよい。この酵素阻害物質の作用が問題になる
もう一方の、酵素は抗体に結合されている状態の
ものであり、遊離状態では酵素阻害物質によつて
失活するものであつてもよい。この酵素阻害物質
にはこのような特異性を有する公知の酵素阻害物
質を利用すればよいが、そのほか、検体に含まれ
ている酵素を温血動物に投与してその抗体を取得
し、これを酵素阻害物質として用いることもでき
る。抗体の取得方法は前述のリガンドに対する抗
体の取得方法と同様でよい。酵素阻害物質の添加
時期は、検体中の酵素による後述する水に不溶性
の高分子物質の分解を実質的に防止できればよ
く、通常はこの高分子物質の添加前に添加する。
しかしながら、一般に酵素阻害物質による阻害作
用は酵素による基質の分解速度よりもはるかには
やいので酵素阻害物質を高分子物質と同時あるい
は多少遅れて添加してもよい。

リガンドと反応させた結合物は高分子物質に接
触させて反応させる。

高分子物質と接融させる結合物は反応物から分
離したものでもよいが、通常は反応物に含まれて
いる状態のままでよい。

この高分子物質は結合物中の酵素が酵素反応し
うるものであり、通常は基質であるが、水に不溶
性のものである。高分子物質の例としてはα−ア
ミラーゼの場合には不溶性デンプン、セルラーゼ
の場合にはセルロース、コラーゲナーゼの場合に
はコラーゲン、マンナーゼの場合にはマンナン、
プロテアーゼの場合には不溶性蛋白質、エラスタ
ーゼの場合にはエラスチン、そしてリパーゼの場
合には各種油脂類を挙げることができる。この高
分子物質はそれ自身が可溶性であつても、不溶性
の担体に結合させるとか、重合させるなどして不
溶化して用いることもできる。

酵素反応条件は用いる酵素に応じて適当になる
ように定めればよい。

酵素反応後は酵素活性を求める。酵素活性は、
この酵素反応による分解物の増加、原料である高
分子物質の減少、その他、酵素反応による系の変
化を追跡すればよい。

（作用） 本発明の方法においては、リガンドが結合物の
抗体部分に結合することによつてその後の酵素反
応に立体障害を生じさせることを利用している。
酵素反応させる高分子物質が不溶性であるために
結合物の酵素部分との接触の大部分が固−液間に
なり、その結果、酵素の高分子化による立体障害
が大きく現われる。本発明者らはこのことを確認
するためにα−アミラーゼの系を用いて検討した
ところ、ペンタオースの場合には酵素の高分子化
による酵素活性の低下がほとんど認められず、一
方、不溶化デンプンの場合には酵素活性が著しく
低下した。

このような系に結合物の抗体とは異なる抗原決
定基を認識する新たな抗体を導入したところに本
発明の特徴がある。すなわち、結合物の抗体部分
に一の抗原決定基部分が結合したリガンドの他の
抗原決定基部分にこの抗体が結合することによつ
て結合物を巨大化してその立体障害をさらに大き
くしている。それによつて、リガンドの測定感度
を大きく高めているのである。

（実施例） 実施例 １ セルラーゼ基質の調製 紙を20cm×20cmの大きさに切断し、あらか
じめ用意しておいたリアクテイブブルー溶液
（５ｇリアクテイブブルー、５ｇNa₂CO₃蒸留
水200ml）中に浸した。60℃に加温し、時々撹
拌しながら、３日間加熱を続けた。この紙を
蒸留水で十分に洗浄し、過剰の染料を除去し
た。続いて、恒温乾燥器で乾燥させ、１cm×５
cmの大きさに切断して、目的の基質を得た。

セルラーゼ−抗ヒトIgGマウスIgG結合物の
調製 セルラーゼ10mgをPH6.0の0.1Mリン酸緩衝液
２mlに溶かし４−（マレイミドメチルシクロヘ
キサン−１−カルボン酸）サクシンイミドエス
テル（CHMS）のジメチルスルホキシド溶液
（２mg／ml）200μを加え、室温で１時間、放
置した。この反応液をセフアデツクスＧ−25を
用いてゲル過し、未反応のCHMSを除去し
た。このCHMS化セルラーゼを１mlまで濃縮
した。

一方、抗ヒトIgGマウスIgG10mlを５ｍＡ
EDTAを含むPH7.5の0.1Mリン酸緩衝液２mlに
とかし９mg／mlのＳ−アセチルメルカプトコハ
ク酸無水物（SAMS）のジオキサン溶液200μ
加えた。それから37℃で一時間放置後、1N
ヒドロキシルアミン水溶液（PH7.5）200μ加
えた。30分後反応液をセフアデツクスＧ−25で
ゲル過し未反応のSAMSを除いた。このHS
−抗ヒトIgGマウスIgG溶液を前述のCHM化セ
ルテーゼ１mlに加え、37℃で２時間放置した。
この反応液をセフアクリルＳ−300でゲル過
し目的のセルラーゼ−抗ヒトIgGマウスIgG結
合物を得た。

ヒトIgGの測定 セルラーゼ−抗ヒトIgGマウスIgG結合物を
含む溶液50μにヒトIgGを含む標準溶液50μ
及び結合物の抗体と別の抗原決定基を認識する
抗ヒトIgGマウスIgG50μ（0.1mg／ml）を加
え、37℃で30分間放置した。これにPH5.0の
0.1M酢酸緩衝液を１mlを加え、次にで調製
したブルーセルロース紙を１枚加えた。１時
間後反応液の吸光度を波長650nｍで測定した。
第１図は標準溶液中のヒトIgG量と吸光度を示
したものである。尚、図中白丸は抗ヒトIgGマ
ウスIgGを加えた場合をそして黒丸は加えなか
つた場合をそれぞれ示している。

実施例 ２ 不溶化ブルーデキストランの作製 ブルーデキストラン2000（フアルマシア社製
品）２ｇを0.6N NaOH水溶液25mlに溶かし、
これにセルロースパウダー１ｇ（フアルマシア
社製品）及びNaBH₄30mgを加えた。撹拌しつ
つジグリシジルエーテル８mlを加え、室温にて
一夜撹拌した。反応後、生じた塊をスパーテル
で破砕し、蒸留水で十分洗浄した。遠心して不
溶化ブルーデキストランを分取した。この不溶
化ブルーデキストラン１ｇを0.1M酢酸緩衝液
50mlに懸濁した。

CHM化デキストラナーゼの作製 デキストラナーゼ１mgをPH7.0の0.1Mリン酸
緩衝液１mlに溶かし、CHMS1mg／mlのDMF
溶液100μを加えて室温で１時間放置して反
応させた。この反応液をBio Gel Ｐ−２のカ
ラムに入れ、PH7.0の0.1Mリン酸緩衝液を流し
てゲル過を行ない、素通り分画を分取した。

抗ヒトα−フエトプロテインヤギIgG Ｆ
（ab′）₂の作製 抗ヒトα−フエトプロテインヤギIgG10mgを
0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）２mlにペプシン300μ
ｇを加え、37℃で18時間撹拌した。0.1N
NaOHを加えてPHを6.0に調節しこの反応液を
予め0.1Mリン酸緩衝１ｍＭ EDTA溶液（PH
6.3）で緩衝化したセフアクリルＳ−300ゲルカ
ラムに入れ、上記のリン酸緩衝液で溶出した。
分子量約10万付近に溶出されたピーク部分を集
めて１mlに濃縮し、目的の抗ヒトα−フエトプ
ロテインヤギIgG Ｆ（ab′）₂を得た。

デキストラナーゼ−抗ヒトα−フエトプロテ
インヤギIgG Fab′結合物の作製 で調製した抗原ヒトα−フエトプロテイン
ヤギIgG Ｆ（ab′）₂3mgを含む0.1Mリン酸緩衝１
ｍＭ EDTA溶液（PH6.0）１mlに10mg／mlの
２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液
100μを加え、37℃で90分間撹拌した。この
反応液を予め0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で緩
衝化したセフアデツクスＧ−25カラムでゲル
過して未反応の２−メルカプトメチルアミンを
除去し、HS−Fab′を得た。これにで調製し
たCHM化デキストラナーゼ１mgを加え、37℃
で90分間反応後４℃で一夜放置した。次にこの
反応液を20ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（PH
7.0）で緩衝化したグリセルCPGカラムでゲル
過して分子量17万以上の分画を集め、これを
濃縮して目的の結合物を得た。

ヒトα−フエトプロテインの測定 濃度０〜１mgのα−フエトプロテイン溶液
（８％PEG含有）50μに、で調製した結合
物溶液50μ及び抗ヒトα−フエトプロテイン
マウスIgG（モノクローナル抗体）50μ（500μ
ｇ／ml）を加えて20分間反応させた。反応液に
不溶化ブルーデキストラン懸濁液1.0mlを加え
て37℃で30分間さらに反応させ、0.5N
NaOH1mlを加えて反応を停止させた。これを
撹拌後、3500rpmで２分間遠心し、得られた上
清の620nｍにおける吸光度を測定した。

得られた吸光度とヒトα−フエトプロテイン
の濃度との関係を示す検量線を第２図に示す。
図中白丸は抗ヒトα−フエトプロテインマウス
IgGを加えた場合を示し、一方、黒丸は加えな
かつた場合を示している。

（発明の効果） 本発明の方法は、検体中のリガンドを特異性高
くかつ極めて高感度で測定できる。この本発明の
方法は先願（特願昭59−27710号、特開昭60−
171461）の方法に比し、感度をさらに１桁ないし
２桁向上させることができる。また、操作が簡単
であり、安価かつ容易にリガンドを定量すること
が可能である。本発明の方法はリガンドの種類を
問わず測定できる。本発明の方法に用いる試薬に
はリガンドを直接使用せず、リガンドは抗体の製
造に用いられるだけであるから微量で足りるとい
う利点も有する。従つて、本発明の方法は測定対
象と同じリガンドが入手しにくい場合とか、高価
な場合に特に有効である。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素にセルラーゼを用い、ヒトIgGの
濃度と吸光度の関係を他の抗原決定基に対する抗
体を加えた場合（白丸）と加えなかつた場合（黒
丸）を比較した結果を示すものであり、第２図は
酵素にデキストラナーゼを用い、ヒトα−フエト
プロテインについて同様に比較した結果を示すも
のである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 検体に含まれる２以上の抗原決定基を具有す
   る物質を測定する方法において、 該抗原決定基具有物質に、この抗原決定基具有
   物質の一の抗原決定基に対する抗体と水に不溶性
   の高分子物質に作用しうる酵素との結合物及び他
   の抗原決定基に対する抗体を接触せしめて反応さ
   せ、 さらに、前記の高分子物質に前記の結合物を接
   触せしめて酵素反応させ、酵素活性を測定するこ
   とを特徴とする 抗原決定基具有物質の測定方法。 ２ 他の抗原決定基に対する抗体が水溶性高分子
   が結合されたものである特許請求の範囲第１項記
   載の測定方法。 ３ 他の抗原決定基に対する抗体にこの抗体に対
   する抗体をさらに接触せしめることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項又は第２項記載の測定方
   法。