JPH0797108B2 - アフィニティークロマトグラフィー用のポリエチレンイミンマトリックス - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアフィニティークロマトグラフィー、固定され
た酵素、そしてアフィニティークロマトグラフィーで使
用するアフィニティーマトリックスの分野に関する。

アフィニティークロマトグラフィーは生物分子の独特か
つ基本的な生物学的性質、即ち、それらの他の分子との
可逆的な分子相互作用の選択的、特異的高アフィニティ
ー認識に基づいている、分離及び精製技術である。多く
の生物分子は特定のリーガンド又はエフェクター分子に
対する基質又は官能的結合位置を有し、特定のリーガン
ド又はエフェクター自身別の蛋白質である。

一般に特異的なリーガンドは固体の支持マトリックスに
共有結合されている。固定されたリーガンドに特異的に
結合（吸収）されている生物的分子を含有する試料は固
定リーガンドと接触される。吸収されていない、汚染分
子が除去された後、特異的に結合した分子は、幾つかの
手順の一つ、例えばイオン強度の変更又は溶離緩衝液の
pHの変更によって特異的に結合した分子−リーガンド相
互作用を撹乱させることによって、固体支持体から溶離
される。

この手順によって固定された医薬、ビタミン類、ペプチ
ド類、ホルモン類等が対応するレセプター又は運搬蛋白
質を単離するために使用することが出来る。

固定された蛋白質は他の相補又は相互作用をする蛋白質
を単離する為に役立てることが出来る。同様にそのよう
な手順は微粒状の生物資料、例えば細胞膜及び特定のレ
セプターを有している無傷の細胞さえも分離するのに使
用することが出来る。そのような手順の使用は又はポリ
ヌクレオチド類、抗原、抗体、ウィルス、酵素等を精製
するのにも有用である。更にそのような固体に基づいた
アフィニティー支持マトリックスは触媒などとして反応
に於て使用する為に酵素を固定する為に使用されてき
た。

〔従来の技術〕

これまでアフィニティークロマトグラフィーに対する殆
どの広く使用されてきた固体マトリックスは多糖類に基
づいたマトリックスであり、例えばアガロース、セルロ
ース及び架橋デキストリンであった。架橋されたポリア
クリルアミド及びシリカ又は多孔質ガラスビーズ等も使
用されてきた。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし殆どのそのような固体マトリックス、特にシリカ
に基づいた固体マトリックスでは、固体の基剤マトリッ
クスは問題となる生物試料中で分子から充分に遮蔽され
ておらず、結果として固定されたリーガンドの特異的な
結果パートナー以外の物質の吸収という性質に於ける非
特異的結果が生じた。これまで使用されてきたシリカに
基づいた固体マトリックスの場合には、シラノール基に
於て強い水素結合及び吸収が生じ、この工程を撹乱し
た。更に問題となる蛋白質又は他の生物物質と共に使用
されなければならない水溶液は、シリカマトリックスの
望ましくない加水分解を生じ、マトリックスから望まし
くない物質を浸出させ、不安定なマトリックスを生じ
た。

アフィニティークロマトグラフィーでこれまで使用され
た固体の支持マトリックスの場合、水溶液中でそのよう
なシリカは約200〜300時間しか一般に使用できず、酸性
又はアルカリ性のpH環境下ではもっと短い。更にそのよ
うな先行技術のマトリックスは0.1N NaOHに対して露出
させることが出来ない。

このように現在使用されている固体支持マトリツクスの
欠点により、特に非特異的な物質の吸収及びマトリック
スの不安定性の為に、アフィニティークロマトグラフィ
ーの開発が非常に妨げられてきた。

従って非特異的な結合の危険を実質的に減少させるか又
はなくし、そして種々のpH条件下で、そして水溶液中で
安定なアフィニティークロマトグラフィー用の固体支持
マトリックスを提供することが望まれる。

〔課題を解決する手段〕

本発明において、共有結合した非架橋ポリエチレンイミ
ンシリカ基盤の固相支持体は、水性の酸性及びアルカリ
環境中で、非常に改良された安定性を有し、そして非特
異的分子吸収を実質的に減少又は事実上除去したアフィ
ニティークロマトグラフィーマトリックスを提供するこ
とが発見された。本発明のアフィニティークロマトグラ
フィーマトリックスを提供する為に使用される共有結合
された非架橋ポリエチレンイミンシリカ基盤の固体支持
体は、ポリエチレンイミノプロピルトリメトキシシラン
と微粒状のシリカゲル又は微粒状の抑制された孔のガラ
スとの反応生成物であって、 式 シリカ−PrSi−PEI として命名される。

本明細書で使用するシリカ−PrSi−PEIという用語は、 （１）ａ）平均粒径約１〜約200、好ましくは３〜70ミ
クロン、平均孔寸法約０〜1000、好ましくは約50〜1000
オングストローム単位を有する微粒状シリカゲル、又は ｂ）平均粒径約１〜約200ミクロン及び平均孔寸法約
０、好ましくは約40〜約1000オングストローム単位を有
する微粒状の抑制された孔のガラス、と （２）約400〜約1800の平均分子量を有するポリエチレ
ンイミノプロピルトリメトキシシラン、 との反応生成物、 又は グラム当たり約0.3〜約1.2カルボキシルミリ当量を含有
する、二塩基酸無水物によるその弱酸性カルボキシル化
生成物、 である共有結合した架橋されていないポリエチレンイミ
ン結合相固体支持体を意味する。

そのようなシリカ−PrSi−PEI生成物、それらのカルボ
キシル化誘導体、及びそれらの製法はハグラムスデン、
1985年９月10日発行の米国特許4,540,486中に開示さ
れ、特許請求されている。そのような製品は、ベーカー
ボンド（登録商標）（BAKERBOND）カラムクロマトグラ
フィーマトリックスとしてジェィティーベーカーインコ
ーポレーテッドから現在入手できる。

本発明のアフィニティークロマトグラフィーマトリック
スはポリエチレンイミン部分の第１級及び第２級アミノ
基が非変性条件下でリーガンドと共有結合を形成するこ
との出来る、そして水性の加水分解条件下で安定な反応
性の部分と反応されている誘導化されたシリカ−PrSi−
PEIマトリックスである。

このように本発明のアフィニティークロマトグラフィー
マトリックスは一般式 シリカ−PrSi−PEIＲ）ｘ で表わされうる。

式中、弱酸性カルボキシル化支持体でないときは、 Ｒは、Ｒがそれの二つの別々の場所の一つに於てPEIの
第１級及び第２級のアミノ基に共有結合されるようにな
る、そして水性の加水分解緩衝条件下で安定な第二の共
有結合を形成するためにそれのもう一方の位置をアフィ
ニティークロマトグラフィーリーガンドによる非変性条
件下での後の親核置換に利用出来、反応性であるように
している、上記二つの別々の位置で親核置換を受けるこ
との出来る任意の化学的に反応性の部分の残基を表わ
し、 ｘはPEI部分の第１級又は第２級アミノ基の合計数より
も小さいか又は等しい整数であり、 弱酸性カルボキシル化支持体である場合に於ては、 Ｒは、アフィニティークロマトグラフィーリーガンド上
で親核官能基によりカルボキシル炭素に於て容易に置換
されるように、カルボニル炭素に共有結合を形成し、そ
れによって充分に親核性の位置を造るために、カルボキ
シルのヒドロキシルの親核置換を促進することの出来る
任意の化学的に反応性の部分の残基であり、 ｘはカルボキシル化PEI部分のカルボニル基の合計数よ
りも小さいか又は等しい整数である。

他の前記の条件を満たしている、PEI部分の第１級及び
第２級アミノ又はカルボキシル基と反応性である部分の
Ｒ残基の例として次の残基が挙げられる。

これらはそれぞれ、グルタルアルデヒド、塩化シアヌ
ル、エピクロルヒドリン、1,4−ブタンジオールジグリ
シジルエーテル、ｐ−ニトロフェニルクロロホルメー
ト、エチルクロロアセテート、1,1′−カルボニルジイ
ミダゾール、ジアゾ化ｐ−ニトロベンズアルデヒドフル
オロボレート塩、及びジアゾ化ｐ−ニトロベンゾイルク
ロライドフルオロボレート塩から誘導される。

本発明のアフィニティーアトリックスはアフィニティー
マトリックスに共有結合する任意のリーガンドに係合す
る為に使用することが出来る。アフィニティーマトリッ
クスは反応性のアミノ基を有するリーガンドと反応する
為に特に有用であるが、他の反応性の基、例えば反応性
のヒドロキシル、スルフヒドリルのような基を含有する
リーガンドと反応するのにも全く同様に有用である。

本発明のアフィニティーマトリックスは蛋白質、酵素、
又はアフィニティーマトリックス上に固定されたリーガ
ンドを生じるための他のリーガンドの、反応性の基と容
易に反応する。本発明のアフィニティーマトリックスと
共有結合によって固定され得るそのような反応性の基を
含有するリーガンドの例として、例えば、この技術で知
られ、例えばパーキン アイ．等、「アフィニティーク
ロマトグラフィー,C＆EN」17−24,32,1985年８月26日に
開示されているような、抗体、抗原、酵素、阻害剤、共
同因子、ホルモン、ビタミン、毒素、成長因子、グリコ
コンジュゲート類、レシチン、核酸、及び蛋白質が挙げ
られる。

〔本発明の効果〕

本発明のリーガンドが結合したアフィニティーマトリッ
クスはアフィニティーマトリックスに共有結合したリー
ガンドを有する本発明のアフィニティーマトリックス
に、溶液中の蛋白質等の物質を結合又は吸収することに
よって、そのような物質を含有している溶液から、その
物質を精製又は分離するのに使用される。分離又は精製
されるべきそのような物質のうち、例えば、酵素、受容
器、抗体、抗原、核酸等が挙げられる。更に本発明のア
フィニティーマトリックスは前に述べたアフィニティー
クロマトグラフィーの為のリーガンド又は反応触媒とし
て使用する為の固定された酵素としての何れかで酵素を
固定するのに使用することが出来る。そのような固定さ
れた酵素、即ち本発明のアフィニティーマトリックスに
固定された酵素は、非常に活性であり、安定な触媒でそ
れらの適当な特異性を保有している。そのような固定さ
れた酵素触媒は再使用でき、連続反応を可能とし、より
よく反応を制御できるようにし、そしてより高い純度及
び生成物を収率を生じる。更にそのような固定された触
媒は一般に酵素触媒の損失の減少又は除去の為、汚染を
生じることが少ない。そのような固定された酵素の使用
は、種々の酵素触媒反応、例えばＬ−アミノ酸の製造方
法に於て広い用途を見出している。

〔実施例〕

実施例１ 反応容器中の25.0gのシリカ−PrSi−PEI（40μ、2.8％
Ｎ、0.05meg）に、13.0g（0.128モル）のトリエチルア
ミンを、100mlのクロロホルム、27.6g（0.115ml）の塩
化シアヌルと共に約20℃で加えた。反応は非常に発熱的
であった。追加の200モルのクロロホルムを加え、混合
物を20℃で約5.5時間撹拌し、濾過し、３×100mlのクロ
ロホルムで洗浄し、80℃で約４時間乾燥した。収量＝2
6.2g。分析:C＝10.74％、Ｈ＝2.11％、Ｎ＝6.32％、Cl
＝5.52％。

実施例２ 温度計、撹拌機、及び冷却器を供えた反応容器中に300m
lのクロロホルムを入れ、約０〜５℃に氷−塩よって冷
却した。27.6g（0.15モル）の塩化シアヌルを20分間か
けて加え、一方温度を約０〜５℃に保った。次に15.0g
（0.15モル）のトリエチルアミンを一度に加え、懸濁液
を黄色に変化し温度は約25℃に上昇した。溶液を次に再
度０〜５℃に冷却し、25.0gのシリカ−PrSi−PEI（40
μ、2.8％N,0.05meg）を約20分間の間隔の間に小ロット
に加え、一方温度を約０〜５℃に保った。反応混合物を
その温度で約30分間撹拌し、その後氷浴を除去し、混合
物を約22時間撹拌し、濾過し、３×100mlのクロロホル
ムで洗浄し、０℃で約４時間乾燥した。収量＝25.4g。
分析:C＝10.22％、Ｈ＝2.12％、Ｎ＝5.78％、Cl＝5.59
％。

実施例３ 25gのシリカ−PrSi−PEl（40μ、2.8％N,0.05megを100m
lのクロロホルムに懸濁し、これに15.0g（0.15モル）の
トリエチルアミンを加えた。28.0gのトリアジンを200ml
のクロロホルムでスラリーにし、反応容器に移し、非常
に発熱的な反応が生じた。混合物を約5.5時間約20℃で
撹拌し、濾過し、３×100mlのクロロホルムで洗浄し、
約80℃で約４時間乾燥した。収量＝26g。分析:C＝10.95
％、Ｈ＝2.12％、Ｎ＝5.96％、Cl＝5.63％。

実施例４ 反応容器中で、50％のシリカ−PrSi−PEI（40μ、2.8％
N,0.05meg）を200mlをクロロホルムに懸濁し、これに2
9.0gのトリエチルアミンを加えた。20.0gの塩化シアヌ
ルを徐々に加え、残りの塩化シアヌルを200mlのクロロ
ホルムでスラリーにし、反応容器に移し、非常に発熱的
な反応が生じた。混合物を約5.1時間約20℃で撹拌し、
濾過し、３×200mlのクロロホルムで洗浄し、約80℃で
約４時間乾燥した。収量＝51g。分析:C＝10.71％、Ｈ＝
2.14％、Ｎ＝5.88％、Cl＝5.33％。

実施例５ 冷却器、撹拌器、及び温度計を供えた反応容器中で300m
lのクロロホルムを懸濁し、約０〜５℃に氷−塩によっ
て冷却した。56g（0.29モル）の塩化シアヌルを約15〜2
0分間の間に冷却したクロロホルム溶液に加え、一方温
度を約０〜５℃に保った。クロロホルム中の36g（0.35
モル）のトリエチルアミンを約30分間滴下し、温度を約
10℃に保った。溶液はトリエチルアミン添加完了後黄色
に変化した。混合物を約０〜５℃に冷却し、実施例４に
従って造った。50.0gのシリカ−PrSi−PEI−トリアジン
を加え、一方温度を約10℃以下に保った。シリカの添加
が約10分間で完了した。反応混合物をその温度で約10分
間撹拌し、その後氷浴を除去し、混合物を約20℃で18.5
時間撹拌し、濾過し、４×250mlのクロロホルムで洗浄
し、80℃で約４時間乾燥した。収量＝49g。分析:C＝11.
3％、Ｈ＝2.25％、Ｎ＝6.31％、Cl＝4.86％。

実施例６ 反応容器中で、250gのシリカ−PrSi−PEI（40μ、2.8％
N,0.05meg）及び100mlの25％グルタルアルデヒド溶液を
混合した。混合物を約４時間シェーカー上で約20℃で保
った。混合物は明るい茶色に変化し、これを約４時間後
濾過し、３×100mlの脱イオン水、３×100mlメタノール
及び３×100mlのアセトンで洗浄し、20℃で真空オーブ
ン中で一夜乾燥し、一定重量にした。収量＝26g。分析:
C＝15.43％、Ｈ＝2.48％、Ｎ＝2.34％。

実施例７ 25gのシリカ−PrSi−PEI（40μ、2.8％N,0.05meg）を50
0mlの丸底フラスコ中に入れ100mlのテトラヒドロフラン
中の5.1g（0.05ml）のトリエチルアミンを加え、続いて
10.15g（0.05モル）のｐ−ニトロフェニルクロロホルメ
ート及び追加的な150mlのテトラヒドロフランを加え
た。混合物を約16時間シェーカー上で約20℃で保ち、次
に濾過し、４×125mlのクロロホルムで洗浄し、約80℃
で約４時間乾燥した。収量＝26g。分析:C＝9.73％、Ｈ
＝2.51％、Ｎ＝3.26％。

実施例８ 25gのシリカ−PrSi−PEI（40μ、2.8％N,0.05meg）を25
0mlのテトラヒドロフラン中に懸濁し、10.12g（0.1モ
ル）のトリエチルアミンを加え、続いて9.32g（0.01モ
ル）のエピクロルヒドリンを加えた。混合物を約19時間
シェーカー上で約20℃で保ち、次に濾過し、２×250ml
のテトラヒドロフラン、２×250mlのクロロホルム及び
２×250mlのアセトンで洗浄し、約80℃で約４時間乾燥
した。収量＝25.5g。分析:C＝7.84％、Ｈ＝1.61％、Ｎ
＝2.63％。

実施例９ 反応容器中で25gのシリカ−PrSi−PEI（40μ、2.86％N,
0.05meg）を250mlのテトラヒドロフラン中に懸濁し、1
1.25g（0.055モル）の1,4−ブタンジオールグリシジル
エーテルを加えた。混合物を約20℃で約８時間シェーカ
ー上に置き、次に濾過し、３×100mlのメタノールで洗
浄し、約80℃で約４時間乾燥した。分析:C＝7.09％、Ｈ
＝1.62％、Ｎ＝2.36％。

実施例10 実施例９を繰り返したが、但し生成物を３×100mlのア
セトン及び３×100mlのジエチルエーテルで洗浄した。
分析:C＝7.13％、Ｈ＝1.61％、Ｎ＝2.75％。

実施例11 10g（0.061ml）の1,1′−カルボニルジイミダゾールを1
50mlのアセトンに懸濁し、懸濁液を反応容器中で25gの
シリカ−PrSi−PEI（40μ、2.8％N,0.05meg）にくわえ
た。追加の100mlのアセトンを反応溶液に加え、これを
ロータリーフィルム蒸発器上で約18時間約30℃で保っ
た。生成物を濾過し、３×250mlのアセトン、１×250ml
ジエチルエーテルで洗浄し、約80℃で約４時間乾燥し
た。収量＝26g。分析:C＝8.99％、Ｈ＝1.72％、Ｎ＝3.9
8％。

実施例12 25gのシリカ−PrSi−PEI（Ｃ＝5.92％、Ｈ＝2.82％、0.
05meg）を125mlのテトラヒドロフラン中に懸濁し、5.05
g（0.05モル）のトリエチルアミンを加え、反応混合物
を約20℃で約10分間撹拌し、その後、6.12g（0.05モ
ル）のエチルクロロアセテートを加え、次に125mlのテ
トラヒドロフランを加えた。反応混合物を約20℃でシェ
ーカー上で約24時間撹拌し、次に濾過し、２×250mlの
クロロホルム、２×250mlのアセトンで洗浄し、約80℃
で約４時間乾燥した。分析:C＝6.61％、Ｈ＝1.67％、Ｎ
＝2.80％。

実施例13 2.5g（0.013ml）の１−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を50mlのアセト
ン:2−プロパノール（1:1）中に溶解した。1.3g（0.011
モル）のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドを100mlのアセ
トン中に懸濁し、シエーカー上で保った。（これは完全
には溶液にならなかった。）25gのサクシノイル化シリ
カ−PrSi−PEI（Ｃ＝11.89％、Ｈ＝1.86g、Ｎ＝0.69
％、カルボキシル基＝0.95meg/g）を反応容器中に入
れ、アセトン−２−プロパノール中の１−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
の溶液を加えた。反応容器を約５分間振とうし、次にア
セトン中のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの溶液を加
え、続いて25mlの２−プロパノールを加えた。反応容器
をシェーカー上で約22時間保ち、次に生成物を濾過し、
２×250mlのイソプロパノール、２×250mlのアセトンで
洗浄し、約80℃で約４時間乾燥した。収量26.4g。分析:
C＝13.60％、Ｈ＝2.14％、Ｎ＝3.38％。

実施例14 本発明に従うジアゾアフィニティークロロホルムマトリ
ックスの調製物は次の手順で製造できる。

Ａ）シリカ−PrSi−PEIをメタノール中でｐ−ニトロベ
ンズアルデヒドと反応させ、生じる生成物をメタノール
中で水酸化ホウ素ナトリウムと反応させる。生成物を約
60℃でナトリウムジチオナイト溶液中に懸濁させる。生
じる生成物を、氷冷したHBF₄と反応させ、生成物を濾過
し、氷水で洗浄し、真空下で乾燥して、所望のジアゾニ
ウムフルオロボレート生成物を生じる。

Ｂ）シリカ−PrSi−PEIをｐ−ニトロベンゾイルクロラ
イドとテトラヒドロフラン及びトリエチルアミン中で反
応させ、生じる生成物をナトリウムジチオナイト溶液中
に懸濁し、続いて反応生成物を氷冷HBF₄で処理し、濾過
し、氷水で洗浄し、生成物を真空下で乾燥して所望のジ
アゾニウムフルオロボレート生成物を生じる。

実施例15 実施例６に従って製造した10gのグルタルアルデヒドPEI
−シリカゲルアフィニティーマトリックスを溶離液のpH
が洗浄用緩衝液のpHと等しくなる（平衡）まで0.1M燐酸
塩（pH8.0）で洗浄した。20.0mlの25mg/ml人|gG溶液
（0.1M燐酸緩衝液、pH8.0中）をアフィニティーマトリ
ックスに加えた。濃縮した蛋白質溶液を反応容量を小さ
く保つ為に使用し、反応を一夜４℃で進行させた。アフ
ィニティーマトリックスを共有結合していない物質を除
去する為に次の緩衝液の順番で洗浄した。0.1M燐酸塩、
0.1M燐酸塩＋1.0M NaCl、0.1M燐酸塩。全ての緩衝液の
pHは8.0に調整した。未反応位置をキャップするために
アフィニティーマトリックスを次に0.2Mエタノールアミ
ン、pH8.0で４℃で１〜３時間洗浄した。アフィニティ
ーマトリックスを0.1M隣接塩でpH7.0で平衡にした。マ
トリックスを４℃で貯蔵した。0.1％ナトリウムアミド
を防腐剤として加えた。96％の免疫のグロブリン蛋白質
を分析によって、そして逆相HPLCで測定されるように固
定し、その免疫グロブリン蛋白質の量は溶液に残った。
固定した抗体はこの溶液中にペプチドが抗体アフィニテ
ィ−マトリックスの充填カラム上を通過させられたとき
に、その特異的な抗体ソマトロトロビンの保持によって
決定されるように、免疫的に活性であった。構造的に関
連したペプチドはカラムにより保持されなかった。

実施例16 実施例６に従って製造した5gのグルタルアルデヒドPEI
−シリカゲルアフィニティーマトリックスを溶離液のpH
が洗浄用緩衝液のpHと等しくなる（平衡）まで0.1Mアセ
テート（pH8.7）で洗浄した。10mlの30mg/mlキモトリブ
シン溶液（0.1M酢酸緩衝液、pH8.7中）をアフィニティ
ーマトリックスに加えた。濃縮した蛋白質溶液を反応容
量を小さく保つ為に使用し、反応を一夜５℃で進行させ
た。アフィニティーマトリックスを0.1M酢酸緩衝液、pH
7.0で、共有結合していない物質を除去する為に洗浄し
た。アフィニティーマトリックスを４℃で乾燥のまま、
又は酢酸塩緩衝液（pH7.0）:2−プロパノール（9:1）中
で貯蔵した。90％の酵素が分析により、そして逆相HPLC
で測定されるように固定され、その量の酵素が溶液に残
った。固定した酵素をガラスカラム中に充電し、アミノ
酸及びアミノ酸誘導体をクロマトグラフィーにかけるた
めにクロマトグラフィーマトリックスとして使用した。

実施例17 実施例６に従って製造した50mgのグルタルアルデヒドPE
I−シリカゲル アフィニティーマトリックスを溶離液
のpHが洗浄用緩衝液のpHと等しくなる（平衡）まで、0.
05〜0.1M燐酸塩（pH7.5〜8.5）で洗浄した。2.0mlの0.5
mg/mlガラストースオキシダーゼ溶液（0.05〜0.1M燐酸
塩又はホウ酸塩緩衝液、pH7.5〜8.5中）をアフィニティ
ーマトリックスに加えた。濃縮した蛋白質溶液を反応容
量を最小に保つ為に使用し、反応を一夜４℃で進行させ
た。アフィニティーマトリックスを共有結合していない
物質を除去する為に、次の順番の緩衝液で洗浄した。0.
1M燐酸塩、0.1M燐酸塩＋1.0MNaCl、0.1M燐酸塩。全ての
緩衝液のpHは8.05に調整した。アフィニティーマトリッ
クスを次に0.2Mエタノールアミン又はトリス（pH8.0）
で洗浄し、未反応位置を１〜３時間４℃でキャップし
た。アフィニティーマトリックスを次に0.1M燐酸塩、pH
7.0で平衡にした。アフィニティーマトリックスを４℃
で貯蔵した。分析により、そして逆相HPLCで測定される
ように98％の酸素は固定され、その量の酵素蛋白質が溶
液に残った。固定された酵素をｏ−ジアニシジンを用い
る比色酸価還元反応によっで測定されるように活性であ
った。

実施例18 実施例３に従って製造したトリアジンPEI−シリカゲル
アフィニティーマトリックスを溶離液のpHが洗浄用緩衝
液のpHと平衡になるまで、0.1M燐酸塩（pH7.5）で洗浄
した。2.5mlの1mg/mlパーオキシダーゼ溶液（0.1M燐酸
塩、pH7.5中）をアフィニティーマトリックスに加え、
反応を室温で４時間進行させた。アフィニティーマトリ
ックスを次の緩衝液の順番で共有結合していない物質を
除去する為に洗浄した。0.1M燐酸塩、0.1M燐酸塩＋1.0M
NaCl、0.1M燐酸塩。全ての緩衝液のpHは8.0を使用し
た。アフィニティーマトリックスを次に0.2Mエタノール
アミン（pH8.0）で、１〜３時間室温で洗浄し、未反応
位置をキャップした。次にアフィニティーマトリックス
を次に0.1M燐酸塩、pH7.0で平衡にした。アフィニティ
ーマトリックスを４℃で貯蔵した。固定方法は反応懸濁
液からの上澄み液の280nmに於ける吸光度をモニターす
ることによって追跡した。溶液中の54％の酵素が吸収さ
れた。固定された酵素は可溶性酵素の当量の55％の活性
を示した。

実施例19 50mgのグルタルアルデヒドPEIシリカゲルアフィニティ
ーマトリックスを0.1M燐酸塩緩衝液、pH8で充分洗浄
し、同じ緩衝液で平衡にした。2.5mlのβ−ガラクトシ
ダーゼ0.8mg/ml溶液をアフィニティーマトリックス懸濁
液に加え、固定速度は上澄み液の280nmに於ける吸光度
をモニターすることによって追跡した。

４℃で20時間後、73％の酵素がマトリックスに結合し、
可溶性酵素の特異的活性の40％を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 サニル ブイ．カコドカー アメリカ合衆国 18017 ペンシルバニア 州 ベスルヘン ブレイヤー ロード 889 (56)参考文献 特開 平１−169355（ＪＰ，Ａ) 米国特許4753983（ＵＳ，Ａ)

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）一般式 シリカ−PrSi−PEIＲ）ｘ 〔式中シリカ−PrSi−PEIは （１）ａ）平均粒径約１〜約200ミクロン、平均孔寸法
   約０〜1000オングストローム単位を有する微粒状シリカ
   ゲル、又は ｂ）平均粒径約１〜約200ミクロン及び平均孔寸法約０
   〜約1000オングストローム単位を有する微粒状の抑制さ
   れた孔のガラス、 と （２）約400〜約1800の平均分子量を有するポリエチレ
   ンイミノプロピルトリメトキシシラン、 との反応生成物である、共有結合した架橋されていない
   ポリエチレンイミン結合相固体支持体である〕の支持
   体、 又は （ｂ）グラム当たり約0.3〜約1.2カルボキシルミリ当量
   を含有する、 シリカ−PrSi−PEIＲ）ｘの固体支持体の二塩基酸無
   水物による弱酸性カルボキシル化生成物、 からなる群から選ばれる固装支持体 〔但し、弱酸性カルボキシル化支持体でないときは、 Ｒは、Ｒがそれの二つの別々の場所の一つに於てPEIの
   第１級及び第２級のアミノ基の両方に共有結合されるよ
   うになる、そして水性の加水分解緩衝条件下で安定な第
   二の共有結合を形成するためにそれのもう一方の位置を
   アフィニティークロマトグラフィーリーガンドによる非
   変性条件下での後の親核置換に利用出来、反応性である
   ようにしている、上記二つの別々の位置で親核置換を受
   けることの出来る任意の化学的に反応性の部分の残基を
   表わし、 ｘはPEI部分の第１級又は第２級アミノ基の合計数より
   も小さいか又は等しい整数であり、 弱酸性カルボキシル化支持体である場合に於ては、 Ｒは、アフィニティークロマトグラフィーリーガンド上
   で親核官能基によりカルボキシル炭素に於て容易に置換
   されるように、カルボニル炭素に共有結合を形成し、そ
   れによって充分に親核性の位置を造るために、アルボキ
   シルのヒドロキシルの親核置換を促進することの出来る
   任意の化学的に反応性の部分の残基であり、 ｘはカルボキシル化PEI部分のカルボニル基の合計数よ
   りも小さいか又は等しい整数である〕。
2. 【請求項２】シリカゲルが平均粒径約３〜約70ミクロン
   を有し、平均孔寸法約50〜約1000オングストローム単位
   を有する特許請求の範囲第１項に記載の固相支持体。
3. 【請求項３】Ｒが からなる群から選ばれる特許請求の範囲第１又は２の何
   れかに記載の固相支持体。
4. 【請求項４】固相支持体が特許請求の範囲第１、２又は
   ３の何れか一の固相である、酵素がアフィニティークロ
   マトグラフィーマトリックス固相支持体上に固定されて
   いる固定固相酵素。
5. 【請求項５】（ａ）式 シリカ−PrSi−PEIＲ）ｘ 〔式中シリカ−PrSi−PEIは （１）ａ）平均粒径約１〜約200ミクロン、平均孔寸法
   約０〜1000オングストローム単位を有する微粒状シリカ
   ゲル、又は ｂ）平均粒径約１〜約200ミクロン及び平均孔寸法約０
   〜約1000オングストローム単位を有する微粒状の抑制さ
   れた孔のガラス、 と （２）約400〜約1800の平均分子量を有するポリエチレ
   ンイミノプロピルトリメトキシシラン、 との反応生成物である、共有結合した架橋されていない
   ポリエチレンイミン結合相固体支持体である〕のマトリ
   ックス、 又は （ｂ）グラム当たり約0.3〜約1.2カルボキシルミリ当量
   を含有する、 シリカ−PrSi−PEIＲ）ｘ 固体支持体の二塩基酸無
   水物による弱酸性カルボキシル化生成物、 からなる群から選ばれるアフィニティーマトリックスに
   共有結合されたリーガンドを含んでいる、リーガンドの
   結合されたクロマトグラフィーアフィニティーマトリッ
   クス。 〔但し、弱酸性カルボキシル化支持体でないときは、 Ｒは、Ｒがそれの二つの別々の場所の一つに於てPEIの
   第１級及び第２級の両方のアミノ基に共有結合されるよ
   うになる、そして水性の加水分解緩衝条件下で安定な第
   二の共有結合を形成するためにそれのもう一方の位置を
   アフィニティークロマトグラフィーリーガンドによる非
   変性条件下での後の親核置換に利用出来、反応性である
   ようにしている、上記二つの別々の位置で親核置換を受
   けることの出来る任意の化学的に反応性の部分の残基を
   表わし、 ｘはPEI部分の第１級又は第２級アミノ基の合計数より
   も小さいか又は等しい整数であり、 弱酸性カルボキシル化支持体である場合に於ては、 Ｒは、アフィニティークロマトグラフィーリーガンド上
   で親核官能基によりカルボキシル炭素に於て容易に置換
   されるように、カルボニル炭素に共有結合を形成し、そ
   れによって充分に親核性の位置を造るために、カルボキ
   シルのヒドロキシルの親核置換を促進することの出来る
   任意の化学的に反応性の部分の残基であり、 ｘはカルボキシル化PEI部分のカルボニル基の合計数よ
   りも小さいか又は等しい整数である〕。
6. 【請求項６】シリカゲルが平均粒径約３〜約70ミクロン
   を有し、平均孔寸法約50〜約1000オングストローム単位
   を有する特許請求の範囲第５項に記載のリーガンドの結
   合されたクロマトグラフィーアフィニティーマトリック
   ス。
7. 【請求項７】Ｒが からなる群から選ばれる特許請求の範囲第５又は６の何
   れかに記載のリーガンドの結合されたクロマトグラフィ
   ーアフィニティーマトリックス。
8. 【請求項８】溶液中のある物質を、その物質に対するア
   フィニティーマトリックス共有結合リーガンドを有する
   アフィニティーマトリックスと結合させることによっ
   て、溶液からその物質を分離又は精製する方法に於て、
   アフィニティーマトリックスとして特許請求の範囲第
   １、２、又は３の何れかの一の固相支持体を使用するこ
   とからなる方法。