JPH0342076B2 - - Google Patents
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- JPH0342076B2 JPH0342076B2 JP60085598A JP8559885A JPH0342076B2 JP H0342076 B2 JPH0342076 B2 JP H0342076B2 JP 60085598 A JP60085598 A JP 60085598A JP 8559885 A JP8559885 A JP 8559885A JP H0342076 B2 JPH0342076 B2 JP H0342076B2
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、酵素又は酵素を産生する微生物の固
定化法によるパラチノースの製造法に関する。 特殊な化学的転換反応を行なうために微生物の
細胞に由来する酵素を用いることは良く知られて
いる。そのような転換反応において、細胞を含ま
ない酵素調製物、裂開細胞又は全細胞が生体触媒
源として使用できる。遊離の酵素又は細胞は、バ
ツチ式工程で効果的に使用できるが、連続式の工
業的規模の工程に役立たない。この難点は、固定
化酵素を種々の形体で製造することに興味を増大
させてきた。 米国特許第3779869号（1973年12月18日付け）
は、全バクテリア細胞をグルタルアルデヒドで処
理することによるグルコースイソメラーゼ活性の
安定化を開示している。裂開細胞の固定化にグル
タルアルデヒドを用いて、グルコースイソメラー
ゼ活性を有する合着した固定生成物を製造する方
法は米国特許第3980521号（1976年９月14日付け）
に開示されている。 米国特許第4060456号（1977年11月29日付け）
は、カチオン性ポリ電解質凝集剤例えばポリエチ
レンイミン又はポリビニルピロリドンで処理する
ことによつてグルコースイソメラーゼ活性を有す
る微生物の細胞物質を安定化する方法を含んでい
る。関連する活性酵素を有する微生物の細胞の安
定化にポリ電解質例えばポリアミン及びカチオン
性ポリアクリルアミドを用いることは米国特許第
3989596号（1976年11月２日付け）に開始されて
いる。 Onoらは、アミノヘキシルセルロース及びシア
ノーゲンブロマイドで活性化されたチヤイニー
ズ・ガロタンニン（Chinese Gallotannin）の反
応によつて製造されるタンニン−アミノヘキシル
セルロースに酵素を吸着させることによつて黒色
麹菌クロカビからナリンギーゼを固定する方法
を、Agric・Biol.Chem.、42（10）、1847〜1853
（1978）に記述している。 Ohbaらは、Biotechnology and
Bioengineering、XX、665〜676（1978）におい
て、好熱性のストレプトマイセス・フラボクロモ
ゲネスの培養液にタンニン酸を添加してタンニ
ン−プルナーゼ（Pullulanase）付加物を生成さ
せ、次いでこれをTEAE−セルロースに結合させ
ることにより、プルラナーゼが成功裏に固定化で
きることを開示している。 米国特許第4212943号（1980年７月15日付け）
においては、バクテリヤの細胞物体を、グルタル
アルデヒド又はシアヌル酸ハライド及びエピハロ
ヒドリンとアルキレンポリアミンとの重合で得ら
れるカチオン性重合体の架橋した反応生成物と、
接触させることによつて製造される増大した粒子
硬度を有するバクテリヤ細胞の凝集物を開示して
いる。 本発明は、 (i)(a) 細胞を含有する水性媒体を準備し； (b) この水性媒体に、タンニン；長鎖ポリアミ
ンのカチオン性凝集剤及び架橋剤を導入して
反応生成物を生成せしめ； (c) 反応生成物を水性媒体から分離し； 及び (d) 反応生成物を乾燥する、工程によつてプロ
タミノバクター・ルブラムに属するパラチノ
ース生産性細胞を固定化し； 及び (ii) 反応生成物をスクロースと接触させ、それに
よつてこれをパラチノースに転化する、ことを
含んでなるパラチノースの製造法に関する。 本明細書に開示され且つ特許請求されている固
定化法は、関連する従来法よりも非常に硬い反応
生成物を与えるが、固定化酵素の生体触媒活性に
は影響しないことが発見された。本発明によつて
付与される物理的強度の予期を越えた改善は、カ
ラム床反応器で長期間使用する場合に弱い糸で遭
遇する問題を排除する。その理由は、強度の弱い
材料は軟化又は膨潤を示しがちであり、その結果
通流抵抗又は閉塞及び／又はチヤンネリングをも
たらすからである。 本発明の方法で固定化しうる生体触媒材料は、
全発酵収穫物又は液或いはそれに由来する部分
的に精製した材料であつてよい。全又は裂開細胞
並びに遊離の酵素は、本系を用いて固定化でき
る。 固定化すべき材料の収穫は、過剰の架橋剤と反
応して架橋剤／凝集剤付加物を生成する長鎖ポリ
アミンのカチオン性凝集剤を用いることによつて
達成される。 適当な凝集剤は、ポリアミンカチオン性物質、
例えばポリ（アクリルアミド）、ポリ（エチレン
イミン）、ポリ（２−ヒドロキシプロピル−１−
Ｎ−メチルアンモニウムクロライド）、ポリ（２
−ヒドロキシプロピル−１，１−ジメチルアンモ
ニウムクロライド）、ポリ−〔Ｎ−（ジメチルアミ
ノメチル）−アクリルアミド〕、ポリ（ジアリルジ
メチルアンモニウムクロライド）、ポリ（Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノエチルメタクリレート）又はポ
リ〔Ｎ−ジメチルアミノプロピル〕−メタクリル
アミドである。好適な凝集剤は、食品工業に適合
することが証明されているBetz Laboratories、
Inc.（Trevose、Pennsylvania）から商品名
BETZ1180として市販されているエピハロヒドリ
ンポリアミン共重合体である。BETZ1180は、
100万以下の分子量を有し、溶液１ｇ当り約0.288
ミリモルのアミノ基（ニンヒドリン評価による）
を含有し、全溶液重量に基づいて30重量％の固体
を含有する溶液として市販されている。この化合
物は米国第3915904号及び第3953330号に開示され
ている。これらには、この化合物はエピハロヒド
リンを、式 R1R2NRNH2 〔式中、Ｒは炭素数２〜約６の低級アルキレン
であり、及びR1及びR2はそれぞれ炭素数１〜約
６の低級アルキルである〕 を有するアルキレンポリアミンとの重合によつて
得られる水溶性でカチオン性の重合体であり；こ
こでエピハロヒドリンとポリアミンのモル比は約
0.6：１〜約2.7：１であり、該重合は重合させる
べきエピハロヒドリンの量の約50〜約90％をアル
キレンポリアミンと反応させ、反応媒体が実質的
に均一な粘度に達するまで反応を継続し、そして
エピハロヒドリンの残りの部分を漸増的に反応さ
せてカチオン性重合体を製造することを含んでな
り、この際この重合反応の温度は約60℃〜約120
℃である、方法によつて製造される水溶性のカチ
オン性重合体として記述されている。 適当な架橋剤は多官能性アルデヒド例えばグル
タルアルデヒド又はジアルデヒド殿粉、多官能性
有機ハライド例えばシアヌル酸クロライド又は
１，５−ジフルオル−２，４−ジニトロベンゼ
ン、多官能性無水物例えばピロメリツト酸無水物
又はエチレン／無水マレイン酸共重合体、多官能
性アゾ化合物例えばジアゾベンジジン、多官能性
イソシアネート例えばヘキサメチレンジイソシア
ネート、多官能性イソチオシアネート例えば４，
4′−ジイソチオシアナトビフエニル−２，2′−ジ
スルホン酸及び脱水的縮合反応剤例えばクロルぎ
酸エチル、ウツドワーズ試薬Ｋ、Ｎ，N′−ジシ
クロヘキシルカルボジイミド又はＮ−ヒドロキシ
スクシニミドを含む。架橋は、凝集剤及び架橋剤
を別々に生体触媒を含有する媒体に導入すること
により、或いは好ましくは媒体へ添加するための
付加物を生成する予備反応によつて達成できる。
固定化すべき材料対架橋剤の反応性の能力は、過
剰の架橋剤が生体触媒活性を失なわせ或いは不必
要な出費をもたらすから、決定しなければならな
い。多官能性アルデヒドを架橋剤として用いる場
合、アルデヒドとの反応性を決定するためにホル
モール滴定（Formoltitration）と呼ばれる反応
を使用する。この工程は、アルデヒドで固定化さ
れうる材料の容易に反応するアミン含量の量を示
し、次のように行なわれる： 材料の１dl部分を250mlのビーカに入れる。水
50〜75mlを添加して容易に撹拌できるように材料
を稀釈する。磁気撹拌子を加え、PH計及び水酸化
ナトリウムを用いて材料をPH8.5に調節する。PH
が8.5で一定になつたとき（細胞内交換のために
数分間を要する）、10〜15％（Ｗ／Ｗ）メタノー
ルで安定化した試薬級37％（Ｗ／Ｗ）ホルムアル
デヒド3.0mlを添加する。PHは遊離のアミノ基と
アルデヒドの反応のために低下する。 水酸化ナトリウムの標準、例えば1.0Nの溶液
を用いることによつてPHを8.5に戻し、５分間安
定するまでこのPHに保つ（全必要時間約20〜25分
間）。アルカリの必要量はミリ当量／dlとして表
現されるホルモール滴定値である。 材料の最高凝集のために望ましい凝集剤の量は
好適な操作法において決定される。段階的添加法
が用いられ、最高凝集は凝集した材料の遠心分離
によつて得られる上澄液に更に凝集剤を添加する
ことによつて知ることができる。中性付近のPHは
普通この決定に対して最良であるが、生体触媒の
安定性のために制限があるならばいくらかの変化
も許容できる。 凝集すべき材料は、そのままの状態の或いはタ
ンニン添加及び／又は架橋剤添加後の材料であつ
てよい。凝集剤はポリアミン又はポリアミンと架
橋剤との反応生成物であつてよい。最適な工程
は、最高凝集及び所望の生体触媒の、無関係な液
体からの分離を達成するための凝集剤必要量を決
定する際に従つた工程の結果に基づくべきであ
る。 凝集させるべき材料の500ml部分を取り、2N水
酸化ナトリウム溶液又は2N塩酸溶液でPHを7.0に
調節する。次いでPHを７に維持しながら、凝集剤
調製物を公知の量で徐々に添加する。凝集が達成
されるまで添加を行ない、混合物を約10分間撹拌
させる。少量の試料（1.7mlの試料２つ）を取り、
５分間1000×ｇで遠心分離にかける。上澄液を小
さい試験管へ注入する。 上澄液の一方を撹拌し且つ注意深く観察しなが
ら更に少量の凝集剤を添加する。更なる凝集が認
められる場合には、撹拌し且つPHを７に維持しな
がら更なる凝集剤を主要部分に添加する。（この
添加量は最初の添加量の10又は20％であるべきで
ある）。10分間混合した後、試料採取と遠心分離
を繰返す。 上澄液に更に凝集剤を添加したときにその以上
の凝集が検知できなくなるまで上記工程を継続す
る。凝集剤が過剰で存在するときには、得られた
他の上澄液試料は、最初の凝集させるべき材料の
少量の試料を添加して或いは希タンニン溶液を添
加して検討することができる。 用いる凝集剤の最適量の良好な決定は、上述の
方法で行なうことができる。生物触媒が可溶性の
外部細胞物質である場合には、生体触媒の最高沈
殿がこの材料塊の最高凝集と一致しないかも知れ
ないから、上記工程をPHに関して変化させて行な
い、上澄液の生体触媒活性を検査する。 本明細書に用いる如きタンニンとは、加水分解
型又は縮合型のいずれかを含む。適当なタンニン
源はクリの木及び木皮、及びペカンの外皮並びに
アーモンドの外皮である。経済的な観点から、ケ
ブラコは好適なタンニン源である。ケブラコ・タ
ンニンの他に、タンニン酸（分子量3100〜3400）、
ガンビエル・タンニン（分子量520）及びミロバ
ラン・タンニン（分子量1900）も適当である。 用いるタンニンの選択には、その架橋剤との共
凝集及び反応性に関してポリカチオン性凝集剤の
タンニンとの相対化学量論量を決定することが望
ましい。 ポリアミン凝集剤の、アルデヒドとの反応性
は、前述したホルモール滴定法を僅かに改変した
方法で決定することができる。凝集剤の１dl試料
の代りに、３ml（又はｇ）部分を使用し、水で
150〜175mlまで希釈させるべきである。工程のバ
ランスは、凝集剤のミリ当量／ml又はｇで表現さ
れる最終的な滴定量と同一であるべきである。 タンニンの、凝集剤に対する共凝集同等性は、
最適な凝集量の決定に対する上述の方法の改変法
によつて決定される。凝集剤１ml（又はｇ）を水
で500mlまでに稀釈し、PHを2N水酸化ナトリウム
又は2N塩酸溶液で７に調節する。PHを撹拌しな
がら７に維持し、沈殿が起こるまでタンニンの４
ｇ／dl溶液を公知の量から添加する。10分間混合
した後、1.7mlの試料を２つ取り、10000×ｇで５
分間遠心分離にかける。上澄液を小さい試験管に
注入し、材料、タンニン又は凝集剤が溶液中に過
剰量で存在することを決定するために沈殿を観察
しながら希釈凝集剤又はタンニン溶液を更に少量
添加する。タンニン溶液の更なる添加がそれ以上
沈殿を与えなくなるまで添加を継続する。次いで
凝集剤１ml（又はｇ）の共凝集に対して添加され
るタンニンの量を当量として表示する。 凝集剤をその架橋剤との反応生成物として用い
る場合、凝集力は未反応の物質のそれよりいくら
か低下するであろう。そのタンニン当量は上述の
工程における反応生成物を用いて直接決定でき
る。 試剤の量の決定に対して前述の滴定法を用いる
ことは、商業的に適当な量の生体触媒を固体化す
るために望ましい手段となろう。しかしながら、
その使用が実用的でない場合には、水性媒体から
凝集によつて回収できる材料の各10ｇ／に対
し、タンニン0.5〜1.0ｇ／、凝集剤1.0〜1.5ｇ
及び架橋剤0.7〜2.5ｇを用いることによつて最適
量の近似を得ることができる。 本発明で開示される生体触媒の固定化法は、生
体触媒が全細胞、裂開細胞又は遊離酵素の形で存
在しているかどうかに拘らず有効であることが発
見された。本方法で固定化できる酵素を生産する
有機体（及びこれによつて生産される酵素）はプ
ロタミノバクター・ルブラム（Protaminobacter
Rubrum）に属するパラチノース生産性細胞であ
る。 次の実施例は本発明の実施法を更に例示する。 実施例 （参考例） 発酵液（可溶性酵素）からの生体触媒粒子 粉末のグルコアミラーゼ〔アスペルギルスフエ
テイダス（Aspergillus Foetidus）ATCC14916
から得られた酵素〕調製物80ｇを水2000mlに溶解
することによつて復元したグルコアミラーゼ液
を調製した。得られた溶液の１部分1900mlを、酢
酸で７に調節したPHにおいて、ポリ（エチレンイ
ミン）の５ｇ／dl水溶液11mlで凝集させた。この
ポリ（エチレンイミン）（PEI）の量は凝集に必
要であると定量された量より20％過剰であつた。 この凝集したスラリーに、タンニン酸（NF
級）の４ｇ／dl水溶液9.6mlを添加した。これは
用いたPEIの過剰量の凝集に対して当量であるこ
とがわかつたタンニン酸の量である。 グリタルアルデヒド（３ミリ当量）を、水約
100ml中グルタルアルデヒドの25％（Ｗ／Ｗ）溶
液0.6mlの希釈物として添加した。この量はホル
モール滴定で決定される化学量論的必要量に基づ
いた。 最終PHを1N水酸化ナトリウム溶液で6.5〜7.5に
調節し、１時間室温で放置した後、凝結した固体
を約10000×ｇで15分間遠心分離することによつ
て回収した。次いで湿つた固体を押し出し、ヌー
ドル状の粒子を、50℃で空気が僅かに通流する真
空で乾燥した。得られる乾燥した押出し物を粒
子に破砕した。この粒子は、PH4.2の0.1M酢酸ナ
トリウム緩衝液中のマルトース１ｇ／dlの溶液に
50℃で添加したとき、望ましい生体触媒（グルコ
アミラーゼ）活性を有することが発見された。こ
の生体触媒活性は、DEXTROSTIX 試剤試験
紙での検査によつて決定できるように、物質中の
グルコースの濃度の増加によつて決定できた。グ
ルコース濃度は、物質50mlと生体触媒200mgとの
混合物中、室温下に２分間で、約０から20mg／dl
まで増加した。この混合物を撹拌しながら50℃で
培養した。40分後にグルコースの濃度は＞250
mg／dlとなつた。 粒子を過し、洗浄し及び上述の新しい反応部
分に移した。この場合にも、それは再び所望の生
体触媒活性を示し、グルコース濃度は40分間で＞
250mg／dlまで増加した。培養の対照物質は40分
間で約０mg／dlを示した。物質中に継続して浸し
た場合、粒子は重要なほど軟化しないで物理的合
体性を保持した。 実施例 （参考例） 全発酵収穫物からの生体触媒粒子 本実施例では、細胞内グルコースイソメラーゼ
を含有するストレプトマイセス・オリバセアウス
（NRRL3916）の突然変異種を用いた発酵の１部
分を用いた。細胞含量の乾燥重量は7.5ｇ／で
あつた。PH8.5におけるホルムアルデヒドの反応
のホルモール滴定量は7.4ミリ当量であることが
決定された。 発酵の１部分に対して次の添加を行なつた：
1.0ｇのケプラコ抽出タンニン全量を、４ｇ／dl
の濃度で予じめ水に溶解した後に添加した。これ
を収穫物の最初のPH5.15において行なつた。次い
でPHを2N水酸化ナトリウムで9.0に調節した。 後にポリアミン凝集剤として言及されるエピハ
ロヒドリン／ポリアミン共重合体（Betz
Laboratories、Inc.からのBETZ1180）の調製物
を、濃度約3.5％（Ｗ／Ｗ）の水性グルタルアル
デヒドに添加することによつてグルタルアルデヒ
ドと混合した。このポリアミンは予じめ固体約２
％まで希釈したものであり、アミンの添加中PHを
9.0に調節し且つ維持した。最終混合物は、グリ
タルアルデヒド1.77ｇ／及びポリアミン1.3
ｇ／からなり、アルデヒドが0.34ミリ当量／ml
過剰であつた。グルタルアルデヒド及びポリアミ
ンの混合物を、最初の収穫物容量１当り112.5
mlの量でタンニンを含有するPH９に調節した発酵
収穫物に添加した。これはそのような発酵の凝集
に普通の必要量であることがわかつた。最終的な
グルタルアルデヒドの濃度は化学量論的必要量よ
り30ミリ当量／だけ過剰であつた。 ポリアミン／グルタルアルデヒド付加物の添加
後、PHを再び９に調節した。混合物を約３時間熟
成させ、凝固した固体を真空過により円形紙
上に保持した。得られた残渣を紙から除去し、直
径1.5mmのオリフイスを有する10c.c.のプラスチツ
ク製注射器から手動で押し出した。この押出し物
を、適当に空気が流れるフード下で数時間及び60
℃の強制空気炉中で８時間乾燥した。 比較のために、他の調製物、即ち試剤の１つを
省略し或いはタンニン又はグルタルアルデヒドだ
けを凝固物の回収に使用するという他の調製物も
作つた。これらの場合、生成する凝固物は、しば
しば過によつて容易に回収できず、従つて遠心
分離にかけ且つ紙の間でプレスすることによつ
て対比しうる過残渣の水分まで脱水した。他の
回収条件は同一であつた。ポリアミン又はグルタ
ルアルデヒドのいずれかを省略した場合、付加物
は製造できなかつたが、その試剤を付加物調製物
と同の希釈で使用した。タンニンそれ自体もPH９
よりも良好な凝集を与えるPH７で評価した。 上述のように調製した乾燥材料を乳鉢及び乳棒
で手動により穏やかに粉砕し、24号メツシユ
Tylerふるいを通過し且つ28号メツシユTylerふ
るいに留まる粉砕材料を集めた。この材料に対
し、圧縮セル中での再水和後の強度及び試料を元
の再水和容量の断片容量（Fractional Volume）
まで圧縮するのに必要な仕事から決定される相対
強度を評価した。 硬度はバクテリヤ細胞の凝固粒子の圧縮に対す
る抵抗性に関して表現される。Instron
Universal試験機1102型を、米国特許第3935069
号に記述されているのと同様の方法で用いた。こ
の装置はInstron Corp.（Canton、Massachustts）
製のものである。 上述のInstron試験機で用いる負荷又は試験セ
ルは、内径4.37cm、外径6.54cm及び高さ21.8cmの
透明なアクリルプラスチツク製シリンダーからな
つた。底部は開口3.81cm、厚さ0.635mのステツプ
を有し、ミクロフイルターの支持部を構成した。
簡便なミクロフイルターは直径約0.2032mmの開口
14500を有する織物の紡糸に用いる紡糸口金であ
つた。 上記シリンダー中を共軸的に移動させるため
に、直径4.3cm及び長さ13.66cmの304型ステンレ
ス鋼製プランジヤーを取りつけた。試料の深さ
10.17cmを示すために、負荷セルに沿つて適当な
しるしをつけた。減圧又は真空を負荷セルの底部
に適用するために及びミクロフイルターを通過す
る液体を集めるための手段もつくつた。 バクテリヤ細胞凝固物の試料を上記負荷セル中
に入れ及びプランジヤーを通して試料に圧力を適
用する場合、試料は圧縮されよう。試料を与えら
れた量に圧縮するために必要とされる圧力は試料
の硬度の尺度である。 この実験の結果を第表に示す： 第 表 試 料 相対強度 上述の処理 ＝100 タンニン省略 68 グルタルアルデヒド省略 49 ポリアミン省略 0* グルタルアルデヒドだけ ０ タンニンだけ（PH９） ０ タンニンだけ（PH７） ０ ＊これらの試料は、再水和時にその粒子の合体
性を失ない、適当に試験するには不適当な強
度しか有さなかつた。 すべての上記粒子は、所望の生体触媒（グルコ
ースイソメラーゼ）活性を示した。 実施例 （参考例） 発酵収穫物からの生体触媒粒子 発酵収穫物をストレプトマイセス・オリバセア
ウス（NRRL3916）の突然変異種から回収する
本実施例において、グルタルアルデヒド過剰量
を、最終混合物において30ミリ当量／から４ミ
リ当量／まで減少させた。 用いた方法は、ポリアミン／グルタルアルデヒ
ド付加物の１部だけを添加し、次いで更なるポリ
アミン（同一希釈のもの）を添加し凝集を行なう
ものであつた。 最初の収穫物１当り0.5ｇ及び1.0ｇのタンニ
ン酸の添加は４ｇ／dlの水溶液を用いて行なつ
た。他の回収条件は前実施例の通りであつた。得
られる再水和した粒子の強度を第表に示す。 第 表 試 料 相対強度 タンニン酸省略 ＝100 タンニン酸濃度１ｇ／ 110 タンニン酸濃度0.5ｇ／ 111 タンニン酸省略、アルデヒド過剰30ミリ当量／
94 タンニン酸１ｇ／量は、ポリアミン／グルタ
ルアルデヒド付加物の27％の共凝集に対して同等
であつた（0.5ｇ／量に対して13.5％）。 すべての粒子は所望の生体触媒（グルコースイ
ソメラーゼ）活性を示した。 実施例 （参考例） 発酵収穫物からの生体触媒粒子 ストレプトマイセス・オリバセアウス
（NRRL3916）の突然変異種の発酵収穫物が本実
験の出発原料であつた。これは7.35ｇ／の乾燥
細胞含量、7.3のPH及びPH8.5において44.7ミリ当
量／のアルデヒド反応性能力を有した。 発酵収穫物の227部分を2.5N水酸化ナトリウ
ムで処理してPHを9.0にした。次いで実施例に
おける如く製造したポリアミン／グルタルアルデ
ヒド付加物25を混合しながら徐々に添加した。
最終PHは8.8であつた。１時間穏やかに撹拌した
後、凝固した固体を過によつて回収した。この
固体残渣を押し出し、強制空気中で60℃下に乾燥
し、粗い粒子に粉砕した。 同様の方法で、収穫物257にケブラコ・タン
ニン抽出物257ｇを3.9ｇ／dl水溶液として添加し
た。混入してから１時間後に2.5N水酸化ナトリ
ウムでPHを7.2〜9.0に調節した。次いでポリアミ
ン／グルタルアルデヒド付加物28.3を撹拌しな
がら、徐々に添加した。 タンニンを含まない第１の部分における如き回
収後、同様の大きさの粒子を再水和してから機械
的強度に対して評価した。タンニンを含まない試
料の相対強度は100であり、一方タンニンを含む
試料は190の相対強度を有することがわかつた。 これらの粒子は所望の生体触媒（グルコースイ
ソメラーゼ）活性を示した。 実施例 （参考例） 発酵収穫物からの生体触媒粒子 実施例に記述した種類の他の発酵物、即ち乾
燥細胞含量が6.26ｇ／であり及びPHが5.3であ
るものを使用した。PH8.5におけるアルデヒド反
応性材料は32.1ミリ当量／であつた。前実施例
におけるものと同様の工程下に、試剤の量を次の
ようにした： 部分１：収穫物200 ポリアミン／グルタルアルデヒド18.8
部分２：収穫物189 ケプラコ・タンニン抽出物189ｇ ポリアミン／グルタルアルデヒド17.7
同一の粒子径を有する各々の部分を再水和後強
度に関して評価した。 試 料 相対強度 タンニンなし ＝100 タンニン添加 224 粒子は所望の生体触媒（グルコースイソメラー
ゼ）活性を示した。 実施例 （参考例） 発酵収穫物からの生体触媒粒子 バチルス・リケニホルミスATCC31604の突然
変異種の発酵収穫物を傾斜してそれをいくつかの
非細胞濃密固体から分離した。PH8.5におけるホ
ルモール滴定によつて決定したアルデヒド反応性
含量は91.3ミリ当量／であつた。 500ml部分を取り、PH８に調節した。次に実施
例において製造した如きポリアミン／エピハロ
ヒドリン及びグルタルアルデヒド付加物150mlを
添加した。この量は最良の凝集に対して必要とさ
れるものよりもいくらか過剰であつた。次いでケ
ブラコ・タンニン抽出物を４ｇ／dl溶液10mlとし
て添加した。１時間放置した後、凝固した固体を
遠心分離によつて回収し、次いでプラスチツク製
シリンジを用いて押し出し、及び強制空気炉中に
おいて60℃で乾燥した。 乾燥した材料を穏やかに粉砕することによつて
粒子を得た。これらの粒子を40％Ｗ／Ｗグルコー
ス溶液中で再水和したとき、それは70℃で24時間
連続的に浸した後もその物理的全体性及び生体触
媒（グルコースイソメラーゼ）活性を保持した。 実施例 パラチノースを生産する酵素活性を含有するパ
イオマスの固定化 ２つの14のChemapec LF−14型発酵器（有
効容量10）中において小規模の発酵の研究を行
なつた。この各発酵器は溶存酸素及びPHの測定手
段を備え、及び管を通して発酵器からの廃ガス中
のCO2、アルゴン、酸素、窒素、H2O及びNH3を
測定するためにPerkin−Elmer MGA−1200型
のプロセスガス分析機に周期的に連結した；勿論
CO2は主たる興味であつた。 発酵媒体は0.1％（NH4）2HPO4及び2.0％コー
ン・スチーブ液を補充した5Brixの濃度の大根の
濃密ジユースからなつた。 発酵容器に、原培養物を上述の媒体中で生育さ
せ、次いで接種前に24時間290rpmで回転する回
転振とう機中で30℃下に培養することによつて得
られるプロタミノバクター・ルブラム
（CBS574.77）接種物100mlを接種した。約15時間
後、続く安定化実験で使用されるバイオマスを発
酵容器から回収した。 本発明の範囲内の固定化法（方法２）及び本発
明の範囲内でない４つの方法は、ホルモール滴定
値が0.61ミリ当量／の上述の発酵液で行なつ
た。 固定化法 方法 １ 全液の500mlを1.0NNaOHでPH4.95から6.5に調
節した。これに次の如く製造したグルタルアルデ
ヒド／ポリアミン付加物55mlを添加した： １ H2O中でBETZ1180の11.67ｇを100mlに希
釈； ２ PH9.0に調節； ３ H2O中で25％グルタルアルデヒド17.8mlを
100mlに希釈； ４ BETZ1180溶液をグルタルアルデヒドに
徐々に添加； ５ PHを9.0に再調節； 及び組合せ物を25℃で１時間反応させた。 方法 ２ 全液500mlに、細胞の凝集が起こるまでケブラ
コ・タンニン4.0ｇ／dlの溶液12.5mlをゆつくり
添加した。この溶液を30分間25℃に維持し、この
時点で溶液のPHを1.0NNaOHで6.5に調節し、方
法１に記述した如く製造したグルタルアルデヒ
ド／ポリアミン溶液65mlを添加した。次いで溶液
を25℃に１時間維持した。 方法 ３ 全液500mlに4.0％Ｗ／Ｖケブラコ・タンニン
12.5mlを添加した。1.0NNaOHでPHを6.5に調節
した後、1.67％グルタルアルデヒド60mlを添加
し、溶液を25℃に維持した。 方法 ４ 全液500mlに10％Ｗ／Ｖポリエチレンイミン
（PEI）2.5mlを添加した。これを30分間25℃に保
つた。この溶液のPHを1.0NNaOHで6.5に調節し、
1.67％Ｗ／Ｖグルタルアルデヒド50mlを添加し
た。得られたものを１時間25℃に維持した。 方法 ５ 全液500mlを10％PEI溶液でPH５に調節した。
この溶液を30分間25℃に維持し、このとき1.67％
Ｗ／Ｖグルタルアルデヒド50mlを添加した。 上記方法のすべてにおいて、凝集した細胞を沈
降させ、上澄液を傾斜した。このスラリーの残り
を、Sorvall RC−2B型遠心分離機においてGSA
型ヘツド（Head）を用いることにより、25℃で
10分間10000rpmで遠心分離にかけた。次いでこ
の固定化された沈殿バイオマスを、針をつけてな
い注射器の開口（1.1〜1.5mm）を通して標準的な
100mlの皮下用注射器から手圧下に押し出した。
ヌードル状の押出し物を強制空気乾燥炉中で40℃
下に乾燥し、更なる試験のために適当な寸法の粒
子に破砕した。そのような試験の結果を第表に
示す。 【表】
定化法によるパラチノースの製造法に関する。 特殊な化学的転換反応を行なうために微生物の
細胞に由来する酵素を用いることは良く知られて
いる。そのような転換反応において、細胞を含ま
ない酵素調製物、裂開細胞又は全細胞が生体触媒
源として使用できる。遊離の酵素又は細胞は、バ
ツチ式工程で効果的に使用できるが、連続式の工
業的規模の工程に役立たない。この難点は、固定
化酵素を種々の形体で製造することに興味を増大
させてきた。 米国特許第3779869号（1973年12月18日付け）
は、全バクテリア細胞をグルタルアルデヒドで処
理することによるグルコースイソメラーゼ活性の
安定化を開示している。裂開細胞の固定化にグル
タルアルデヒドを用いて、グルコースイソメラー
ゼ活性を有する合着した固定生成物を製造する方
法は米国特許第3980521号（1976年９月14日付け）
に開示されている。 米国特許第4060456号（1977年11月29日付け）
は、カチオン性ポリ電解質凝集剤例えばポリエチ
レンイミン又はポリビニルピロリドンで処理する
ことによつてグルコースイソメラーゼ活性を有す
る微生物の細胞物質を安定化する方法を含んでい
る。関連する活性酵素を有する微生物の細胞の安
定化にポリ電解質例えばポリアミン及びカチオン
性ポリアクリルアミドを用いることは米国特許第
3989596号（1976年11月２日付け）に開始されて
いる。 Onoらは、アミノヘキシルセルロース及びシア
ノーゲンブロマイドで活性化されたチヤイニー
ズ・ガロタンニン（Chinese Gallotannin）の反
応によつて製造されるタンニン−アミノヘキシル
セルロースに酵素を吸着させることによつて黒色
麹菌クロカビからナリンギーゼを固定する方法
を、Agric・Biol.Chem.、42（10）、1847〜1853
（1978）に記述している。 Ohbaらは、Biotechnology and
Bioengineering、XX、665〜676（1978）におい
て、好熱性のストレプトマイセス・フラボクロモ
ゲネスの培養液にタンニン酸を添加してタンニ
ン−プルナーゼ（Pullulanase）付加物を生成さ
せ、次いでこれをTEAE−セルロースに結合させ
ることにより、プルラナーゼが成功裏に固定化で
きることを開示している。 米国特許第4212943号（1980年７月15日付け）
においては、バクテリヤの細胞物体を、グルタル
アルデヒド又はシアヌル酸ハライド及びエピハロ
ヒドリンとアルキレンポリアミンとの重合で得ら
れるカチオン性重合体の架橋した反応生成物と、
接触させることによつて製造される増大した粒子
硬度を有するバクテリヤ細胞の凝集物を開示して
いる。 本発明は、 (i)(a) 細胞を含有する水性媒体を準備し； (b) この水性媒体に、タンニン；長鎖ポリアミ
ンのカチオン性凝集剤及び架橋剤を導入して
反応生成物を生成せしめ； (c) 反応生成物を水性媒体から分離し； 及び (d) 反応生成物を乾燥する、工程によつてプロ
タミノバクター・ルブラムに属するパラチノ
ース生産性細胞を固定化し； 及び (ii) 反応生成物をスクロースと接触させ、それに
よつてこれをパラチノースに転化する、ことを
含んでなるパラチノースの製造法に関する。 本明細書に開示され且つ特許請求されている固
定化法は、関連する従来法よりも非常に硬い反応
生成物を与えるが、固定化酵素の生体触媒活性に
は影響しないことが発見された。本発明によつて
付与される物理的強度の予期を越えた改善は、カ
ラム床反応器で長期間使用する場合に弱い糸で遭
遇する問題を排除する。その理由は、強度の弱い
材料は軟化又は膨潤を示しがちであり、その結果
通流抵抗又は閉塞及び／又はチヤンネリングをも
たらすからである。 本発明の方法で固定化しうる生体触媒材料は、
全発酵収穫物又は液或いはそれに由来する部分
的に精製した材料であつてよい。全又は裂開細胞
並びに遊離の酵素は、本系を用いて固定化でき
る。 固定化すべき材料の収穫は、過剰の架橋剤と反
応して架橋剤／凝集剤付加物を生成する長鎖ポリ
アミンのカチオン性凝集剤を用いることによつて
達成される。 適当な凝集剤は、ポリアミンカチオン性物質、
例えばポリ（アクリルアミド）、ポリ（エチレン
イミン）、ポリ（２−ヒドロキシプロピル−１−
Ｎ−メチルアンモニウムクロライド）、ポリ（２
−ヒドロキシプロピル−１，１−ジメチルアンモ
ニウムクロライド）、ポリ−〔Ｎ−（ジメチルアミ
ノメチル）−アクリルアミド〕、ポリ（ジアリルジ
メチルアンモニウムクロライド）、ポリ（Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノエチルメタクリレート）又はポ
リ〔Ｎ−ジメチルアミノプロピル〕−メタクリル
アミドである。好適な凝集剤は、食品工業に適合
することが証明されているBetz Laboratories、
Inc.（Trevose、Pennsylvania）から商品名
BETZ1180として市販されているエピハロヒドリ
ンポリアミン共重合体である。BETZ1180は、
100万以下の分子量を有し、溶液１ｇ当り約0.288
ミリモルのアミノ基（ニンヒドリン評価による）
を含有し、全溶液重量に基づいて30重量％の固体
を含有する溶液として市販されている。この化合
物は米国第3915904号及び第3953330号に開示され
ている。これらには、この化合物はエピハロヒド
リンを、式 R1R2NRNH2 〔式中、Ｒは炭素数２〜約６の低級アルキレン
であり、及びR1及びR2はそれぞれ炭素数１〜約
６の低級アルキルである〕 を有するアルキレンポリアミンとの重合によつて
得られる水溶性でカチオン性の重合体であり；こ
こでエピハロヒドリンとポリアミンのモル比は約
0.6：１〜約2.7：１であり、該重合は重合させる
べきエピハロヒドリンの量の約50〜約90％をアル
キレンポリアミンと反応させ、反応媒体が実質的
に均一な粘度に達するまで反応を継続し、そして
エピハロヒドリンの残りの部分を漸増的に反応さ
せてカチオン性重合体を製造することを含んでな
り、この際この重合反応の温度は約60℃〜約120
℃である、方法によつて製造される水溶性のカチ
オン性重合体として記述されている。 適当な架橋剤は多官能性アルデヒド例えばグル
タルアルデヒド又はジアルデヒド殿粉、多官能性
有機ハライド例えばシアヌル酸クロライド又は
１，５−ジフルオル−２，４−ジニトロベンゼ
ン、多官能性無水物例えばピロメリツト酸無水物
又はエチレン／無水マレイン酸共重合体、多官能
性アゾ化合物例えばジアゾベンジジン、多官能性
イソシアネート例えばヘキサメチレンジイソシア
ネート、多官能性イソチオシアネート例えば４，
4′−ジイソチオシアナトビフエニル−２，2′−ジ
スルホン酸及び脱水的縮合反応剤例えばクロルぎ
酸エチル、ウツドワーズ試薬Ｋ、Ｎ，N′−ジシ
クロヘキシルカルボジイミド又はＮ−ヒドロキシ
スクシニミドを含む。架橋は、凝集剤及び架橋剤
を別々に生体触媒を含有する媒体に導入すること
により、或いは好ましくは媒体へ添加するための
付加物を生成する予備反応によつて達成できる。
固定化すべき材料対架橋剤の反応性の能力は、過
剰の架橋剤が生体触媒活性を失なわせ或いは不必
要な出費をもたらすから、決定しなければならな
い。多官能性アルデヒドを架橋剤として用いる場
合、アルデヒドとの反応性を決定するためにホル
モール滴定（Formoltitration）と呼ばれる反応
を使用する。この工程は、アルデヒドで固定化さ
れうる材料の容易に反応するアミン含量の量を示
し、次のように行なわれる： 材料の１dl部分を250mlのビーカに入れる。水
50〜75mlを添加して容易に撹拌できるように材料
を稀釈する。磁気撹拌子を加え、PH計及び水酸化
ナトリウムを用いて材料をPH8.5に調節する。PH
が8.5で一定になつたとき（細胞内交換のために
数分間を要する）、10〜15％（Ｗ／Ｗ）メタノー
ルで安定化した試薬級37％（Ｗ／Ｗ）ホルムアル
デヒド3.0mlを添加する。PHは遊離のアミノ基と
アルデヒドの反応のために低下する。 水酸化ナトリウムの標準、例えば1.0Nの溶液
を用いることによつてPHを8.5に戻し、５分間安
定するまでこのPHに保つ（全必要時間約20〜25分
間）。アルカリの必要量はミリ当量／dlとして表
現されるホルモール滴定値である。 材料の最高凝集のために望ましい凝集剤の量は
好適な操作法において決定される。段階的添加法
が用いられ、最高凝集は凝集した材料の遠心分離
によつて得られる上澄液に更に凝集剤を添加する
ことによつて知ることができる。中性付近のPHは
普通この決定に対して最良であるが、生体触媒の
安定性のために制限があるならばいくらかの変化
も許容できる。 凝集すべき材料は、そのままの状態の或いはタ
ンニン添加及び／又は架橋剤添加後の材料であつ
てよい。凝集剤はポリアミン又はポリアミンと架
橋剤との反応生成物であつてよい。最適な工程
は、最高凝集及び所望の生体触媒の、無関係な液
体からの分離を達成するための凝集剤必要量を決
定する際に従つた工程の結果に基づくべきであ
る。 凝集させるべき材料の500ml部分を取り、2N水
酸化ナトリウム溶液又は2N塩酸溶液でPHを7.0に
調節する。次いでPHを７に維持しながら、凝集剤
調製物を公知の量で徐々に添加する。凝集が達成
されるまで添加を行ない、混合物を約10分間撹拌
させる。少量の試料（1.7mlの試料２つ）を取り、
５分間1000×ｇで遠心分離にかける。上澄液を小
さい試験管へ注入する。 上澄液の一方を撹拌し且つ注意深く観察しなが
ら更に少量の凝集剤を添加する。更なる凝集が認
められる場合には、撹拌し且つPHを７に維持しな
がら更なる凝集剤を主要部分に添加する。（この
添加量は最初の添加量の10又は20％であるべきで
ある）。10分間混合した後、試料採取と遠心分離
を繰返す。 上澄液に更に凝集剤を添加したときにその以上
の凝集が検知できなくなるまで上記工程を継続す
る。凝集剤が過剰で存在するときには、得られた
他の上澄液試料は、最初の凝集させるべき材料の
少量の試料を添加して或いは希タンニン溶液を添
加して検討することができる。 用いる凝集剤の最適量の良好な決定は、上述の
方法で行なうことができる。生物触媒が可溶性の
外部細胞物質である場合には、生体触媒の最高沈
殿がこの材料塊の最高凝集と一致しないかも知れ
ないから、上記工程をPHに関して変化させて行な
い、上澄液の生体触媒活性を検査する。 本明細書に用いる如きタンニンとは、加水分解
型又は縮合型のいずれかを含む。適当なタンニン
源はクリの木及び木皮、及びペカンの外皮並びに
アーモンドの外皮である。経済的な観点から、ケ
ブラコは好適なタンニン源である。ケブラコ・タ
ンニンの他に、タンニン酸（分子量3100〜3400）、
ガンビエル・タンニン（分子量520）及びミロバ
ラン・タンニン（分子量1900）も適当である。 用いるタンニンの選択には、その架橋剤との共
凝集及び反応性に関してポリカチオン性凝集剤の
タンニンとの相対化学量論量を決定することが望
ましい。 ポリアミン凝集剤の、アルデヒドとの反応性
は、前述したホルモール滴定法を僅かに改変した
方法で決定することができる。凝集剤の１dl試料
の代りに、３ml（又はｇ）部分を使用し、水で
150〜175mlまで希釈させるべきである。工程のバ
ランスは、凝集剤のミリ当量／ml又はｇで表現さ
れる最終的な滴定量と同一であるべきである。 タンニンの、凝集剤に対する共凝集同等性は、
最適な凝集量の決定に対する上述の方法の改変法
によつて決定される。凝集剤１ml（又はｇ）を水
で500mlまでに稀釈し、PHを2N水酸化ナトリウム
又は2N塩酸溶液で７に調節する。PHを撹拌しな
がら７に維持し、沈殿が起こるまでタンニンの４
ｇ／dl溶液を公知の量から添加する。10分間混合
した後、1.7mlの試料を２つ取り、10000×ｇで５
分間遠心分離にかける。上澄液を小さい試験管に
注入し、材料、タンニン又は凝集剤が溶液中に過
剰量で存在することを決定するために沈殿を観察
しながら希釈凝集剤又はタンニン溶液を更に少量
添加する。タンニン溶液の更なる添加がそれ以上
沈殿を与えなくなるまで添加を継続する。次いで
凝集剤１ml（又はｇ）の共凝集に対して添加され
るタンニンの量を当量として表示する。 凝集剤をその架橋剤との反応生成物として用い
る場合、凝集力は未反応の物質のそれよりいくら
か低下するであろう。そのタンニン当量は上述の
工程における反応生成物を用いて直接決定でき
る。 試剤の量の決定に対して前述の滴定法を用いる
ことは、商業的に適当な量の生体触媒を固体化す
るために望ましい手段となろう。しかしながら、
その使用が実用的でない場合には、水性媒体から
凝集によつて回収できる材料の各10ｇ／に対
し、タンニン0.5〜1.0ｇ／、凝集剤1.0〜1.5ｇ
及び架橋剤0.7〜2.5ｇを用いることによつて最適
量の近似を得ることができる。 本発明で開示される生体触媒の固定化法は、生
体触媒が全細胞、裂開細胞又は遊離酵素の形で存
在しているかどうかに拘らず有効であることが発
見された。本方法で固定化できる酵素を生産する
有機体（及びこれによつて生産される酵素）はプ
ロタミノバクター・ルブラム（Protaminobacter
Rubrum）に属するパラチノース生産性細胞であ
る。 次の実施例は本発明の実施法を更に例示する。 実施例 （参考例） 発酵液（可溶性酵素）からの生体触媒粒子 粉末のグルコアミラーゼ〔アスペルギルスフエ
テイダス（Aspergillus Foetidus）ATCC14916
から得られた酵素〕調製物80ｇを水2000mlに溶解
することによつて復元したグルコアミラーゼ液
を調製した。得られた溶液の１部分1900mlを、酢
酸で７に調節したPHにおいて、ポリ（エチレンイ
ミン）の５ｇ／dl水溶液11mlで凝集させた。この
ポリ（エチレンイミン）（PEI）の量は凝集に必
要であると定量された量より20％過剰であつた。 この凝集したスラリーに、タンニン酸（NF
級）の４ｇ／dl水溶液9.6mlを添加した。これは
用いたPEIの過剰量の凝集に対して当量であるこ
とがわかつたタンニン酸の量である。 グリタルアルデヒド（３ミリ当量）を、水約
100ml中グルタルアルデヒドの25％（Ｗ／Ｗ）溶
液0.6mlの希釈物として添加した。この量はホル
モール滴定で決定される化学量論的必要量に基づ
いた。 最終PHを1N水酸化ナトリウム溶液で6.5〜7.5に
調節し、１時間室温で放置した後、凝結した固体
を約10000×ｇで15分間遠心分離することによつ
て回収した。次いで湿つた固体を押し出し、ヌー
ドル状の粒子を、50℃で空気が僅かに通流する真
空で乾燥した。得られる乾燥した押出し物を粒
子に破砕した。この粒子は、PH4.2の0.1M酢酸ナ
トリウム緩衝液中のマルトース１ｇ／dlの溶液に
50℃で添加したとき、望ましい生体触媒（グルコ
アミラーゼ）活性を有することが発見された。こ
の生体触媒活性は、DEXTROSTIX 試剤試験
紙での検査によつて決定できるように、物質中の
グルコースの濃度の増加によつて決定できた。グ
ルコース濃度は、物質50mlと生体触媒200mgとの
混合物中、室温下に２分間で、約０から20mg／dl
まで増加した。この混合物を撹拌しながら50℃で
培養した。40分後にグルコースの濃度は＞250
mg／dlとなつた。 粒子を過し、洗浄し及び上述の新しい反応部
分に移した。この場合にも、それは再び所望の生
体触媒活性を示し、グルコース濃度は40分間で＞
250mg／dlまで増加した。培養の対照物質は40分
間で約０mg／dlを示した。物質中に継続して浸し
た場合、粒子は重要なほど軟化しないで物理的合
体性を保持した。 実施例 （参考例） 全発酵収穫物からの生体触媒粒子 本実施例では、細胞内グルコースイソメラーゼ
を含有するストレプトマイセス・オリバセアウス
（NRRL3916）の突然変異種を用いた発酵の１部
分を用いた。細胞含量の乾燥重量は7.5ｇ／で
あつた。PH8.5におけるホルムアルデヒドの反応
のホルモール滴定量は7.4ミリ当量であることが
決定された。 発酵の１部分に対して次の添加を行なつた：
1.0ｇのケプラコ抽出タンニン全量を、４ｇ／dl
の濃度で予じめ水に溶解した後に添加した。これ
を収穫物の最初のPH5.15において行なつた。次い
でPHを2N水酸化ナトリウムで9.0に調節した。 後にポリアミン凝集剤として言及されるエピハ
ロヒドリン／ポリアミン共重合体（Betz
Laboratories、Inc.からのBETZ1180）の調製物
を、濃度約3.5％（Ｗ／Ｗ）の水性グルタルアル
デヒドに添加することによつてグルタルアルデヒ
ドと混合した。このポリアミンは予じめ固体約２
％まで希釈したものであり、アミンの添加中PHを
9.0に調節し且つ維持した。最終混合物は、グリ
タルアルデヒド1.77ｇ／及びポリアミン1.3
ｇ／からなり、アルデヒドが0.34ミリ当量／ml
過剰であつた。グルタルアルデヒド及びポリアミ
ンの混合物を、最初の収穫物容量１当り112.5
mlの量でタンニンを含有するPH９に調節した発酵
収穫物に添加した。これはそのような発酵の凝集
に普通の必要量であることがわかつた。最終的な
グルタルアルデヒドの濃度は化学量論的必要量よ
り30ミリ当量／だけ過剰であつた。 ポリアミン／グルタルアルデヒド付加物の添加
後、PHを再び９に調節した。混合物を約３時間熟
成させ、凝固した固体を真空過により円形紙
上に保持した。得られた残渣を紙から除去し、直
径1.5mmのオリフイスを有する10c.c.のプラスチツ
ク製注射器から手動で押し出した。この押出し物
を、適当に空気が流れるフード下で数時間及び60
℃の強制空気炉中で８時間乾燥した。 比較のために、他の調製物、即ち試剤の１つを
省略し或いはタンニン又はグルタルアルデヒドだ
けを凝固物の回収に使用するという他の調製物も
作つた。これらの場合、生成する凝固物は、しば
しば過によつて容易に回収できず、従つて遠心
分離にかけ且つ紙の間でプレスすることによつ
て対比しうる過残渣の水分まで脱水した。他の
回収条件は同一であつた。ポリアミン又はグルタ
ルアルデヒドのいずれかを省略した場合、付加物
は製造できなかつたが、その試剤を付加物調製物
と同の希釈で使用した。タンニンそれ自体もPH９
よりも良好な凝集を与えるPH７で評価した。 上述のように調製した乾燥材料を乳鉢及び乳棒
で手動により穏やかに粉砕し、24号メツシユ
Tylerふるいを通過し且つ28号メツシユTylerふ
るいに留まる粉砕材料を集めた。この材料に対
し、圧縮セル中での再水和後の強度及び試料を元
の再水和容量の断片容量（Fractional Volume）
まで圧縮するのに必要な仕事から決定される相対
強度を評価した。 硬度はバクテリヤ細胞の凝固粒子の圧縮に対す
る抵抗性に関して表現される。Instron
Universal試験機1102型を、米国特許第3935069
号に記述されているのと同様の方法で用いた。こ
の装置はInstron Corp.（Canton、Massachustts）
製のものである。 上述のInstron試験機で用いる負荷又は試験セ
ルは、内径4.37cm、外径6.54cm及び高さ21.8cmの
透明なアクリルプラスチツク製シリンダーからな
つた。底部は開口3.81cm、厚さ0.635mのステツプ
を有し、ミクロフイルターの支持部を構成した。
簡便なミクロフイルターは直径約0.2032mmの開口
14500を有する織物の紡糸に用いる紡糸口金であ
つた。 上記シリンダー中を共軸的に移動させるため
に、直径4.3cm及び長さ13.66cmの304型ステンレ
ス鋼製プランジヤーを取りつけた。試料の深さ
10.17cmを示すために、負荷セルに沿つて適当な
しるしをつけた。減圧又は真空を負荷セルの底部
に適用するために及びミクロフイルターを通過す
る液体を集めるための手段もつくつた。 バクテリヤ細胞凝固物の試料を上記負荷セル中
に入れ及びプランジヤーを通して試料に圧力を適
用する場合、試料は圧縮されよう。試料を与えら
れた量に圧縮するために必要とされる圧力は試料
の硬度の尺度である。 この実験の結果を第表に示す： 第 表 試 料 相対強度 上述の処理 ＝100 タンニン省略 68 グルタルアルデヒド省略 49 ポリアミン省略 0* グルタルアルデヒドだけ ０ タンニンだけ（PH９） ０ タンニンだけ（PH７） ０ ＊これらの試料は、再水和時にその粒子の合体
性を失ない、適当に試験するには不適当な強
度しか有さなかつた。 すべての上記粒子は、所望の生体触媒（グルコ
ースイソメラーゼ）活性を示した。 実施例 （参考例） 発酵収穫物からの生体触媒粒子 発酵収穫物をストレプトマイセス・オリバセア
ウス（NRRL3916）の突然変異種から回収する
本実施例において、グルタルアルデヒド過剰量
を、最終混合物において30ミリ当量／から４ミ
リ当量／まで減少させた。 用いた方法は、ポリアミン／グルタルアルデヒ
ド付加物の１部だけを添加し、次いで更なるポリ
アミン（同一希釈のもの）を添加し凝集を行なう
ものであつた。 最初の収穫物１当り0.5ｇ及び1.0ｇのタンニ
ン酸の添加は４ｇ／dlの水溶液を用いて行なつ
た。他の回収条件は前実施例の通りであつた。得
られる再水和した粒子の強度を第表に示す。 第 表 試 料 相対強度 タンニン酸省略 ＝100 タンニン酸濃度１ｇ／ 110 タンニン酸濃度0.5ｇ／ 111 タンニン酸省略、アルデヒド過剰30ミリ当量／
94 タンニン酸１ｇ／量は、ポリアミン／グルタ
ルアルデヒド付加物の27％の共凝集に対して同等
であつた（0.5ｇ／量に対して13.5％）。 すべての粒子は所望の生体触媒（グルコースイ
ソメラーゼ）活性を示した。 実施例 （参考例） 発酵収穫物からの生体触媒粒子 ストレプトマイセス・オリバセアウス
（NRRL3916）の突然変異種の発酵収穫物が本実
験の出発原料であつた。これは7.35ｇ／の乾燥
細胞含量、7.3のPH及びPH8.5において44.7ミリ当
量／のアルデヒド反応性能力を有した。 発酵収穫物の227部分を2.5N水酸化ナトリウ
ムで処理してPHを9.0にした。次いで実施例に
おける如く製造したポリアミン／グルタルアルデ
ヒド付加物25を混合しながら徐々に添加した。
最終PHは8.8であつた。１時間穏やかに撹拌した
後、凝固した固体を過によつて回収した。この
固体残渣を押し出し、強制空気中で60℃下に乾燥
し、粗い粒子に粉砕した。 同様の方法で、収穫物257にケブラコ・タン
ニン抽出物257ｇを3.9ｇ／dl水溶液として添加し
た。混入してから１時間後に2.5N水酸化ナトリ
ウムでPHを7.2〜9.0に調節した。次いでポリアミ
ン／グルタルアルデヒド付加物28.3を撹拌しな
がら、徐々に添加した。 タンニンを含まない第１の部分における如き回
収後、同様の大きさの粒子を再水和してから機械
的強度に対して評価した。タンニンを含まない試
料の相対強度は100であり、一方タンニンを含む
試料は190の相対強度を有することがわかつた。 これらの粒子は所望の生体触媒（グルコースイ
ソメラーゼ）活性を示した。 実施例 （参考例） 発酵収穫物からの生体触媒粒子 実施例に記述した種類の他の発酵物、即ち乾
燥細胞含量が6.26ｇ／であり及びPHが5.3であ
るものを使用した。PH8.5におけるアルデヒド反
応性材料は32.1ミリ当量／であつた。前実施例
におけるものと同様の工程下に、試剤の量を次の
ようにした： 部分１：収穫物200 ポリアミン／グルタルアルデヒド18.8
部分２：収穫物189 ケプラコ・タンニン抽出物189ｇ ポリアミン／グルタルアルデヒド17.7
同一の粒子径を有する各々の部分を再水和後強
度に関して評価した。 試 料 相対強度 タンニンなし ＝100 タンニン添加 224 粒子は所望の生体触媒（グルコースイソメラー
ゼ）活性を示した。 実施例 （参考例） 発酵収穫物からの生体触媒粒子 バチルス・リケニホルミスATCC31604の突然
変異種の発酵収穫物を傾斜してそれをいくつかの
非細胞濃密固体から分離した。PH8.5におけるホ
ルモール滴定によつて決定したアルデヒド反応性
含量は91.3ミリ当量／であつた。 500ml部分を取り、PH８に調節した。次に実施
例において製造した如きポリアミン／エピハロ
ヒドリン及びグルタルアルデヒド付加物150mlを
添加した。この量は最良の凝集に対して必要とさ
れるものよりもいくらか過剰であつた。次いでケ
ブラコ・タンニン抽出物を４ｇ／dl溶液10mlとし
て添加した。１時間放置した後、凝固した固体を
遠心分離によつて回収し、次いでプラスチツク製
シリンジを用いて押し出し、及び強制空気炉中に
おいて60℃で乾燥した。 乾燥した材料を穏やかに粉砕することによつて
粒子を得た。これらの粒子を40％Ｗ／Ｗグルコー
ス溶液中で再水和したとき、それは70℃で24時間
連続的に浸した後もその物理的全体性及び生体触
媒（グルコースイソメラーゼ）活性を保持した。 実施例 パラチノースを生産する酵素活性を含有するパ
イオマスの固定化 ２つの14のChemapec LF−14型発酵器（有
効容量10）中において小規模の発酵の研究を行
なつた。この各発酵器は溶存酸素及びPHの測定手
段を備え、及び管を通して発酵器からの廃ガス中
のCO2、アルゴン、酸素、窒素、H2O及びNH3を
測定するためにPerkin−Elmer MGA−1200型
のプロセスガス分析機に周期的に連結した；勿論
CO2は主たる興味であつた。 発酵媒体は0.1％（NH4）2HPO4及び2.0％コー
ン・スチーブ液を補充した5Brixの濃度の大根の
濃密ジユースからなつた。 発酵容器に、原培養物を上述の媒体中で生育さ
せ、次いで接種前に24時間290rpmで回転する回
転振とう機中で30℃下に培養することによつて得
られるプロタミノバクター・ルブラム
（CBS574.77）接種物100mlを接種した。約15時間
後、続く安定化実験で使用されるバイオマスを発
酵容器から回収した。 本発明の範囲内の固定化法（方法２）及び本発
明の範囲内でない４つの方法は、ホルモール滴定
値が0.61ミリ当量／の上述の発酵液で行なつ
た。 固定化法 方法 １ 全液の500mlを1.0NNaOHでPH4.95から6.5に調
節した。これに次の如く製造したグルタルアルデ
ヒド／ポリアミン付加物55mlを添加した： １ H2O中でBETZ1180の11.67ｇを100mlに希
釈； ２ PH9.0に調節； ３ H2O中で25％グルタルアルデヒド17.8mlを
100mlに希釈； ４ BETZ1180溶液をグルタルアルデヒドに
徐々に添加； ５ PHを9.0に再調節； 及び組合せ物を25℃で１時間反応させた。 方法 ２ 全液500mlに、細胞の凝集が起こるまでケブラ
コ・タンニン4.0ｇ／dlの溶液12.5mlをゆつくり
添加した。この溶液を30分間25℃に維持し、この
時点で溶液のPHを1.0NNaOHで6.5に調節し、方
法１に記述した如く製造したグルタルアルデヒ
ド／ポリアミン溶液65mlを添加した。次いで溶液
を25℃に１時間維持した。 方法 ３ 全液500mlに4.0％Ｗ／Ｖケブラコ・タンニン
12.5mlを添加した。1.0NNaOHでPHを6.5に調節
した後、1.67％グルタルアルデヒド60mlを添加
し、溶液を25℃に維持した。 方法 ４ 全液500mlに10％Ｗ／Ｖポリエチレンイミン
（PEI）2.5mlを添加した。これを30分間25℃に保
つた。この溶液のPHを1.0NNaOHで6.5に調節し、
1.67％Ｗ／Ｖグルタルアルデヒド50mlを添加し
た。得られたものを１時間25℃に維持した。 方法 ５ 全液500mlを10％PEI溶液でPH５に調節した。
この溶液を30分間25℃に維持し、このとき1.67％
Ｗ／Ｖグルタルアルデヒド50mlを添加した。 上記方法のすべてにおいて、凝集した細胞を沈
降させ、上澄液を傾斜した。このスラリーの残り
を、Sorvall RC−2B型遠心分離機においてGSA
型ヘツド（Head）を用いることにより、25℃で
10分間10000rpmで遠心分離にかけた。次いでこ
の固定化された沈殿バイオマスを、針をつけてな
い注射器の開口（1.1〜1.5mm）を通して標準的な
100mlの皮下用注射器から手圧下に押し出した。
ヌードル状の押出し物を強制空気乾燥炉中で40℃
下に乾燥し、更なる試験のために適当な寸法の粒
子に破砕した。そのような試験の結果を第表に
示す。 【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (i)(a) 細胞を含有する水性媒体を準備し； (b) この水性媒体に、タンニン；長鎖ポリアミン
のカチオン性凝集剤及び架橋剤を導入して反応
生成物を生成せしめ； (c) 反応生成物を水性媒体から分離し； 及び (d) 反応生成物を乾燥する、工程によつてプロタ
ミノバクター・ルブラムに属するパラチノース
生産性細胞を固定化し； 及び (ii) 反応生成物をスクロースと接触させ、それに
よつてこれをパラチノースに転化する、ことを
含んでなるパラチノースの製造法。 ２ タンニンがケブラコ・タンニンであり、凝集
剤がエピハロヒドリン／ポリアミン共重合体であ
り、及び架橋剤がグルタルアルデヒドである、特
許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
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| US06/214,218 US4337313A (en) | 1980-12-08 | 1980-12-08 | Immobilization of biocatalysts |
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| JPH0342076B2 true JPH0342076B2 (ja) | 1991-06-26 |
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