JPH0341073A - 色原性ジベンゾキサゼピノン及びジベンゾチアゼピノン酵素基質 - Google Patents

色原性ジベンゾキサゼピノン及びジベンゾチアゼピノン酵素基質

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JPH0341073A
JPH0341073A JP2150072A JP15007290A JPH0341073A JP H0341073 A JPH0341073 A JP H0341073A JP 2150072 A JP2150072 A JP 2150072A JP 15007290 A JP15007290 A JP 15007290A JP H0341073 A JPH0341073 A JP H0341073A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は１分析試験システムにおける光学的指示薬化合
物として有用な色原性化合物に関する。特に、本発明は
、新規色原性酵素基質化合物、及び液体試験試料中の酵
素の検出・測定のための分析試験システムにおけるそれ
らの用途に関する。
酵素の測定は、生化学的研究、環境及び産業試験、並び
に医学的診断のような種々の分野において重要である。
血清及び血漿のような体液中の酵素レベルの定量は、疾
病状態の診断及びそれらの治療に際して医者に非常に有
用な情報を提供する。生体液中で重要な分析対象物であ
ることに加えて、酵素は、イムノアッセイ及び核酸パイ
プリダイゼーション法のような種々の分析システムにお
ける検出・測定試薬としても有用である。このような系
においては、発生する抗原−抗体結合、又は核酸パイプ
リダイゼーションの程度を監視するための標識として直
接又は間接的に有用である。
したがって、種々の分析試験システムにおいて酵素分析
対象物を検出し、診断の手段として酵素標識を用いたい
という要求が、このような酵素の活性の検出及び測定に
用いる光学的指示薬化合物の開発のもととなった。一般
に、このような公知の光学的指示薬化合物は螢光原体又
は色原体のような検出可能な化学基を包含するが、これ
らは関与する酵素に特異的な酵素により開裂しうる基質
基（以下、酵素開裂性基質基という）により誘導されて
いる。このような光学的指示薬化合物は、開裂された元
の形の螢光原体又は色原体により提示される光学的信号
とは異なる光学的信号を示す、原則的には、酵素は、指
示薬化合物を開裂して螢光原体又は色原体を明瞭に螢光
性又は着色した生成物の形態で遊離させて、存在する酵
素の量に比例し、引いては、液体試験試料中に存在する
分析対象物の量に相関し得る螢光又は色の変化を提示す
る。
特に、加水分解酵素、即ちエステル、グリコシド結合、
ペプチド結合、その他の炭素−窒素結合、及び酸無水物
の加水分解反応を触媒する酵素の検出及び／又は測定［
Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ、　Ｉｎｃ、、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　ＮＹ、
　１９７０）　ｐ、　１４８参照】は、例えば膵臓機能
障害の診断におけるアミラーゼ及びリパーゼの測定［Ｋ
ａｐｌａｎとＰｅ５ｃｅ、　Ｃｈｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ−Ｔｈｅｏｒｙ、　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ａ
ｎｄ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　（Ｃ，Ｖ、　Ｍｏ５ｂ
ｙＣｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｍｏ、　１９８４
）　Ｃｈａｐｔｅｒ　５６参照］、腎臓病の指示薬とし
てのＮ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）の測定
［Ｐｒ１ｃｅ、　Ｃｕｒｒ。
Ｐｒｏｂｌ、　Ｃ１１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　９．１
５０　（１９７９）参照］、並びに白血球の指示薬とし
てのエステラーゼの検出［５ｋｊｏｌｄ、　Ｃｌ１ｎ、
　Ｃｈｅｗ、　３１．９９３　（１９８５）参照］とい
ったような種々の疾病の診断及びモニタリングにおいて
重要である。疾病モニタリングにおいて有用であるのに
加えて、加水分解酵素は、近年、診断並びにバイオテク
ノロジー領域においても重要となってきた０例えば、ア
ルカリ性ホスファターゼ、及び、好ましくはβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼは、酵素イムノアッセイ用の指示薬酵素
としての用途が増大していることが判明している［Ａｎ
ｎａｌｓ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　１Ｇ、　２２１−４０（１９７９）参照］。
従って、分析試験システムにおける指示薬酵素標識とし
てのグリコシダーゼ、特にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの
使用により、フェニル−β−〇−ガラクトシダーゼ、０
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、及びｐ−ニ
トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドのような基質グリ
コシドの開発がもたらされた［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｚ、
、　Ｖｏｌ、　３３３．　ｐ。
２０９　（１９６０１参照］が、これらの物質は、β−
Ｄ−ガラクトシターゼによって加水分解されて、それぞ
れ、測光法では紫外線領域において測定されるフェノー
ル、又は短波長可視領域において測定されるニトロフェ
ノールに遊離する。欧州特許公告第１５６．３４７号及
び米国特許第４．８１０．６３６号は、それぞれレソル
フィン及びアクリジノン誘導体のグリコシドを開示する
が、これらの物質は関与する特定のグリコシダーゼに特
異的であって且つそれにより開裂された検出可能な色原
体を遊離する。米国特許第３．９５０．３２２号は、ノ
イラミニダーゼの検出のための、４−メチル−ウンベリ
フェロン、フルオレセイン、メチルフルオレセイン、レ
ソルフィン、又はウンベリフェロンのような螢光助剤に
より誘導されるＮ−アシル−ノイラミン酸を開示するが
、この場合、色原性基質グリコシドは、酵素によって同
様の作用を受け、螢光原体を遊離する。
β−Ｄ−ガラクトシドの使用は、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉ
ｅ。
Ｖｏｌ、　３５．　ｐ、　１９９及びＶｏｌ、　３７．
　ｐ、　８９　（１９７３１１：記載されているナフチ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド、並びにＪ、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、　１９５．　ｐ、　２３９（１
９５２１に記載されているその６−ブロモ−α−ナフチ
ル誘導体のような組織化学的研究とともに記載されてい
る。このような試験系に従って、ガラクトシドと酵素の
相互作用時にｉ離されるナフトールは、種々のジアゾニ
ウム塩と反応して、後に可視化され得るそれぞれのアゾ
染料を産生ずる。
このような公知の光学的指示薬化合物は、分析試験系に
おける酵素分析対象物及び標識の検出に有用であるけれ
ども、にもかかわらず、低吸光係数、水溶性不良、生体
液中に通常存在する種々の色素及びその他の成分による
妨害最大吸光度、並びに複雑な装置を用いずに測定する
のが難しい光学的指示薬化合物と遊離色原体又は螢光原
体との間の色の変異といったような測定感度及び精度に
影響を及ぼす多数の問題が存在する。
したがって、本発明の目的は、液体試験試料中の酵素の
正確且つ高感度の測定のために、分析試験系における光
学的指示薬化合物として用い得る色原性酵素基質化合物
を提供することである。
さらに、本発明の目的は、そこに混合される、又はそれ
に適用される液体試験試料中の酵素の測定のために、光
学的指示薬化合物として分析試験具の固形、多孔質マト
リックス中に混合し得る色原性酵素基質化合物を提供す
ることである。
発明の要約 本発明は、次式： （式中、Ｙは分析的に関係のある特異的対応酵素に特異
性を授けるために選択される酵素開裂基を表わし；Ｗは
酸素又は硫黄であり；並びにＲ及びＲ′は、同一であっ
ても異なってもよく、水素、アルキル又はアリールであ
る）の新規色原性酵素基質化合物を提供する。酵素開裂
基Ｙは、広範な種類の酵素のいずれかに特異性を授ける
ために選択され得る酵素特異性部分を包含する化合物Ｙ
−ＯＨの基であって、酵素特異性部分の例としては、糖
及びその誘導体、脂肪族及び芳香族カルボン酸を含むア
シル基、アミノ酸及びペプチド、並びに燐酸及び硫酸の
ような無機塩が挙げられるが、必ずしもこれらに限定さ
れない。
本発明は、適切な酵素的に開裂可能な基Ｙによって誘導
される中間物質としてジベンズアゼピノン及びジベンゾ
チアゼピノン色原体を使用することから、その主要利益
を得る。特に、酵素的に開裂可能な基Ｙが、好ましくは
約ｐＨ７，０＝ｐＨ１０，０の塩基性溶液中でその特異
的酵素により開裂される場合、本発明の色原性酵素基質
化合物の最大吸光度より実質的に大きい最大吸光度を有
する脱プロトン化形態の色原体が遊離し、それによりそ
の間の吸光度の明白な変化が示される。吸光度の明白の
変化は、容易に観察可能且つ検出可能な光学的信号を提
示するが、これは液体試験試料中に存在する酵素の量を
正確に測定し得るし、またそれと相関し得る。
好ましい具体例の説明 本発明の色原性酵素基質化合物は、−数式：［式中、Ｗ
は酵素であり、色原体は異性体８−ヒドロキシ−１１８
−ジベンズ［ｂ、ｅｌ　　［１゜４］−才キサゼビン−
２−オンと２−ヒドロキシ−１ＩＨ−ジベンズ［ｂ、ｅ
ｌ　　［１，４］−オキサゼピン−８−オン（このよう
な〇−類縁色原体及びその誘導体は、本明細書ではジペ
ンゾキサゼビノン類と呼ぶ）の混合物である。Ｗが硫黄
である場合は、色原体は異性体８−ヒドロキシ−１１Ｈ
−ジベンゾ［ｂ、ｅｌ　　［１，４］チアゼピン−２−
オンと２−ヒドロキシ−１１Ｈ−ジベンゾ［ｂ、ｅｌ　
　［１，４］チアゼピン−８−オン（このようなＳ−類
縁色原体及びその誘導体は、本明細書ではジベンゾチア
ゼピノン類と呼ぶ）の混合物である］を有する色原体か
ら得られる。ＲがＨであり、Ｒ′がメチルである場合の
ジベンズアゼピノンは文献に記載されている［Ｒ。
Ｈｉｌｌ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｅｎｅｒｇ
ｅｔｉｃｓ、　ｖｏｌ、　４゜ｐ、２２９　（１９７３
１，及びＲ，Ｈｉｌｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＮｅｗＰｈ
ｙｔｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、　７？、　ｐ、　１　（１
９７６１］　、この色原体の可視吸収スペクトルは、Ｔ
、　Ｇｒａａｎ、　ｅｔ　ａｌ、。
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　
ｖｏｌ、　１４４．　ｐ、　１９３（１９８５１に記載
されているが、この場合、このような色原体のプロトン
化形態と脱プロトン化形態との間の吸収（λｍａｘ）に
おける１２２ｎ＋ｗの移動が報告された。このような脱
プロトン化は、通常約ｐＨ５，７５〜ｐＨ６，７５の弱
酸性溶液中で、分子全体の陰イオンの陰電荷の非局在化
により色原体のフェノール性ヒドロキシル基で起こる０
本酵素基質化合物（１）の場合、Ｙ残基の酵素開裂、並
びにその後の脱プロトン化により色原体積：（式中、Ｗ
、Ｒ及びＲ′は上記と同様である）が生じる。
本発明によれば、色原体のフェノール性ヒドロキシル基
を酵素特異性部分である化合物ＹＯＨの基から成る酵素
的開裂可能基を用いて誘導する場合、その結果生じろ化
合物は異性体−数式： ［式中、Ｙは酵素開裂基を表わし、Ｗ、Ｒ及びＲ′は上
記と同様である（以後、（１）〜（４）式のいずれかで
表わされる２つの異性体構造の一つのみの使用による本
発明の化合物の言及は、さらにその他の異性体構造の言
及を含むものと理解されたい）］の新規異性体色原性酵
素基質化合物である。異性体形態の本基質化合物は、混
合物として用い得るし、もしくはクロマトグラフィのよ
うな常用手段によって分離し得る。ＷがＯであるジベン
ゾキサゼビノン類が特に好ましい。さらに、Ｒ及びＲ′
はその置換形態を含むＨ１低級アルキル及びフェニルか
ら選択されるのが好ましい。Ｒ及びＲ′の一方がＨ又は
フェニルである場合、一般的には、それぞれ他方は、Ｈ
又はフェニルでないのが好ましい。特に、Ｒ及びＲ′が
同一であっても異なっていてもよく、Ｈ又は低級アルキ
ルである、特にＲ及びＲ′の一方がＨで他方が低級アル
キル、例えばメチルであるか、あるいはＲ及びＲ′の両
方がメチルであるジベンゾキサゼビノン類（Ｗ＝Ｏ）が
好ましい。
本発明は、色原性酵素基質における指示薬基としての色
原体のジベンゾキサゼビノン及びジベンゾチアゼピノン
類の一次用途を記載し、したがって広範囲の置換ジベン
ゾキサゼビノン及びジベンゾチアゼピノン誘導体を包含
する、と理解すべきである。（４）式における芳香族Ｅ
ＭＡ及びＢが本発明の範囲を逸脱しない種々の置換基を
有し得ることは明らかである。丁亥でさらに詳細に考察
するように、このような置換基は、本発明の色原性酵素
基質特性を有する安定化合物を調製するための当業界の
通常技術者の能力によってのみ限定され、その例として
は、非置換及び置換アルキル、非置換及び置換アリール
、アルコキシ、アリールオキシ、ハロ（例えばフルオロ
、クロロ、ブロモ）、ニトロ、並びにジアルキルアミノ
のような置換アミノのような基が挙げられる。
本発明明細書においては、「アルキルＪは、数式−ＣＩ
Ｉ　Ｈｘｎ＋＋の、好ましくはｎが６又はそれ以下の、
メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ〜ブ
チル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル等
のような「低級アルキル」脂肪族型の、直鎖又は分枝鎖
形態の非置換炭化水素残基、並びにその置換形態を含む
よう意図されている。
さらに、本発明明細書においては、「アリール」は、水
素原子の除去により芳香族炭化水素環又は理系から得ら
れる有機残基を含み、さらにまた、フェニル及びナフチ
ルのような非置換炭化水素環残基、並びにその置換形態
を包むよう意図されている１本発明の目的のために、ア
リール残基は、本発明の色原性酵素基質化合物を提供す
るために当業者により選択される１つ又はそれ以上の同
−又は異なる官能基もしくは置換基を有するものを含む
。
さらに、「アリール」及び「アルキル」が置換される場
合、このような置換は、本化合物の有用な特性を実質的
に減じない官能基でモノ−又はポリ置換される場合にこ
のような基又は置換基を含むよう意図されている。その
ような官能基は、合成的に導入することができ、本発明
の有用な色原体酵素基質指示薬化合物をもたらす化学基
を含む、このような官能基の例としては、ハロ（例えば
フルオロ、クロロ、ブロモ）、ジアルキルアミノのよう
な置換アミノ、ニトロ、アルコキシ、アリールオキシ、
アルキル、及びアリールが挙げられるが、これに限定さ
れない。
特に、Ｒ及び／又はＲ′がアルキル、好ましくは低級ア
ルキルである場合、このようなアルキル基の例としては
、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−
ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ヘキシル
、並びにベンジル、ジアルキルアミノメチル、特にジメ
チルアミノメチル、又はハロメチル、特にブロモメチル
等を含むが必然的にこれに限定されないその置換形態が
挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｒ及
び／又はＲ′がアリールである場合、このようなアリー
ル基としては、ナフチル、フェニル、ｐ−クロロフェニ
ル、２．４−ジメトキシフェニル等が挙げられるが、こ
れらに限定されるものではない。
色原性酵素基質化合物（１）は、周囲液体環境のｐＨに
かかわらず、基本的にプロトン化形態の色原体と同じ色
特性を有するが、ここで、誘導化色原性酵素基質化合物
（１）を約ｐＨ６，５〜Ｉ）ＨＩＯの溶液から成る周囲
環境中で適当な酵素と接触させる場合、酵素的開裂可能
基Ｙは、酵素によって開裂されて、色原性酵素基質化合
物の最大吸収より実質的に大きい最大吸収を有する解離
又は脱プロトン形態の色原体（３）を遊離して、その間
の最大吸収に明確な変化を来たす、したがって、本発明
の色原性酵素基質化合物は、そこに用いられる酵素標識
検定試薬の検出を要する分析試験系において特に有用で
ある。基質化合物と脱プロトン形態の色原体との間に生
じた最大吸収の明確且つ測定可能な変化は、液体試験試
料中に存在する分析対象物の量を正確に検出し、測定し
て、相関させ得る。
酵素的開裂可能基 本発明によれば、酵素開裂基Ｙは、分析化学、特に臨床
化学において遭遇する広範な種類の酵素、特に加水分解
酵素に特異性を授与する新規色原性酵素基質化合物を提
供するための酵素特異性部分を包含する化合物Ｙ−ＯＨ
の基である。化合物Ｙ−ＯＨとしては、糖及びその誘導
体、アミノ酸及びペプチドを含む脂肪族及び芳香族カル
ボン酸を含有するアシル基、燐酸及び硫酸基のような無
機酸が挙げられるが、必然的にこれらに限定されない。
酵素的開裂可能基Ｙの選択は、もちろん、関連する特定
の酵素に依ることは当業者には明らかである０例えば、
関連する酵素がグリコシダーゼである場合、グリコシド
が調製されるが、その酵素的開裂可能基Ｙは特定のグリ
コシダーゼに対する天然基質に対応するグリコシド基で
ある。好適なグリコシド基としては、単糖類及び少糖類
基が挙げられる（ただし、これらに限定されない）が、
これらは特定のグリコシダーゼ酵素に特異的なグリコシ
ド基質中に導入することができるし、β−Ｄ−ガラクト
ピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−グ
ルコビラノース、α−Ｄ−グルコビラノース、及びα−
Ｄ−マンノピラノース並びにＮ−アセチルグルコサミン
及びＮ−アセチルノイラミン酸のようなアミン糖の基の
ような基であって、上記酵素によって開裂される。その
他の好適なグリコシド基としては、α−１−４グリコシ
ド結合によって結合する約２〜２０、好ましくは２〜７
単糖類単位の少糖類銀が挙げられるが、これは糖類鎖分
解酵素により単糖類又は少糖類に分解され、少糖類は次
に、例えばマルトペントース、マルトヘキソース、及び
マルトヘプトースに、対応するグリコシダーゼにより開
裂できる。
グリコシド基が以前記載されたと同様、少糖類銀である
いくつかの場合、このような鎖は、二次基質化合物を産
生ずるために測定中の酵素により短鎖少糖類又は単糖類
に先ず変性又は分解されるが、この場合、酵素的開裂可
能基を二次酵素により基質化合物の核から開裂し、次い
で、二次基質化合物を二次酵素と接触させて以前に記載
されたと同様、吸収における測定可能な変化を生じさせ
る１例えば、測定中の酵素がα−アミラーゼである場合
、少糖類銀は開裂されて、二次グリコシド基質化合物、
例えばα−グルコシド又はβ−グルコシドを生成するが
、この場合、その結果生じるそのグリコシド基は、二次
グリコシダーゼ酵素、例えばそれぞれα−グルコシダー
ゼ又はβ−グルコシダーゼにより基質化合物の核から開
裂可能である。
非特異的エステラーゼ酵素の場合、酵素的開裂可能基Ｙ
は、次式： （式中、Ｚは低級アルキル又はアリールであり、このよ
うな化合物はコリンエステラーゼ、アシラーゼ、リパー
ゼ等のような非特異的エステラーゼ酵素の検出のために
使用し得る）の色原性エステルを提供するためのアシル
基のラジカルである。
本発明の色原性酵素基質化合物は、白血球中に一般に見
出される蛋白質分解酵素の検出のために用いることもで
きる。このような化合物は１例えば約２〜５アミノ酸単
位から成るＮ−保護アミノ酸又は短鎖ペプチドである化
合物Ｙ　−ＯＨの基である０例えばＹは、次式： で表されるＮ−保護アミノ酸Ｎ−トシル−Ｌ−アラニン
の基であり得る０本発明は、下女でさらに詳細に記述さ
れるように、その他のカルボン酸残基、アミノ酸残基、
及びＮ−保護基も同等のものとして意図する。
同様に、液体試験試料からアルカリ性ホフファターゼを
検出するためには、酵素的に開裂可能な基Ｙは化合物Ｙ
−ＯＨの基であって、この場合Ｙ−ＯＨは次式： の燐酸基である。
色原性酵素基質化合物の調製 本発明の色原性酵素基質化合物（１）は、当業界で公知
の縮合反応条件下で、化合物Ｙ−ＯＨ（Ｙは選択された
酵素的開裂基である）を、下女でさらに詳細に記述する
ように、適切に誘導されたジベンゾキサゼビノン又はジ
ベンゾチアゼピノン色原体と反応させることにより調製
できる。一般に、適切なジベンゾキサゼビノン又はジベ
ンゾチアゼピノン色原体は、適当な条件下で、化合物Ｙ
−ＯＨ１好ましくは炭水化物（糖）、又は炭水化物誘導
体、あるいは前記と同様の酸の反応性誘導体と結合せし
めて、所望の立体異性を有する色原性酵素基質を生ずる
。
上述したように、本発明は、（４）式に示す核の芳香族
３ｍ！Ａ及びＢで置換可能な種々の置換基を意図する。
置換同等物は、当業界で公知の方法によって調製され得
る適当に誘導されるジベンゾキサゼビノン類又はジベン
ゾチアゼピノン類を用いて調製する。
ジベンゾキサゼビノン類の調製（第１図）には、反応し
て［反応（ａ）］置換フェノール（９）を生じる、３−
ヒドロキシアセトフェノン、３−ヒドロキシベンゾフェ
ノン、又は３−ヒドロキシベンズアルデヒド（８）、及
び適当なグリニヤール試薬を出発原料として用いる。そ
れに代わる方法として、適当な還元剤を用いて、３−ヒ
トロキシアセトフエノン、３−ヒドロキシベンゾフェノ
ン、又は３−ヒドロキシベンズアルデヒド（８）を還元
してもよい［反応（ａ′）］。このフェノール（９）を
、次に、置換ベンゾキノン−Ｎ−クロロイミンと反応さ
せて［反応（ｂ）］、官能化インドフェノール（１２）
を生成する６次に、このインドフェノール（１２）を塩
基中で環化させて、所望の基質化合物（１３及び１４）
を生成する。
特に、このフェノール（９）は、Ｈｉｌｌ等（上記）に
よって記載された方法に従って（この場合、Ｒ及びａ′
はともにメチル又はフェニルであり、Ａ、Ｂ、及びＣは
水素である）、対応する３−ヒドロキシアセトフェノン
又は３−ヒドロキシベンゾフェノン（８）から調製する
が、これらはそれぞれ、臭化メチルマグネシウムグリニ
ヤール試薬又はヨウ化フェニルマグネシウムグリニヤー
ル試薬と反応するＣ反応（ａ）］。グリニャール試薬は
当業界で記載済の広範な種類のこのような試薬から選択
することができるが、その例としては、アルキル及びア
リールグリニヤール試薬（Ｘは臭素又はヨウ素を表わす
）、並びに−Ｏ−アルキル（アルコキシ）、−Ｏ−アリ
ール（アリールオキシ）、−アルキル及び−アリールの
ような官能基置換基を有するものが挙げられるが、これ
らに限定されるちのではない、同様に、種々の置換３−
ヒドロキシアセトフェノン（８）（Ｒがアルキル又は置
換アルキルであり得る）、及び３−ヒドロキシベンゾフ
ェノン（８）（Ｒはアリール又は置換アリールであり得
る）の合成が記載されており、それらの例としては一般
式（８）（式中、Ｒ，Ａ、Ｂ及びＣは当業界で公知の広
範な置換基から選択される）の化合物が挙げられる９例
えば、Ｒはメチルであり、Ａ及びＣは水素であり、Ｂは
ブロモ、クロロ、ヨード、メチル又はシクロヘキシルで
あり得る［Ｊ、　ｌｅｄ、　ＣｈｅＩＩ＋、、　Ｖｏｌ
、　２３゜ｐ、　７３８　（１９８０１］　；あるいは
Ｒ及びＣはメチルであり、Ａ及びＢはそれぞれニトロ及
び水素、又は水素及びニトロであるか、６しくはＡ及び
Ｂが水素であり得る［Ｃｈｅｍ、　Ｂｅｒ、、　Ｖｏｌ
、　９２．　ｐ、　２１７２（１９５９１］　、あるい
はＲはメチルであり、Ａ及びＣは水素であり、Ｂはメト
キシであるか［Ｃｈｅｍ。
Ｈｅｒ、、　Ｖｏｌ、　５５Ｂ、　ｐ、　１８９２　（
１９２２）］　、もしくはシクロヘキシルエーテルであ
り得る［Ｊ、　Ｃｈｅｍ。
Ｓａｃ、、　ｐ、　３４３０　（１９５１１１：あるい
はＲ及びＡはメチルであり、Ｂは水素であり、Ｃはニト
ロであり得る［Ｊ、　Ｏｒｇ、　ＣｈｅＩＩｌ、　Ｖｏ
ｌ、　１４．　ｐ、　３９７（１９４９１］　　：ある
いはＲはメチルであり、Ａ及びＢはメトキシであり、Ｃ
は水素であり得る［Ｊ。
Ｐｒａｋｔ、　Ｃｈｅｔ、　Ｖｏｌ、　１０３．　ｐ、
　３２９　ｆ１９２２）］　；あるいはＲはメチルであ
り、Ａ及びＣは水素であり、Ｂはｐ−ヒドロキシフェノ
ールであり得る［Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、
　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ。
２９２、　ｐ、　５８　（１９５３）］　　：あるいは
Ａ、Ｂ及びＣは水素であり、Ｒはジメチルアミノメチル
である［Ｍｏｎａｔｓｈ、、　ＶｏＪ、、　８０．　ｐ
、　５１７　（１９４９）］か、もしくはベンジル又は
フェニルエチルである［Ｍｅｄｄ、　Ｎｏｒｓｋ、　Ｆ
ａｒｍ、　５ｅｌｓｋａｐ、、　Ｖｏｌ、　２４．　ｐ
。
４５　（１９６２）］か、もしくは］ｐ−クロロフェニ
である［Ｊ、　（：ｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　ｐ、　５　
（１９４６）］か、もしくは］２．４−ジメトキシフェ
ニである［Ｂｕｌｌ。
Ｓｏｃ、　Ｃｈｉｍ、　Ｆｒａｎｃｅ、　ｐ、　１６８
２　（１９５９）］　；あるいはＲはブロモメチルであ
り、Ａ、Ｂ又はＣがニトロである場合は、それぞれ、Ｂ
及びＣ，Ａ及びＣ５又はＡ及びＢが水素であり得る［Ａ
ｃｔａ　Ｕｎｉｖ。
Ｓｚｅｇｅｄ、、　Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓ、　Ｃｈｅｍ、
、　Ｖｏｌ、　９．　ｐ、　４８（１９６３）］　　；
あるいは、Ｒはフェニルであり、Ａ及びＣは水素であり
、Ｂはメチルであるか［Ｈｅ１ｖ。
Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、、　Ｖｏｌ、　２９．　ｐ、　
１４１３　（１９４６）］　、もしくはＡ及びＢはメト
キシであり、Ｃは水素であり得る［Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃ
ｈｅｗ、、　Ｖｏｌ、　２４．　ｐ、　９５２（１９５
９）１゜ Ｒ及びＲ′のいずれか又は両方がＨである場合のフェノ
ール（９）は１種々の還元剤を用いてカルボニル基をヒ
ドロキシル基に還元することにより［反応（ａ′）］、
対応する３−ヒドロキシベンズアルデヒド、３−ヒドロ
キシアセトフェノン、又は３−ヒドロキシベンゾフェノ
ン（８）から調製する。このような還元剤は当業界で公
知であって（Ｈｏｕｓｅ、　Ｍｏｄｅｒｎ　５ｙｎｔｈ
ｅｔｉｃ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ。
２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｗ、Ａ、　Ｂｅｎｊａｍｉ
ｎ、　Ｉｎｃ、、　Ｍｅｎｌ。
Ｐａｒｋ、　ＣＡ、　１９７２．　ｐｐ、　１−２２７
参照）、その例としては、水素化リチウム、水素化リチ
ウムアルミニウム、ホウ化水素ナトリウム、及び接触水
素添加が挙げられる。
所望のインドフェノール（１２）は、Ｈｉｌｌ等（上記
）によって記載されているように（この場合、Ａ−Ｇは
全て水素であり得る）、またＧｉｂｂｓ等によってより
一般的に記載されているように［Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ
　Ｎｏ、　６９　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａ
ｌｔｈＲｅｐｏｒｔｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ
、Ｃ，ｆ１９２８）　］　　（この場合、−殻構造（ｌ
Ｏ）における置換基り、Ｅ、Ｆ及びＧは全て水素である
か、もしくはＤはメチルであり、Ｅ、Ｆ及びＧは水素で
あるか、もしくはり、Ｅ及びＧは水素でありＦはメチル
であるか、ちしくはＤ及びＥは塩素又は臭素であり、Ｆ
及びＧは水素であり得る）、反応（ａ）又は（ａ′）か
ら生じる適当に置換されたフェノール（９）を、適当に
置換されたベンゾキノン−Ｎ−クロロイミン（１０）と
アルカリ水溶液中で反応させる［反応（ｂ）］ことによ
り調製する。インドフェノール（１２）製造のためのも
う一つの合成経路は、　Ｃｏｒｂｅｔｔ　ＩＪ、　Ｃｈ
ｅＩＩｌ、　Ｓａｃ、　ｆＢ）、　ｐ、　１５０２（１
９７０）　］が記載しているが、この場合、アルカリ水
溶液存在下で、適当に置換されたフェノール（９）を適
当に置換されたｐ−アミノフェノール（１１）と反応さ
せる［反応（Ｃ）］。］ｐ−アミノフェニル１１）の置
換基り、Ｅ、Ｆ及びＧが記載されているが、この場合、
それぞれ、Ｄ、　Ｅ及びＧは水素で、Ｆはメチル又は塩
素であり得るか、らしくはり、Ｆ及びＧは水素で、Ｅは
メチルであり得るか、もしくはＤ及びＧはメチルで、Ｅ
及びＦは水素であり得るか、もしくはＤ及びＥはメチル
又は塩素で、Ｆ及びＧは水素であり得るか、もしくはＤ
は塩素で、Ｅ、Ｆ及びＧは水素であり得る。
反応（ｂ）又は（Ｃ）から生じるインドフェノール（１
２）は１次に、Ｈｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　ＮｅｗＰｈ
ｙｔｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、７７、　ｐａｇｅ　１　（１
９７６１に従って、基質化合物（１３）及び（１４）を
調製するために用いるが［反応（ｄ）］、この場合、イ
ンドフェノール（１２）は、水性塩基中、好ましくはホ
ウ酸ナトリウム（ｂｏｒａｘｌ中で、周囲温度で数日間
かけて環化する（工程２）、申し分ない収量の基質化合
物（１３）及び（工４）を得るために、反応（ｄ）の工
程１〜３から生じる種々の中間物質を単離する必要はな
い。
ジベンゾチアゼピノンの調製（第２図）には、前記置換
３−ヒドロキシメチルフェノール（９）から得られる置
換３−メルカプトメチルフェノールを出発原料として用
いて、置換３−ブロモメチルフェノールを生じるための
臭素化［反応（ａ）］と、その後のチオ尿素及び塩基加
水分解による反応［反応（ａ’）］から成る二工程を進
める。続いて、フェノール（１６）を置換ベンゾキノン
−Ｎ−クロロイミン（ｌ　Ｏ）と反応させて、官能化イ
ンドフェノール（１７）を生成する０次に、インドフェ
ノール（１７）を塩基中で環化させて、所望の基質化合
物（１８及び１９）を生成する。
特に、３−ヒドロキシベンジルアルコール（９、Ｒ＝Ｒ
’　＝Ａ＝Ｂ＝Ｃ＝Ｈ）からの臭化３−ヒドロキシベン
ジル（１５、Ｒ＝Ｒ′＝Ａ＝Ｂ＝Ｃ＝Ｈ）の合成は、Ｊ
、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｗ、　ｖｏｌ、　２３゜ｐ、　１
０１３　（１９８０）に記載されており、またその３−
メルカプトメチルフェノール（１６、Ｒ＝Ｒ’　＝Ａ＝
Ｂ＝Ｃ＝Ｈ）への転換は、Ｊ、　Ｃｈｅｍ。
Ｓｏｃ、　Ｐｅｒｋｉｎ　１．　ｐ、　１５５５　ｆ１
９８０１に報告されている。
さらに−射的には、この方法を用いて、又はその他の適
切な方法を用いて、種々の置換３−ヒドロキシベンジル
アルコール（９）を対応する３−メルカプトメチルフェ
ノール（１６）に変換することは、当業界の通常技術の
範囲内である。
置換ベンゾキノン−Ｎ−クロロイミン （１０）、及び置換ｐ−アミノフェノール（１１）の特
異的性質は前記と同様であり、また残りの工程（ｂ）、
（ｃ）及び（ｄ）は、ジベンゾチアゼピノン（１３及び
１４）に関して先に記載されたものと同様である。
適切に誘導化された出発原料及び適切なグリニヤール試
薬又は還元剤の選択により、種々の置換フェノールが生
成され、したがって、有機化学合成の当業者は１本発明
の色原性アクリジノン酵素基質化合物の色原体として使
用するために所望の適切誘導ジベンゾキサセビノン及び
ジベンズチアゼピノンに変換し得る種々の置換基を有す
る特定のインドフェノールを調製することができる。
一般式（１，）のグリコシド誘導体は、適当な色原体と
反応する式Ｙ−ＯＨの炭水化物の公知の誘導体を用いる
炭水化物化学の当業界で公知の方法に従って調製できる
。ある場合には保護基を有するこのような炭水化物誘導
体は、市販されている（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　ＷＩ、　ｔｌ
ｓＡ；Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ
、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，ｌｌ５Ａ）か、又は当業界で
公知の方法に従って調製できる［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９６３）、　Ｖｏｌ
、　２］　、グリコシド基としては、β−Ｄ−ガラクト
ピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−グ
ルコビラノース、α−Ｄ−グルコビラノース、α−Ｄ−
マンノピラノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、β−グ
ルクロン酸、及びノイラミン酸のような糖の基が挙げら
れるが、これらに限定されるものではない。その他の好
適なグリコシド基としては、糖類錫分離酵素により単糖
類又は少糖類のレベルに分解され、順次、対応するグリ
コシダーゼにより基質化合物の核から直接分離され得る
少糖類鎖の基が挙げられる。このような少糖類鎖が、マ
ルトペントース、マルトヘキソース、又はマルトヘプト
ースのような、約２〜約２０、好ましくは２〜７の単糖
類単位から成る鎖であることが理解されるべきである。
−数式（２）の色原体は単糖類、又は少糖類もしくはそ
のｌ−ハロゲノ誘導体と反応させるが、この場合、ヒド
ロキシル基は全て、炭水化物化学の当業界で公知の方法
に従って保護基で置換されて、ペルー〇−置換グリコシ
ドを生成し、これから、当業界で公知の方法に従って保
護基を分離することにより、−数式（１）のグリコシド
誘導体を生成する。
適切な色原体を、水性アセトン中、又は（相転移条件下
で）水／クロロホルム、又は水／ベンゼン混合液中で、
好ましくはアルカリ性水酸化物又はアルカリ性炭酸塩の
ようなプロトン受容体の存在下で、ペルー〇−置換ｌ−
ハロゲノ糖類と反応させる。この操作は、さらに、アル
カリ性水酸化物又はアルコラードを用いて色原体を先ず
アルカリ性塩に変換するか、もしくは出来るならば置換
アミンを用いて、アンモニウム塩に変換し、次いで、ア
セトン、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、テト
ラヒドロフラン、又はジメチルホルムアミドのような双
極性非プロトン性溶媒中で、これらをペルー〇−置換１
−ハロゲノ糖類と反応させることにより、実行し得る。
さらに、ペルー〇−置換グリコシド及びペルー〇−置換
ｌ−ハロゲノ糖類の合成に際しては、酸化銀、炭酸銀、
Ｃｅ１ｉｔｅｅ上の炭酸銀（Ｊｏｈｎｓ−Ｍａｎｖｉｌ
ｌｅＣｏｒｐ、、　Ｄｅｎｖｅｒ、　ＣＯ，ＵＳＡｌ、
　５ｉｌｖｅｒ　ｔｒｉｆｌａｔｅ、又はサリチル酸銀
のような単一銀塩又は銀塩の混合物、並びに／あるいは
臭化水銀、シアン化水銀、酢酸水銀、又は酸化水銀のよ
うな単一水銀塩又は水銀塩の混合物、並びに／あるいは
炭酸カドミウム又は酸化カドミウムのような単一カドミ
ウム塩又はカドミウム塩の混合物の形態の添加物を、で
きれば塩化カルシウム、モレキュラーシーブ、又は叶１
ｅｒｉｔｅ■（Ｗ、Ａ、　Ｈａｍｍｏｎｄ　Ｄｒｉｅｒ
ｉｔｅ　Ｃｏ、。
Ｘｅｎ１ａ、　ＯＨ，ＵＳＡＩのような乾燥剤ととちに
、塩化メチレン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、
酢酸エチル、キノリン、テトラヒドロフラン、又はジオ
キサンのような溶媒中で用いるのが効果的である。α−
結合グリコシドの合成に際しては、色原体は、塩化亜鉛
のようなルイス酸の存在下で、そのヒドロキシ基が保護
基、好ましくはアセチル基で置換される糖類と共に溶融
する［Ｃｈｅｍ。
Ｂｅｒ、　６６、３７８−３８３　（１９３３）　、及
びＭｅｔｈｏｄｓ　１ｎＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、
１９６７）　Ｖｏｌ、　２．　ｐｐ、　３４５−３４７
参照］６反応温度は、好ましくは８０〜１３０℃、さら
に好ましくは１１０〜１３０℃である。その結果生じる
ペルー〇−置換グリコシドも同様に新規化合物である。
ペルー〇−置換グリコシドから保護基を除去してグリコ
シドを生成する操作は、ナトリウムメチラート、バリウ
ムメチラート、又はメタノールに溶解したアンモニアを
用いる保護アシル基についてと同様の、炭水化物化学の
当業界で公知の方法に従って実行する［Ａｄｖａｎｃｅ
ｓ　ｉｎ　ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｅｗ、　１２
．１５７　（１９７Ｇ）　参照］、炭水化物化学に通常
用いられる「保護基Ｊとして好適なものは、特に、アセ
チル、ベンゾイル、ベンジル、又はトリメチルシリル基
である。
一般式（１）（式中、Ｙはα−１，４グリコシド結合を
介して結合する約２〜２０単糖類単位の少糖類の基であ
る）は、Ｆｒｅｎｃｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＡｍ、　
Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、　７６、２３８７　（１９５４）
により最初に記載され、その後、Ｗａｌｌｅｎｆｅｌｓ
、　ｅｔ　ａｌＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　６１．３５９　（１９７８）によって記載され
た酵素処理によって、α−及びβ−色原体グリコシドか
ら付加的に調製され、酵素（１，４）−α−グルカン−
４−グルコシルトランスフェラーゼ（シクロマルトデキ
ストリングルカノトランスフェラーゼとしても公知：Ｅ
Ｃ２，４，１，１９）により予備生成多糖類鎖へのグリ
コシドの転移を引き起こす。
一般式（１）のエステル誘導体は、式Ｙ−ＯＨ（式中、
Ｙ＝Ｚ−Ｃ（０）−であり、Ｚは上記Ｒ及びＲ゛と同様
に定義される）のカルボン酸の公知の誘導体と適当な色
原体を反応させることにより、有機化学の当業界で公知
の方法によって調製できる０式Ｙ−ＯＨのカルボン酸の
このような公知の誘導体としては、アミノ酸残基、好ま
しくはＬ−又はＤ−型の、ちしくはラセミ形態の天然に
存在するα−アミノ酸の残基が挙げられ、グリシン、ア
ラニン、バリン、ロイシン、インロイシン、フェニルア
ラニン、及びチロシンの残基が好ましく、そのＬ−型形
態がさらに好ましいが、これらに限定されるものではな
い、存在する可能性のある任意の遊離ヒドロキシル基を
アシル化してちよく、好ましくはアセチル化してもよい
、Ｙ−ＯＨについてのこの定義におけるペプチド残基は
、例えば、アミノ酸、又はジー、トリー、テトラ−１及
びペンタペプチドのような約２〜約５アミノ酸単位のペ
プチドであると理解されるべきであり、ジー、及びトリ
ーペプチドが好ましく、そのアミノ酸成分は上記アミノ
酸である。このようなアミノ酸又はペプチドのアミノ基
が１例えばアシル、オキシカルボニル、チオカルボニル
、スルホニル特にｐ−）ルエンスルホニル（Ｔｏｓｙｌ
、　Ｔｓｌ、スルフェニル、ビニル、シクロヘキセニル
、並びにカルバモイル特にｔ−ブチル−（ＢＯＣ）及び
ベンジル−（ＣＥｚ）カルバモイル基を含むペプチド化
学の当業界で公知の窒素保護基によって保護されてらよ
い［Ｔ、Ｗ、　Ｇｒｅｅｎ。
Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａ
ｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（ＪＷｉｌｅｙ　ａｎｄ
　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ、　１９８１
１．　ｐｐ。
２１８−２８７　参照］、このようなエステルはまた、
有機化学の当業界で公知の方法を用いて、適当な色原体
をカルボン酸、アミノ酸又はペプチド、上記と同様のＹ
−ＯＨと、あるいはその適当な反応性誘導体と反応させ
ることにより、同様に調製してもよイ［Ｊ、　Ｍａｒｃ
ｈ、　Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ：　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
　ａｎｄ　５ｔｒｕｃ−ｔｕｒｅ　ｆｌＪｃＧｒａｗ−
Ｈｉｌｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　
ＮＹ。
１９６８）　ｐｐ、　３１９−３２３参照］、使用する
反応性誘導体は１例えばクロロギ酸エチルを用いるもの
のような、ペプチド合成において慣用的に用いる酸クロ
リド類、酸プロミド類、又は混合無水物、あるいはＮ−
ヒドロキシスクシンイミドの場合のような活性エステル
であってもよい。
同様に、−１１１１式（１）の無機エステルは、有機合
成の当業界の公知の方法に従って調製できる。ｔＡ酸又
は硫酸のような無機ｒＪＩＹ−ＯＨの公知の誘導体を、
ある種のクマリンの無機エステルに関してＫｏｌｌｅｒ
及びＷｏｌｆｂｅｉｓ、　Ｍｏｎａｔｓｈ、　１１６．
６５ｆ１９８５１に示されているような、有機化学の当
業界で公知の方法を用いて、色原体と反応させる。
分析試験系 本発明の色原性酵素基質化合物は、そこに存在する酵素
の量の測定を要する分析試験系、特に酵素標識化検定試
薬を用いる分析試験系において有用である。このような
分析試験系としては、競合的、サンドイッチ、及び免疫
測定法として当業界で公知の酵素イムノアッセイが挙げ
られるが、これに限定されない、この場合、その特定の
画分中の酵素標識量を測定し、液体試験試料から得られ
る測定中の分析対象物の量と相関させ得る。
酵素で標識化される、抗原、ハブテン、抗体、レクチン
、受容体、アビジン、及びその他の結合性蛋白質、並び
にポリヌクレオチドのような特異的結合物質の用途が近
年開発され、生体液中の物質の測定に適用されるように
なってきた［例えば、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏ
ｌ、　２２．　ｐ、　１２３２　（１９７６１Ｕ、Ｓ、
　Ｒｅ１ｓｓｕｅ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　３１．００
６；及びＵ、ＫＰａｔｅｎｔ　Ｎｏ、２．０１９．３ｏ
ｇ参照］、一般的に、このような測定は、結合性物質、
例えば抗体又は抗原が特定の分析対象物に結合する能力
に依っており、この場合、酵素で標識されたこのような
結合性物質を包含する標識試薬は、このような結合の程
度を測定するために使用する。通常、結合の程度は、分
析対象物との結合反応において沈澱していた、又は沈澱
していなかった標識化試薬中に存在する酵素標識量を測
定することにより測定するが、この場合、検出及び測定
される酵素の量は、液体試験試料中に存在する分析対象
物の量と相関し得る。
本発明の色原性酵素基質化合物は、前記したような分析
試験系において特に有用であるが、この場合、本発明の
色原性酵素基質化合物を包含した担体マトリックスを含
む分析試験具を使用し、その酵素特異性部分の性質は、
もちろん、検出される特定の酵素に依っている。
このような担体マトリックスの原料の性質は、溶液分析
のために試薬ストリップを用いるもののような、本発明
の色原性酵素基質化合物を包含可能な任意の物質のもの
であり得る０例えば、米国特許第３，８４６，２４７号
には、フェルト、多孔質セラミックストリップ、及びガ
ラス繊維の織布又はマットが記載されている。紙の代用
として、米国特許第３，５５２，９２８号には、木材環
、布、スポンジ物質、及び陶土質物質の使用が記載され
ている。紙の代わりの合成樹脂フリース及びガラス繊維
フェルトの使用は、英国特許第１．３６９，１３９号に
示唆されており、英国特許第１，３４９．６２３号は、
裏打ち紙マトリックス用カバーとしての細いフィラメン
トの光透過性網細工の使用を教示している。この参考文
献はまた、試薬系の一部を紙に含浸させ、その他の配合
禁忌の可能性がある試薬を網細工に含浸させることを教
示している。仏国特許第２．１７０，３９７号は、その
中に５０％以上のポリアミド繊維を有する担体マトリッ
クスの使用を示す、担体マトリックスに対する別のアプ
ローチは、米国特許第４，０４６，５１３号に記載され
ているが、この場合、好適な担体マトリックス上に試薬
をプリントするという概念が用いられる。米国特許第４
．０４６．５１４号には、反応体系における試薬を有す
るフィラメントの織り込み及び編み込みが記載されてい
る。このような担体マトリックスの概念は全て、他のも
のと同様、本発明に用い得る。好ましくは、担体マトリ
ックスは濾紙のような吸水性物質から戊り、それにより
、本発明の色原性酵素基質化合物はマトリックスを含浸
するために使用する。それは、高分子マイクロカプセル
のような検定試薬を物理的に閉じ込め、次いで試験試料
と接触した時に破裂する系をも包含する。それは、検定
試薬が液体又は半液体状態で担体マトリックスと均質に
結合し、その後硬化又は固化することにより検定試薬を
閉じ込める系を包含し得る。
好ましい実施例においては、担体マトリックスは本発明
の色原性酵素基質化合物を包含した領域又は層の形態の
吸水性物質であって、これは、標識化試薬の結合種から
標識化試薬の遊離種を物理的に分離するために当業界で
公知の不溶性検定試薬を用いて、液体環境中で特定の検
定を実施する場合に用いる。このような検定システムに
より、遊離種を含む液体の一定量を取り出し、そこに包
含された色原性酵素基質化合物が液体試験試料からの遊
離種の標識化試薬の酵素標識と相互作用して、分光光度
計のような適切な装置で目視的に観察及び／又は測定で
きる検出可能な信号を提供する担体マトリックスに適用
する。
同様に、例えば最上位層又は領域、及び最下位層又は領
域の形態で２つ又はそれ以上の担体マトリックスを包含
する試験具を用いることができる。このような試験具の
最下層は、本発明の色原性酵素基質化合物を包含できる
が、この場合、測定中の分析対象物を含む液体試験試料
は装置の最上層に適用する。そこに拡散する分析対象物
は、必要な結合反応に際して沈澱し、前記と同様、その
中の酵素標識化試薬の遊離及び結合（即ち不動化）種を
生じる。したがって、そのようにして生成された標識化
試薬の遊離種は、遊離して、最下層に移動する。この場
合、遊離種の酵素標識はそこに包含された本発明の色原
性酵素基質化合物の酵素的開裂可能基を開裂して、前記
と同様、測定可能、検出可能信号を提供する。
本発明は、次の実施例でさらに詳しく説明するが、これ
らに限定されるものではない、カッコ内のアンダーライ
ンを有する数字は１図面及び／又は明細書中で使用する
構造式を示す。
ｔ（ｉ　１１等（上記）の方法に従って調製した８−ヒ
ドロキシ−１１−メチル−１１８−ジベンズ［ｂ、ｅｌ
　　［１，４］オキサゼピン−２−オン（「メチルパー
プル、ｇ）（工旦）（０，２ｇ：０　、　８３ｍｍｏｉ
’）　、アセトブロモガクラクトース（Ｓｉｇｍａ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　＆
４０．　ＵＳＡ）（０，６８５ｇ　；　１．６６ｍｍｏ
ｉ’）、及び酸化銀（１）　　（Ａ　ｇｚ　　ｏ）　　
（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ、。
Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　　Ｉｌ、　　ＵＳＡ）　　（０
，４２５ｇ　；　　１．　６６ｍｍｏｆ）の混合物を、
光を遮断した密栓フラスコ中で１６時間、無水キノリン
（６，２５ｍ１’）及び酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（２
ｉ）に溶解して、周囲温度で撹拌した０反応混合液をＥ
ｔＯＡｃ（約４０１ｎｌ）中に入れて希釈し、Ｃｅ１ｉ
ｔｅ　（Ｊｏｈｎｓ−Ｍａｎｖｉｌｌｅ　Ｃｏｒｐ、、
　Ｄｅｎｖｅｒ、　ＧＯ，ＵＳＡ　）に通してｔ濾過し
、少量のＩＭ　　Ｈ（ｌで抽出液が酸性（ｐＨ＝１）に
なるまで抽出した。−緒にした水性抽出液をＥｔＯＡＣ
（２５−）で洗浄し、次いで混合ＥｔＯＡｃ層を塩水（
２０Ｗｄりで洗浄し、硫酸ナトリウム（Ｎａ＊５０４）
を用いて乾燥して、濾過し、真空蒸発乾燥して、全黄色
泡状物質を得た（０．８ｇ）、この組成生成物を、クロ
ロホルム溶媒中に溶解した７、５％（Ｖ：Ｖ）アセトン
を用いてシリカゲル（１００ｇ）上でクロマトグラフィ
にかけ、２つの明黄色物質帯（Ｒｆ＝０．２８及び０．
３４．シリカゲル板上で、アセトン：クロロホルム［１
：９］で展開させた）を採取し、−緒に合わせ、溶媒を
除去して、檀色泡状物質として表題化合物の混合物を生
成した（９．４４ｇ；９２％）。
ＩＲ（ＫＢｒ）　ｃｍ−’　２９８５．１７５６．１６
４１．１６１８゜１５７５、１５１１．１４３７．１３
７２．１２３０．１０７５゜’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ
’）δ：　１．４−１．７　（ｍ、　３Ｈ）。
１．９−２．２　（ｍ、　１２Ｈ）、　４．０−４．２
　（ｍ、　２）１）。
４．４５−４．５５　（ｍ、　ＬＨ）、　５．１−５．
４　（ｒｎ、　４Ｈ）。
５．６−５．７６　（＋ａ、　ＩＨ）、　５．８５−５
．９　（ｍ、　ＩＨ）。
ｅ、４−７．７　（ｍ、　５１（）− ”ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ’）　ｐｐｍ、　１８７．９
３．１８７．５１゜１６９．９９．１６９．９３．１６
９．５９．１６９．２７．１５９．４８゜１５８．５６
．１５７．７３．１５１．６７、１４４．７１．１４２
．３８゜１４２．００．１４０．６９．１３７．００．
１３６．４８．１３４．３４゜１３４．１１．１３０．
５１．１３０．１６．１２５．７５．１２５．６４゜１
１６．６９．１１６．６３．１１３．０４．１１２．９
５．１１０．９９゜１０７．３８．９６．９４．７６．
７２．７５．０３．７０．７６゜７０．１６．６８．１
９．６７．３４．６１．５９．２０．５２．１？、６２
゜１７．２３　（１７合致帯）。
分析二計算値 （Ｃ，、Ｈ，、ＮＯ ２として） Ｃ１’５８．８４；　　Ｈ。
５．１１．　　Ｎ。
２．４５ 実測値：　Ｃ，５８，６１；　Ｈ。
５．３１：　　Ｎ。
２．２９ ＨＰＬＣ用メタノール（２５ｍｆｆ）中に溶解した（１
ユ）及び（主２）（０，４１ｇ；０．７２ＩＩＩＩＩｏ
Ｉ）の溶液を周囲温度で、ナトリウムメトキシド（３１
ｍｇ）で処理し、１．５時間撹拌した。酢酸（約２５Ｊ
Ｌ１）を加えて反応を中断し、次に真空蒸発乾燥して撞
色固体を得た。この粗製物を、クロロホルム溶媒中に溶
解した１５％（Ｖ：Ｖ）メタノールを用いて、シリカゲ
ル（１００ｇ）上でクロマトグラフィにかけ、生じた明
黄色物質帯（Ｒｆ＝０．２５゜シリカゲル板上でメタノ
ール：クロロホルム［１：　４］を用いて展開）を採取
し、溶媒を真空除去して、表題化合物の混合物を赤檀色
固体として得た。６４℃で２時間真空乾燥して、元素分
析用試料を生成した（０．１９５ｇ；６７％）。
ＩＲｆＫＢｒｌ　ｃｍ−’　３３２８．２９２５．２８
７６、１６３９゜１６１２、１５７１．１５０８．１３
８４．１２４５．１２１９．１０８５゜８９６、８８０
．８２３．７９１゜ ’ＨＮＭＲｆＤＭｓＯ−ｄ’ｌδ：　１．４−１．７　
ｆｍ、　３Ｈ１゜３．３−３．７５　ｆｍ、　７Ｈ）、
　４．５−４．７５　（ｍ、　５Ｈ１゜５．８５−５．
９０　ｆｍ、　ＩＨｌ、　６．４−７．６５　ｆｍ、　
５Ｈ１゜目ＣＮＭＲｆＤＭｓｏ−ｄ’ｌ　ｐｐｍ、　１
８７．９５．１８７．５１゜１６１．１８．１５９．３
４．１５８．６７、１５２．０７．１５１．６１゜１５
１．００．１４４．７６、１４２．５２．１４２．１１
．１４０．０６゜１３６．９６．１３６．３６．１３４
．２８．１３３．８５．１３０．３１゜１２９．９５．
１２５．００．１１６．９３．１１６．８４．１１３．
０８゜１１３．０４．１１０．９１．１０７．３６．１
００．７６、１００．５９゜７６．６５．７５．９４．
７５．１８．７３．３４．７３．２４．７０．２１゜６
８．２７．６８．１９．６０．５２．６０．４４．１７
．６８．１７．３０（１合致帯）。
分析：計算値（Ｃ，。Ｈｘ＋ＮＯａとして）：Ｃ，５９
，５５：　　Ｈ，５，２５：　　Ｎ、３．４７実測値：
　Ｃ，５９，５７，Ｈ，５，４８；　Ｎ、　３．２１５
ｍＭ塩化マグネシウム（Ｍ　ｇ　ＣＱ　ｇｌを含有する
ｐＨ７，４の、５０ｍＭ燐酸緩衝液中に溶解した場合、
化合物（主１）＋（Ｚま）（混合物）は、えｍａｘが４
５４ｎｏ＋（ｔ＝２２．０００）及び３４４ｎａ＋（ｃ
ｍ１４．０００）であった、β−ガラクトシダーゼ存在
下では、基質は、１．３２ＸｌＯ’　ｍｏｌ　・分−’
／ｍａｉｌ活性部位の速度（Ｋ　ｃａｔ）で（主１）に
開裂し、Ｋｍは０．０７５１１ＩＭを示した。
（Ｚ旦） 周囲温度に保ったＨ、Ｏ（２００ｍ／）中に溶解した２
−（３′−ヒドロキシフェニル）−１−プロパノール（
主１）（２，２０ｇ；１４．４５ｍｍｏＩ）　　［Ｂｒ
ｕｃｅ、　　ｅｔ　ａｌ、　　Ｊ、　　Ｃｈｅｍ、　　
Ｓｏｃ、　　（Ｃ１１６２７（１９６６１に記載された
ようにして調製］、及びＮａｇ　Ｂ４０ｍ　・１０８ｔ
　Ｏ（ｂｏｒａｘ）　（２８ｇ　：　７３．　４２ｍｍ
ｏ７）の溶液を、ベンゾキノンクロロイミド（主１）（
２，０ｇ：１４．１３ｍｍｏＩ）　　［Ｇｉｂｂｓ、　
ｅｔ　ａｌ、　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　Ｎｏ、　６９　
ｔ。
Ｔｈｅ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｒｅｐｏｒｔｓ
、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ（１９２８）に記載
されたようにして調製］及びテトラヒドロフラン（５−
）で処理し、次いで７日間撹拌した０次に反応混合物を
ＩＭ　　ＨＣＪ２で酸性化し、Ｅ　ｔＯＡｃ　（１２５
ｍｌ’）で４回抽出した。−緒にしたＥｔＯＡｃ層を塩
水（１００ｍＦ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ　ｘ　５ｏ４１
Ｌ、濾過して、真空蒸発乾燥した。残渣を、アセトン：
クロロホルム（１：９）溶媒を用いてシリカゲル（２０
０ｇ）上でクロマトグラフィにかけ、その結果生じた赤
色物質帯（Ｒｆ＝０．３３）を採取し、溶媒を真空除去
して、表題化合物の混合物を赤色粉末として生成した（
７２ｍｇ）− ＩＲｆＫＢｒｌ　Ｃｍ−’　１６３４．１６１４．１５
５６．１３１Ｌ。
１２１３、　１１８０，８７８゜ ’ＨＮＭＲｆＤＭｓｏ−ｄ’　／周囲温度）δ：　１．
５２（ｂｒ、ｓ、　６Ｈ１，５，８−７，７（ｖ、ｂｒ
、ｍ、　６Ｈ１゜１０．７５　　（ｂｒ、ｓ、　　ＩＨ
Ｉ。
’ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ”７１００　°Ｃ）δ　：　
１．５３　　（ｓ、　　６Ｈ１２，９８（ｖ、ｂｒ、ｓ
、　　ＩＨＩ　　（ＯＨＩ、　　６．１３　　（ｂｒ、
ｓ、　　ＩＨＩ。
６．５７　　（ｂｒ、ｄ、　　Ｊ＝９．３　Ｈｚ、　　
ＩＨＩ。
６．６６　　（ｂｒ、ｓ、　　ＩＨｌ、　　Ｇ、７３　
　ｆｖ、ｂｒ、ｄ、、　　Ｊ＝９．１　Ｈｚ。
ＬＨＩ、　　７．２８　　（ｄ、　　Ｊ＝９．３　Ｈｚ
、　　ＩＨ）。
７．４４　　ｆｄ、　　Ｊ＝９．０　Ｈｚ、　　ＩＨＩ
。
ＥＩＭＳ、　ｖａ／ｅ　　（相対強度）　２５５　（Ｍ
”、塩基）。
２４０　　（１４，８）、　　２２６　　（４４，３１
，２１２＋４１．８１゜２１０　　（２３，７）、　　
１９８　　（２６，８１，１８４（３０，３＋。
分析：計算値（Ｃ，＠Ｈ，，ＮＯ２，％Ｈ２０として）
　　：　Ｃ，６９，３５；　Ｈ，５，２４：　Ｎ、　５
．３９実測値：　Ｃ，６９，５４：　Ｈ，５，２６，Ｎ
、　５．３８−アセチルー　−Ｄ−ガラクトピラノシル
オキ（１旦） （Ｚユ）及び（主１）（０，１０３ｇ；０．４ｍｍｏｆ
）　、アセトブロモガラクトース（０，３３３ｇ；２ｅ
ｑ）及び酸化銀（１）（Ａｇ、０）（０，１８８ｇ；２
ｅｑ）の混合物を、光を遮断した密栓フラスコ中で１８
時間、無水キノリン（７−）及びＥｔＯＡｃ（２ｄ）に
溶解して、周囲温度で撹拌した。その反応混合液をＥｔ
ＯＡｃ（約４０−）で希釈し、Ｃｅ１ｉｔｅを通して濾
過し、１．０ＭＨＣβ（各３０−）で３回抽出した。−
緒にした水性抽出液をＥｔＯＡｃ　（４０１ｎｌ）で洗
浄し、次に合わせたＥｔＯＡｃ層を塩水（４０ｍ／）で
洗浄し、乾燥（Ｎ　ａ　ｚ　Ｓ　Ｏ４）　シ、ｉ濾過し
て、真空蒸発乾燥した。この粗製生成物を、アセトン：
クロロホルム（７：９３）溶媒を用いてシリカゲル（９
３ｇ）上でクロマトグラフィにかけ、その結果生じた２
つの黄色物質帯（Ｒｆ＝０．３８及び０．４３．シリカ
ゲルプレート上でアセトン：クロロホルム（１：９１）
で展開）を採取し、−緒に合わせて、溶媒を真空除去し
、表題化合物の混合物を橿色泡状物質として得た（０．
２１６ｇ；９２％）。
ＩＲ（ＫＢｒ）　ｃｍ−’　１７５０．１６４０．１６
１５．１５７３゜１３６ｇ、　　１２６０．　１０？０
．　９５５．　８９８’ＨＮｕＲ（ＣＤＣ１ａｌδ：　
１．４５−１．７０　ｆｍ、　６Ｈ）。
２．０−２．２　（ｍ、　１２Ｈ）、　４．ＯＬ４．２
６　（ｍ、　３Ｈ１５，１０−５，２０（ｍ、　２Ｈ１
，５，４５−５，５５ｆｍ、　２Ｈ］。
６．００−７．７０　（ｍ、　６Ｈ１゜”ＣＮＭＲ（Ｃ
ＤＣ１ｘｌ　ｐｌ）４０．１８ｇ、８２．１８８．５０
゜１７０．２５．１７０．０４．１６９．９４．１６９
．２６．１５９．９１゜１５８．００．１５６．５５．
１５１．６７、１５１．６３．１５０．５６゜１４６．
４５．１４５．３８．１４１．７８．１４０．１９．１
３７．１１゜１３６．５９．１３５．１１．１３０．７
０．１２９．４６．１２９．３１１２６．２２．１２４
．９６．１５５．３３．１１５．２８．１１３．８１゜
１１２．７６、１０９．０３．９８．５４．９８．４２
゜８０．１４゜７９．７８．７１．２９．７０．５７．
６８．３２．６６．７３．６１．４２゜２６．４４．２
６．２３．２０．５６　ｆ１７合致合致帯− −Ｄ−ガラクトピラノシルオキシー （１１） ＨＰＬＣ用メタノール（２０ｍｊ）中に溶解した（主１
）及び（１旦）（０，２１ｇ；０．３５８ｍｍｏｉ’）
の溶液を、周囲温度でナトリウムメトキシド（２２ｍｇ
）を用いて処理し、数時間撹拌した。酢酸（２３μ）を
加えて反応を中止し、次いで真空蒸発乾燥した。粗製生
成物を、メタノール：クロロホルムＮ　５　：　８５）
溶媒を用いて、シリカゲル（６０ｇ）上でクロマトグラ
フィにかけ、その結果生じた榎色物質帯（Ｒｆ＝０．２
３．シリカゲルプレート上でメタノール：クロロホルム
［１：　４］で展開）を採取し。
溶媒を真空除去して、表題化合物を赤禮色粉末として得
た（０．１２ｇ；８０％）。
ＩＲｆＫＢｒｌ　　ｃｍ−’　　３４１Ｂ、２９２６．
１６３４．１６１２゜１５６７、　１５０３．　１３８
５．　１２９２．　１２２７．　１０７４．８８９’Ｈ
Ｎ！ＪＲ（ＤＭＳＯ−ｄ’）δ　：　１．４５−１．６
５　　（ｍ、　　６Ｈ）。
３．３０−３．７５　　（ｎ＋、　　６Ｈ）、　　４．
５　　（ｖ、ｂｒ、ｄ、　　Ｊ＝１．４　ＨｚＩＨｌ、
　　４．６８　　ｆｂｒ、ｑ、、　　Ｊ＝６．７　Ｈｚ
、　　ＩＨＩ。
４．９１　　（ｖ、ｂｒ、ｓ、　　ＩＨｌ、　　４．９
９　　（ｔ、　　Ｊ＝６．９　Ｈｚ、　　０１）。
５．２３　　［ｖ、ｂｒ、ｓ、　　ＩＨｌ、　　５．９
−７．７　　（ｍ、　　６Ｈ１゜目ＣＮｕＲ（ＤＭＳＯ
−ｄ’）　ｐｐｍ、　１８７．９１．１８７．７Ｇ。
１６１．４７，１５９．６８．１５６．３５，１５０．
６１，１５０．４８゜１５０．３１．１４６．２５，１
４５．６２，１４１．９９．１４０．９１゜１３８．６
５．　１３７．２３．　１３６．２０．　１３４．０９
．　１３０．３３゜１２９．１９．　１２４．７５．　
１１６．１５．１１４．６９，１１３．３２゜１１３．
０１．　１０８．６５．　１００．５８．　１００．４
２．　８０．７２゜７９．９９．　７６．００．　７５
．７８．７３．３０、　？３．２４，７０．１９゜６８
．２６．６８．１？、　　６０．５２．６０．３８．２
６．０１（４合致帯）。
分析：計算値（Ｃｔ、）１．、ＮＯ、・　１−％Ｈ２０
として）　　：　に、　５６．７５；　Ｈ２Ｓ、９０．
　Ｎ、　３．１５実測値：　Ｃ，５６，６１；　Ｈ，５
，８２：　Ｎ、　３．１４゜誌並旦 試験試料中のβ−ガラクトシダーゼの存在に感応する試
験具を作製した。試験具は、ポリスチレンフィルムの長
方形ストリップの一端に取付けた７戸紙の小長方形小片
を含んでいた。濾紙は、（２旦）及び（主１）、緩衝液
、及び無機塩を含む種々の成分で含浸した。　Ｗｈａｔ
ｍａｎ　５４濾紙のＡ２インチ幅ストリップを以下の成
分を含む水溶液中に浸漬した： ０　、６４　Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｅ　ｐｐｓ緩衝液（ｐＨ＝
８．４）４　、０　ｍＭ　　Ｍ　ｇ　ＣＱ　２ 次いでその濾紙を空気中で一晩乾燥した。
次に、その濾紙を、１５ｍＭの［（２旦）＋（２４）］
を含むＤＭＦ溶液中に浸漬した。
次いで、その濾紙を５０〜８０℃で空気乾燥した。その
結果、黄色試験紙が得られた。
乾燥、含浸紙の小片をＯ，ＩＸｏ、４インチの長方形に
切って、軸方向に配位した０、１×３．２５インチのポ
リスチレンストリップの一端に取り付けた。ストリップ
への濾紙の取付けは、両面接着テープ（３Ｍ社）を用い
て行つた。
ｐＨ６，４の燐酸カリウム／クエン酸カリウム緩衝液中
に溶解したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液は、０．０２
５．０．０５．０．０７５．０．２０．０．１２５、及
び０．１５ＩＵ／ｍｊの濃度に調整した。３つの分析試
験具を各試験溶液に浸漬した０次に、それぞれの分析試
験具を５ＥＲＡＬＹＺＥＲ＠反射光度計（Ｍｉｌｅｓ、
　Ｉｎｃ、。
Ｅｌｋｈａｒｔ、　ＩＮ、　ＵＳＡＩに取り付け、遊離
色原体（２０）を含有する試験具からの光の反射率を７
０〜９０秒後に測定したが、この場合、その反射率値を
それぞれの試験試料溶液濃度に対してプロットした結果
、第４図に示すような直線的用量反応が明示された。
本発明を、上述のとおり、特に説明し、例示してきた０
本発明の多数のその他の変法及び変更が、その精神及び
範囲を逸脱することなくなされ得ることは明らかである
。
【図面の簡単な説明】
第１図は、８−ヒドロキシ−１ＬＨ−ジベンズ［ｂ、ｅ
］　　［１，４］オキサゼピン−２−オン色原体の製造
のための合成経路のフローダイヤグラムである。 第２図は、８−ヒドロキシ−１１８−ジベンゾ［ｂ、ｅ
］　　［１，４］チアゼピン−２−オン色原体の製造の
ための合成経路のフローダイヤグラムである。 第３図は、本発明の色原性酵素基質化合物製造のための
合成経路のフローダイヤグラムである。 第４図は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの存在に対して本
発明の色原性酵素基質を包含せしめた試験具の用量応答
を示すグラフである。 〈９〉 （１５） （１８） 第 図 （１６） （１つ） （２３） （２４） 第 図 第 ４

Claims (49)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式
    、表等があります▼ （式中、Ｙは酵素によって開裂しうる基を表し：Ｗは０
    又はＳであり；Ｒ及びＲ′は、同一であるか又は異なっ
    てもよく、Ｈ、アルキル又はアリールである） の色原性酵素基質化合物。
  2. （２）ＷがＯである請求項１記載の化合物。
  3. （３）Ｒ及びＲ′が、同一であるか又は異なってもよく
    、Ｈ、低級アルキル、又はフェニルである請求項２記載
    の化合物。
  4. （４）Ｒ及びＲ′が、共にＨ又はフェニルではない請求
    項３記載の化合物。
  5. （５）上記の酵素によって開裂しうる基が糖及びその誘
    導体、脂肪族及び芳香族カルボン酸、並びに無機酸より
    成る群から選択される酵素特異性部分を包含する化合物
    Ｙ−ＯＨの基である請求項１記載の化合物。
  6. （６）上記酵素特異性部分が、α−Ｄ−ガラクトース、
    β−Ｄ−ガラクトース、α−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−
    グルコース、α−Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグルコ
    サミン、及びＮ−アセチルノイラミン酸より成る群から
    選択される糖又はその誘導体である請求項５記載の化合
    物。
  7. （７）上記酵素特異性部分が約２〜約２０単糖類単位の
    少糖類鎖である請求項５記載の化合物。
  8. （８）上記酵素特異性部分が、マルトペントース、マル
    トヘキソース、及びマルトヘプトースから成る群から選
    択される少糖類である請求項５記載の化合物。
  9. （９）上記酵素特異性部分がβ−Ｄ−ガラクトースであ
    る請求項５記載の化合物。
  10. （１０）上記酵素特異性部分がβ−Ｄ−グルコースであ
    る請求項５記載の化合物。
  11. （１１）上記酵素特異性部分がα−Ｄ−グルコースであ
    る請求項５記載の化合物。
  12. （１２）上記酵素特異性部分がマルトヘプトースである
    請求項５記載の化合物。
  13. （１３）上記酵素特異性部分が脂肪族又は芳香族カルボ
    ン酸である請求項５記載の化合物。
  14. （１４）上記酵素特異性部分が、Ｎ−保護アミノ酸、又
    は約２〜約５アミノ酸単位のペプチドから成るカルボン
    酸である請求項５記載の化合物。
  15. （１５）上記酵素特異性部分がＮ−トシル−Ｌ−アラニ
    ンである請求項１４記載の化合物。
  16. （１６）上記酵素特異性部分が燐酸である請求項５記載
    の化合物。
  17. （１７）上記酵素特異性部分が硫酸である請求項５記載
    の化合物。
  18. （１８）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式
    、表等があります▼ （式中、Ｙは糖及びその誘導体、脂肪族及び芳香族カル
    ボン酸、並びに燐酸から成る群から選択される酵素特異
    性部分を包含する化合物Ｙ−ＯＨの基であり、Ｒ及びＲ
    ′は同一であるか又は異なってもよく、Ｈ又は低級アル
    キルである） の色原性酵素基質化合物。
  19. （１９）Ｒ及びＲ′のうち一方がＨであり、他方が低級
    アルキルである請求項１８記載の化合物。
  20. （２０）Ｒ及びＲ′のうち一方がＨであり、他方がメチ
    ルである請求項１８記載の化合物。
  21. （２１）Ｒ及びＲ′がどちらもメチルである請求項１８
    記載の化合物。
  22. （２２）上記酵素特異性部分が、α−Ｄ−ガラクトース
    、Ｂ−Ｄ−ガラクトース、α−Ｄ−グルコース、β−Ｄ
    −グルコース、α−Ｄ−マンノース、Ｎ−アセチルグル
    コサミン、及びＮ−アセチルノイラミン酸より成る群か
    ら選択される糖又はその誘導体である請求項１８記載の
    化合物。
  23. （２３）上記酵素特異性部分が約２〜約２０単糖類単位
    の少糖類鎖である請求項１８記載の化合物。
  24. （２４）上記酵素特異性部分がβ−Ｄ−ガラクトースで
    ある請求項１８記載の化合物。
  25. （２５）上記酵素特異性部分がβ−Ｄ−グルコースであ
    る請求項１８記載の化合物。
  26. （２６）上記酵素特異性部分がα−Ｄ−グルコースであ
    る請求項１８記載の化合物。
  27. （２７）上記酵素特異性部分がマルトヘプトースである
    請求項１８記載の化合物。
  28. （２８）上記酵素特異性部分がＮ−保護アミノ酸、又は
    約２〜約５アミノ酸単位のペプチドである請求項１８記
    載の化合物。
  29. （２９）上記酵素特異性部分がＮ−トシル−Ｌ−アラニ
    ンである請求項２８記載の化合物。
  30. （３０）上記酵素特異性部分が燐酸である請求項１８記
    載の化合物。
  31. （３１）液体試験試料中の特定の酵素の測定方法であっ
    て： （ａ）試験試料を次式： ▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式
    、表等があります▼ （式中、ＷはＯ又はＳであり；Ｒ及びＲ′は同一である
    か又は異なってもよく、Ｈ、アルキル又はアリールであ
    り；Ｙは酵素によって開裂しうる基、即ち、 （ｉ）上記酵素により酵素基質化合物の核から開裂でき
    るか、又は、 （ｉｉ）上記酵素により変性されて、Ｙが二次酵素によ
    り、その変性酵素基質化合物の核から開裂できる二次基
    質化合物を産生することができる 基であって、後者（ｉｉ）においては、二次基質化合物
    を上記二次酵素と接触せしめる）の色原子酵素基質化合
    物と接触させ；そして、 （ｂ）その結果として酵素基質化合物の開裂核により生
    じる色を測定し、上記液体試験試料の存在と相関させる 工程から成る方法。
  32. （３２）上記の酵素によって開裂しうる基が、糖及びそ
    の誘導体、脂肪族及び芳香族カルボン酸、並びに無機酸
    より成る群から選択され酵素特異性部分を包含する化合
    物Ｙ−ＯＨの基である請求項３１記載の方法。
  33. （３３）ＷがＯである請求項３２記載の方法。
  34. （３４）Ｒ及びＲ′が、同一であるか又は異なってもよ
    く、Ｈ、低級アルキル又はフェニルである請求項３３記
    載の方法。
  35. （３５）Ｒ及びＲ′がＨ又はフェニルである請求項３４
    記載の方法。
  36. （３６）Ｒ及びＲ′のうち一方がＨであり、他方が低級
    アルキルである請求項３３記載の方法。
  37. （３７）Ｒ及びＲ′のうち一方がＨであり、他方が低級
    アルキルである請求項３３記載の方法。
  38. （３８）Ｒ及びＲ′がともにメチルである請求項３３記
    載の方法。
  39. （３９）上記酵素がグリコシダーゼであり、Ｙがα−Ｄ
    −ガラクトース、β−Ｄ−ガラクトース、α−Ｄ−グル
    コース、β−Ｄ−グルコース、α−Ｄ−マンノース、Ｎ
    −アセチルグルコサミン、及びＮ−アセチルノイラミン
    酸より成る群から選択される糖又はその誘導体の基であ
    る請求項３１記載の方法。
  40. （４０）上記酵素がα−アミラーゼであり、Ｙがα−ア
    ミラーゼにより変性されて二次グリコシド基質化合物を
    産生することができる約２〜約２０単糖類単位の少糖類
    鎖であって、その結果生じるグリコシド基が二次グリコ
    シダーゼ酵素により基質化合物の核から開裂可能であり
    、二次グリコシド基質化合物を上記二次グリコシダーゼ
    酵素と接触させる請求項３１記載の方法。
  41. （４１）上記少糖類鎖がマルトヘプトースである請求項
    ４０記載の方法。
  42. （４２）上記の結果的に生じるグリコシド基がグリコシ
    ドであり、上記二次グリコシダーゼ酵素がグリコシダー
    ゼである請求項４０記載の方法。
  43. （４３）上記酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであり、
    Ｙがβ−Ｄ−ガラクトース基である請求項３１記載の方
    法。
  44. （４４）上記酵素がβ−Ｄ−グルコシダーゼであり、Ｙ
    がβ−Ｄ−グルコース基である請求項３１記載の方法。
  45. （４５）上記酵素が非特異性エステラーゼであり、Ｙが
    脂肪族又は芳香族カルボン酸の基である請求項３１記載
    の方法。
  46. （４６）上記酵素が白血球中に存在する蛋白質分解酵素
    であり、ＹがＮ−保護アミノ酸又は約２〜約５アミノ酸
    単位のペプチドから成るカルボン酸の基である請求項３
    １記載の方法。
  47. （４７）ＹがＮ−トシル−Ｌ−アラニン基である請求項
    ４６記載の方法。
  48. （４８）上記酵素がアルカリ性ホスファターゼであり、
    Ｙが燐酸基である請求項３１記載の方法。
  49. （４９）上記酵素がスルファターゼであり、Ｙが硫酸基
    である請求項３１記載の方法。
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