JPH01211595A - 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、その製法及びＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬への利用 - Google Patents

新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、その製法及びＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬への利用

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JPH01211595A
JPH01211595A JP63033994A JP3399488A JPH01211595A JP H01211595 A JPH01211595 A JP H01211595A JP 63033994 A JP63033994 A JP 63033994A JP 3399488 A JP3399488 A JP 3399488A JP H01211595 A JPH01211595 A JP H01211595A
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JP63033994A
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Koichi Kasai
浩一 葛西
Shoichi Tokutake
昌一 徳武
Nobuyuki Yamatsugu
山次　信幸
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Kikkoman Corp
Original Assignee
Kikkoman Corp
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    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘
導体、ソの製法、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ダーゼ活性の測定法及びＮ−アセチル−β−Ｄ−グルフ
サミニダーゼ活性の測定用試薬に関する。
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以下、Ｎ
ＡＧａｓｅ　　と略す）は、腎硬細管上皮に多いる。尿
中ＮＡＧａｓｅ　　は急性腎不全や糸球体腎炎等の各種
腎臓疾患や腎臓の術後においては上昇し、また糖尿病に
おいては尿中ばかりでなく血清中ＮＡＧａｓｅ　　も上
昇することが認められており、こういった各種腎臓疾患
の診断及び経過観察の一助として、また薬物の腎毒性検
討の指標としても、臨床及び動物実験面でＮＡＧａｓｅ
　の測定が注目されている。
〔従来の技術〕
従来、ＮＡＧａｓｅ　　活性の測定用基質としては、例
、ｔ　ハルー二トｐフェニルーＮ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニド［Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｇｙｍｏｌ、
、　　２８，７０２（１９７２）　］　及び］４−メチ
ルウンベリフェリルーＮ７セチルーβ−Ｄ−グルコサミ
ニド［Ｃ１１ｎｉｃａ。
Ｃｈｉｍｉｃａ、　　Ａｃｔａ、、　　２４，１８９　
（１９６９）　］　、］ｍ−クレゾールスルホンフタレ
イニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｃ１１
ｎ、　　Ｃｈｅｍ、、　　２９．１７１３（１９８３）
　］が知られている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
しかし、上記のｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミニドをＮＡＧａｓｅ　活性測定用基質
として用いる場合は、生成するｐ−ニトロフェノールを
測定する際の波長が約４００　ｎｍ　　付近であるため
、尿中の黄色物質によるブランク値の上昇という影響を
受け、測定精度が著しく低下する等の欠点を、また４−
メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニドもブランクの影響を受ｉ、更に蛍光光度計の
ような特殊な膜器が必要である等の欠点がある。さらに
、ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミニド及びｍ〜クレゾールスルホンフタレイニル−Ｎ
−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを用いる場合は、
酵素作用によって生成したアグリコンを比色定量する際
、反応液のｐＨを１０〜１１程度という高アルカリ性と
するため、酵素反応を停止させなければならないので、
酵素活性の測定を連続的に行なうことが著しく困難とな
る等の欠点を有している。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者等は、従来技術の欠点を改善するため研究な重
ねた結果、新規なＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン
誘導体を創製し、この化合物がＮＡＧａｓｅ　　活性の
測定用試薬として極めて有用であることを見出した。
本発明は、次式 （式中、Ｒは水素原子又はアシル基、Ｘは窒素原子又は
窒素のオキシドを意味する）で表わされるＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルフサミン誘導体である。
弐ＩＬ７）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルフサミン誘導体
としては、例えば下記の化合物が挙げられる。レゾルフ
ィニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｒ＝
Ｈ，Ｘ＝Ｎ］　、レザズリニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニド［Ｒ＝Ｈ，Ｘ＝Ｎ→０］、レゾルフィ
ニル−２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グル
フサミニド［Ｒ＝ＣＯＣＨ３，Ｘ＝Ｎ］　、レザズリニ
ル−２，３，４，６−テトラアセチルーβ−Ｄ−グルコ
サミニド［Ｒ＝ＣＯＣＨ３，Ｘ＝Ｎ−０］など。
式１ＯＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体は、
次式 （式中、Ｒはアシル基、Ｙはハロゲン原子を意味スる）
で表わされるハロゲノ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ン誘導体に、次式 （式中、Ｘ　は窒素原子又は窒素のオキシド、Ｚは水素
原子、有機アンモニウム基、又はアルカリ金属原子を意
味する）で表わされる化合物を作用させ、必要に応じて
脱０−アシル化することにより製造することができる。
化合物■は、例えば市販のＮ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミンにアセチルクロライドを作用させて製造するこ
とができるＣ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｒｅｐａｒａ
ｔｉｏｎｓ、　１０．１１８〜１２１　　（１９６３）
　］　ｏ化合物１の例としては、１−り一〇−１−デオ
キンー礼３゜４．６−テトラ７セチルーα−Ｄ−グルコ
サミン等が挙げられる。
化合物■は、市販品を用いてもよく、あるいは適宜の方
法で合成してもよい。化合物■の例としては、レゾルフ
ィン［７−ハイドａ　キシ−３）（−フェノキサジン−
３−オン］、レザズリン［７−ハイドロキシ−３Ｈ−フ
ェノキサジン−３−オフ１Ｏ−ｔ−＋シト］、及びそれ
らのす）　ｌ）ラム塩やトリエチルアミン塩等が挙げら
れる。その量は通常、化合物■の１〜１０倍モル当量、
好ましくは２〜５倍モル当量である。
溶媒としては、ケトン類例えばアセトン、メチルエチル
ケトン等、ニトリル類例えばアセトニトリル等、Ｉ・ロ
ゲン化炭化水素類例えばジクロロメタン、クロロホルム
、ジクロロエタン等、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルスルホキ
シド（ＤＭＳＯ）、ヘキサホスホラミド（ＨＭＰＡ　）
等が挙げられ、これらを組み合わせて用いてもよいが、
アセトニド、リルが特に好ましい。その量は通常は化合
物■の重量の５〜５００倍量、好ましくは２０〜２００
倍量である。
触媒としては、銀塩、例えばＡｇ２Ｏ、ＡｇＣｌ０４　
。
ＡｇＮ０３．　Ａｇ２ＣＯ３等、水銀塩、例えばＨｇＯ
。
Ｈｇ（ＣＮ　）　２等、カドミウム塩、例えばＣｄＣ０
３、三級アミン類、例えばトリエチルアミン、トリブチ
ルアミン等が挙げられ、これらを組み合わせて用いても
よ（・が、Ａｇ２Ｏが好ましい、その量は通常、化合物
■の１〜ｌＯ倍モル当量、好ましくは２〜５倍モル当量
である。
反応温度及び反応時間は化合物■、化合物り溶媒及び触
媒の種類によって異なるが、通常は２０〜６０°Ｃで１
〜６０時間継続して反応させる。
こうして得られたＲがアシル基である化合物夏に、塩基
を作用させて０−アシル基を脱離すると、Ｒが水素原子
である化合物！　（化合物１’）が得られる。塩基とし
ては、例えばＫＯＨ。
Ｋ　２ＣＯ３、ＮａＯＨ、ＮａＣ０３等のアルカリ金属
塩、例えばナトリウムメチラート、ナトリウムフェノラ
ート等のアルカリ金属のフェノラート、及びアンモニア
等が挙げられ、無水炭酸カリウムが特に好ましい。
Ｒが水素原子である化合物ｌは、ＮＡＧａｓｅ活性の測
定に用いることができる。
従って本発明は、次式 （式中、Ｘ　は窒素原子又は窒素のオ・キシドを意味す
る）で表わされるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン
誘導体及び緩衝剤を含有するＮＡＧａｓｅ活性の測定用
試薬である。
定量のための有利な系は１〜２０　ｍＭのＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミン誘導体及び２〜１００　ｍＭの
緩衝剤を含有する系である（ｐＨ３，５〜６．５）。緩
衝剤としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス−（
ヒドロキシメチル）−アミツメ）ン、ホウ酸塩、クエン
酸塩、ジメチルグルタル酸塩等が用いられる。また必要
に応じて溶解補助剤、安電化剤としてグリセリン、牛血
清アルブミン、トリトンＸ１００等、クラウンエーテル
類、シクロデキストリン類、グライコール類等を加えて
もよい。
本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した形で存在して
よく、薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の紙等に含
浸されていてもよい。本試薬を用いることにより、各種
の試料に含有されるＮＡＧａｓｅの活性を簡単な操作で
正確に、しかも高感度で測定することができる。
次に、本発明のＮＡＧａｓｅ　活性の測定法について説
明する。
まずＮＡＧａｓｅ　　を含む試料に、Ｎ−アセチル−β
−Ｄ−グルコサミン誘導体（１’）を１〜２０ｍＭ−１
好ましくは１〜５　ｍＭ程度加え、更に緩衝剤を加え、
３０〜６０°Ｃ５ｐＨ３，５〜６，５で３分以上、好ま
しくは５〜１２０分間酵素反応させる。生成するアグリ
コン（レゾルフィン類）を直接、分光光度計あるいは蛍
光光度計を用いて、連続的もしくは断続的に吸光度値を
測定し、あらかじめ測定したＮＡＧａｓｅ　原品の吸光
度値と対比させて、試料中のＮＡＧａｓｅ活性を算出す
る。
本発明に用いられるＮＡＧａｓｅ　　含有試料としては
、ＮＡＧａｓｅ　　を含有するものであれば何れを用い
てもよく、具体的には微生物の培養液、植物の抽出液、
動物の体液、尿、組織及びそれらの抽出液等が挙げられ
る。
また緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩
、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ホウ
酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタル酸塩等が挙げられ
る。その他、必要に応じて還元物質の影響を少なくする
ため、前処理や酸゛他剤の添加を行なう。
本発明の測定法によれば、試料に含まれるグルコース、
ビリルビン、ヘモグロビン等の影響を受けることなく、
簡易にＮＡＧａｓｅ　　活性を自動分析法、用手法、ド
ライ分析法等により精度よく測定することができる。
以下に、実施例を示して本発明の詳細な説明する。
〔実施例〕
実施例ル ゾルフイニル−２，３，４，６−テトラアセチルーβ−
Ｄ−グルコサミニドの製造 １−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラア
セチルーα−Ｄ−グルコサミン２．０　ｇ　（５，５ｍ
ｍｏｌ　）をアセトニトリル２５０コに溶解し、これに
レゾルフ４７３．５９　（１６，４ｍｍｏｌ）及び酸化
銀（Ａｇ２０　）　３．８１ｙ　（１６，４ｍｍｏｌ）
を加え、４０°Ｃで１０時間撹拌しながら反応させる。
次いで未反応のＡｇ２Ｏを濾別し、濾液のアセトニトリ
ルを留去したのち、シリカゲルクロマトグラフィにより
精製シ、クロ四ホルムーアセトニトリル混液（容ｆｆ比
　６：４）で溶出した区分をクロロホルム−ジエチルエ
ーテル混液から再結晶すると、レゾルフィニル−２，３
，４，６−テトラアセチルーβ−Ｄ　−グルコサミニド
が１２２１　ＴＲｇ（２，２５ｍｍｏｌ　　、　４１．
２％）得られる。
融点：２０８．０〜２１０．０°Ｃ（分解）紫外部・可
視部吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）　：吸収極大波長［λ
ｍａｘｌ　＝４５０　（ε＝　１９２００）　。
３７５．２４８　ｎｍ 赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）　　：　３４８０　（
ｓｈ）　。
３３００、１７４５．１６６０．１６０５．１５６５．
１５１０　ｃｍ−’核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨ
ｚ　）（ＤＭＳＯｄ６）　　：δ（ｐｐｍ） ８．０４　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝　８．８　Ｈｚ、　ＮＨ）
　、　７．７９　（ＬＨ，ｄＪ＝８．８　Ｈｚ）　、　
７．５３　（ＬＨ，ｄ、Ｊ　＝ｌＯ，ＯＨｚ＞　。
７．２０　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝２．４　）Ｉｚ）　、　７
．０７　（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ＝８．８　Ｈｚ、２．４　Ｈ
ｚ）　　、　　６．８０　（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ＝　１０．
０　Ｈｚ。
１．７　Ｈｚ）　　、　　６．２５　（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝
１．７　Ｈｚ）　　、　　５．５６（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝８
．８　Ｈｚ）　　、　　５．２５　（ＬＨ，ｂｒｔ、Ｊ
　　＝９．８Ｈｚ）　　、　　４．９５　（ＩＨ，ｂｒ
ｔ、Ｊ　　＝９．８　Ｈｚ）　　、　　４．００−４．
３０　（４Ｈ，ｍ）　　、　　２．０３　（３Ｈ，ｓ　
）　　、　　２．０１　（３Ｈ。
ｓ）　　、　　１．９６　（３Ｈ，ｓ）　　、　　１．
７９　（３Ｈ，ｓ）実施例２ レゾルフィニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ドの製造 レゾルフィニル− β−Ｄ−グルコサミニド４３４　ｍｇ　（０．８　ｍｍ
ｏｌ　）をメタノール（４０ｍ／）−アセトニトリル（
２０屑ｌ）混液に溶解し、これに無水炭酸カリウム２８
肩９（０．２　ｍｍｏｌ　）を加え、室温で１時間撹拌
しながら反応させる。次いで５°Ｃで１時間放置し、析
出した結晶を濾取する。得られた結晶をメタノールから
再結晶すると、レゾルフィニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニドが３３３　ｍｙ　（　０．０８　ｍｍ
ｏｌ　、　１００．０％）得られる。
融点：　１９５．０〜１９８．０°Ｃ（分解）紫外部・
可視部吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）　：吸収極大波長［
λｍａｘ］　＝　４５５　（ε＝　１８５００）　。
３８２、３４９　ｎｍ 赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）　　：　３３８０　（
ｓｈ）　。
３２５０、　１６４０　（ｓｈ）　、　１６００，　１
５６０，　１５０５　ｃｔｇ−’咳磁気共鳴スペクトル
（　２００　ＭＨｚ　）（　ＤＭＳＯ−ｄ　ａ　）　　
：δ（ｐｐｍ）７、７６　（　２Ｈ，ｄ，Ｊ　＝　８．
８　Ｈｚ）　、　７．５２　（　ＬＨ，ｄ，Ｊ　＝１０
、０　Ｈｚ）　、　７．０８　（ＬＨ，ｄ，Ｊ　＝２．
４　Ｈｚ）　、　７．０２（ＩＨ，ｄｄ，Ｊ＝８．８　
Ｈｚ，２．４　Ｈｚ）　、　６．７９　（ＬＨ，ｄｄ，
Ｊ＝ＩＯ．Ｏ　Ｈｚ，２．０　Ｈｚ）　、　６．２６　
（ＩＨ，ｄ，Ｊ　＝２．０Ｈｚ）　、　５．２０　（Ｉ
Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３　Ｈｚ）　、　５．０３　（２Ｈ。
ｂｒｔ，Ｊ　＝５．９　Ｈｚ）　、　４．５５　（ＬＨ
，ｂｒｔ，Ｊ　＝５．６Ｈｚ）　、　３．１０−３．８
０　（６Ｈ，ｍ）　、　１．８２　（３Ｈ，ｓ）実施例
３ レザズリニル−２．３，４．６−テトラアセチルーβ−
Ｄ−グルコサミニドの製造 ｌ−クロロ−１−デオキシ−２．　３，　４．　６−テ
トラアセチルーα−Ｄ−グルコサミン１．５　ｇ（４．
１ｍｍｏｌ　）をアセトニトリル２００　ｍｌに溶解し
、これにレザズリン２．８　、ＳＦ　（１２，２ｍｍｏ
ｌ　）及び酸化銀（Ａｇ２０　）　２．８　ｇ　（１２
，１ｍｍｏｌ　）を加え、室温で３０時間撹拌しながら
反応させる。次（・で未反応のＡｇ２Ｏを濾別し、濾液
のアセトニトリルを留去したのち、シリカゲルクロマト
グラフィにより精製し、クロロホルム−アセトニトリル
混液（容積比６：４）で溶出した区分をクロロホルム−
ジエチルエーテル混液から再結晶すると、レザズリニル
−２，３，４，６−テトラアセチルーβ−Ｄ−ゲルコサ
ミニ下が８４０　ｍｇ　（１，５１ｍｍｏｌ　、　３６
．７％）得られる。
融点：２２０．０〜２２１．０°Ｃ（分解）紫外部・可
視部吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）　　：吸収極大波長［
λｍａｘコ＝５２０（ε＝　１４６００）　。
４８９　（ε＝　１４６００）　、　３７５　（ｓｈ）
　、　３５８．３４８゜７０　ｎｍ 赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）　　：　３４８０　（
ｓｈ）　。
３３２０、１？４０．１６６０．１６３０．１６００．
１５４０　ｃｍ−’核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨ
ｚ　）　　（ＣＤＣｌ　３）　：δ（ｐｐｍ） ８．１３　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝　１０．０　　Ｈｚ）　　
、　　８．０１　（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝１０．０　Ｈｚ）　
　、　　７．０３　（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝２．０　Ｈｚ）　
　、　　７．０１（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ＝ｌＯ，ＯＨｚ、２
．０　Ｈｚ）　　、　６．７４　（ＬＨ，ｄｄ。
Ｊ＝１０．０　出、２．０　士）　　、　　６．２２　
（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝２．０Ｈｚ）　　、　６．１５　（Ｌ
Ｈ，ｄ、Ｊ＝８．１　Ｈｚ　ＮＨ）　　、　　５．５２
（ＬＨ，ｄ、Ｊ”８．３　Ｈｚ）　　、　　５．４９　
（ＬＨ，ｂｒｔ、Ｊ　＝　１０．０Ｈｚ）　　、　５．
１４　（ＬＨ，ｂｒｔ、Ｊ　＝９．８　Ｈｚ）　　、　
　４．１５−４．３５　（３Ｈ，ｍ）　　、　３．９５
−４．０５　（ＩＨ，ｍ）　　、　２．１０（３Ｈ，ｓ
　）　　、　２．０８　（３Ｈ，ｓ）　　、　２．０７
　（３Ｈ，ｓ）　　。
１．９７　（３Ｈ，ｓ　） 実施例４ レザズリニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
の製造 レザズリニル−２，３，４，６−テトラアセチルーβ−
Ｄ−グルコサミニド４４７　鰐ｇ（０，８ｍｍｏｌ　）
をメタノール（４０ａｔ／）−アセトニトリル（２０ｍ
／）混液に溶解し、これに無水炭酸カリウム２８　ｊｌ
ｇ（０，２ｍｍｏｌ　）を加え、室温で１時間撹拌しな
がら反応させる。次いで５°Ｃで１時間放置し、析出し
た結晶を濾取する。得られた結晶をメタノールから再結
晶スると、レザズリニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニドが１５４　ｍｇ　（０，３６ｍｍｏｌ、　４
４．５％）得られる。
融点：１５０．５〜１５３．０℃（分解）紫外部・可視
部吸収スペクトル（ＭｅＯＨ）　　：吸収極大波長［λ
ｍａｘ］　＝　５２２　（ε＝　１４４００）　。
４９０　（ｔ　＝　１４４００）　、　３７９　（ｓｈ
）　、　３５９．３４９゜２７０　　ｎｍ 赤外線吸収スペクトル（）Ｇ３ｒ）　　：　３３８０　
（ｓｈ）　。
３２５０、１６５０　（ｓｈ　）　、　１６３０．１６
００．１５４５゜１４７０ｃｍ−’ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ　）（ＤＭＳＯｄ
ａ）　　：δ（ｐｐｍ） ８．０７　（ＬＨ，ｄ、Ｊ　＝９．３　Ｈｚ）　、　７
．９８　（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝１０．０　Ｈｚ）　、　７．
７７　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝８．８　Ｈｚ、ＮＨ）　。
７．１７　（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝２．０　Ｈｚ）　、　７．
０４　（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ＝９．３　Ｈｚ、２．０　Ｈｚ
）　、　６．６７　（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ＝１０．ＯＨｚ、
１．７Ｈｚ＞　、　６．１５　（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝１．７
　Ｈｚ）　、　５．２３（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝８．８　Ｈｚ
）　、　５．０３　（２Ｈ，ｂｒｔ、Ｊ　＝５．９Ｈｚ
）　、　４．５４　（ＩＨ，ｂｒｔ、Ｊ　＝４．９　Ｈ
ｚ）　、　３．１０−３．８０　（６Ｈ，ｍ）　　、　
　１．８２　（３Ｈ，ｓ　）実施例５ Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測定
法Ａ　（ｅｎｄｏ−ｐｏｉｎｔ　法）（１）基質液の調
整 レゾルフィニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ド１　ｍｍｏｌをとりＮ　５０　ｍＭ　クエン酸緩衝液
（ｐＨ＝５．０）を加えて全量を１７１として基質液と
する。
（２）標品ＮＡＧａｓｅ液の調整 市販の酵素活性既知のＮＡＧａｓｅ液を０．０５％牛血
清アルブミン含有５０　ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ＝
５．０）を用いて数種類の濃度に希釈して標品ＮＡＧａ
ｓｅ液とする。
（３）試料液の調整 ＮＡＧａｓｅ活性測定用試料１０すを精密に秤量し、０
．０５％牛血清アルブミン含有５０　ｍＭクエン酸緩衝
液（ｐＨ＝５．０）に加えて全量を１００　ｍｌとして
試料液とする。
（４）検量線の作製 基質液１＃Ｉ／ンこ各濃度の標品ＮＡＧａｓｅ液０．５
ｓ＋／を加え、３７°Ｃで１５分間加温する◇これに２
００　ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液２　ｍｌを加え、直ち
に５７０ｎｍ　　における吸光度を測定する。このとき
の原品ＮＡＧａｓｅ　液活性と吸光度の関係により検量
線を作成する。
シグマ社製ＮＡＧａｓｅ　　（２８，６ｕ　／　０．５
　ｍｌ　）を使用した場合、検量線の式はＵ＝６９．４
　Ｘ　Ａ　−０，７７７（Ｕ：酵素活性ｕ／Ｊ、Ａ：吸
光度）となる。そのグラフを第１図に示す。
（５）試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定基質液１　ｍ
ｌに試料液０．５屑／を加え、３７°Ｃで１５分間加温
する。これに２００　ｍＭ炭酸す）１７ウム水溶液２　
ｍｌを加え、直ちに５７０　ｎｍ　　における吸光度を
測定する。この吸光度の値と（４）で作成した検量線か
ら算出して試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定を行なう
ことができる。
なお、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範囲（１４
，３〜１４３　ｕ　／　ｌ　）を超えた場合は０．０５
％牛血清アルブミン含有５０　ｍＭ　クエン酸緩衝液（
ｐＨ＝５．０）を用いて相当する倍数の希釈を行なった
のち、再測定を行なう。
実施例６ Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性の測定
法Ｂ　（ｒａｔｅ−ａｓｓａｙ法）（１）基質液の調整 レザズリニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
ｌ　ｍｍｏｌをとり、５０　ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝５．０）を加えて全量をＩＥとして基質液とする。
（２）標品ＮＡＧａｓｅ液の調整 市販の酵素活性既知のＮＡＧａｓｅ液を０．０５％牛血
清アルブミン含有５０　ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ＝
５．０）を用いて数種類の濃度に希釈して標品ＮＡＧａ
ｓｅ液とする。
（３）試料液の調整 ＮＡＧａＳｅ活性測定用試料ＩＱｇを精密に秤量し、０
．０５％牛血清アルブミン含有５０　ｍＭクエン酸緩衝
液（ｐＨ＝５．０）に加えて全量を１００　ｍｌとじて
試料液とする。
（４）検量線の作製 基質液２　ｍｌを３７°Ｃで３分間加温したのち、各濃
度の標品ＮＡＧａｓｅ液１　ｍｌを加え、３７゛Ｃで３
分間加温後からの２分間の６００　ｎｍ　　における吸
光度の変化量の関係により検量線を作成する。
シグマ社製ＮＡＧａｓｅ　　（２８，６ｕ　／　０．５
　ｍｌ　）を使用した場合、検量線の式は Ｕ＝１．３３Ｘ　　（ΔＡ）　Ｘ　１０３（Ｕ：酵素活
性ｕ　／　ｌ　、ΔＡ：吸光度変化量／分）となる。そ
のグラフを第２図に示す。
（５）試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定基質液２ＩＩ
Ｉｔを３７°Ｃで３分間加温したのち、試料液１　ｍｌ
を加え、３７°Ｃで３分間加温後からの２分間の６００
　ｎｍ　　における吸光度の変化量を測定する。この吸
光度変化量と（４）で作成した検量線から算出して試料
液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定を行なうことができる。
なお、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範囲（１４
，３〜１４３　ｕ　／　ｌ　）を超えた場合は０．０５
％牛血清アルブミン含有５０　ｍＭ　クエン酸緩衝液（
ｐＨ＝５．０）を用いて相当する倍数の希釈を行なった
のち、再測定を行なう。
実施例７ 測定用試薬Ａ （１）試薬の組成 含有物　　　　　　　　　濃度 ルーβ−Ｄ−グルフサミニド クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）　　５０．０　ｍＭ精
製水 試薬Ｂ：炭酸ナトリウム　　　　　　　２００　　ｍＭ
精製水 試薬Ｃ：牛血清アルブミン　　　　　　０．０５％クエ
ン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）　　５０．０　ｍＭ精製水 （２）測定法 まず、測定用試料１０＃Ｉｇを精密に秤量し、試薬Ｃを
加えて全量を１００　ｍｌとし、これを試料液とする。
次いで試薬Ａｉｍ／に試料液を０．５屑／加え、３７°
Ｃで１５分間加温する。これに試薬Ｂを２ゴ加え、直ち
に５７０　ｎｍ　　における吸光度を測定する。
この吸光度の値とあらかじめ作成した検量線から算出し
て試料液中のＮＡＧａｓｅ　活性の測定を行なうことが
できる。
なお、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範囲を超え
た場合は試薬Ｃを用いて相当する倍数の希釈を行なった
のち、再測定を行なう。
実施例８ 測定用試薬Ｂ ｆ＋）試薬の組成 含有物　　　　　　　　　濃度 一β−Ｄ−グルコサミニド クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）　　５０．０　ｍＭ精
製水 試薬Ｂ：牛血清アルブミン　　　　　　０．０５％クエ
ン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）　　５０．０　ｍＭ精製水 （２）測定法 まず、測定用試料ｌＯｓ＋ｇを精密に秤量し、試薬Ｂを
加えて全量を１００−とし、これを試料液とする。次い
で試薬Ａ２ｍ／を３７°Ｃで３分間加温したのち、試料
液Ｉ　Ｉ！／を加え、３７°Ｃで３分間加温後からの２
分間の６００　ｎｍ　　における吸光度の変化量を測定
する。この吸光度変化量とあらかじめ作成した検量線か
ら算出して試料液中のＮＡＧａｓｅ活性の測定を行なう
ことができる。
なお、試料液の酵素活性の値が検量線の測定範囲を超え
た場合は試薬Ｂを用いて相当する倍数の希釈を行なった
のち、再測定を行なう。
【図面の簡単な説明】
第１図は実施例５におけるＮＡＧａｓｅ活性の測定と生
成する色素の波長５７０　ｎｍ　　における吸光度の関
係を示すグラフ、第２図は実施例６におけるＮＡＧａｓ
ｅ活性の測定と生成する色素の波長６００　ｎｍにおけ
る吸光度の変化量の関係を示すグラフであって、図中の
直線はそれぞれの検量線を示す。 特許出願人　　キッコーマン株式会社 宵′Ｌ図 ０反先度 嘉２０ 吸光度の変化量

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒは水素原子又はアシル基、Ｘは窒素原子又は
    窒素のオキシドを意味する）で表わされるＮ−アセチル
    −β−Ｄ−グルコサミン誘導体。 ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｒはアシル基、Ｙはハロゲン原子を意味する）
    で表わされるハロゲノ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
    ン誘導体に、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（III） （式中、Ｘは窒素原子又は窒素のオキシド、Ｚは水素原
    子、有機アンモニウム基、又はアルカリ金属原子を意味
    する）で表わされるレゾルフィン類を作用させ、必要に
    応じて脱Ｏ−アシル化することを特徴とする、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒは水素原子又はアシル基、Ｘは窒素原子又は
    窒素のオキシドを意味する）で表わされるＮ−アセチル
    −β−Ｄ−グルコサミン誘導体の製法。 （３）次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ′） （式中、Ｘは窒素原子又は窒素のオキシドを意味する）
    で表わされるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導
    体を有効成分とするＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
    ニダーゼ活性測定用試薬。 （４）Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ含有
    試料に、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ′） （式中、Ｘは窒素原子又は窒素のオキシドを意味する）
    で表わされるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導
    体を加え、酵素反応によって生成するアグリコン（レゾ
    ルフィン類）を直接、分光光度計で比色定量するか、あ
    るいは蛍光光度計で蛍光定量することにより、測定する
    ことを特徴とする、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
    ニダーゼ活性の測定法。
JP63033994A 1988-02-18 1988-02-18 新規Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン誘導体、その製法及びＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性測定用試薬への利用 Pending JPH01211595A (ja)

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