JPH0341100A - 固定化抗体製造の改良法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分封〕 本発明な一定１じ抗体表造りα良欲に関し、こ（／、ｌ
餘、抗体ｃ／）反水化物知域Ｑ敗化にふる変性に工って
オリゴ糖を有抗体の佃城特共的扱合体が形成される。

〔従来り技術〕

未公開Ｏ西ドイツ特肝出ｈＭＰ３７　３８　７２１．９
号明鯛薔には抗体の炭水化物知城Ｑ斌性に↓つでマトリ
ックスポリマーにへ有績合している固定化さｔＬ７ｃ抗
体が記載されている。抗体との結合は、鹸化に工って変
性された炭水化物鴇域甲０少くとも１１１Ｉ！ｌｌｏア
ルデヒド基反ひエポキシ丞冨有マトリックスポリマーＱ
少くとも１１（５）リエホキシ官能基と藺１＞　４４合
反応に↓るが、少くとも３個の基及び−万の木端部には
アルデヒド官能基との縮合に好適な基反ひ他の木端部に
はエポキシ基と共有結合反応する＆Ｌ−ｆするスペーサ
ー　（ａｐａｃｅｒ　）力・らなる２゛目能性夙条を用
いることにより行われる。たとえ１道の凶ドイツ時ｒｆ
出細明ａ沓に記載り技術に１つて非常に膏月な製品が得
られるにしても、これＯ笑施汰ｏ改良に対しては依然と
して相当の脚上が工ぜられている。νＩＩえは抗体−奴
Ｏ周知り軸缶性七４嵐するｚらば、操作時間の短縮友ひ
方法の部系化自体が全成果に幻して必ず有利に作用する
に相異ないことは直ちに理解とれる。従って本発明の方
法は、ドイツ特許出ＩＪＡ第Ｐ３７５Ｂ　７２１号明細
簀記載Ｏ原理に凸づ〈改良舐として理解される。この新
規Ｏ改良法は、旭ヨウ：Ａ醜塩七用いて酸化さｎ九オリ
ゴ循貧有抗体か１谷器−反応でアクピン葭りヒドラゾド
で食性され７こポリマー坦体ＡＤＨ−ＰＣに酸化結合す
ることｔ誌錠にしている。上述り西ドイツ％肝出細にひ
いて有利に使用とれている多段１１ｕ法、すなわ１ｆ）
１す鳩ヨウ素敞塩によって抗体？ｆ”ｌｌＫ化し、仄い
で過料の試薬ｔレリえばエチレングリコール処理に工っ
て除去し、その後ゲル濾過にＬり臥系朔に蛛去し、繊細
し、取扱に該抗体をヒドラシトで俊包されたポリマー坦
体と反応させる方法とは対照的に、本発明の新規方法に
９いて１よ、該抗体にアルデヒド段階迄酸化し、アンピ
ン敵７ヒドラゾドで及性とれたポリマー坦体ＡＬＩＨ−
ＰＯと共に１ステツプ工程でインキュベートする。

〔発明が解決しようとする銖馳〕 従って、本発明は、Ｍ化型で存在する抗体でアゾピン顛
ゾヒドラゾドで変性とれ７ｃ相体ＡＤＨ−ＰＯと縮合さ
ぜることによって固定化トｆ′Ｌπオリゴ抛貧有抗体七
製造する方法に関し、七の除、抗体上、過ヨウ素酵塩（
抗体の炭水化ｗ仙域Ｏ範囲にｐけるアルデヒド１で酸化
するのに十分な量で）ｋひアゾピン敗シヒドラゾドで変
江葛れたポリマーの坦体＃科七口時に貧有する水性培体
中で１容器法でインキュベートシ、これに工って袈換で
ぜ、引続ぎ周知り方法で後処理ｔおこなう。

このようにして、間化に工って一度生じたアルデヒド基
が指体のＡＩ）Ｈ−Ｐ　Ｃ中の７７ビン麺７ヒドラゾド
ｉ　（ＡＤＨ）と直償反応するので、酸化性の共有結合
固定が達成とれる。

〔銖題に解決するための手段〕

こＯ”１容器−反に６　’のために、第１に、ジェミナ
ル（ｇｅｍｉｎａｌ　）　％　％ぺ水敗基忙符しないポ
リマー担体が使用されることが条件である。

マトリックスの材料が炭水化物上に、例えばアガロース
又はセファロース中に３けると同極に存在する場合には
、該ポリマーも過ヨウ素飲准化に適当でありうる。従っ
て本発明リマトリックスボリマー（ＭＰ）は、有利にア
クリルアミドもしくはメタクリルアミド友ひグリシゾル
アクリレートもしくは、グリシゾルメタクリレートから
なり、有利にはパール状の粒子からなる架偏された共重
合体で６；ｂｏこりようなマトリックス０１合体は、西
ドイツ時計（ＩＪＩ−０）第２７　２２　７５１号明細
膏もしくは木幽脣鼾（ＵＳ−Ａ）第４　１９０　７１３
号明細書並びに米国特許（ＵＳ−Ａ）第４５１１６９４
号明細書□記載葛れている。こりバール状粒子は通常５
〜１０００μｍ、ｅに３０〜１０００μｍ　ＩＪ直直径
持持かつ内赴（空洞球粒）紫有する。反応させることの
できるマトリックスＭ合体（ＭＰ）中Ｏグリシゾル基Ｏ
宮’４４童としては、乾燥相体物真１■歯９０．８〜２
．５μｍｏｌの値が挙げられる。既知の型のマトリック
ス重合体ＭＰとして代表される布敷のマトリックス重合
体（オイペルギットＣ／Ｒ６ｈｍ社のＢＵＰＫＲＧＩＴ
Ｏ）にに関する他０特性データーは欠の表から得られる
： 特性データー　　　　　　　　　次元 平均粒子寸法：　　　　　　　１４０〜１８０μｍ孔径
：　　　　　　　　　　　　４０ｎｍ結合活性表面積（ エポキシを有量： 吸水性： 密度−ａ、２ｕ　； 嵩＠度： 結合（標準条件〕 人アルプミン二 人ＩｇＧ　： 水に対する膨潤度 Ｂｉｎａｕｎｇａａｋｔｉｖｅ　ｏｂｅｒｆｌｍｏｈｅ
　　：１８０ｍ−力（乾燥） ８００１０００　ｍ　ｍｏ１／、９←乾燥）２．３ｗｌ
　＆　（乾燥） １．２０ ０．３４．８／　／　ａｔ ４８ｍ９／＆（湿ン ６４η／（（湿す １　　：　　１，４ １　ａｄ＜１！ｚ、燥）−１，４ａｚ（温浴Ｍ性（氷、
緩衝減反び有機陪媒中〕：不溶剛比住＝　　　　　　　
　　　　　　３００バール電子鵡微鋭にＬり直径０．１
〜２．５１ｉ１（１０００〜２５０００ＡＪの導管及び
腔所γ有するバールのマクロ孔性構造が紹められ、従っ
て１０〜１００Ａの大きさの酵素−もしくは基質分子が
マクロ孔性マトリックス全内部に到達することができる
。

ポリマーの坦体ｖｔＪ質ＡＤＨ−ＰＣの数造（メタンア
クリルアミド及びグリシゾル（メタ）アクリレートから
虫取されにマトリックス−東合体ＣＭＰ）、有利にはパ
ール状０粒子ｐうらなｐ（上記ＩＪＭＬ　特にレーム社
細品０オイペルギットＯ（ｌｕｐｅｒｇｉｔ　、’　Ｒ
６ｈｍ　Ｇｍｂ）Ｉ　。

わａｒ肝ｔａｄｔ　）　ｋ有利にはアルカリ性仙城０通
歯な緩衝液、ｆｙＩＪえは蜘酸駿衝液中、−８，８で一
定時間、例えば１６±３時間室龜で２笛能性の夙桑、％
にアゾピン敏ンとドランド七用いて鉛塩する。有利に位
、２笛能性式桑ｔボＶマー坦体Ｍ　Ｐ　％舟に［Ｆ］オ
イベルギットｏり乾燥重重１ｇ当９０．１〜１０　ｍｏ
ｌの童で、殊に１ｆｉ、燥重量１ｇ当り２笛能性試薬１
μｍｏｌ’ｚ使用する。食性されたマ）　ＩＪツクスロ
合体ＡＤＨ−Ｐ　０七燐酸標準軟衝液でｆｃ浄すること
が有利である、有利には緩衝液（例えば０．１　Ｍ姉域
緩衝液）　−す、５で平衡させて比較的低置で、例えは
４度０でＩ！ｆＪ１１．丁ゐことが可能である。

〔芙施例〕

本発明の範囲内にふ・いては、胸知０如く、炭水化物糸
七有し、又化学的変性、止しくは通ヨウ素敵敵化に対し
て十分に安定であり、かっこｔ’ＬＫつづく固定もうけ
やすいすべてり抗体が基本的に好適である。目安として
は抗体における炭水化物約６％の含意から出発できる。

ル嶽りの中心にモノクローナル抗体が存在する。モノク
ローナル抗体０表＠は十分に知られている（　Ｋｉｒｋ
−Ｑｔｈｍｅｒ＋１ｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｏ
ｈｅｍｉｃａｌＴｅＯｈｎＯＩＯｇ７．３　ｒｄ、１４
．Ｖｏｌ、　２３　Ａ　Ｊ、Ｗｉｌｅｙ（１９８３）、
ｐｐ、　　６５７〜６４３　　；　Ｄ、Ｂａｒｏｕ。

Ｕ、Ｈａｒｔ’１ａｕｂ　、Ｈｕｍａｎｅ　ＭＯｌｅｋ
ｕｌａｒｅ　Ａｕｔｉｋ６ｒｐｅｒ（ヒト抗体分子）、
Ｇｕｓｔａｖ　Ｐｉａｃｈｅｒ　Ｖａｒｌ、ａＢ＋Ｓｔ
ｕｔｔｇａｒｔ　　、Ｎｅｗ　ＹＯｒｋ　１９８７　）
、ｌ。

こ０除以下の如くそれぞれ実施することができる：例え
ば捌々のｎＪＡ法、例えば仇敵アンモニウム沈澱、イオ
ン交換クロマトグラフィー友ひ／又はアフィニティー４
０マドグラフイーによって和装さｆＬ７ｃモノクローナ
ル抗体ｔ１有利カルボキシペプテダーゼー抗体（ＯＰＡ
　９　）　ｕｚ本発明法の応用に非宮に好適なことが立
証されている。Ｍ氷液七硫酸アンモニウム沈澱挾作法に
用いて部分的にｎ製する（５０優飽相浴液、４℃で１６
時間ンのが有利である。七の後−７，４の１０倍容址Ｑ
標部−酸緩伽液（ＰＢＢ　）中に入れ４℃で１６時間Ｆ
Ｂ８　Ｋ対してＭｉｔｒ４ぐる。

若干の９１験に除して、匈（駿アンモニウム処理によっ
て軸装とｆｉた抗体ｔ１固足化とれに抗原に有するオイ
ペルギノトー〇カラムで史に（ｇ釦した。

１容器−＠　（１ｉｎｔｏｐｆ−Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ　
）抗体？！−固定化Ｔるための１容器法は進例前記のポ
リマー坦体ｐ、ｖＨ−ａｈび抗体υ使用のもとて実施す
ることができる。従来の技術本革にかけると同嫌に比較
的低い−、有利にａ５，５職に１ける操作によって、抗
体ｏＰ３部朱橋０危険性が減少もしくは排除ぐれる。有
利な方法は鳩ヨウ酸ナトνクム（基本ＥＩ９ＶＣ，は：
　０．Ｉ　Ｍ　）　ｋ適当７’ｘ、不活性駿衝浴液中で
、有利には、−城５．５で、例えばり、１Ｍ＠ｅｉｋ縁
１ｌｌＪ液中で使用Ｔることにめる。該変装は、有利に
は比較的低置でＶすえば０〜５℃、有利には４℃でかつ
暗所で行なう。磁化は、例えは比較的少量のエチレング
リコールＱ）ｉｌＡ加にＬつで停止することができる。

こり万＠は、例えば抗カルボキシペプチダーゼー抗体Ｃ
ＯＰＡ　９　）の使用をもとにして評細に説明’ｇｎる
＊　ｍｗ　ＰＤＨ−ＰＯＫ対するＯＰＡ　９−抗体Ｑ結
合は、種々の磯度υ過ヨウ素叡塩を使用し、かつ反応時
間２色々変えて検討した。１つの典型的実験例ではモノ
クローナル抗体２５μｇｔ有する坦体ＡＪ）Ｈ−ＰＣと
してのＡＤＩ（によって変性とれ次オイペルイットＯの
５１１’９　ｋモノクローナル抗体２５μＩｌ＆び過ヨ
ウ素酸ナトリウム１〜１０　ｍｎ　（最Ｊ’ｌＪｔ度〕
ｖｐ８５．５の０，１Ｍナトリウム級備液中で混合する
。この混合物上４℃で１０〜１２０分、暗所で攪拌する
。本反応終了後に上澄み七分鵡し上澄みり抗体の含有量
をａ））１！１Ｊ５Ａ　ＭＯｒｃＯｔ、ｅ　ｋ用いてか
つｂ）蛋白質定ｌｉｉによって測定する。

坦体材料上様＊ｇ４酸稜衝液ＥＢＢで十分に洗浄後結合
抗体υ？Ｉｉ性會酔索測定ｈｒ用いて測定する。

坦体ＡＤＨ−Ｐ○に一定された抗体り抗原結合活性坦体
物負ＡカＨ−ＰＯ、例えはＡＤＨで変性遜れたオイベル
ぞットＣＶｃ−固定化された抗体を、例えば抗体５−２
５μ９を有する坦体物置１−５ｎツＯパッチ中で過動の
抗原、例えは机−力ルボキシペプテダーゼ（Ｇ！ＰＡ　
）−抗体又は抗−西洋ワサビペルオキ７ダーゼ（ＨＲＰ
　）−抗体（結合抗体１モル当り抗原２モル以上）ｔ１
時間室温でインキュベートする。次に非結合抗Ｍｋ十分
にＰＢＢで洗浄することによって除く。結合した抗原分
は、酵素測定法□よって次のように確關する。

ＯＰＡ活性の測定 オイペルギット〇−抗体−抗原一複合体（１−ｓｙ；４
−２０μＪ）ｋヒラグリル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｎ
ａ０Ａｆ　ｏ、ｂモル２有ｐＢｓｃｐｑ）１０！ｌＬＭ
溶液５０μｌンと温合し、全容上〇、５ｍｏｘのＮａＯ
＃　ｔ　Ｎ　ＰＢＢで１００μＡに光重。該混合物ｋｍ
温で振盪して１０分間インキュベートする。インキュベ
ート時間終了後に、反応醜合物の上澄み試料（１０〜５
０μ１）ｆＢＬ工８Ａのミクロ滴定プレートＯウェル中
に入れ、以下の如くニンヒドリン試薬〔メチルセロソル
ブ中の（Ｍｅｔｈｙｌｏｅｌｌｏｒｏｌｖｅ　）ニンヒ
ドリン３に童嘩〕と反応とぜる。

各試料に、新装ニンヒドリン試薬１００μｌ及び新８０
．２Ｍ−シアン化ナトリクム／３．８Ｍ蝿酸ナトリウム
緩衝浴ｆｉ（ｐＨ５，３）５０μ／に加える。こ０混合
物を２０分間９５℃に２１１１熱する。仄いで、ｉ工８
Ａ−リーダ−−（Ｒｅａｄｅｒ　）で５００ｎｍＫ＄−
ける青色発色の比色定ｋｋ行う。

発色と酵素含有菫間の相関閃係鷺２檜類の較正曲嶽を用
いて求める： ＋）ａ知友のフェニルアラニンリニンヒドリンにぶる測
定値を使用する。

−既知量ＯＯＩ索カルボキシペ１テダーゼＯ活性測定よ
り求める。

オイベルギットＣ−抗体〜仇涼−懐合体（０，１〜２．
０ｎｆＩ）ｋオルトフエニレ７ゾアくン試薬（過酸化水
素０．０８　Ｍ量％含有する５０ｍＭクエン階ナトリウ
ムｕ＆Ｗ（ｐＥ（５，０）　Ｉ　ａｔ中（７Ｊオルトフ
エニレ７ゾアミン２ＪＩ＋９）１−と温合する。１分後
に、該反応上５　Ｎ　−ＨＣＩ　０．５鷹ＩＯ跣加によ
ってり止する。この反応からの上直み２００μＪ′Ｉｔ
肌工８Ａ−マイクロプレートに移す。仄いて４０２　ｎ
ｍにかける発色ｔｙ）　＠さ七ＥＬ工けＡ−リーダーを
用い４　Ｄ　５　ｎｍでの！＆九度′ｔ−標準グラフを
参照することに１つて測定する。

既知ｆ；１ｋｌＪ西洋ワサビ西洋ワサビペルオキマメら
ｎた／標準曲線で用いて、久料中り発色とそＯ酵素含有
量との間Ｑ相関関係を褥ることか可能である。

本発明によって一定さｎた抗体の兜投馳の出１ｊ宏 本発明によって固定化さｆｔ７ｃ抗体の粕合舵に１抗原
、酵素例えは、特に抗体に結合する恍−カルポキシペプ
テダーゼ（ＯＰＡ　）　Ｉｉ測測定Ｌつて足にされる。

この目釣りために、しＵえは固定化されたモノクローナ
ル抗体が権々に負荷されたポリマー坦体物質ＡＤＨ−Ｐ
Ｏｋ夫々１００η宛入れた試験官に、ＯＰＡ七、得意に
ＰＢＢ中に加える。

マトリックスポリマーＯ抗体に珀合したＯＰＡ分’に久
りＬうにして測定し７ｃ： α）　　ＢＲＡＤＦＱＲＤテストに用いて大々の蛋白質
ま荷ｉｏ相異の測定及び最初の浴ａ、＆び最後に決９０
浴柩に存する酵素活性によって、β）　　ＡＤＨ−ＰＯ
坦体バールに内定化とれた酵素０＃索活性０測定により
　（Ｃ！ＰＡにかいては例えはニンヒドリン洗上用いて
）。

坦体に粘合した綿糸部分にインキュベーション後に−４
１０，５の炭酸ナトＩＪウム敏術欣で浴出した。−鯛竪
後に浴出された師糸、例えば０ＰＡＱ活性を測定子ゐ。

みグ素活性の測定は、＃索活注ｔそこな３丁ない抗体が
存在する丁べてのクリにひいて有効でめる。

酸化によって変性されＡＤＨ−ＰＣ−坦体パールに一定
纏れた抗体は、そＱ酔索、倒えばＯＰＡυ紹合ｖ′！′
ｃめＱ完全な免役学的活性を保狩していることが実証さ
れている。

モノクローナル抗体対ＣＰＡのモル比υ続祭埴は２：１
とされている。

丁でに記載Ｑ如く、本発明Ｑ思想はＲも普遍的なＩ＠、
味でオリゴ糖苫再抗体υ時共的泡合体鵠に１で及ぶ。

殊に、例えば欠の柚類の抗原に対するモノクローナル抗
体が挙げられる： 抗ＩＱ　Ｑ）分類　　　　　　抗　　原剣劇　　　破傷
風−トキソイド（Ｔｅｔａｎｕｓ−’ｒｏｘｏ土ｄ　） ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　）インクルエ
／デタイプｂ多楯類 ンフテリアートキシン クラミゾア・トラコマテス（Ｏｈ：Ｌａｍ１−ｄｉａ　
ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓノ ミコバクテリクム・ｖ　７’　ｖ （ＭｙＣＯｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｅｐｒａｅ　　）Ｉ
Ｊ　ホ多糖／エンドトキシン プノイモコッヶン（Ｐｎｅｕｍｏｋｏｋｋｓｎ　）プソ
イドモナス・アエルギノ廿 （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）υ
１＜曳匂ＬＰＳ ７ンイドモナス・アエルギノサリエ ストレグトコッケン（ｑｔｒｅｐｔｏｋｏｋｋｅｎ）ウ
ィルス 自家免役 ９グルー１Ａの炭水化物 Ｘ３１インフルエンデウイルス核蛋 白質 はしか−ウィルス 単純ヘルペスウィルス砧蛋白質り はしか−ウイルスーヌタレオキャ７ シド シトメガローウィルス（Ｚｙｔｏｍｅｇａｌｉｅツイン
フルエンｆＡ−ウ、イルス玩博９ 風疹−ウイルスー抗原 ＴＬＶＩ バリゼラーゾスクーウイルス （Ｖａｒｉｚｅｌｙｌａ−ｚｏθｔｅｒ〕ＶｓＡｇ ２不知ＩＪＮＡ ランゲルハンス島細胞（糖尿病ン Ｎ症勧無力虹、仇イディオタイグ チａキシン回江ホルモンー＋ｂ体 リウマナー凶子 アセチルコリン−受容体 麗綺 組織／血液 そＯ他 甲状腺 利子類 乳舶 前立脈動 帥肋 胃癌 黒色癌 ＧＤ２（人メラノーマン グリオーマ 直腸瑚 白血病 ０どの物 アカｒｆルわ 血欣型抗原Ａ ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ！、ＤＲ 中間フィラメント マラリャ フオルスマ／−抗９ｉ　（Ｆｏｒｓｏｍａｎ−Ａｎｔｉ
−ｇｅｎノ ヒツ７赤血球 ニトロフェノール ７ニトロフエノール トリニトロフェノール ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐａｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ
　（ＫＬＨ）リウマチ因子 インシュリン 本光明による固定は、技術７に準に比べて一迎υ利点紮
捉供する。

有利な作用 多段階法０朱件下でｌ＋５」−（／ｉすＣ休を平行して
作用する比較実験によって、約７０％Ｑ抗体−−定が得
られることが判明したが、七の除り抗体―、抗原結合能
１モル１モル上方する。

この新組の改良された１容器伝は技術氷年υ多段階法に
比べて一連り利点に提供する：１）酸化の段南恢、浴欣
中に過剰に存在する過ヨウ素酸塩から抗体上強制的に分
離することがなくなジ、史に、鞘表段階乞通じて抗体は
失なわれることもない。

２）糸酌の作用によって遇刺の選ヨウ糸酸塩を無理して
除去することがなくなろ。

３ノ　全反応は央貿的に比較的迅速ｖＣ逸行する；工業
法０４〜５時間と比軟すると、成子に今では６０〜６０
分に心安とするｃ／）みでめゐ。

４ノ　反応時間が短縮された粕朱として比較的校勘Ｑ）
過ヨウ索該作用Ｖこ工って抗体がこわれる危険性か（自
滅する。

５）反応は最小のｊｉｔｙ）抗体でも亦坦体物貝Ｖこ懐
しても実施が可能である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、酸化型の抗体とアジピン酸ジヒドラジドで変性され
   たポリマーの担体材料との間の縮合反応を使用すること
   による固定化抗体製造をする改良法において、抗体を同
   時に過ヨウ素酸塩及びアジピン酸ジヒドラジドで変性さ
   れたポリマー担体材料を含有する水性媒体中での１容器
   −反応で酸化しかつ縮合し、引続き自体公知の方法で後
   処理することを特徴とする、固定化抗体製造の改良法。 ２、酸化及び縮合のために約３０〜６０分インキュベー
   トすることを特徴とする、請求項１記載の方法。