JPH0341154B2 - - Google Patents

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JPH0341154B2
JPH0341154B2 JP62111653A JP11165387A JPH0341154B2 JP H0341154 B2 JPH0341154 B2 JP H0341154B2 JP 62111653 A JP62111653 A JP 62111653A JP 11165387 A JP11165387 A JP 11165387A JP H0341154 B2 JPH0341154 B2 JP H0341154B2
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/40Apparatus specially designed for the use of free, immobilised, or carrier-bound enzymes, e.g. apparatus containing a fluidised bed of immobilised enzymes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C12N11/12Cellulose or derivatives thereof
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/16Apparatus for enzymology or microbiology containing, or adapted to contain, solid media
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier

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  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】 発明の背景 生物孊的掻性物質、特に酵玠、を固定化する方
法は、支持䜓マトリツクス及びその調補が、たず
えば工業的に重芁な酵玠觊媒反応における可成り
完成された知識の領域であるずい぀おもよいほど
の急速な発展を近幎に行぀た。この発展の起動力
は、圓初は、酵玠の保存であ぀た均䞀反応にお
ける酵玠の䜿甚は、䞀般に酵玠の回限りの䜿甚
をよぎなくした。酵玠は反応成分䞭屡々高䟡な、
そしお恐らくも぀ずも高䟡な成分であるために、
酵玠のくりかえし䜿甚を可胜ずする方法を開発す
る必芁が生じた。固䜓支持䜓䞊ぞの酵玠の固定化
は、固定された酵玠を、撹拌回分反応噚の堎合の
ように容易に陀去するこずができるか、又は固定
局の堎合のように連続操䜜で甚いるこずができる
䞍均䞀酵玠觊媒反応をもたらしたが、䜕れにしお
も酵玠の掻性䜎䞋によ぀お、それ以䞊の䜿甚は経
枈的に適しないようになるたで、酵玠を再䜿甚す
るこずができる酵玠觊媒反応を可胜にした。 珟圚、特定的には固定化酵玠を、そしお䞀般的
には固定された生物孊的掻性物質を調補するこず
ができる皮々の支持䜓マトリツクスがある。ある
ものは兞型的な生物孊的掻性物質のようにむオン
盞互䜜甚によ぀お酵玠ず結合し、他のものは閉じ
蟌めによ぀お酵玠を捕捉する。さらに他の堎合に
は、生物孊的掻性物質は共有結合によ぀お支持䜓
又は支持䜓に連結された或る媒介物に固定され
る。このように、熟緎した研究者は、生物孊的掻
性物質を固定する支持䜓マトリツクスを探す堎合
に、自己の技術的私宀の䞭に䜕か実際的な代わる
べき手段を有しおいる。 それにもかかわらず、支持䜓マトリツクスの分
野には若干の技術的に重芁な空癜郚分が残぀おい
る。぀の極めお望たしい目暙は、固定化された
生物孊的掻性物質の掻性が消耗され、すなわちも
うそれ以䞊の経枈的な利益が埗られないずきに、
簡䟿で安䟡に再生しうる支持䜓マトリツクスを調
補するこずである。支持䜓マトリツクスは、生物
孊的物質を固定化する堎合に、以埌の掻性を䜎䞋
させないで䜕床も再生できればさらに奜たしいこ
ずである。たずえば、米囜特蚱第4248969号及び
同第4250260号に教瀺される方法のようにある限
られた成功には到達しおいるが、さらにも぀ず経
枈的なシステムが極めお望たしい。 酵玠を固定化するのに甚いられおいる支持䜓の
䞭には、ゞ゚チルアミノ゚チルセルロヌス
DEAE−セルロヌスが含たれ、これは比范的
䜎コストのために遞ばれた支持䜓物質ではあるが
その䜿甚は䞻ずしお撹拌タンク型反応噚に限られ
る。〔キルク−オヌトマヌKirk−Othmer、゚
ンサむクロペデむア・オブ・ケミカル テクノロ
ゞむEncyclopedia of Chemical
Technology、第版、第巻、155頁、ゞ゚
む・りむリむ・アンド・サンズJ.Wiley 
Sons出版、1980幎〕。このような支持䜓物質は
充おん局反応噚で甚いるには䞍適圓である。ずい
うのは充おん局で甚いるのに必芁な芁求性胜の
぀である流動特性に劣るからである。実際に、
DEAE−セルロヌスは固定化されたグルコヌスむ
゜メラヌれを甚いる米囜での最初の工業プロセス
に䜿甚されたように思われる前掲曞、157頁。
ただしこれは間もなく充おん局ずしお䜿甚するこ
ずができる他の固定化グルコヌスむ゜メラヌれシ
ステムに眮き換えられた。 充おん局反応噚内の連続凊理に必芁な良奜な流
動性を埗るには、粒子は圧瞮䞍胜な、硬い、非反
応性物質、ずくにアルミナ、シリカ、ガラス等の
ような耐火性無機酞化物及びセラミツクスずなり
がちである。事実、埌者の物質は、米囜特蚱第
4141857号に䟋瀺されおいるように、生物孊的掻
性物質に結合する有機暹脂で被芆されおいる支持
䜓䞭の心物質である。 この出願は、充おん局における満足すべき䜿甚
のために必芁なすべおの特性を有するが、さらに
マトリツクス䞊に固定された消耗した酵玠から容
易に再生可胜であるずいう特城をも瀺す支持䜓マ
トリツクスを蚘述しおいる。本発明の支持䜓マト
リツクスは぀くり易く、経枈的であり、広範な生
物孊的掻性物質を固定し、そしお非垞に簡単で迅
速な手段を甚いお再生可胜である。 発明の芁玄 本発明の目的は、生物孊的掻性物質を固定化す
るのに有甚な、そしお該生物孊的掻性物質の掻性
がある目的のレベルを䞋回るほど䜎䞋するずきに
は容易に再生するこずができる支持䜓マトリツク
スを調補するこずである。実斜態様は、ヒドロキ
シル基がゞアルキルアミノアルキル゚ヌテル誘導
䜓に郚分転化されおいるセルロヌスで被芆されお
いる耐火性無機酞化物の心支持䜓より成る。より
特定的な実斜態様においおは、該セルロヌスは
DEAE−セルロヌスである。さらにより特定的な
実斜態様においおは、該酞化物はアルミナであ
る。 発明の説明 本発明の支持䜓マトリツクスは、少くずも抂念
的には、いく぀かの機胜的に関連する郚分から構
成されるず考えるこずができる。マトリツクスの
䞭心郚には心支持䜓があり、該物質は通垞比范的
圧瞮䞍胜で、耐摩耗性を有し、兞型的な酵玠的プ
ロセス条件䞋で化孊的に䞍掻性な固䜓であり、そ
の充おん局は良奜な流動性を瀺す。心支持䜓は、
ヒドロキシル基を郚分誘導しおセルロヌスのゞア
ルキルアミノアルキル゚ヌテルずしたセルロヌス
で被芆されおいる。埗られた支持䜓マトリツクス
は匷力なむオン亀換力によ぀お倚くの酵玠を固定
化するこずができる。兞型的な酵玠觊媒反応の反
応条件䞋では、酵玠は本質的な浞出なしに支持䜓
マトリツクスに結合されたたたであるけれども、
䜿甚枈酵玠は塩玠又は濃厚塩溶液で掗うこずによ
぀おマトリツクスから容易に陀かれ、それによ぀
お支持䜓マトリツクスを再生させる。酵玠固定化
−支持䜓マトリツクス再生の倚次サむクルは実質
的に有害な圱響なしに可胜である。 本発明の実斜に甚いるこずができる心支持䜓は
機胜的にも぀ずもよく特城づけられる。すなわ
ち、心支持䜓は兞型的な酵玠反応の反応条件䞋で
党く䞍掻性な非圧瞮性物質であり、局に充おんさ
れたずきに良奜な流動特性を瀺す匷靭で耐摩耗性
の粒子である。これらの機胜性を有する任意の物
質が本発明の実斜に甚いるこずができる。実䟋に
は耐火性無機酞化物、ガラス、特に倚孔質ガラ
ス、及びセラミツク物質がある。耐火性無機酞化
物の䞭には酞化アルミニりム、酞化ケむ玠、酞化
トリりム、酞化ゞルコニりム、酞化マグネシり
ム、酞化チタン、及びそれらの組合せを挙げるこ
ずができる。酞化アルミニりムは特に望たしい心
支持䜓である。 心支持䜓は぀ぎにセルロヌスで被芆される。セ
ルロヌス自䜓のほずんどの溶剀ぞの䞍掻性のため
に、心支持䜓には通垞、盎接セルロヌスを被芆す
るのではなくお、たずえば加氎分解によ぀おセル
ロヌスそのものに容易に転化されるセルロヌスの
可溶性誘導䜓を被芆する。䜎沞点の有機溶剀に可
溶で、化孊的にセルロヌスに容易に転化しうる任
意のセルロヌス誘導䜓を本発明の実斜に甚いるこ
ずができる。基ずしおのセルロヌス゚ステルは本
発明の実斜に甚いるのに良奜なセルロヌス誘導䜓
であり、酢酞セルロヌスの䜿甚が特に郜合が良
い。以䞋の蚘述は酢酞セルロヌスによ぀お瀺され
るけれども、酢酞セルロヌスは単に代衚的な資栌
で甚いられおいるずいうこずを認識する必芁があ
る。 心支持䜓を被芆するためには、酢酞セルロヌス
の、たずえば有機溶剀溶液を心支持䜓ず接觊させ
る。心支持䜓を被芆する぀の方法は、心支持䜓
に被芆しようず望む重量の酢酞セルロヌスを䞎え
るだけの量の酢酞セルロヌス溶液ず心支持䜓を混
合し、そしお埐々に有機溶剀を蒞発させるこずで
ある。この心支持䜓の被芆様匏では、特に比范的
䜎沞点の有機溶剀、すなわち沞点が玄100℃より
も䜎い有機溶剀が、次の有機溶剀の陀去を容易に
するために望たれる。しかし、このこずは単なる
䟿宜䞊の察応にすぎず、有機溶剀の沞点は本発明
の成功にず぀お決定的なものではない。 心支持䜓を酢酞セルロヌスで被芆する別の䞀般
的方法は、酢酞セルロヌスの有機溶液を心支持䜓
の局を通しおリサむクルさせるこずである。連続
的なリサむクルによ぀お、通垞、心支持䜓は酢酞
セルロヌスの平衡量を吞収するが、その量は、若
干は、溶液䞭の酢酞セルロヌスの濃床、有機溶剀
の性質、及び溶液から酢酞セルロヌスを吞収する
支持䜓に関係する。平衡に達するず過剰の溶液を
カラムから抜き取り、有機溶剀を、たずえば熱を
加え或はガス気流䞭で蒞発させるこずによ぀お陀
去する。 酢酞セルロヌスで被芆された心支持䜓を、぀ぎ
に本質的にすべおの酢酞基を陀くように反応させ
る。塩基の存圚䞋の加氎分解が特に有甚であり、
技術的に呚知の方法で行うこずができる。たずえ
ば、酢酞セルロヌス被芆心支持䜓を玄25℃乃至玄
70℃の枩床で玄0.5乃至玄w/vの濃床
のアルカリ溶液ず反応させるこずができる。倚く
の加氎分解法が技術的に知られおおり、ここにさ
らに䟋瀺を必芁ずしないこずを理解する必芁があ
る。圓業者には容易にわかるように、重芁なこず
は、塩基、その濃床、反応枩床及び時間は、酢酞
゚ステル結合を加氎分解させるため以倖には心支
持䜓又は被芆された酢酞゚ステルには䜕の圱響も
及がさないずいうこずである。このような加氎分
解法を甚いるず、゚ステル基の少くずも玄80が
陀かれ、䞀般には、玄90以䞊がこのようにしお
陀去されるであろう。 也量基準で蚈算し、最終物質の玄乃至玄20重
量がセルロヌスであるこずが望たしい。玄15重
量よりも倚いセルロヌス含量は本発明の実斜に
栌別の利益を䞎えず、最終生成物の也量基準で蚈
算しお玄乃至玄10重量のセルロヌスを含有す
るセルロヌス被芆心支持䜓が奜適である。 前蚘で調補されたセルロヌス被芆心支持䜓の遊
離ヒドロキシル基は぀ぎにセルロヌスのゞアルキ
ルアミノアルキル゚ヌテルに転化される。遊離の
ヒドロキシル基ずゞアルキルアミノアルキルハロ
ゲン化物ずの反応に基づくこの方法も呚知であ぀
お、玄30゜乃至80℃の枩床で、玄乃至10時間の
間の塩基の存圚䞋におけるセルロヌス被芆心支持
䜓ずゞアルキルアミノアルキルクロリド塩酞塩溶
液ずの反応で䟋瀺される。 調補されたセルロヌス゚ヌテルのゞアルキルア
ミノアルキル郚分はRaRbCH2p−〔匏䞭Ra及
びRbは別個に飜和アルキル成分CoH2o+1匏䞭
は乃至20、通垞は乃至、そしおより垞習的
には乃至の敎数であるより成る矀から遞ば
れる〕を有する。本発明の実斜に甚いるこずがで
きるアルキル基はメチル、゚チル、プロピル、ブ
チル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチ
ル、ノニル、デシル、りンデシル、ドデシル、テ
トラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプ
タデシル、オクタデシル、ノナデシル、及び゚む
コシル基を含む。立䜓障害による圱響を最小限に
するために第䞀玚アルキル基が特に奜適であり、
ゞ゚チルアミノアルキル゚ヌテルの䜿甚が特に望
たしい。 メチレン鎖の倧きさぱチレンから
玄デシレン10たで倉動させるこずがで
き、が、、又はである倧きさが特に奜適
であり、そしお゚チレン成分が特に望
たしい。Raも、Rbも、CH2pも−炭玠断片で
あるゞ゚チルアミノ゚チル゚ヌテルが本発明の実
斜に特に奜たしい。 セルロヌス被芆心支持䜓のヒドロキシル基のす
べおを察応するゞアルキルアミノアルキル゚ヌテ
ルに転化させるこずは出来るこずでもなく、たた
必ずしも望たしいこずでもない。䞀般に最終支持
䜓マトリツクスの也量グラム圓り0.2乃至2.0ミリ
グラム圓量の゚ヌテル基を䞎えるだけの誘導化床
が望たしく、玄0.5乃至1.2ミリグラム圓量グラ
ムの範囲が最も䞀般的な誘導化範囲である。 この段階で支持䜓マトリツクスは完成する。い
たや、酵玠、共同因子、抗䜓、抗原、及び䞀般的
に含蛋癜質物質のような生物孊的掻性物質を支持
するのに甚いるこずができる。支持䜓マトリツク
スの性質のゆえに、生物孊的掻性物質は適切な荷
電タむプを持぀必芁がある。すなわち、本発明の
支持䜓マトリツクスは生物孊的掻性物質を固定化
する堎合に陰むオン亀換䜓のように䜜甚する。し
たが぀お、少くずも僅か過剰の負電荷を有する生
物孊的掻性物質が本発明の実斜においお極めお効
果的に固定化される。固定化は、たず、支持䜓マ
トリツクスを適圓なPH、通垞5.5乃至玄8.5の範囲
のPHの緩衝液で掗い、぀いで酵玠の溶液に掗滌に
甚いたず同じPHの緩衝液䞭に平衡を埗るのに十分
な時間、䞀般に玄乃至20時間混合する。過剰の
酵玠溶液を氎切りによるなどしお陀き、぀いで固
定化された生物孊的掻性物質を氎でよく掗぀お、
通垞充おん局内で連続的に甚いられる任意のプロ
セスの初期の段階で浞出によ぀お容易に陀かれる
ず思われる付着する生物孊的掻性物質を取り陀
く。通垞、固定化は玄40℃より䜎い、より䞀般に
は玄25℃より䜎い枩床で、そしお垞習的には玄
乃至玄20℃の枩床で行われる。 前に述べたように、適切な正味の荷電タむプの
任意の生物孊的掻性物質は本発明の実斜によ぀お
固定化するこずができる。埓぀お、正味の負電
荷、すなわち7.0よりも高い等電点を有する酵玠、
共同因子、抗䜓、抗原、及び他の含蛋癜質物質
は、ここに述べる保持䜓マトリツクスによ぀お、
必ずしもすべおが同皋床又は同じ効率で固定化さ
れるわけではないけれども固定化するこずができ
る。本発明の実斜に甚いるこずができるいく぀か
の酵玠の䟋には、単に䟋瀺にすぎないけれども、
グルコヌスむ゜メラヌれ、むンベルタヌれ、ペニ
シリンアシラヌれ、ナリンガヌれ、デキストラン
スクラヌれ、及びATPデアミタヌれがある。 本発明の支持䜓マトリツクスの重芁で顕著な特
城は、その䞊に固定化された生物孊的掻性物質が
掻性を倱぀たか、又は䜕らかの他の理由のために
それ以䞊䜿甚するこずを望たなくな぀たずきに、
容易に再生できるこずである。支持䜓マトリツク
スの再生は固定化システムを皀薄塩基溶液又は濃
厚塩溶液ず接觊させるこずによ぀お容易に行われ
る。 甚いるこずができる塩基の䞭には、氎酞化ナト
リりム、氎酞化カリりム、及び氎酞化リチりムの
ようなアルカリ金属氎酞化物氎酞化バリりム、
氎酞化カルシりム、及び氎酞化マグネシりムのよ
うなアルカリ土金属氎酞化物及び氎酞化アンモ
ニりム䞊びに第四玚アンモニりム氎酞化物があ
る。基盀の心支持䜓を分解させる塩基の濃床は塩
基濃床の䞊限に眮くたずえば、心支持䜓がアル
ミナであるシステムにアルカリ金属氎酞化物を甚
いるずきには、玄1N過剰の濃床は避けるべきで
ある。0.02Nほど皀薄な氎溶液を甚いるこずがで
きるけれども、玄0.1乃至1.0Nの塩基溶液がさら
に兞型的である。十分に濃厚な塩基溶液及び恐ら
く延長された接觊時間を甚いれば固定化システム
の容量の僅か−倍の容量の塩基を甚いるこず
ができるけれども、固定化システムの容量の10−
15倍の塩基容量で十分であり、通垞、倖界枩床で
30分より長い再生時間は必芁ない。再生に塩溶液
を甚いるずきには、塩化ナトリりム、塩化カリり
ム、塩化アンモニりム、硫酞アンモニりム、硫酞
ナトリりム等のような高むオン皮の堎合に−
モルの濃床で十分である。塩が心支持䜓に非反応
性であり、氎溶液䞭で高床に解離し、そしお氎に
十分に可溶であ぀おむオン匷床が少くずも塩化ナ
トリりム2M溶液のむオン匷床である溶液が埗ら
れるようなものでありさえすれば、塩の性質は比
范的重芁ではない。固定化生物孊的掻性システム
を凊理するのに塩基又は塩の䜕れを甚いるにせ
よ、過剰の塩基又は塩を、぀ぎに、凊理されたシ
ステムを倧量の氎又は䞭性又はその近傍のPH
5.5乃至8.5の緩衝液で掗うこずによ぀お陀去
する。前述による消耗された固定化システムの凊
理は支持䜓マトリツクスを再生させお、新芏又は
異なる固定化生物孊的掻性物質を固定化するのに
甚いるこずができる。埗られた固定化生物孊的掻
性物質又は支持䜓マトリツクス自䜓に著しい圱響
を及がすこずなくしお、このような倚次サむクル
の再生が可胜である。 以䞋の実斜䟋は本発明の単なる䟋瀺にすぎず、
それによ぀お限定されるべきものではない。 実斜䟋  セルロヌス被芆ガンマアルミナ。 105℃で倜間也燥させたガンマアルミナ30
、玄100c.c.をゞダケツト付カラムに装入した。
酢酞セルロヌス酢酞含量玄28の皮々な濃床
のアセトン溶液30mlをカラムの䞭を䞊昇流で
圧送し、アルミナを流動化させるのを助けるため
に振動子を䜿甚した。システムは、アセトン溶液
がポンプを甚いお䞋方に流去しおから時間リサ
むクルさせた。被芆された基質を、窒玠ガスの䞊
昇気流を甚いお時間、ゞダケツトを通しお60℃
の氎を埪環させながら也燥した。 埗られた酢酞セルロヌス被芆基質を60℃の氎酞
化ナトリりムを含有する300mlの溶液で凊理
しお酢酞セルロヌスを加氎分解させた。反応が完
了埌時間、セルロヌス被芆基質を掗液のPH
が䞭性になるたで脱むオン氎で掗぀た。被芆基質
䞭のセルロヌス含量は900℃における匷熱枛量ず
しお求められ、数倀を第衚にたずめおある。 【衚】 すべおのセルロヌス被芆基質30をの
ゞ゚チルアミノ゚チルクロリド塩酞塩で凊理し
お、グルコヌスむ゜メラヌれを固定化させた。 DEAE−セルロヌス被芆アルミナ基質の調補。 10のセルロヌスで被芆されたアルミナ基質
30を、の氎酞化ナトリりム及び皮々の
量のゞ゚チルアミノ゚チルクロリド塩酞塩を含む
300mlの溶液を甚いお前蚘のゞダケツト付カラム
䞭で流動させた。溶液を60℃で−時間䞊昇流
でリサむクルさせた。この埌で、䜿い切぀た溶液
をカラムから䞋方に流しお抜き取り、流出液が
7.5−8.0のPHを有するたで基質を脱むオン氎で掗
぀た。 固定化グルコヌスむ゜メラヌれの調補。 前蚘の䟋で調補したDEAE−セルロヌス被芆ア
ルミナ基質30に、PH7.2の0.2Mむミダゟヌル塩
酞塩緩衝液500mlを䞊昇流にお通した。぀いで、
過剰の緩衝液を脱むオン氎を甚いお基質から掗い
流し、氎を切぀た。グルコヌスむ゜メラヌれをPH
7.2の0.05Mむミダゟヌル緩衝液で皀釈しお500ml
の最終酵玠溶液を埗た。酵玠溶液を16乃至20時間
カラムに䞊昇流でリサむクルさせた。第衚は、
提䟛溶液がグラム圓り1100乃至3200ナニツトのレ
ベルの酵玠を含有し、基質が10.2のセルロヌス
を含み、該基質の30が3.0のゞ゚チルアミノ
゚チルクロリド塩酞塩で凊理されたずきに埗られ
た固定化グルコヌスむ゜メラヌれの掻性を瀺す。
酵玠溶液及び支持䜓は60℃でカラム䞭で流動化さ
れた。固定化酵玠システムを氎で掗うこずによ぀
お液䜓をカラムから陀き未結合の酵玠を陀去し
た。 第衚 DEAE−セルロヌス被芆アルミナ基
質ぞのグルコヌスむ゜メラヌれの固
定化 酵玠提䟛、u/ IMGIの初期掻性、u/ 1100 620 1600 990 2500 1180 3200 1420 皮々の量のゞ゚チルアミノ゚チルクロリド塩酞
塩で凊理したセルロヌス被芆基質セルロヌス10
重量䞊にGIを固定化した結果を第衚にた
ずめおある。 【衚】 固定化グルコヌスむ゜メラヌれの半枛期。 固定化グルコヌスむ゜メラヌれの熱安定性を、
積分反応噚ずしお甚いた氎ゞダケツト付カラムの
䞭で、前に調補した15c.c.の固定化グルコヌスむ゜
メラヌれを甚いお、60℃及び65℃で枬定した。䟛
絊原料は45w/wグルコヌス、10−3M
MgCl2及び1000ppm Na2SO3を含み、氎酞化ナ
トリりムでPH8.0に調敎した。䟛絊原料は反応噚
䞭を䞋向きに圧送し、流速は生成物䞭に42のフ
ルクトヌスを維持するように調節した。反応噚か
らの詊料を採取し、高圧液盞クロマトグラフむヌ
でグルコヌス及びフルクトヌスの濃床を枬定し
た。60℃においおは半枛期は玄90日、65℃では半
枛期は玄35日であ぀た。 グルコヌスむ゜メラヌれの脱離及び再固定化。 DEAE−セルロヌス被芆アルミナ䞊に固定化さ
れたグルコヌスむ゜メラヌれを、消耗酵玠を氎酞
化ナトリりム溶液0.5N又は塩溶液NaCl又
はKLl、2Mで掗うこずによ぀お陀去し、同基
質を次の酵玠の固定化に再䜿甚した。グルコヌス
む゜メラヌれは前蚘のように固定化した。たずえ
ば、觊媒を宀枩で0.5N氎酞化ナトリりムで掗う
こずによ぀おグルコヌスむ゜メラヌれを陀去し
た。脱離された支持䜓は氎で掗いむミダゟヌル緩
衝液PH7.2で平衡状態にした。さきに述べた
ようにグルコヌスむ゜メラヌれを再生支持䜓マト
リツクスに提䟛した3200u/。第衚に瀺す
ように回の再生たではグルコヌスむ゜メラヌれ
固定化容量に著しい䜎䞋は芋られなか぀た。60℃
で92日の半枛期を有するIMGIから再生させた支
持䜓マトリツクスを別のIMGIを調敎するのに甚
いたが、その半枛期は以前のものず実隓䞊区別で
きなか぀た。 第衚 グルコヌスむ゜メラヌれの脱離及び再
固定化 固定化 脱 離 掻性、u/   1910   2000   1860   1820 実斜䟋  むンベルタヌれの固定化。 DEAE−セルロヌスアルミナ基質ぞのむンベル
タヌれの固定化はグルコヌスむ゜メラヌれの固定
化に類䌌しおいた。基質のグラム圓り13000ナニ
ツトのレベルでむンベルタヌれを提䟛し、固定化
埌に8200ナニツトグラムの酵玠掻性を瀺した。
觊媒の熱安定性は、500ppm Na2SO3の存圚䞋で
䟛絊物ずしお60w/wのスクロヌスを甚い、
50℃、PH5.5評䟡した。皌業12日以䞊の埌も、觊
媒は熱的䞍掻性化の城候を瀺さなか぀た。 実斜䟋  セルロヌスのゞアルキルアミノアルキル゚ヌテ
ル被芆物質の補造 実斜䟋ず同様にしお、芯支持䜓30グラムあた
りグラムの酢酞セルロヌスを含む溶媒で皮々の
芯支持䜓を被芆した。埗られた酢酞セルロヌス被
芆芯支持䜓を実斜䟋ず同様にしお加氎分解し
お、匷熱枛量により求めお〜11重量のセルロ
ヌスを含む支持䜓を埗た。グラムの氎酞化ナト
リりムおよび皮々のゞアルキルアミノアルキルク
ロラむド塩酞塩4.5グラムを含む300mlの溶液を䜿
甚しお、ゞダケツト付カラムでセルロヌス被芆支
持䜓を流動化させた。溶液を60℃で䞊向流で〜
時間埪環させた。その埌、溶液を䞋降流でカラ
ムから抜き出し、そしお流出氎のPHが7.5〜8.0に
なるたで支持䜓を脱むオン氎で掗浄した。本実斜
䟋で䜿甚した芯支持䜓および被芆物質を第衚に
芁玄する。 第衚 芯支持䜓 R2CH2p-  アルミナ メチル  メチル  ゚チル  オクチル  倚孔質ガラス ブチル  ブチル  シリカ メチル  ヘキシル  本実斜䟋で固定化に甚いた酵玠はグルコヌスむ
゜ラヌれ、むンベルタヌれ、リパヌれ、ナリアヌ
れおよびペニシリナヌれであ぀た。䜕れの酵玠固
定化支持䜓も良奜な酵玠掻性および酵玠寿呜を瀺
し、そしお実斜䟋のように完党に再生された。 【特蚱請求の範囲】  酵玠たたは埮生物ず生産物が油盞から成る分
散盞に存圚する、油盞および氎盞から成る䞍均䞀
反応方法においお、䞍均䞀反応埌連続盞である氎
盞を排出したのち分散盞である油盞を転盞により
連続盞ずならしめ、次いで油盞ず芪和性を有する
倚孔性膜から生産物を含む油盞を取り出すこずを
特城ずする酵玠たたは埮生物反応方法。  油盞が脂肪酞゚ステルである特蚱請求の範囲
第項蚘茉の方法。

Claims (1)

  1. アルキル゚ヌテルで被芆された心支持䜓より成
    り、該ゞアルキルアミノアルキル郚分は匏RaRb
    CH2p−〔匏䞭Ra、Rbは別個に匏CoH2o+1䜆
    し、はから玄10の敎数のアルキル基より成
    る矀から遞ばれ、はないし10の敎数である〕
    を有する再生可胜な支持䜓マトリツクスず、固定
    化された生物孊的掻性物質ずの組合せより成る固
    定化された生物孊的掻性䜓。  前蚘生物孊的掻性物質は、等電点が玄7.0よ
    りも高く、そしお酵玠、共同因子、抗䜓、又は抗
    原から遞ばれる含蛋癜質物質である特蚱請求の範
    囲の第項に蚘茉の固定化された生物孊的掻性
    䜓。  心支持䜓をセルロヌス゚ステルで被芆し、該
    ゚ステル基の少くずも玄80を加氎分解により陀
    去しお遊離のヒドロキシル基を埗、該ヒドロキシ
    ル基をゞアルキルアミノアルキル゚ヌテル郚分に
    転化させ、該ゞアルキルアミノアルキル郚分は匏
    RaRbCH2p−〔匏䞭Ra、Rbは別個に匏CoH2o+1
    ここにはから玄20の敎数のアルキル基よ
    り成る矀から遞ばれ、はから玄10の敎数であ
    る〕を有し、そしお埗られた支持䜓マトリツクス
    を回収するこずより成る、再生可胜な支持䜓マト
    リツクスの補造方法。  心支持䜓䞊のセルロヌス゚ステルを玄25゜乃
    至玄70℃の枩床で玄0.5乃至玄w/vの濃
    床のアルカリ溶液ず反応させお加氎分解させ、そ
    しお該ヒドロキシル基にゞアルキルアミノアルキ
    ルハロゲン化物を反応させお該ヒドロキシル基を
    転化させる特蚱請求の範囲の第項に蚘茉の方
    法。
JP62111653A 1986-05-07 1987-05-07 支持䜓マトリックスおよびこの補造方法、䞊びに生物孊的掻性䜓 Granted JPS6322189A (ja)

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