JPH02176465A - リガンドの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 血清、尿などの体液に含まれる薬物あるいは、各種疾患
に由来する微量成分の分析は病気の診断あるいは、治療
経過の判定などに非常に有意義であり、日常の臨床検査
に活用されている。本発明はこの微量成分を測定する方
法に関するものである。

〔従来の技術］ 血液等の体液には多種多様の成分が含まれており、その
なかには、分子量の近似した物質、生理活性の似た物質
あるいは構造の近似した物質なども含まれていることも
多い。そこで、この分析法は特異性が高く、かつ微少量
まで定量しうろことが要求される。

血液のこれらの微量成分を検出する方法が種々開発され
ているが、感度、特異性、短時間処理などの点にすぐれ
る酵素免疫測定法が賞月されている。しかしながら、従
来の酵素免疫測定法の場合には、未だ感度が充分とはい
えず正確な濃度を求めることが容易でなかった。

そこで、本発明者らはさらに感度を高める分析方法を開
発するべく検討を行ない、測定対象のリガンドに対する
抗体と酵素に対する抗体との結合物を利用する方法を開
発した。この方法は、この結合物に対して測定対象のリ
ガンドと酵素を競争反応させその後、この酵素の活性を
測定することによって、リガンドを定量する方法（特開
昭５９−１６４９６０号公報）である。その際、このリ
ガンドに対する抗体と反応する抗体あるいは酵素に対す
る抗体と反応する抗体をさらに競争反応させる方法（特
開昭５９−１７８３６０号公報）、あるいはリガンドと
高分子化合物との結合物又は、リガンドの重合物を競争
反応させる方法（特開昭５９−１７８３６１号公報）も
併せて開発した。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らの開発したこれらの方法は感度を高め、かつ
操作を簡便にするものであったが、感度がｌｎｇ／ＩＲ
１程度であった。

［問題点を解決するための手段〕 そこで、さらに高感度でリガンドを測定できる方法を開
発するべく種々検討の結果、分子ふるい効果を有する固
相と高分子基質を組み合わせることにより、さらに高感
度でリガンドを測定できることを見出し、この知見に基
いて本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、検体に含まれるリガンドを測定す
る方法において、該リガンドを、このリガンドの抗原決
定基またはこの抗原決定基に対する抗体を内部にも固定
し、かつ当該内部まで後記する結合物を進入させうる分
子ふるい効果を有するゲル状固相、及び前記リガンドの
抗原決定基に対する抗体または抗原決定基と酵素との結
合物と接触せしめて反応させ、さらに、前記ゲル状固相
を分離し、もしくはしいままで該ゲル状固相の前記内部
まで進入しえない前記酵素の高分子基質を前記反応物に
加えて酵素反応させ、酵素活性を測定することを特徴と
するリガンドの測定方法に関・するものである。

本発明における測定対象は検体に含まれる抗原決定基具
有物質である。検体の種類は限定されないが、例えば血
清、尿などである。血清、尿などの場合には、通常は特
別な前処理を必要とせず、そのまま測定を行なうことが
できる。

リガンドは抗原決定基を一つ以上有しているものであり
、例えば、各種内分泌腺に由来するホルモン類、免疫グ
ロブリン、アルブミン、フェリチン等の血漿蛋白質、Ｈ
Ｂ抗原等のウィルス、バクテリア類、α−フェトプロテ
ィン、癌胎児性抗原等の各種臓器あるいは血中、尿中に
存在する抗原などである。

ゲル状固相に固定される抗体はりガントと反応するもの
でなければならない。この抗体にはＦ（ａｂ’）ｚ。

Ｐａｂ’、　Ｆａｂなとのフラグメントも含まれる。

抗体の製造方法としては、リガンド又はリガンドと蛋白
との結合物を兎、山羊、馬、モルモット、ニワトリなど
の温血動物に体重１ｋｇあたり０．３〜２■を１〜数回
背中皮下、フットバッド、大腿筋等にアジュバントとと
もに注射して当該動物の体内に形成させる。この抗体は
各種の抗原決定基を認識する抗体の混合物であるからこ
れを分離して用いる。分離方法にはアフィニティークロ
マトグラフィーを用いるのがよく、例えば、リガンドを
酵素あるいは化学試薬により分解してゲルが過、イオン
交換クロマトグラフィーなどで分離し、この各抗原フラ
クションを不溶化したアフィニティーカラムを作製し、
このカラムを用いて前記の抗体混合物を分離することが
できる。また、この抗体は市販品も存在する。本発明の
方法においては、抗体は単一抗体に分離しなくともよく
、少なくとも２群に分割すれば足りる。

一方、この抗体はモノクローナル抗体として取得するこ
ともできる。その場合には、マウスに前記のいずれかの
抗原をアジュバントとともに数回腹腔等に注射し、肺臓
細胞を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマ
ウスミエローマ細胞と融合させる。そして、この融合細
胞のなかから当該抗体を産生ずるものをクローニングに
よってモノクローン細胞として増殖させ、マウス腹腔中
で増殖させることによって単一抗体、すなわちモノクロ
ーナル抗体を大量に製造することができる。

ゲル状固相は抗体または抗原を内部まで進入させて固定
化しうるちのであるとともに後記する抗体あるいは抗原
と酵素との結合物を当該内部まで進入させうるちのであ
る。このような固相としては一般に蛋白質を分離するク
ロマトグラフィーに利用される各種のゲルを利用できる
。例として、デキストランゲル、ポリアクリルアミドゲ
ル、シリカゲルなどを挙げることができる。使用するゲ
ルのポアサイズはリガンドのサイズ等に応じて決定すれ
ばよく、例えばりガントの分子量が５万の場合、抗体と
酵素の結合物の分子量がｌＯ万〜２０万程度であればゲ
ルが進入を阻止する酵素の基質の分子量の下限は１００
万〜２００万程度でよい。

抗体または抗原をゲル状固相に固定化する方法としては
、−ａにはＣＮＢｒ活性化する方法あるいはカルボキシ
ル化後活性化エステルとする方法を利用する。あるいは
ジクリシジルエーテル等によりエポキシ化し、このエポ
キシを利用して縮合させることもできる。そのほか、公
知の酵素固定化法のなかから適宜選択して利用すること
ができる。

抗体または抗原はこの固定化の際にゲル状固相の表面に
加えて固相内部にも進入し、その面積の差から抗体また
は抗原の大部分は内部に固定化される。

酵素に結合させる抗原は抗原そのもであっても、あるい
はリガンドであってもよい。あるいは酵素に結合させる
抗体はゲル状固相の抗体が反応する抗原決定基と異なる
抗原決定基に対して反応するものであることが望ましい
。この抗体はＩｇＧ、　ｒｇＭあるいはＩｇＡであり、
Ｆ（ａｂ’）ｚ　、　Ｆａｂなとのフラグメントであっ
てもよく、また、例えばＤＮＰ化、アセチル化、ビオチ
ニル化、ニトロ化などの化学修飾が施されたものであっ
てもよい。この抗体は１種類に限られるものではなく、
２種類以上あってもよい。

この異なる抗原決定基を認識する抗体は前述の細胞融合
法によるモノクローナル抗体を製造する方法により容易
に取得することができる。また、前述の温血動物を利用
して抗体群を産生させ、これを分離してもよい。その場
合には単一抗体まで分離しなくともよ（、例えば２群に
分割してその一方を前述の酵素と結合させ、もう一方を
ゲル状固相に固定化する抗体に利用してもよい。また、
この抗体は完全に分離しなくともよく、測定を阻害しな
い程度に他方の抗体が混入してもよい。

結合物を構成している酵素は高分子基質に作用しうるち
のであるが、そのなかでは活性の測定方法が容易なもの
がよい。このような酵素は、例えばアミラーゼ、デキス
トラナーゼ、セルラーゼ、グルコアミラーゼ、コラ−ゲ
ナーゼ、マンナーゼ、プロテアーゼ、エラスターゼ、リ
パーゼ、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなど
である。

この高分子基質は、酵素の基質そのものは低分子であっ
ても高分子化合物を結合させることによって高分子化し
たものであってもよい。

酵素と抗体あるいは抗原との結合方法は双方の官能基を
考慮して決定すればよい。官能基は、アミノ基、カルボ
キシル基、水酸基、チオール基、イミダゾール基、フェ
ニル基などを利用することができ、例えばアミノ基相互
間を結合させる場合には、ジイソシアネート法、グルタ
ルアルデヒド法、ジフルオロベンゼン法、ベンゾキノン
法等数多く知られている。また、アミノ基とカルボキシ
ル基との間を結合させる方法としては、カルボキシル基
をサクシンイミドエステル化する方法のほかカルボジイ
ミド法、ウッドワード試薬法等が知られており、アミノ
基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸化法（Ｎａｋａｎｅ法
）もある。チオール基を利用する場合には、例えばもう
一方の側のカルボキシル基をサクシンイミドエステル化
してこれにシスティンを反応させてチオール基を導入し
、チオール基反応性二価架橋試薬を用いて双方を結合す
ることができる。フェニル基を利用する方法としてはジ
アゾ化法、アルキル化法などがある。結合方法はこれら
の例示に限られるものではなく、このほか例えばｒＭｅ
ｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」あるいは「酵素免疫測定
法」等の成書に記載されている方法のなかから適宜選択
して利用することができる。結合比は１：ｌに限らず、
目的に応じて任意の比率をとることができることはいう
までもない。反応後は、ゲルが適法、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど
を適宜組み合わせて精製を行い、必要により凍結乾燥法
等で乾燥する。

測定対象のりガントを、前記の抗原決定基に対する抗体
または、抗原を固定化したゲル状固相及び抗原または抗
原決定基に対する抗体と酵素の結合物と水溶液中で接触
させる。その際、溶液の温度は２０〜４５℃程度、そし
てｐＨは通常４〜９程度が適当である。ｐＨを一定に保
つために、必要により、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液など
の緩衝液を用いてもよい。その際、ゲル状固相及び結合
物の適当な量は、その種類、リガンドの種類、あるいは
接触時の条件などによって異なるので予め試験をして定
めるのがよい。リガンドをゲル状固相及び結合物へ接触
させる順序は問うところではな（、いずれが先であって
もまた両方同時であってもよい。

一方、結合物の酵素がアミラーゼなどであってこれと同
種の酵素が検体に含まれている場合には、この検体中の
酵素を阻害する程度が前記の結合物に結合されている酵
素の活性を阻害する程度より大きい酵素阻害物質を接触
させるのがよい。

この酵素阻害物質は検体に含まれている酵素を完全に失
活させかつ結合物に結合されている酵素を全く阻害しな
いものが最も望ましいことはいうまでもないが、実用上
は要は測定時においてブランク値を上昇させなければよ
く、測定後に酵素阻害物質が失活するなどしてこの酵素
活性が回復してもよい。この酵素阻害物質の作用が問題
になるもう一方の、酵素は抗体に結合されている状態の
ものであり、遊離状態では酵素阻害物質によって失活す
るものであってもよい。この酵素阻害物質にはこのよう
な特異性を有する公知の酵素阻害物質を利用すればよい
が、そのほか、検体に含まれている酵素を温血動物に投
与してその抗体を取得し、これを酵素阻害物質として用
いることもできる。抗体の取得方法は前述のリガンドに
対する抗体の取得方法と同様でよい。酵素阻害物質の添
加時期は、検体中の酵素による後述する高分子基質の分
離を実質的に防止できればよく、通常はこの高分子基質
の添加前に添加する。しかしながら、一般に酵素阻害物
質による阻害作用は酵素による基質の分解速度よりもは
るかにはやいので酵素阻害物質を高分子基質と同時ある
いは多少遅れて添加してもよい。

リガンドと反応させた結合物は高分子基質に接触させて
反応させる。

高分子基質と接触させる結合物は反応物から分離したも
のでもよいが、通常は反応物に含まれている状態のまま
でよい。

この高分子基質は結合物の酵素の基質であることはいう
までもないが、それに加えてゲル状固相の内部には進入
しえない程度の大きさが必要である。例えば使用するゲ
ル状固相が分子量１００万〜２００万程度の分子を阻止
するものであれば、高分子基質は分子量２００万以上の
ものを使用する。高分子基質の例としてはα−アミラー
ゼの場合には不溶性あるいは可溶性デンプン、デキスト
ラナーゼの場合にはデキストラン、セルラーゼの場合に
はセルロース、コラ−ゲナーゼの場合にはコラーゲン、
マンナーゼの場合にはマンナン、プロテアーゼの場合に
は蛋白質、エラスターゼの場合にはエラスチン、そして
リパーゼの場合には各種油脂類を挙げることができる。

この高分子基質は可溶性であっても不溶性であってもよ
い。また、基質自体が低分子の場合でも不溶性あるいは
水溶性の高分子化合物を結合させ、あるいは重合させる
ことによって所定の分子量まで高分子化して使用するこ
とができる。例えば、酵素にパーオキシダーゼを用いた
場合に基質であるロイコ色素にデキストラン等を結合さ
せて所定の分子量にして使用することができる。

酵素反応条件は用いる酵素に応じて適当になるように定
めればよい。

酵素反応後は酵素活性を求める。酵素活性は、この酵素
反応による分解物の増加、原料である高分子物資の減少
、その他、酵素反応による系の変化を追跡すればよい。

〔作用〕

本発明の方法においては、ゲル状固相の高分子基質に対
する分子ふるい効果を利用している。すなわち、抗体が
ゲル状固相に固定化されている場合、この固定化された
抗体がこれと反応するリガンドの抗原決定基と反応して
リガンドがこの抗体に結合される。そして、抗体−酵素
結合物の抗体部分がこれと反応するリガンドの抗原決定
基と反応してリガンドと結合物が結合される。その結果
、結合物がリガンドを介してゲル状固相に結合された状
態になる。あるいは、リガンドと酵素に結合したりガン
トのそれぞれの抗原決定基がゲル状固相に固定化された
抗体と競合的に反応し、これと結合する。その結果、リ
ガンド−酵素結合物がリガンドの量に逆比例してゲル状
固相に結合された状態になる。

リガンドがゲル状固相に固定化されている場合、リガン
ドと固定化されたリガンドのそれぞれの抗原決定基がこ
れと反応する抗体−酵素結合物の抗体部分と競合的に反
応し、これと結合する。その結果、抗体−酵素結合物が
リガンドの量に逆比例してゲル状固相に結合された状態
になる。

ゲル状固相に固定化されている抗体あるいはリガンドの
大部分は固相内部にあるところから結合物も固相内部に
結合されることになる。一方、結合物の酵素の基質は高
分子であって固相内に進入できないところから、この基
質は固相外でのみ酵素反応できる。従って、リガンドの
量により固相内に結合される結合物の量が決まる結果と
して基質と反応できる固相外の酵素量が決定されるので
、この酵素反応を測定することによってリガンドの量を
求めることができる。

〔実施例］ 実施例１ ■　抗ヒトα−フェトプロティンマウスＩｇＧＦ（ａｂ
’）ｚ固定化ゲル状固相作製ＣＮＢｒ活性化セファロー
ス４Ｂ（ファルマシア社製）５ｇを１ｍＭ塩酸水溶液５
００　ｒｒｄｌで洗浄し、０．１ＭＮａＨＣＯ３０，５
ＭＮａＣ１’ｌｌ液液ｐＨ８，０）に？容かした抗ヒト
α−フェトプロティンマウスＩｇＧＦ（ａｂ’）ｚ（２
０ｍｇ含有）溶液２０ｒｔｄｌを加えてこの懸濁液を室
温にてエンドオーバーエンドミキサーで一夜撹拌した。

このセフブロース４ＢゲルをＰＢＳ　（ｐＨ７，０）で
十分に洗浄し、０．１Ｍエタノールアミン溶液（ｐＨ８
，０）に懸濁して３７°Ｃで１時間放置した。これをＰ
ＢＳ（ｐＨ７，０）で洗浄し、５０ｄのＰＢＳ（ｐＨ７
，０）懸濁させた。

■　ＣＨＭ化β−アミラーゼの作製 β−アミラーゼ１ｍｇをｐＨ７，０の０．１Ｍリン酸緩
衝液１　ｍｌに溶かし、ＣＩＭＳ　１　ｍｇ　／　ｍｆ
ｌのＤ肝熔液１００μ２を加えて室温で１時間放置して
反応させた。

この反応をＢｉｏ　ＧｅｆＰ−２のカラムに入れ、ｐＨ
７，０の０．１　Ｍリン酸緩衝液を流してゲルが過を行
ない、素通り分画を分取した。

■　抗ヒトα−フェトプロティンヤギＩｇＧＦ　（ａｂ
”）８の作製 抗ヒトα−フェトプロティンヤギＩｇＧ１０■を含む０
．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐｔ（４，０）　２　ｍｌにペプ
シン３００μｇを加え、３７°Ｃで１８時間攪拌した。

０、　Ｉ　ＮＮａＯＨを加えてｐＨを６．０に調節しこ
の反応液を予め０．１Ｍリン酸緩衝１　ｍＭ　ＥＤＴＡ
溶液（ｐＨ６，３）で緩衝化したセファクリルＳ−３０
０ゲルカラムに入れ、上記のリン酸糧固液で溶出した。

分子量約１０万付近に溶出されたピーク部分を集めて１
ｍ１に濃縮し、目的の抗ヒトα−フェトプロティンヤギ
ＩｇＧＦ（ａｂ’）ｘを得た。

■　β−アミラーゼ−抗ヒトα−フェトプロティンヤギ
ＩｇＧＦａｂ’結合物の作製 ■で調製した抗ヒトα−フェトプロティンヤギＩｇＧＦ
（ａｂ’）ｚ　３　ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝１　
ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６，０）　　Ｌ　ｄに１０ｍ
ｇ／ｄの２−メルカブトエチルミアン塩酸塩水溶液１０
０μｌを加え、３７°Ｃで９０分間撹拌した。この反応
液を予め０、１　Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．０）で緩
衝化したセファデックスＧ−２５カラムでゲルが遇して
未反応の２−メルカプトメチルアミンを除去し、ｔｌｓ
−Ｆａｂ“を得た。これに■で調製したＣＨＭ化β−ア
ミラーゼ１　ｍｇを加え、３７°Ｃで９０分間反応後４
°Ｃで一夜放置した。次にこの反応液を２０ｍＭ’Ｊン
酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７，０）で緩衝化したグリセ
ルＣＰＧカラムでゲルが過して分子量１７万以上の分画
を集め、これを′ａ縮して目的の結合物を得た。

■　ヒトα−フェトプロティンの測定 濃度０〜６４０ｎｇ／ｍｌのα−フェトプロテイン溶液
（８％ＰＥＧ含有）５０μ２に、■で調製した抗ヒトα
−フェトプロティンマウスＩｇＧ　　（モノクローナル
抗体）固定化ゲル状固相１００ｕｌ及び■で調製した結
合物溶液５０μ２を加えて２０分間反応させた。次に、
分子量２０００万以上のスターチ５０ｍｇ／戚、β−グ
ルコシダーゼ２Ｕ／ｄ、グルコースオキシダーゼ２　Ｕ
　／　ｍｌ、ＰＯＤ　Ｉ　Ｕ　／　ｍｌ、８ｎ＋Ｍフェ
ノール、２．５ｍＭ４−アミノアンチピリン及び０．１
Ｍリン酸を含むｐｌｌｌ、０の溶液１−を加えて３７°
Ｃで３０分間反応させ、上清の波長５０５ｎｍにおける
吸光度を測定した。こうして得られたα−フェトプロテ
ィン濃度と吸光度との関係を第１図に示す。

実施例２ ■　抗ヒトフェリチンマウスモノクローナルＩｇＧ結合
セファロース４Ｂの作製 ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）
５ｇを１ｍＭＨＣｆｆｉ水溶液で十分に洗浄し、０．Ｉ
ＭＮａＨＣＯｔ　　Ｏ，５ＭＮａＣｌ溶液（ｐＨ８，ｏ
）に溶かした抗ヒトフェリチンマウスモノクローナルＩ
ｇＧ（２０■含有）溶液１５ｍ１を加えてこの懸濁液を
室温にてエンドオーバーエンドミキサーで一夜攪拌した
。

このセファロース４ＢゲルをＰＢＳ（ｐｌ＋７．０　）
で洗浄後０．１　Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８，０）に懸
濁し、３７°Ｃで１時間放置した。これをＰＢＳ（ρ１
１７．０　）で洗浄し、５０ｍ１のＰＢＳ　（ｐＨ７，
０＞に懸濁させた。

■　ＣＩＩＭ化グルコアミラーゼの調製グルコアミラー
ゼ５　ｍｇを１０ｍＭ０−ツェナトロリンを含むｐｌ＋
６．３の０．１Ｍグリセロリン酸緩衝液１ｄに溶かし、
４−（マレイミドメチルクロヘキサン−１−カルボン酸
）サクシンイミドエステル（ＣＨＭＳ）　２　ｒＮ／ｌ
Ｉｒ１のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液１００μ
２を加えて室温で１時間放置して反応させた。この反応
液をセファデックスＧ−２５のカラムに入れ、ｐＨ６，
３の０．１　Ｍリン酸緩衝液を流してゲル濾過を行ない
、素通り分画を分取した。

■　抗ヒトフェリチンマウスモノクローナルＩｇＧＦ（
ａｂ’）ｚの調製 抗ヒトフェリチンマウスモノクローナルＩｇＧ　１０ｍ
ｇを０．１　Ｍ酢酸緩衝３ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ５
，５）２ｍｌにパパイン３００μｇを加え、３７℃で１
８時間撹拌した。０．　Ｉ　ＮＮａＯＨを加えてｐＨを
６．０に調節しこの反応液を予め０．１Ｍリン酸緩衝１
　ｄ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ６，３）で緩衝化したセファ
クリルＳ　−３００ゲルカラムに入れ、上記のリン酸緩
衝液で溶出した。分子量約１０万付近に溶出されたピー
ク部分を集めて１　ｍｌに濃縮し、目的の抗ヒトフェリ
チンマウスモノクローナルＩｇＧＦ（ａｂ’）ｚを得た
。

■　グルコアミラーゼ−抗ヒトフェリチンマウスモノク
ローナルＩｇＧＰａｂ’結合物の調製■で調製した抗ヒ
トフェリチンマウスモノクローナルＩｇＧＦ（ａｂ’）
ｚ　６　ｆｌａｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝１ｍＭ　Ｅ
口ＴＡ溶液（ｐＨ６，０）１ｍに１０ｍｇ／−の２−メ
ルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μ２を加え、
３７°Ｃで９０分間撹拌した。この反応液を予め０．１
　Ｍリン酸緩衝液（ｐ！４７．０）で緩衝化したセファ
デックスＧ−２５カラムでゲル濾過して未反応の２−メ
ルカプトメチルアミンを除去し、ｌ５−Ｆａｂ’　を得
た。これに■で調製したＣＨＭ化グルコアミラーゼ１　
ｍｇを加え、３７°Ｃで９０分間反応させた。次にこの
反応液をＯ，ｌ　Ｍ酢酸緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液
（ｐＨ６，０）で緩衝化したセファクリルＳ−３００カ
ラムでゲル濾過して分子量２０万以上の分画を集め、こ
れを：ａ縮して目的の結合物を得た。

■　グルコアミラーゼ基質の作製 可溶性デンプン５ｇをＩ　ＮＮａＯＨ水溶液５０ｄに溶
かし、これに界面活性剤エマルゲン８１０１ｄを加え、
さらにベンゼン２５２戚及びエピクロルヒドリン２　ｒ
ｔｒｌを加えて攪拌しなから６０°Ｃで６時間反応させ
た。生成した沈澱物をメタノール、続いて水で洗浄し、
水に懸濁して１００°Ｃで１時間加温して基質として用
いた。

■ヒト血清のフェリチンの測定 ヒトフェリチンを含むヒト血清をヤギ血清で希釈して３
ｎ希釈列を調製した。各々１００μ２を小試験管にとり
、これに■で調製された結合物にストレプトミセス・ビ
リトスポラスＮα２９７−八２ＦＥＲＭ　−Ｐ５４０５
の産生するアミラーゼインヒビター１００μｇ　／　ｒ
ｕｌを含む溶液５０μ２と結合物の抗体と認識部位の異
なる抗ヒトフェリチンモノクローナル抗体を結合した■
で作製されたゲル状固相１００μｌを加えて３７°Ｃで
３０分間加温した。

次に、■で作製したデンプン５０ｍｇ／ｓｉ、グルコー
スオキシダーゼ２　Ｕ　／　ｍｌ、パーオキシダーゼｌ
Ｕ／ｉｆ、８ｍＭフェノール、２．５ｍＭ４−アミノア
ンチピリン及び０．１Ｍ酢酸を含むｐｏ６．ｓの溶液１
　ｔｎＱを加えて３７°Ｃで３０分間反応後上清の波長
５０５ｎｍにおける吸光度を測定した。こうして得られ
たフェリチン濃度と吸光度との関係を第２図に示す。

実施例３ ■　抗ヒｌ−１８Ｅマウス１ｇＧ固定化ゲル状固相の作
製 ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂゲル５ｇを１ｍＭｌ１
１水溶液で十分に洗い、０．１　ＭＮａｌｌＣＯｚ−０
，５ＭＮａＣｅ溶液（ｐｔ（８，０）に溶かした抗ヒ目
ｇＥマウスＩｇＧ（２０ｍｇ含有）？８液１５ｚ＋＋１
を加えてこの懸濁液を室温にてエンドオーバーエンドミ
キサーで一夜攪拌した。次に、このセファロース４Ｂゲ
ルをＰＢＳ（ｐＨ７，０）で洗浄し、０．１Ｍエタノー
ルアミン水溶液（ｐＨ８，０）に懸濁して３７°Ｃで１
時間放置した。これをＰＢＳ（ＰＨ７，０）で洗浄し、
ＰＢＳ（ｐＨ７，０＞５０ｄに懸濁させた。

■　抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナルＩｇＧＦａｂ’
−パーオキシダーゼ結合物の作製 β−アミラーゼの代わりにパーオキシダーゼを用い、実
施例１■と同様にしてＣＩＩＭ化パー化生−ダーゼを作
製した。

抗ヒトＩｇＥマウスモノクローナルＩｇＧＦ　（ａｂ“
）２３ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝１　ｍＭＥＤＴＡ
溶液（ｐｌ＋６．０）ｌ　ｍｌに１０ｒｎｇ／ａ１の２
−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液１００μ２を加
え、３７°Ｃで９０分間攪拌した。この反応液を予め０
．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝化したセフ
ァデックスＧ−２５カラムでゲルが過して未反応の２−
メルカプトエチルアミンを除去し、）Ｉｓ　−Ｆａｂ’
を得た。これに先に調製したＣＩＩＭ化パー化生−ダー
ゼ５■を加え３７°Ｃで９０分間反応させた。次に、こ
の反応液を０．１Ｍ酢酸緩衝５ｍＭ塩化カルシウム溶液
（ｐＨ６，０）で緩衝化したセファクリルＳ−３００カ
ラムでゲル濾過して分子量約１０万の分画を集め、これ
を濃縮して目的の結合物を得た。

■　パーオキシダーゼ基質の作製 分子量５００万〜４０００万のデキストラン５ｇを１０
０　ｍｌのピリジンに懸濁し、これに５ｇの無水コハク
酸と２００ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンを加えて
室温で一夜撹拌した。このデキストランをエタノールで
３回、ジメチルホルムアミドで１回洗浄した後、１００
　ｔｙｒｌのジメチルホルムアミドに溶かし、これに５
ｇの１−エチル−３−（３ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩と２．５ｇのＮ−ヒドロキシコハク
酸イミドを加えて室温で１時間放置した。遠心して得ら
れた上清に５０ｍｇ／ｍのルミノールのジメチルホルム
アミド溶液１０ｍ１と０．２　Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８，０）　　１０　ｔｎＲを加え室温で２時間攪
拌した。

過剰のメタノールを加えてデキストランを沈澱させて決
別した。得られた沈澱をジメチルホルムアミドに溶かし
メタノールで沈澱させてか刑する精製操作を繰り返した
後、沈澱を減圧乾燥した。

■　ヒトｒｇＥの測定 ０〜５１００ｎｇ　／　ｍｌのヒトＩｇＥ溶液１ｏａｎ
に■で作製したゲル状固相９０μｉ及び■で作製した結
合物１０μｌを加え、３７°Ｃで３０分間反応させた。

次に、■で作製した基質の５０■／−の水溶液３００μ
ｌを加え攪拌した。この上清に３１１１１１のＨ２０□
水溶液１００μ２を加えて１秒後の発光強度を測定した
。こうして得られたヒｌ−１ｇＨの濃度と発光強度との
関係を第３図に示す。

実施例４ ■　抗テオフィリンマウスＩｇＧＦ　（ａｂ’　）　ｚ
固定化ゲル状固相の作製 セファデックスＧ−２００のゲル５ｇを２■／ｍ１の水
素化ホウ素ナトリウムを含む０．３Ｎ水酸化ナトリウム
水溶液に懸濁した。これに２５１ｄの１．４−ブタンジ
オールジグリシジルエーテルを加えて３７”Ｃで３時間
震盪した後、ゲルをガラスフィルター上で十分量の水で
洗った。このようにして得られたゲルを０．１Ｍ炭酸緩
衝液（ｐＨ９，５）に溶かした抗テオフィリンマウスＩ
ｇＧＦ（ａｂ’）ｚ　（２０■含有）溶液２０−に懸濁
してエンドオーバーエンドミキサーで室温にて一夜攪拌
した。このゲルを　ＰＢＳ（ｐＨ７，０）で十分に洗浄
し、０．１　Ｍエタノールアミン溶液（ｐＨ８，０）に
懸濁して３７°Ｃで１時間放置した。これをＰＢＳ（ｐ
Ｈ７，０）で洗浄し、５０ｄのＰＢＳ　（ｐＨ７，０）
に懸濁させた。

■　テオフィリンアミラーゼの調製 テオフィリン５■とＮ−ヒドロキシサクシンイミド２．
５　ｒａｇを５００ｕｌのジメチルホルムアミドに溶か
し、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）　５■を加え室温
で２時間攪拌した０次に、バチルサブチリス由来α−ア
ミラーゼ２■を０．１　Ｍグリセロリン酸緩衝液（ｐＨ
８，０）ｌｄに溶かし、上記のジメチルホルムアミド溶
液を２５０μ２加えた。室温にて３時間放置後、０．１
　Ｍグリセロリン酸溶液（ｐＨ７，０）で平衡化したセ
ファデックスＧ−２５でゲル濾過し未反応のテオフィリ
ンを除去した。

■チオフォリンの測定 ■で調製した抗テオフィリンマウスＩｇＧゲル１００μ
ｌにテオフィリンを含む溶液（０〜１００７７ｇ／ｄ）
を５０μｌ及び■で調製したテオフィリンアミラーゼ結
合物５０μＩ！、（１μｇ　／　ａｌｌ　）を加え、２
０分間室温に放置した。次に分子量４００万以上の高分
子アミローズを１％、α−ゲルコミダーゼ３Ｕ／ｄ、グ
ルコースオキシダーゼ２Ｕ／ｄ、Ｐｏｏ（パーオキシダ
ーゼ）２Ｕ／ｄ、チアミノアンチピリン３Ｉｌ１Ｍ、フ
ェノール８ＩＩＩＭを含む２０ＩＩＩＭグリセロリン酸
緩衝液を８００μｌ加え３７°Ｃで３０分間反応させ上
清の発色を５０５１１Ｉ１１における吸光度で測定した
。

表は濃度と吸光度を示している。

濃度　　　　　　　　吸光度 １１００ｕ／ｄ　　　　　　Ｏ，８６０５０μｇ／ｄ　
　　　　　０．８０ ２５　ｕ　ｇ／ｍｉ　　　　　　Ｏ，７０６，２５μｇ
／Ｉｎ１０．５５ １．５　　ｕｇ／１ｕｆｔ　　　　　　０．４５〔発明
の効果〕 本発明の方法は各種リガンドを高感度で測定できる。し
かも、反応後の分離、洗浄操作などが不要であるところ
から操作が極めて簡単である。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図にいずれも各種リガンドの濃度と吸光度
または発光強度の関係を本発明の方法で測定して得られ
た結果を示すものである。 特許出願人　富士レビオ株式会社 第１図 α−フェトプロティン 第 図 フェリチン ｒＪ　／ｍｉ 第 図 ヒ ト ｇＥ ｎｉｌ／ｍｌ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 検体に含まれるリガンドを測定する方法において、該リ
   ガンドを、このリガンドの抗原決定基またはこの抗原決
   定基に対する抗体を内部にも固定し、かつ当該内部まで
   後記する結合物を進入させうる分子ふるい効果を有する
   ゲル状固相、及び前記リガンドの抗原決定基に対する抗
   体または、抗原決定基と酵素との結合物と接触せしめて
   反応させ、さらに、前記ゲル状固相を分離し、もしくは
   しないままで該ゲル状固相の前記内部まで進入しえない
   前記酵素の高分子基質を前記反応物に加えて酵素反応さ
   せ、酵素活性を測定することを特徴とする、リガンドの
   測定方法