JPH0343069A - 微生物細胞の生細胞の計測方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物細胞の生細胞の計測方法に巳し、特に食
品製造プラント、医薬品製造プラごトにふ・ける原料、
製品の品質管理や殺菌装置（性能確認等に有利に適用さ
れる生細胞の計測）法に関する。

〔従来の技術〕

食品製造、医薬品製造プラントにかいては、原料や製品
の品質管理、殺菌装置の性能確認のため微生物計測が行
われている。

従来の微生物計測方法、特に生細胞の計測方法として最
も良く用いられているのは寒天培養方法である。この方
法は微生物の栄養源を溶は込はした寒天上、又は寒天内
に試料を分散させ、適温で培養することにより寒天上又
は寒天内にコロニーを形成させて、このコロニー数を計
数することにより生細胞数を把握するものである。

しかし、この方法は培養操作を伴うため、コロニーを形
成させる！でに少なくとも１０時間以上、菌の種類によ
っては数日間の測定時間が必要であり１製品の品質管理
に支障をきたす場合が多くある。

そこで、微生物の迅速測定方法について最近多くの研究
がなされているがその中ではパイオルミネツセンヌ方法
が実用化されている。パイオルミネツセンヌ方法ではＡ
ＴＰ（アデノシン三リン酸）とホタルの生物発光酵素で
あるルンフェリン／ｖＶフェラーゼとの反応を利用する
方法が良く知られている。

この方法は生細胞中に含憬れる補酵素の一種テするＡＴ
Ｐにルシフェリンルシフェラーゼを作用させるとフォト
ンが放出され、このフォトン量を測定することにより生
菌数を間接的に把握するものである。しかし、この方法
は細胞中ば含まれるＡＴＰを細胞外に放出させる必要が
あり１そのために細胞を界面活性剤などで可溶化させる
などの面倒な前処理操作が必要であると共に、何ようも
試料中の総フォトン量を計数することによシ生菌数を推
定する間接方法であるため、個凌の微生物が生きている
かどうかという絶対的な数値を求めることができず、測
定の信頼性に問題があうＳ筐た濃度の低い試料に対して
適用に限界があった。

食品、医薬品分野で要求されている微生物計測方法は、
殺菌装置のコントロール、製品品質管理等に即座に生か
せることであシ、そのためには高感度でしかも迅速な結
果が出ること、自動化の可能性があることであるが、今
のところ、このような目的にかなう方法は見つかってい
ない。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来方法には次のような問題点がある。

■　寒天培養方法では測定時間が非常に長くかかる ■　バイオルミネッセンス方法は、細胞懸濁液から放出
される総フォトン数を計数することにより間接的に細胞
数を推定する方法であり、生菌数を直接計数することは
できず測定の信頼性に問題がある。

本発明は、上記問題点を解決し、個々の生菌数を直接的
に高感度でしかも迅速に計測できる方法を提供しようと
するものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は微生物の生細胞に存在する酵素又は補酵素と反
応し、細胞内で蛍光物質を生成する化学物質を微生物を
含む測定対象試料に作用させ、一定時間混合接触を行っ
た後、細胞内に生成した蛍光物質を励起するに必要な波
長の光を試料に照射し、そのとき試料中の個々の微生物
から発する光を点の数として計測することを特徴とする
微生物細胞の生細胞の計測方法である。

〔作用〕

生細胞内に存在する酵素又は補酵素と反応し、細胞内に
蛍光物質を生成するような化学物質としては、表１のよ
うな組合せがある。

表 本発明の実施例を以下に示す。

〔実施例〕

生細胞を迅速に検知・自動計測するために試作した装置
構成を第１図に示す。第１図において、１は細胞に光を
照射するための光源で出力１００Ｗの水銀灯を用いてい
る。２は水銀灯を集光するためのコレクターレンズ、３
は励起フィルタであシ、生細胞を発光させるに必要な波
長を選定するためのものである。フルオレセインニ酢酸
を使用した場合には４５０〜４９０ｎｍの波長領域を透
過する励起フィルタを予備実験結果より選定した。

光源として水銀灯を用いたが、細胞内に生成する蛍光物
質を励起させることができればレーザを光源として用い
ることもでき、この場合は励起フィルタ５は不必要であ
る。４はミラー５は対物レンズで、この実験では２０倍
のものを使用した。６はガラス製置μで、この中に試料
を通過させ、連続的に測定を行う時に用いるが連続測定
の必要のない時はスライドグラス上に試料をのせ、直接
、計測してもよい。１４はフルオレセインニ酢酸と試料
を混合するためのガラス製容器、１５はヒータ付きマグ
ネチツクヌターラ、１６は回転子でフルオレセインニ酢
酸と試料を所定の温度に保ち攪拌、混合を行うためのも
のである。Ｐ、は測定対象である微生物試料の注入ライ
ン、Ｐ２はフルオレセインニ酢酸の注入ラインであり、
ガラス容器１４内で所定時間、所定温度で接触、混合す
ることにより、生きた細胞内ではフルオレセインニ酢酸
は酵素の作用により蛍光物質であるフルオレセインを生
成するようになる。この試料をＰ、を経由してセ／Ｌ／
６内を通過させるが、この時、４５０〜４９０ｎｍの光
を照射すると細胞内にフルオレセインを蓄積した生細胞
では５２０　ｎｍを主波長とする蛍光を発する。吸収フ
ィルタ７により、この近辺の波長を通過させ、レンズ８
を介してカメラ９により発光細胞を撮像する。１０は任
意に設定可能な輝度レベル内に存在する発光細胞の画像
を出力することができる画像処理装置で、画像処理され
た画像はモニタ１２に写し出される。画像処理された信
号をパーティクルカウンタ１１と連結すれば、任意の輝
度範囲にある細胞数を計測することができる。

なか、画像処理の代りに、セル内の細胞から発する光を
吸収フィルタ７、レンズ８を介して受光器に直接受け、
同受光器の出力をパルスカウントするパルスカウンタ１
１との組み合せでも、生菌数の測定はできる。１３はデ
ータ処理解析装置で、所定の輝度範囲にある細胞数、細
胞の輝度分布が計算アウトプットされる。

食品殺菌では加熱殺菌装置が多用されて釦シ、加熱温度
、加熱蒸気吹き込み量の制御が問題になる場合が多いが
、このダーク処理解析装置１５と加熱殺菌装置を連結す
ることにより試料中に残存する生菌数の情報を迅速に殺
菌装置の加熱制御にフィードバックすることができ製品
の品質管理に大いに役立てることができる。

次に本装置を用いた試験実施例を示す。

（１）試験に用いた細胞 ４８時間培養したＢａｋｅｒ’ｓ　ｙｅａｓｔ　（酵母
）を遠心分離器により遠心濃縮（へ００　Ｏｒｐｍ。

５分間）して細胞を回収し、ｐＨ７，０１／１５Ｍリン
酸バッファーで洗浄したものを用いた。

死菌はこれを１２１°Ｃ，５分間加熱処理し生菌二死菌
＝１：１の割合で混合したものを細胞試料として用いた
。

（２）　　フｐオレセインニ酢酸溶液 アセトンにフルオレセインニ酢酸ヲ’ｆ８　ＨＩ。

１η／ｍｔｖ濃度に調整したものをｐＨ７，０１／１５
Ｍリン酸バッファーでさらに希釈し、０．２！ｒｑ／−
の濃度とした。

（３）作用ｐＨ 細胞を１０’〜１０７個／−の濃度に調整したものにフ
ルオレセインニ酢酸溶液を１：１の割きで添加し、１Ｎ
のＨＣＬ又は１ＮのＮ　ａ　ＯＸ（にて、ｐＨ，４、５
、６、７、８、１０の対胞液を各々調整した。

（４）細胞液とフルオレセインニ酢酸溶液の作用温度、
作用時間 ヒータ付きマグネットヌターラによシ作用１温度は３５
°Ｃに一定に保ち、５　、１０　、２０゜４０．６０分
と作用時間を変化させた。

ｆ５）　　、ｉ！ＩＩｌ胞液とフルオレセインニ＃４酸
溶液の７昆合ヒータ付キマグネットスターラと回１云子
によシ試料を強力に攪拌混合した場合と、混合しなかっ
た場合の両者について実験を試みた。

（６）実験結果 （りｐＨの影響 温度３５°ＣでｐＨ４，５，６，７，８゜１０に保った
試料を、１ず６０分間、攪拌なしの条件で生菌発光の有
無を調べた結果、ｐＨ５〜８の範囲で発光が確認された
がｐＨ４、釦よび１０の条件では発光は微弱であった。

（ｉｉ）作用時間の影響 次にｐＨ＆ｏの試料に対し作用時間を、５．１０，２０
，４０，６０分と変化させた結果、１０分経過後から発
光が始筐り４０分経過後には、発光量はほぼ安定な領域
に達した。

（ｉｉｉ）攪拌の影響 ｐＨ＆０の試料に対し、攪拌を行ったものと行わなかっ
た試料に対し作用時間を５゜１０．２０．４０　６０分
と変化させた結果、攪拌混合を行った試料では、５分経
過後にすでに明るく発光し、１０分経過後にはすべての
生細胞に対して計測可能な状態となり、攪拌混合による
効果が迅速計測を行う上で非常に大きいことがわかった
。

ｐＨ６，０、作用時間１０分の条件下での画像処理によ
る生菌の計測結果を第２図に示す。第２図は、横軸に細
胞の発光の強さ（輝度）、縦軸は受光した全細胞数に対
する計測された細胞数の割合を示しており、生細胞の輝
度分布を示している。この場合、計測された生細胞数は
５０個で、この５０個の生細胞は５０〜１２５の輝度範
囲内にあることがわかる。死細胞は発光しないので検知
計測されていない。なお、この画像処理装置は細胞の明
るさに応じ０〜２５５段階で輝度表示を行うことができ
る。このことからあらかじめ輝度レベルを５０〜１２５
の範囲に設定しておき、この範囲内にある発光細胞を計
数すれば、生菌数が自動的に求する。

〔発明の効果〕

本発明の効果として ■　従来の寒天培養方法では１０時時間数十時間必要で
あった測定時間が１０分以内と格段に早くなり ■　筐た、生菌の発する光を点として光学的、電気的に
検知計測する手段を確立したことにより、生菌の直接自
動計数が可能となり殺菌装置のコントロール、製品品質
の迅速管理が速やかに行えるようになった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例における生菌の検知計測する際
に使用した装置の概略図、第２図は第１図の装置を用い
て計測した生菌の測定結果を示す図表である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 微生物の生細胞に存在する酵素又は補酵素と反応し、細
   胞内で蛍光物質を生成する化学物質を微生物を含む測定
   対象試料に作用させ、一定時間混合接触を行つた後、細
   胞内に生成した蛍光物質を励起するに必要な波長の光を
   試料に照射し、そのとき試料中の個々の微生物から発す
   る光を点の数として計測することを特徴とする微生物細
   胞の生細胞の計測方法。