JPS60203192A - 細胞及び／又は酵素の固定化方法 - Google Patents
細胞及び／又は酵素の固定化方法Info
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- JPS60203192A JPS60203192A JP60041356A JP4135685A JPS60203192A JP S60203192 A JPS60203192 A JP S60203192A JP 60041356 A JP60041356 A JP 60041356A JP 4135685 A JP4135685 A JP 4135685A JP S60203192 A JPS60203192 A JP S60203192A
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は細胞及び／又は酵素の固定化法に関する。
今回、２官能性又は多官能性アルデヒドを用いる凝固又
は固化によって細胞及び／又は酵素を固定化する際に、
固定化を低分子量の水溶性モノアミンの存在下及び適当
ならばアンモニアの存在下に行なう、該細胞及び／又は
酵素の固定化法が発見された。
は固化によって細胞及び／又は酵素を固定化する際に、
固定化を低分子量の水溶性モノアミンの存在下及び適当
ならばアンモニアの存在下に行なう、該細胞及び／又は
酵素の固定化法が発見された。
凝固（ｆｌｏｃｃｌＬｌａｔｉｏｎ ）を２官能性アル
デヒド、特にグルタルアルデヒドの存在下に行なう酵素
の固定化法は、ヨーロッパ特許第５３，７６４号からす
でに公知である。しかしながら、この方法ではグルタル
アルデヒドが酵素活性をかなり減少させる。本発明によ
る方法はこの欠点を回避する。
デヒド、特にグルタルアルデヒドの存在下に行なう酵素
の固定化法は、ヨーロッパ特許第５３，７６４号からす
でに公知である。しかしながら、この方法ではグルタル
アルデヒドが酵素活性をかなり減少させる。本発明によ
る方法はこの欠点を回避する。
本発明による方法は、アルデヒドによる不活性化の影響
を減するために、低分子量の水溶性のモノアミン化合物
を固定化に用いることに基づいている。この時モノアミ
ン化合物は、アルデヒドをシッフ塩基として可逆的に結
合することにより化学的緩衝剤として作用する。モノア
ミン化合物は凝固中に固定化される生体物質に含まれず
に、洗浄操作において過剰のアルデヒドと一緒に除去さ
れる。
を減するために、低分子量の水溶性のモノアミン化合物
を固定化に用いることに基づいている。この時モノアミ
ン化合物は、アルデヒドをシッフ塩基として可逆的に結
合することにより化学的緩衝剤として作用する。モノア
ミン化合物は凝固中に固定化される生体物質に含まれず
に、洗浄操作において過剰のアルデヒドと一緒に除去さ
れる。
適当なモノアミン化合物は、水溶性アミン及びその誘導
体、特に次式を有する硫酸モノ−（２−アミノエチル）
エステル（１）、２−アミノエタノール（１）、グリク
ン（ＩＩＩ）又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（ｌである二Ｎｌｌ、−Ｃ１ｌ、−ＣＨ，０５０，
ＨＮＢ２−ＣＢ、−ＣＭ、−〇Ｈ（１） 、（１１） Ｎ１１２−Ｃ１ｌ、−ＣＯＯＩｉ （ＨＯ−ＣＤ２）、
−Ｃ−ＮＨ。
体、特に次式を有する硫酸モノ−（２−アミノエチル）
エステル（１）、２−アミノエタノール（１）、グリク
ン（ＩＩＩ）又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（ｌである二Ｎｌｌ、−Ｃ１ｌ、−ＣＨ，０５０，
ＨＮＢ２−ＣＢ、−ＣＭ、−〇Ｈ（１） 、（１１） Ｎ１１２−Ｃ１ｌ、−ＣＯＯＩｉ （ＨＯ−ＣＤ２）、
−Ｃ−ＮＨ。
（Ｉ［ｌ） （Ｆ／）
本発明の方法を行なうのに可能なアルデヒドのうちグル
タルアルデヒドは特に適当である。
タルアルデヒドは特に適当である。
本発明によれば、グルタルアルデヒド含有の溶液の添加
時に、上首モノアミン誘導体を固体で又は溶解形で添加
する。これはグルタルアルデヒドの添加の前、後或いは
同時に行なうことができる。
時に、上首モノアミン誘導体を固体で又は溶解形で添加
する。これはグルタルアルデヒドの添加の前、後或いは
同時に行なうことができる。
凝固した細胞を、沈降又は遠心分離によって母液から分
離し、数回水洗する。これらの洗浄工程中、過剰のグル
タルアルデヒド及び保護アミン化合物の双方は殆んど完
全に除去される。酵素活性の、アミノ化合物によるグル
タルアルデヒドからの保護は、後述の比較例の助けを借
りて明らかにされるように、処理期間中には特に決定的
に必要である。
離し、数回水洗する。これらの洗浄工程中、過剰のグル
タルアルデヒド及び保護アミン化合物の双方は殆んど完
全に除去される。酵素活性の、アミノ化合物によるグル
タルアルデヒドからの保護は、後述の比較例の助けを借
りて明らかにされるように、処理期間中には特に決定的
に必要である。
第１ｉは、多くのアミン化合物を例示し、プロタミノバ
クタ−・ルプルムからのスクロース・ムターゼをグルタ
ルアルデヒドに対して保護する際の効果を比較する。
クタ−・ルプルムからのスクロース・ムターゼをグルタ
ルアルデヒドに対して保護する際の効果を比較する。
第１図は、アミン化合物の保護作用の濃度依存性を、化
合物（１）及び（１）を例として用いることによって示
す。最大の比活性は０．１〜０，２Ｍアミン化合物で観
察できる。アミン化合物（＋）及び（ｌを用いる多くの
固定化実験の比活性を、それを添加しない場合の比活性
と第２及び３図で比較する。それぞれの場合、比活性は
発酵液の容量活性に対してプロットされている。第２及
び３図からのすべての実験の平均値は、無紛加の場合の
実験に対して５７単位／ｇでおったが、アミノ化合物（
Ｉｆ／）の場合の実験に対して２２４単位／９及びアミ
ノ化合物（＋）の場合の実験に対して２１８単位／ｇで
あった。これらの結果は、多くの実験において個々の凝
固法と関係なしにグルタルアルデヒドに対するアミン化
合物の保護の影響を示している。
合物（１）及び（１）を例として用いることによって示
す。最大の比活性は０．１〜０，２Ｍアミン化合物で観
察できる。アミン化合物（＋）及び（ｌを用いる多くの
固定化実験の比活性を、それを添加しない場合の比活性
と第２及び３図で比較する。それぞれの場合、比活性は
発酵液の容量活性に対してプロットされている。第２及
び３図からのすべての実験の平均値は、無紛加の場合の
実験に対して５７単位／ｇでおったが、アミノ化合物（
Ｉｆ／）の場合の実験に対して２２４単位／９及びアミ
ノ化合物（＋）の場合の実験に対して２１８単位／ｇで
あった。これらの結果は、多くの実験において個々の凝
固法と関係なしにグルタルアルデヒドに対するアミン化
合物の保護の影響を示している。
上記アミン化合物の１つを添加した及び添加しない固定
化生成物の機械的安定性は互いに対比しうる。
化生成物の機械的安定性は互いに対比しうる。
本発明による保護アミノ化合物は、細胞の発酵中に直接
、同時に生成せしめてもよく、即ち発酵によってその場
で生成せしめてもよい。例えばアミノ酸生産体例えばコ
リネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｖｔｎ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、プレヒハク
テリウム・フラブム（Ｂｒｅνｉｂαｃｔｅｒｉｕｍｆ
ｌαυＵηＬ）、大腸菌、バチルス・スプチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）又はアルスロバク
タ−、Ａラフイネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐ
ａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）は、本方法により発酵溶液から
直接固定化でき、そして発酵中に生成したアミノ酸で保
護されつつ、２官能性アルデヒドで架橋することができ
る。
、同時に生成せしめてもよく、即ち発酵によってその場
で生成せしめてもよい。例えばアミノ酸生産体例えばコ
リネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｖｔｎ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、プレヒハク
テリウム・フラブム（Ｂｒｅνｉｂαｃｔｅｒｉｕｍｆ
ｌαυＵηＬ）、大腸菌、バチルス・スプチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）又はアルスロバク
タ−、Ａラフイネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐ
ａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）は、本方法により発酵溶液から
直接固定化でき、そして発酵中に生成したアミノ酸で保
護されつつ、２官能性アルデヒドで架橋することができ
る。
本発明の方法で固定化される細胞及び酵素は、生物変換
反応に対する生物触媒として使用することができる。
反応に対する生物触媒として使用することができる。
実施例１
プロタミノバクタ−・ルプルムの、硫酸モノ−（２−ア
ミノエチル）エステル（＋）の存在下における固定化 スクロース・ムターゼの生産のために、菌株プロタミノ
バクタ−・ルプルムＺ１２（ＣＢＳ５７４、７７ ）を
使用した。栄養溶液は粘稠なジュース５チ、トウモロコ
シのステイープ液（５ｔｅｅｐＬｉｑｕｏｒ ） ２％
及び（ＮＥ４）、ＥＰＯ４０，０５％がらなり、そのｐ
Ｈ値は７．２であった。１１の三角フラスコ中において
、栄養溶液２００ ｍｌにゾロタミノパクター・ルブル
ムの懸濁液１ ｍｅを接種した。
ミノエチル）エステル（＋）の存在下における固定化 スクロース・ムターゼの生産のために、菌株プロタミノ
バクタ−・ルプルムＺ１２（ＣＢＳ５７４、７７ ）を
使用した。栄養溶液は粘稠なジュース５チ、トウモロコ
シのステイープ液（５ｔｅｅｐＬｉｑｕｏｒ ） ２％
及び（ＮＥ４）、ＥＰＯ４０，０５％がらなり、そのｐ
Ｈ値は７．２であった。１１の三角フラスコ中において
、栄養溶液２００ ｍｌにゾロタミノパクター・ルブル
ムの懸濁液１ ｍｅを接種した。
発酵を回転式振とう機上で３１℃で１５時時間性させた
。
。
スクロース・ムターゼ１’−Ｆ−位＝スクロースのイソ
マルトースへの転化１μモル／分。
マルトースへの転化１μモル／分。
６．０単位／ ｒｒｔの活４４−と８℃において５．５
のｐＨとを有する発酵液１／に、タンニン（４％）６０
゛ｍｅを攪拌しながら添加し、次いでグロタミノバクタ
ー細胞の完全な凝固のためにＢＥＴＺ／グルタルアルデ
ヒド混合物（ＢＥＴＺ６０ｇ／ｌ、グルタルアルデヒド
２２襲υ／ｖ、ｐＨ９，０）を添加した（ＢＥＴＺはＢ
ｅｔｚ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、。
のｐＨとを有する発酵液１／に、タンニン（４％）６０
゛ｍｅを攪拌しながら添加し、次いでグロタミノバクタ
ー細胞の完全な凝固のためにＢＥＴＺ／グルタルアルデ
ヒド混合物（ＢＥＴＺ６０ｇ／ｌ、グルタルアルデヒド
２２襲υ／ｖ、ｐＨ９，０）を添加した（ＢＥＴＺはＢ
ｅｔｚ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、。
Ｔｒｅｖａｓｅ、 ｐｅｎｎｓｙｌｖａ、ｎｉａ 、の
商品名である。これは１００万よりも小さい分子量を有
し、また溶液１ｇ当りアミノ基約０．２ ｓ ｇ ミリ
モルを含有するエビハロヒドリン／ポリアミン共重合体
を示す）。
商品名である。これは１００万よりも小さい分子量を有
し、また溶液１ｇ当りアミノ基約０．２ ｓ ｇ ミリ
モルを含有するエビハロヒドリン／ポリアミン共重合体
を示す）。
次いで架橋のために、同一のＢＥＴＺ／グルタルアルデ
ヒド混合物を直ぐに更に７５ｍ１！添加した。
ヒド混合物を直ぐに更に７５ｍ１！添加した。
この結果ｐＨ値は７．２に上昇した。直後に、約０、１
７ Ｍの最終濃度に相当する固体（＋）ａｏｇを混入し
、ｐＨ値をｌＮＮａ０１ｌで７．２に調節した。凝固物
を遠心分離にかけた後、上澄液を傾斜し、沈降物を１１
２０１ ｌで洗浄し、できるだけ無水になるまでプフナ
ー済斗で吸引済過しだ。濾過残渣を手動ブレスで押出し
、４０〜４５℃で夜通し乾燥した。（１）を含まない更
なるバッチを同一の方法で沈殿させ、処理した。粉砕及
びふるい分は後、（Ｉ）を含むバッチの中央の両分（粒
径０．５〜１．０謳）は２３１．０単位／ｇの活性を有
し、その活性収率が２３．３％であった。また（１）を
含まないバッチのそれは４１．２単位／Ｉの活性を有し
、その活性収率が２．８チであった。収量は殆んど同一
で、１３．１．９及び１３．８．９ （それぞれ乾燥基
準）であった。
７ Ｍの最終濃度に相当する固体（＋）ａｏｇを混入し
、ｐＨ値をｌＮＮａ０１ｌで７．２に調節した。凝固物
を遠心分離にかけた後、上澄液を傾斜し、沈降物を１１
２０１ ｌで洗浄し、できるだけ無水になるまでプフナ
ー済斗で吸引済過しだ。濾過残渣を手動ブレスで押出し
、４０〜４５℃で夜通し乾燥した。（１）を含まない更
なるバッチを同一の方法で沈殿させ、処理した。粉砕及
びふるい分は後、（Ｉ）を含むバッチの中央の両分（粒
径０．５〜１．０謳）は２３１．０単位／ｇの活性を有
し、その活性収率が２３．３％であった。また（１）を
含まないバッチのそれは４１．２単位／Ｉの活性を有し
、その活性収率が２．８チであった。収量は殆んど同一
で、１３．１．９及び１３．８．９ （それぞれ乾燥基
準）であった。
実施例２
プロタミノバクタ−・ルブルムの、種々の量の（＋）の
存在下における固定化 実施例１と同様に、それぞれの場合細胞液（４，６単位
／Ｐ６）１６の平行なバッチを凝固させ、種々の濃度の
（＋）の存在下に架橋し、処理した。
存在下における固定化 実施例１と同様に、それぞれの場合細胞液（４，６単位
／Ｐ６）１６の平行なバッチを凝固させ、種々の濃度の
（＋）の存在下に架橋し、処理した。
比活性は、（１）０．０１邊ｆの存在下に１０５．６単
位／、９、活性収率７．４％であり、（ｌ） ｏ、 ｔ
Ｍの存在下に２８８５単位／Ｉ１１活性収率３３．９
チであり、そし−ｃ（＋）ｏ、ｌ（の存在下に、１１０
１．８単位／ｇ、活性収率２５．７ ％であった（第１
図参照）。
位／、９、活性収率７．４％であり、（ｌ） ｏ、 ｔ
Ｍの存在下に２８８５単位／Ｉ１１活性収率３３．９
チであり、そし−ｃ（＋）ｏ、ｌ（の存在下に、１１０
１．８単位／ｇ、活性収率２５．７ ％であった（第１
図参照）。
粉砕及びふるい分は前の収量（乾燥重量）は１０．２．
９，１０．３．ｌｉ’及び１０．５！ｊであった。
９，１０．３．ｌｉ’及び１０．５！ｊであった。
実施例３
プロタミノバクタ−・ルプルムの、Ｉ及びアンモニアの
存在下における固定化 それぞれの場合、９，２単位／ゴの活性を有する細胞懸
濁液１１を、平行バッチで凝固させ、架橋した。最初に
細胞懸濁液１ｅに４％タンニン溶液１２０ ｍｌを添加
し、次いで凝固が完了するまで実施例１のＢ Ｅ Ｔ
Ｚ／グルタルアルデヒド１６０ｍ（！を添加した。次い
でこの懸濁液に、ＢＥＴＺ／グルタルアルデヒド混合物
を更に８０ｍ／！、（１）０．２モル及びアンモニア溶
液０．２モルを攪拌しながら直ぐに添加し、ｐＨ値値を
８．０にもっていった。
存在下における固定化 それぞれの場合、９，２単位／ゴの活性を有する細胞懸
濁液１１を、平行バッチで凝固させ、架橋した。最初に
細胞懸濁液１ｅに４％タンニン溶液１２０ ｍｌを添加
し、次いで凝固が完了するまで実施例１のＢ Ｅ Ｔ
Ｚ／グルタルアルデヒド１６０ｍ（！を添加した。次い
でこの懸濁液に、ＢＥＴＺ／グルタルアルデヒド混合物
を更に８０ｍ／！、（１）０．２モル及びアンモニア溶
液０．２モルを攪拌しながら直ぐに添加し、ｐＨ値値を
８．０にもっていった。
処理を実施例１における如く行なった。
ふるいの中央画分の比活性： １９８．４単位／９゜活
性収率２５．１ ％。（１）を添加しないバッチ或いは
（１）だけを添加したバッチと比較した場合、このバッ
チは実質的に高い機械的安定性を有した。
性収率２５．１ ％。（１）を添加しないバッチ或いは
（１）だけを添加したバッチと比較した場合、このバッ
チは実質的に高い機械的安定性を有した。
２つの対照バッチの分析値： （ｒ ） ｏ、ＩＭ、２
８１．９単位／ｇ、活性収率２１．４φ；アミノ化合物
を添加しない場合、６１．４単位／１１活性収率６．０
チ。粉砕及びふるい分は前の乾燥重量は殆んど同一であ
った：２０．４，９，２０．３ｇ、２１．８，９゜実施
例４ セラシア・プリムシ力の（りの存在下における固定化 スクロース・ムターゼの生産のために、菌株セラシア・
グリムシカ（ＡＴＣＣ１５９２８）を用いた。栄養溶液
は粘稠なジュース５襲、トウモロコシのステイーゾ液（
５ｔｅｅｐ １ｉｑｕｏｒ ） ２ ％及び（ＮＨ４）
、１１１）０４０．０５％からなり、そのｐＨ値は７０
であった。１１の三角フラスコ中において、栄養溶液２
００ｍ！！に懸濁液ｌゴを接種した。発酵を回転式振と
り機上で３１’Ｃで１５時時間桁させた。
８１．９単位／ｇ、活性収率２１．４φ；アミノ化合物
を添加しない場合、６１．４単位／１１活性収率６．０
チ。粉砕及びふるい分は前の乾燥重量は殆んど同一であ
った：２０．４，９，２０．３ｇ、２１．８，９゜実施
例４ セラシア・プリムシ力の（りの存在下における固定化 スクロース・ムターゼの生産のために、菌株セラシア・
グリムシカ（ＡＴＣＣ１５９２８）を用いた。栄養溶液
は粘稠なジュース５襲、トウモロコシのステイーゾ液（
５ｔｅｅｐ １ｉｑｕｏｒ ） ２ ％及び（ＮＨ４）
、１１１）０４０．０５％からなり、そのｐＨ値は７０
であった。１１の三角フラスコ中において、栄養溶液２
００ｍ！！に懸濁液ｌゴを接種した。発酵を回転式振と
り機上で３１’Ｃで１５時時間桁させた。
７．２単位／ ｍｅ及びｐ Ｈ６，５の発酵液ｌｌに、
タンニン（４％）１２０ｍｌを攪拌しながら８℃で添加
し、次いで凝固が完了するまで実施例１によるＢＥＴＺ
／グルタルアルデヒド混合物１３５ｍ１を添加した。次
いでＢＥＴＺ／グルタルアルデヒド混合物更に６０ｍｅ
及びアミノ化合物（＋）０．２モルを添加し、ｐＨ値を
６５に調節した。
タンニン（４％）１２０ｍｌを攪拌しながら８℃で添加
し、次いで凝固が完了するまで実施例１によるＢＥＴＺ
／グルタルアルデヒド混合物１３５ｍ１を添加した。次
いでＢＥＴＺ／グルタルアルデヒド混合物更に６０ｍｅ
及びアミノ化合物（＋）０．２モルを添加し、ｐＨ値を
６５に調節した。
実施例１に従って処理した後、ふるいの中央画分の比活
性は１７１２単位／ｇであった。
性は１７１２単位／ｇであった。
対比すると、（１）を添加してない平行バッチはふるい
の中央画分において６９８単位／ｇにすぎない活性を示
した。
の中央画分において６９８単位／ｇにすぎない活性を示
した。
実施例５
プロタミノバクタ−・ルプルムの、グリシンの存在下に
おける固定化 グロタミノバクター・ルブルムＺ１２ｃＨ５５７４，７
７を実施例１〜３における如く生長させた。
おける固定化 グロタミノバクター・ルブルムＺ１２ｃＨ５５７４，７
７を実施例１〜３における如く生長させた。
活性８２単位／ ｍｌを有する細胞懸濁液１１を、実施
例１に従い４係タンニン溶液１２０ｍｅ及びＢＥＴＺ／
グルタルアルデヒド混合物１７０ｍ７！で完全に凝固さ
せた。次いでＢＥＴＺ／グルタルアルデヒド混合物更な
る８５１ｄ及び固体形のグリシン０．１モルを添加し、
ｐＨ値を６．７にした。次いで処理を実施例１に記連し
たよう“に行なった。
例１に従い４係タンニン溶液１２０ｍｅ及びＢＥＴＺ／
グルタルアルデヒド混合物１７０ｍ７！で完全に凝固さ
せた。次いでＢＥＴＺ／グルタルアルデヒド混合物更な
る８５１ｄ及び固体形のグリシン０．１モルを添加し、
ｐＨ値を６．７にした。次いで処理を実施例１に記連し
たよう“に行なった。
比活性： ２３２． Ｏ単位／Ｉ、活性収率１０，２係
、及び粉砕及びふるい分は前の乾燥重量ｊ １．５ 、
！ｉ’。
、及び粉砕及びふるい分は前の乾燥重量ｊ １．５ 、
！ｉ’。
グリシンを添加しないで架橋した対照バッチは２９９単
位／ｇの比活性を示し、その活性収率は２０％、及び粉
砕及びふるい分は前の乾燥型）Ｒは１３、４ ｇであっ
た。
位／ｇの比活性を示し、その活性収率は２０％、及び粉
砕及びふるい分は前の乾燥型）Ｒは１３、４ ｇであっ
た。
実施例６
グロタミノバクター・ルブルムの、２−アミンエタノー
ル（ＩＩ）又はトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノ
メタン（ｌの存在下における固定。
ル（ＩＩ）又はトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノ
メタン（ｌの存在下における固定。
それぞれの場合、実施例１に従って生長させた３、４単
位／ ｍｅの活性を有するプロタミノバクタ−・ルプル
ムＺｌ ２ （ＣＪＪＳ５’１４．７’ｌ）填養物の発
酵溶液１１に、凝固が完了する捷で攪拌し７ながら４チ
タンニン溶液６０ｍｅ、次いで１３ＥＴＺ／グルタルア
ルデヒド混合物１ｏｏｒｎｌを添加した。このＢ Ｅ
Ｔ Ｚ／グルタルアルデヒド混合物の更なる５０ゴに加
えて、２−アミンエタノール０２モルをバッチの一方に
添加し、また（ＩＶ）０．２モルを他のバッチに添加し
た。次いですべてのバッチのｐｎ値を７．５にもってい
き、このバッチを実施例１における如く処理した。
位／ ｍｅの活性を有するプロタミノバクタ−・ルプル
ムＺｌ ２ （ＣＪＪＳ５’１４．７’ｌ）填養物の発
酵溶液１１に、凝固が完了する捷で攪拌し７ながら４チ
タンニン溶液６０ｍｅ、次いで１３ＥＴＺ／グルタルア
ルデヒド混合物１ｏｏｒｎｌを添加した。このＢ Ｅ
Ｔ Ｚ／グルタルアルデヒド混合物の更なる５０ゴに加
えて、２−アミンエタノール０２モルをバッチの一方に
添加し、また（ＩＶ）０．２モルを他のバッチに添加し
た。次いですべてのバッチのｐｎ値を７．５にもってい
き、このバッチを実施例１における如く処理した。
添加せず （ｎ ） ０．２ （■） ０．２モル モ
ル 比活性、 ３０．５ ３２４．７ １８０．４単位／Ｉ 活性収率、 ７ ５８．５ ２３．８ チ 乾燥重量、１３．４ １１．８ ９．ＩＩ 実施例７ 大腸菌の（１）の存在下における固定化。
ル 比活性、 ３０．５ ３２４．７ １８０．４単位／Ｉ 活性収率、 ７ ５８．５ ２３．８ チ 乾燥重量、１３．４ １１．８ ９．ＩＩ 実施例７ 大腸菌の（１）の存在下における固定化。
ペニシリン・アシラーゼの生産のために大腸菌ＡＴＣＣ
９６３Ｔを用いた。栄養溶液はトウモロコシのステイー
グ液２チ及びフェニル酢酸アンモニウム１ｑ６からなり
、そのｐＨ値は６．５であった。
９６３Ｔを用いた。栄養溶液はトウモロコシのステイー
グ液２チ及びフェニル酢酸アンモニウム１ｑ６からなり
、そのｐＨ値は６．５であった。
この栄養溶液２００１ｎｌに、太町菌懸濁液１ ｍｌを
、１４の三角フラスコ中で接種した。次いで発酵を２９
Ｏｒ ｐｍで回転する振とり機上で３１℃で２０時時
間性させた。先ず細胞懸濁液５００ ｍｅに４％タンニ
ン溶液２０ｍｅを滴々に添加し、次いで懸濁液ｆ、ＢＥ
ＴＺ／グルタルアルデヒド混合物（Ｂｐ、ｒｚ ６０
ｇ７ｃ、グルタルアルデヒド２．．２％ ｖ／ｖ、ｐａ
ｌ ９．０ ） １００ｍｌの助けを借りて完全に凝固
させた。凝固が完了した時、５０チ過剰量のＢＥＴＺ／
グルタルアルデヒドを直ぐに添加した。このバッチのイ
において、過剰量のＢＥＴＺ／グルタルアルデヒドの他
に固体（１）を０．１Ｍの最終濃度まで直ぐに添加し、
他の半分を（１）なしに処理した。細胞物質を分離し、
洗浄しＡそして押出した後、これを４０〜４５℃で夜通
し乾燥し、次いで粉砕し、ふるいにかけた。（＋）を含
まない場合、６−アミノペニシランｅ 及びフェニル酢
酸中でのペニシリンＧの開裂は、８．３６＃Ｉ Ｐ Ａ
Ｂ単位／ｇに対応Ｌ７て、乾燥触媒ｇ当り２．１７ペ
ニシリンＧ単位の比活性を鳥えた。
、１４の三角フラスコ中で接種した。次いで発酵を２９
Ｏｒ ｐｍで回転する振とり機上で３１℃で２０時時
間性させた。先ず細胞懸濁液５００ ｍｅに４％タンニ
ン溶液２０ｍｅを滴々に添加し、次いで懸濁液ｆ、ＢＥ
ＴＺ／グルタルアルデヒド混合物（Ｂｐ、ｒｚ ６０
ｇ７ｃ、グルタルアルデヒド２．．２％ ｖ／ｖ、ｐａ
ｌ ９．０ ） １００ｍｌの助けを借りて完全に凝固
させた。凝固が完了した時、５０チ過剰量のＢＥＴＺ／
グルタルアルデヒドを直ぐに添加した。このバッチのイ
において、過剰量のＢＥＴＺ／グルタルアルデヒドの他
に固体（１）を０．１Ｍの最終濃度まで直ぐに添加し、
他の半分を（１）なしに処理した。細胞物質を分離し、
洗浄しＡそして押出した後、これを４０〜４５℃で夜通
し乾燥し、次いで粉砕し、ふるいにかけた。（＋）を含
まない場合、６−アミノペニシランｅ 及びフェニル酢
酸中でのペニシリンＧの開裂は、８．３６＃Ｉ Ｐ Ａ
Ｂ単位／ｇに対応Ｌ７て、乾燥触媒ｇ当り２．１７ペ
ニシリンＧ単位の比活性を鳥えた。
ここに＃ Ｉ Ｊ） Ａ Ｈは６−ニトロ−３−フェニ
ルアセトアミドー安息香敞に対して文献に与えられた略
号であシ、１つのＮＩｐＡＢ単位は活性として定義され
る（ Ｋ’ｕｔｚｂａｃｈ、 Ｃ，、Ｒａｕｅｎｂｖ、
ｓｃｈ。
ルアセトアミドー安息香敞に対して文献に与えられた略
号であシ、１つのＮＩｐＡＢ単位は活性として定義され
る（ Ｋ’ｕｔｚｂａｃｈ、 Ｃ，、Ｒａｕｅｎｂｖ、
ｓｃｈ。
Ｅ、 （１９７４） 、 Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’
ｓ Ｚ 、ｐｈ１／５ｉｏｌ。
ｓ Ｚ 、ｐｈ１／５ｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、 ３５４ 、４５ ）。
（１）を用いる場合、比活性は約５０％高く、ｌ Ｚ６
６ＮＩＰＡＢ単位／ｆ／ニ相Ｍして、ｙ当り３．２９ペ
ニシリンＧ単位であった。
６ＮＩＰＡＢ単位／ｆ／ニ相Ｍして、ｙ当り３．２９ペ
ニシリンＧ単位であった。
実施例８
アスペルギルス・フエチズスからの細ＵＱ＋、外アミロ
グルコシダーゼの、（１）の、存在下における固定化。
グルコシダーゼの、（１）の、存在下における固定化。
アミログルコシダーゼの生産のために、アスペルギルス
・フエチズスＡＴＣＣ１４９１６を使用した。栄養溶液
はモロコシ粉１５０ｇ／Ａ！、）ウモロコシのステイー
プ液ｓ ｏ ｌ ／ ｌ及び市販の粗α−アミラーゼ０
．２ ｇ ／ ｌからなった。ｐＨを殺菌のために６．
０にもっていつだ。殺菌前に、培養溶液を７５℃まで加
熱し、冷却し、次いで発酵フラスコ間に分配した。次い
で１２１℃で２０分間殺菌した。栄養溶液２００ ｙｄ
２に、アスペルギルス・フエチズスの胞子懸濁液５−を
、１７！の三角フラスコ中で接種した。発酵を２９０１
ｐη１で回転する振とう機上で３１°Ｃで１００時間進
行させた。
・フエチズスＡＴＣＣ１４９１６を使用した。栄養溶液
はモロコシ粉１５０ｇ／Ａ！、）ウモロコシのステイー
プ液ｓ ｏ ｌ ／ ｌ及び市販の粗α−アミラーゼ０
．２ ｇ ／ ｌからなった。ｐＨを殺菌のために６．
０にもっていつだ。殺菌前に、培養溶液を７５℃まで加
熱し、冷却し、次いで発酵フラスコ間に分配した。次い
で１２１℃で２０分間殺菌した。栄養溶液２００ ｙｄ
２に、アスペルギルス・フエチズスの胞子懸濁液５−を
、１７！の三角フラスコ中で接種した。発酵を２９０１
ｐη１で回転する振とう機上で３１°Ｃで１００時間進
行させた。
遠心分離した発酵溶液５ＯＯ−に４％タンニン溶液４８
ゴを滴々に添加し、次いでｐＨを６５に保ちつつ、実施
例１に従いＩＪＥＴＺ／グルタルアルデヒド混合物２０
１ｎＩ２を更に添加して溶液を完全に凝固させた。（１
）の最終濃度０．１ ！、Ｉへの中間的な添加の後に半
分を処理し、残シ半分を（＋）を添加しないで処理した
。
ゴを滴々に添加し、次いでｐＨを６５に保ちつつ、実施
例１に従いＩＪＥＴＺ／グルタルアルデヒド混合物２０
１ｎＩ２を更に添加して溶液を完全に凝固させた。（１
）の最終濃度０．１ ！、Ｉへの中間的な添加の後に半
分を処理し、残シ半分を（＋）を添加しないで処理した
。
凝固したアミログルコシダーゼを４０〜４５°Ｃで夜通
し乾燥し、粉砕し、ふるいにかけた。乾燥粒子の活性を
、予じめ膨潤させた後マルトースの開裂でグルコースを
生成せしめることによって決定した。遊離したグルコー
スは酵素試験においてへキノキナーゼ／グルコース６−
ホスフニートテヒドログナーゼを用いて決定した。（１
）を用いた場合の比活性：９．５単位／ｇ（４０℃）；
３５単位／ｙ（３ｏ°Ｃ）。（りを用いない場合の比活
性二８，７単位／＃（４ｏ℃）；ｚ８単位／ｇ（３０℃
）。
し乾燥し、粉砕し、ふるいにかけた。乾燥粒子の活性を
、予じめ膨潤させた後マルトースの開裂でグルコースを
生成せしめることによって決定した。遊離したグルコー
スは酵素試験においてへキノキナーゼ／グルコース６−
ホスフニートテヒドログナーゼを用いて決定した。（１
）を用いた場合の比活性：９．５単位／ｇ（４０℃）；
３５単位／ｙ（３ｏ°Ｃ）。（りを用いない場合の比活
性二８，７単位／＃（４ｏ℃）；ｚ８単位／ｇ（３０℃
）。
第１表
神々のモノアミンの、プロタミノバクタ−・ルプルムの
固定中における影響に関しての比較添 加 固定化細胞
の比活性 単位／！！ なし ４５，２ Ｎｌｌ５．０．０５Ｍ ２４．６ Ｎｌ１３．０．１ （ＩＡ（２５，３ Ａ’／／３． ｏ、２ ｏＡＩ ２３．７（＋ ） ＋
Ｎ１ｊ８．それぞれ０．２ Ｍｌ ９８．４トリス（ヒ
ドロキシメチル）−アミ ノメタン（ＩＶ ） 、 ０．２Ｍ １８０．４２−ア
ミンエタノール（１）、０．２ １１ｆ ３２４．７ ２−メチルアミンエタノール、０２ Ｊ（２５，５ トリエタノールアミン、０．２Ｍ ａｌ、ｓＮ−メチル
−ジェタノールアミン。
固定中における影響に関しての比較添 加 固定化細胞
の比活性 単位／！！ なし ４５，２ Ｎｌｌ５．０．０５Ｍ ２４．６ Ｎｌ１３．０．１ （ＩＡ（２５，３ Ａ’／／３． ｏ、２ ｏＡＩ ２３．７（＋ ） ＋
Ｎ１ｊ８．それぞれ０．２ Ｍｌ ９８．４トリス（ヒ
ドロキシメチル）−アミ ノメタン（ＩＶ ） 、 ０．２Ｍ １８０．４２−ア
ミンエタノール（１）、０．２ １１ｆ ３２４．７ ２−メチルアミンエタノール、０２ Ｊ（２５，５ トリエタノールアミン、０．２Ｍ ａｌ、ｓＮ−メチル
−ジェタノールアミン。
０、２ Ｍ ３０．５
グリシ７（＋＋＋） 、 ｏ、ｌｋｌ ２３２．０
第１図は硫酸モノ（２−アミノエチル）エステル（１）
及び２−アミンエタノール（１）の固定化中の添加にお
いて、その保獲効果の濃度に対する依存性を示し、但し
−は（＋ ） 、０−−−一・は（ＩＩ）であり、また
横軸はモノアミノ化合物のモル濃度、縦軸は単位／固定
化細胞（乾燥）ｙを表わし； 第２図は硫酸モノ（２−アミノエチル）エステル（１）
の有無下に固定したプロタミノバクタ−・ルプルム細胞
の比活性の比較を示し、但し＋＋＋は固定化中に（１）
を添加しない場合、・・・・は（１）を添加した場合で
ｔりシ、また横軸は単位／固定化細胞（乾燥）ｇ、縦軸
は単位／発酵液ｄを表わし； 第３図はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｎ
）を固定化中に添加した（・・・・）及び添加してない
（＋ −１−＋ ）状態において固定化したプロタミノ
バクタ−細胞の比活性の比較を示し、但し横軸は単位／
固定化細胞（乾燥重量）Ｉ、縦軸は単位／発酵液ｍ７！
を表わし；そして第４図１定化アミログルコシダーゼの
、マルトース開裂における比較を示し、但し□は硫酸モ
ノ（２−アミノエチル）エステル（１）を添加した場合
、ｏ−−−−ｏは添加しないで固定した場合であり、乾
燥した固定化アミログルコシダーゼｔｏｏｍｐを、酢酸
塩ｔａＱ 衝液（ｐＨ４，７５） ２０ｍｅ中マルトー
ス５０■と共に３０℃（下方の曲線）及び４０℃（上方
の曲線）で培養した結果を示し、横軸は反応時間（分）
、縦軸はダルコースのりを表わす。 第１図 第２図 第３図 第１頁の続き
及び２−アミンエタノール（１）の固定化中の添加にお
いて、その保獲効果の濃度に対する依存性を示し、但し
−は（＋ ） 、０−−−一・は（ＩＩ）であり、また
横軸はモノアミノ化合物のモル濃度、縦軸は単位／固定
化細胞（乾燥）ｙを表わし； 第２図は硫酸モノ（２−アミノエチル）エステル（１）
の有無下に固定したプロタミノバクタ−・ルプルム細胞
の比活性の比較を示し、但し＋＋＋は固定化中に（１）
を添加しない場合、・・・・は（１）を添加した場合で
ｔりシ、また横軸は単位／固定化細胞（乾燥）ｇ、縦軸
は単位／発酵液ｄを表わし； 第３図はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｎ
）を固定化中に添加した（・・・・）及び添加してない
（＋ −１−＋ ）状態において固定化したプロタミノ
バクタ−細胞の比活性の比較を示し、但し横軸は単位／
固定化細胞（乾燥重量）Ｉ、縦軸は単位／発酵液ｍ７！
を表わし；そして第４図１定化アミログルコシダーゼの
、マルトース開裂における比較を示し、但し□は硫酸モ
ノ（２−アミノエチル）エステル（１）を添加した場合
、ｏ−−−−ｏは添加しないで固定した場合であり、乾
燥した固定化アミログルコシダーゼｔｏｏｍｐを、酢酸
塩ｔａＱ 衝液（ｐＨ４，７５） ２０ｍｅ中マルトー
ス５０■と共に３０℃（下方の曲線）及び４０℃（上方
の曲線）で培養した結果を示し、横軸は反応時間（分）
、縦軸はダルコースのりを表わす。 第１図 第２図 第３図 第１頁の続き
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．２官能性又は多官能性アルデヒドを用いる凝固又は
固化によって細胞及び／又は酵素を固定化する際に、固
定化を低分子量の水溶性モノアミンの存在下及び適当な
らばアンモニアの存在下に行なう、該細胞及び／又は酵
素の固定化方法。 ２．１級アミンをモノアミンとして用いる特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ３、硫酸モノ（２−アミノエチル）エステルをモノアミ
ンとして用いる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４．２−アミンエタノールをモノアミンとして用いる特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、 グリシンをモノアミンとして用いる特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ６、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンをモ
ノアミンとして用いる特許請求の範囲第１項記載の方法
。 ７、 モノアミンを０．０５〜１．０、好ましくは０．
１〜０．２モル濃度で用いる特許請求の範囲第１項記載
の方法。 ８、 固定化をｐＨ５〜９で行なう特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ９、 プロトアミノバクター・ルプルム（ｐｒｏｔｏ−
ａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｂｒｕｍ ）の細胞及び
／又は酵素を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
法。 １０、セラシア・プリムシ力（５ｅｒｒａｔｉαＰ ｌ
ｙｍｕ ｔ ｈ ｉ ｃα）の細胞及び／又は酵素を
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、大腸菌の細胞及び／又は酵素を特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の方法。 １２．７スペルギルス・フエチズス（Ａｓｐｅｒ−ｇｉ
ｌｈｂｓ ｊ’ｏｅｔｉｄｒｂｓ ）の細胞及び／又は
酵素を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３、固定化された細Ｍｍ及び／又は酵素を生物変換反
応に用いる特許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19843408299 DE3408299A1 (de) | 1984-03-07 | 1984-03-07 | Verfahren zur immobilisierung von zellen und enzymen |
| DE3408299.9 | 1984-03-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60203192A true JPS60203192A (ja) | 1985-10-14 |
Family
ID=6229785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60041356A Pending JPS60203192A (ja) | 1984-03-07 | 1985-03-04 | 細胞及び／又は酵素の固定化方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4681843A (ja) |
| EP (1) | EP0157170A3 (ja) |
| JP (1) | JPS60203192A (ja) |
| DE (1) | DE3408299A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63146791A (ja) * | 1986-12-08 | 1988-06-18 | Hitachi Ltd | 酵素の固定化方法 |
| US4952519A (en) * | 1988-05-02 | 1990-08-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Protein immobilization with poly(ethyleneimine) derivatized with a hydroprobic group |
| FI85285C (fi) * | 1988-05-13 | 1992-03-25 | Stabra Ag | Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav. |
| DE19700518C2 (de) * | 1997-01-09 | 2000-03-16 | Fraunhofer Ges Forschung | Vorrichtung und Verfahren zum Verformen von thermoplastischen Material zum Verbinden zweier Bauteile |
| GB0212825D0 (en) * | 2002-05-31 | 2002-07-10 | Dna Res Innovations Ltd | Methods compositions and kits for cell separation |
| US7964415B2 (en) | 2006-04-26 | 2011-06-21 | Cardiogenics Inc. | Stable water-soluble polyethylenimine conjugates and methods of use thereof |
| DE102008052680A1 (de) * | 2008-10-22 | 2010-04-29 | Surgitaix Ag | Vorrichtung zur kontrollierten Einstellung einer chirurgischen Positioniereinheit |
| US9168106B2 (en) * | 2009-05-05 | 2015-10-27 | Blue Ortho | Device and method for instrument adjustment in computer assisted surgery |
| ES2546295T3 (es) | 2009-05-06 | 2015-09-22 | Blue Ortho | Sistema de fijación con invasividad reducida para elementos de seguimiento en cirugía asistida por ordenador |
| WO2011001292A1 (en) * | 2009-06-30 | 2011-01-06 | Blue Ortho | Adjustable guide in computer assisted orthopaedic surgery |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS536483A (en) * | 1976-07-02 | 1978-01-20 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | Composition having enzymatic activity and its preparation |
| DK146942C (da) * | 1978-04-19 | 1984-07-30 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt |
| AT362038B (de) * | 1978-09-18 | 1981-04-27 | Henkel Kgaa | Mittel zur stabilisierung von enzymen |
| US4652524A (en) * | 1980-10-02 | 1987-03-24 | Ivan E. Modrovich | Soluble stabilized enzymes |
| US4411991A (en) * | 1980-10-07 | 1983-10-25 | Kanegafuchi Chemical Industry Company, Limited | Process for fermentative production of amino acids |
| US4337313A (en) * | 1980-12-08 | 1982-06-29 | Miles Laboratories, Inc. | Immobilization of biocatalysts |
| DE3222912A1 (de) * | 1982-06-18 | 1983-12-22 | Basf Ag, 6700 Ludwigshafen | Unloeslicher biokatalysator |
-
1984
- 1984-03-07 DE DE19843408299 patent/DE3408299A1/de not_active Withdrawn
-
1985
- 1985-02-22 US US06/704,350 patent/US4681843A/en not_active Expired - Fee Related
- 1985-02-27 EP EP85102127A patent/EP0157170A3/de not_active Withdrawn
- 1985-03-04 JP JP60041356A patent/JPS60203192A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4681843A (en) | 1987-07-21 |
| EP0157170A2 (de) | 1985-10-09 |
| EP0157170A3 (de) | 1987-01-07 |
| DE3408299A1 (de) | 1985-09-12 |
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