JPH0833395B2 - 固相免疫測定用成形品の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、免疫検査の一手法である固相免疫測定法に
用いられる、試料の容器もしくは、担体等の成形品を製
造する方法に関する。

〔従来技術〕

近年、医学の幅広い分野で免疫反応を利用した分析手
法が取り入れられ、血中薬物の定量、癌性たん白質の検
出、組織適合性の決定などが行なわれ、非常に有用な臨
床データを与えている。また、現在著るしい展開を見せ
ているバイオテクノロジーの各分野でも、この免疫反応
を利用した分析手法が取り入れられている。たとえば、
遺伝子変換によって生みだされる生理活性物質の検知や
農作物に感染したウイルスの同定など、この手法は欠く
べからざるものとなっている。

免疫反応を利用した分析法としては種々の方法があ
る。すなわち、免疫拡散法、免疫クロマトグラフィー、
免疫電気泳動法、補体結合反応、赤血球凝集反応、受身
赤血球凝集反応、けい光抗体法、ラジオイムノアッセ
イ、酵素免疫測定法等である。このなかでも、抗原もし
くは抗体を固相上に固定して測定を行う手法を固相免疫
測定法と言い、たとえば固相ラジオイムノアッセイや、
固相酵素免疫測定法（Enzyme Linked Immunosorbent As
say、以下ELISAという）がある。この固相免疫測定法
は、多くの免疫測定法の中でも最も感度高く定量できる
手法である。この測定法は、あらかじめ固相上に抗原も
しくは抗体を固定し、ラジオアイソトープ、けい光性物
質もしくは酵素等の標識物を結合させた抗体もしくは抗
原と、抗原−抗体反応を行わせる。反応物と未反応物の
分離は洗浄によって容易に行う事ができ、固相表面に抗
原−抗体反応によって固定された抗原もしくは抗体は、
標識物を測定する事により定量できる。

この測定法では、抗原もしくは抗体を固相へ多量に、
且つ安定性良く吸着固定する事が重要であるが、従来、
固相担体の表面に固定される抗原や抗体の量は少なく満
足のいくものではなかった。

そこで、固相表面に何らかの処理を加えることによっ
て、抗原や抗体が吸着、固定され易くするための研究が
行なわれ、例えば、ポリスチレン系ポリマーの測定用担
体を発煙硫酸または無水硫酸中で処理することによって
スルフォン酸基を導入し、抗原や抗体の固定量を増大さ
せた免疫測定用固相担体（特開昭59-84161号公報）、基
体表面をプラズマ処理することによって基体の表面化学
性を変性し、大分子の結合および／または配向を制御
し、抗体等の結合量を増大させる方法（特開昭59-80442
号公報）等が開示されている。

しかしながら、これらの処理によってもなお固体表面
における抗原や抗体の吸着、固定量は十分なものとは言
えず、また、処理方法や条件によっても効果が異なるた
め、吸着、固定量をさらに向上させ、安定化させること
が求められている。

〔発明の目的〕

本発明は、従来の固相免疫測定法用成形品の持つ欠
点、すなわち抗原の吸着性が十分ではないという点を解
決するため、単なる材質の検討や化学的表面処理の手法
検討にとどまらず、物理的、電気的な検討を鋭意進めた
結果、本発明を完成するに至ったものである。その目的
とするところは、従来は吸着性が低く測定が行えなかっ
た抗原もしくは抗体（たん白質、糖たん白、ペプチド
等）の、吸着安定性を増大することができる免疫測定用
成形品の製造方法を提供するところにある。

〔発明の構成〕

上記の目的を達成するための本発明による固相免疫測
定用成形品は、ポリスチレン成形品もしくはポリプロピ
レン成形品の表面を、Ｘ線光電子スペクトルから求めた
酸素原子／炭素原子の比が0.07〜0.19の範囲になるよう
に酸化処理することを構成上の特徴とする。

本発明の固相免疫測定用成形品を構成するプラスチッ
クとしては、ポリスチレンまたはポリプロピレンが選択
使用される。また、成形品の形状は、免疫測定の方法に
よって自ずと決まって来るもので特に限定されるもので
はなく、試験管、ビーズ、マイクロプレート、キュベッ
ト、ディスクなどがその好例である。

このようなプラスチック成形品表面の酸素原子／炭素
原子の比率が0.07〜0.19の範囲になるように調製する手
法としては、酸、アルカリ、過酸化物等の薬品による化
学的処理、コロナ放電処理、低温プラズマ処理、電子線
やガンマー線等の照射などがあるが、特に限定されるも
のではない。

蛋白質のガラス、プラスチック等への吸着現象につい
ては、蛋白質の分離・精製に用いるクロマトグラフィー
の分野で種々の検討が行なわれているが、その吸着に寄
与する力は、疎水結合、イオン結合および水素結合が主
要な作用力であると考えられている。従来の固相免疫測
定用成形品は、主に疎水結合性や化学的に固定する共有
結合性を利用して蛋白質を吸着させるものであった。し
かし、吸着させる蛋白質は、アミノ基、カルボキシル
基、水酸基、カルボニル基などを分子内に数多く有する
高分子であり、疎水結合力のみの場合よりもイオン結合
や水素結合の作用力をも加える方が、吸着固定能が増す
事は明らかである。

本発明は、ポリスチレンもしくはポリプロピレンから
なる成形品の表面に酸化処理を施し、疎水結合性に加え
てイオン結合力、水素結合力をも吸着に寄与させようと
するもので、特に、炭化処理の方法に応じて処理条件を
選択し、成形品表面のＸ線光電子スペクトルから求めた
酸素原子／炭素原子の比率が0.07〜0.19の範囲になるよ
うに酸化度合を調節することによって、蛋白質の吸着固
定能を著るしく増大させるものである。酸素原子／炭素
原子の比率が0.07未満では、イオン結合力や水素結合力
が吸着に十分寄与せず、また、0.19以上、即ち過度に酸
化処理を行なった場合には、酸化度合が強くなりすぎる
ために蛋白質の疎水結合性が抑制され、特殊な蛋白質、
たとえば塩基性の蛋白質の吸着性は大きくなるが、一般
的には吸着性は低下する。

免疫測定の対象となる蛋白質の種類は多様であり、従
って、免疫測定用成形品表面の酸化状態もこれに対応し
て各種のものを用意するのが望ましいが、本発明によれ
ば、酸化処理の方法と処理条件を組合せて、酸素原子／
炭素原子の比率を調節することにより、使用目的に応じ
た一定の蛋白質吸着性を有する免疫測定用成形品を調製
することができる。

尚、酸、アルカリ等の薬品による化学的処理は、プラ
スチックの材質により試薬の選択が必要であり、また、
処理後は反応液を十分洗浄しおく事が必要である。この
処理法は、物理的処理であるドライ法に比して、表面原
子の酸化の他に表面をミクロなレベルで粗面化する効果
もあり、吸着性をより増大させる特徴を有する。一方、
物理的処理であるコロナ放電、低温プラズマ処理、電子
線照射、ガンマ線照射などは、表面の原子のみの酸化が
可能で、均一な表面状態を形成する事ができる。

〔発明の効果〕

本発明により得られた固相免疫測定用成形品は、抗原
もしくは抗体の吸着固定性にすぐれ、良好な免疫学的分
析結果を与えるもので、医療診断分野、バイオテクノロ
ジーの研究分野等で極めて有用なものである。また、成
形品の形状を問わずいかなる形状へも応用が可能であ
る。

以下、実施例により本発明を説明する。

実施例１ ポリスチレン製の96ウエルマルチプレート（住友ベー
クライト（株）製）を用意し、何らの処理も施さないも
の、ガンマ線を3.0、6.0、8.0および15.0Mrad照射した
もの、低温プラズマ処理（空気圧0.2Torr、周波数13.56
MHz、出力50W）を５および10分間行なったもの、および
７分間低温プラズマ処理した後、さらに５％過酸化水素
溶液中に40℃、60分間浸漬処理したものを調整し、それ
ぞれ試料（１）〜試料（８）とした。また、比較試料と
してFlow社製の組織培養用プレートを用いた。

これらの各試料について、アルバックファイ社製のＸ
線光電子分析装置により測定したＸ線光電子スペクトル
から、試料表面の酸素原子／炭素原子の比率を求めた。

一方、抗体（蛋白質）に対する吸着性評価は以下のと
おり行なった。まず、プレートの各ウエルに、アルカリ
フォスファターゼ標識イムノグロブリンＧ（抗体）（Mi
les社製）を1000倍および10000倍にそれぞれ希釈したリ
ン酸塩緩衝液を100μl/ウエルづつ加え、37℃で60分間
吸着させた後、ツィーン20（東京化成社製）0.05％含有
生理食塩水（以下、洗浄液と言う）で３回洗浄して、プ
レートへの未吸着分を除去した。次に、基質液（フェニ
ルリン酸２−ナトリウム3.8mM、４−アミノアンチピリ
ン5.4mM、および塩化マグネシウム50nMを含む0.05M炭酸
塩緩衝液）を100μl/ウエル加え、37℃で60分酵素反応
を行った。フェリシアン化カリウムの36mM溶液100μl/
ウエルを加えて反応を停止した後、波長492nmの光で反
応液の吸光度を測定した。

測定結果は第１表に示した通りで、酸素原子／炭素原
子の比率を0.0714〜0.1357調節して酸化処理することに
より、吸光度、即ち抗体に対する吸着性が増大するが、
酸素原子／炭素原子の比率が0.318では酸化が不足して
吸光度が十分に増大せず、他方、比率が0.231になると
酸化が進み過ぎて吸着性が低くなることが分かる。な
お、比較に用いたFlow社製のプレートは酸素原子／炭素
原子比が0.32と大きいため、吸光度は極端に減退してい
ることが認められる。

実施例２ 住友ベークライト（株）製5mlポリプロピレンチュー
ブに、アルゴンガス中で20秒間低温プラズマ処理を行っ
た（圧力0.2Torr、周波数13.56MHz、出力50W）。表面の
酸素原子／炭素原子比の測定は、実施例１と同様にして
行った。

ヒト・アルブミンを生理食塩水により夫々１、10、10
0μg/mlの濃度に調製した溶液を、チューブに500μｌ加
え37℃、60分間吸着させた。洗浄液で３回洗い、ブロッ
キング操作として１％ゼラチン溶液を600μｌ加え37℃
で60分反応した。洗浄液で３回洗浄した後、抗ヒト・ア
ルブミン抗体（ペルオキシダーゼ標識、カペル社製）を
500μｌ加えて、抗原であるヒト・アルブミンと反応さ
せた。未反応分を洗浄除去した後、基質液（2,2′−ア
ジノジ（３−エチルベンズチアゾリン）−６′−スルホ
ン酸２アンモニウム塩2.5mM、過酸化水素水5mM）を500
μｌ加えて37℃で20分反応させた。0.05％窒化ナトリウ
ム100μｌにより反応を停止した後、フローセル型分光
光度計で405nmの波長で吸光度を測定した。

測定結果は第２表に示した通りで、プラズマ処理によ
り酸素原子／炭素原子の比率が0.190になるように表面
酸化した成形チューブは未処理チューブに比べて大幅に
吸光度が増大していることが認められる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ポリスチレン成形品もしくはポリプロピレ
   ン成形品の表面を、Ｘ線光電子スペクトルから求めた酸
   素原子／炭素原子の比が0.07〜0.19の範囲になるように
   酸化処理することを特徴とする固相免疫測定用成形品の
   製造方法。