JPH06125791A - 乳清及び乳清含有物質中の細菌数を測定するための方法及び分析キット - Google Patents
乳清及び乳清含有物質中の細菌数を測定するための方法及び分析キットInfo
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- JPH06125791A JPH06125791A JP5084253A JP8425393A JPH06125791A JP H06125791 A JPH06125791 A JP H06125791A JP 5084253 A JP5084253 A JP 5084253A JP 8425393 A JP8425393 A JP 8425393A JP H06125791 A JPH06125791 A JP H06125791A
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- G01—MEASURING; TESTING
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 乳清及び乳清含有物質中の細菌数を測定する
こと。 【構成】 分析試料中で、 ａ） ７．０〜７．９のｐＨ値を調整し、 ｂ） 細菌細胞から溶解試薬によって細菌アデノシン三
燐酸を遊離し、 ｃ） ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬を加え、 ｄ） ルシフェラーゼ−ルシフェリン−反応の間に放出
された生物発光の光量を定量的に測定し、測定された光
量から試料中に含有するアデノシン三燐酸を測定する。 【効果】 小さい時間的及び空間的消費で乳清及び乳清
含有物質中の細菌負荷に関する信頼できる情報が迅速か
つ再現可能に得られる。
こと。 【構成】 分析試料中で、 ａ） ７．０〜７．９のｐＨ値を調整し、 ｂ） 細菌細胞から溶解試薬によって細菌アデノシン三
燐酸を遊離し、 ｃ） ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬を加え、 ｄ） ルシフェラーゼ−ルシフェリン−反応の間に放出
された生物発光の光量を定量的に測定し、測定された光
量から試料中に含有するアデノシン三燐酸を測定する。 【効果】 小さい時間的及び空間的消費で乳清及び乳清
含有物質中の細菌負荷に関する信頼できる情報が迅速か
つ再現可能に得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、乳清及び乳清含有物質
中の細菌数を、ルシフェリン−ルシフェラーゼ−生物発
光反応の使用下に測定する方法及びこの方法を実施する
ための分析キットに関する。
中の細菌数を、ルシフェリン−ルシフェラーゼ−生物発
光反応の使用下に測定する方法及びこの方法を実施する
ための分析キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】乳清及び乳清含有物質の加工は、この加
工から製造された最終生成物の微生物汚染を除去するた
めには、使用された原料の微生物学的品質の不断の監視
を必要とする。それ故に酪農場及び牛乳加工工場では、
加工の前、間及び後に絶えず微生物学的試験を行い、こ
のような試験で製造された最終生成物及び加工された粗
原料、例えば乳清及び乳清から得られた乳清生成物すな
わちラクトース又は乳清タンパク質粉末の不所望の細菌
の存在を検査する。この際繰返し極めて小さい細菌密度
が検出されなければならない。酪農場生成物中の細菌数
を測定する従来の方法の一つは、所謂コッホの平板培養
法である。この方法の場合には、被検試料を寒天平板培
地上に塗布し、３０℃で約７２時間インキュベートす
る。寒天平板培地上の増殖コロニーの数から次に被検試
料中の細菌数を知ることができる。この方法は極めて時
間浪費的であるのみならず、極めて費用浪費的である、
それとゆうのも寒天平板培地の評価まで相応の供給原料
はこの時間の間冷却下に保存されなければならない。こ
の方法の他の欠点は、該方法では胞子形成菌、例えばセ
レウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）はかなり
不正確にしか検出されずもしくは胞子形成菌の存在では
コロニーを数えることが極めて困難になることである。
工から製造された最終生成物の微生物汚染を除去するた
めには、使用された原料の微生物学的品質の不断の監視
を必要とする。それ故に酪農場及び牛乳加工工場では、
加工の前、間及び後に絶えず微生物学的試験を行い、こ
のような試験で製造された最終生成物及び加工された粗
原料、例えば乳清及び乳清から得られた乳清生成物すな
わちラクトース又は乳清タンパク質粉末の不所望の細菌
の存在を検査する。この際繰返し極めて小さい細菌密度
が検出されなければならない。酪農場生成物中の細菌数
を測定する従来の方法の一つは、所謂コッホの平板培養
法である。この方法の場合には、被検試料を寒天平板培
地上に塗布し、３０℃で約７２時間インキュベートす
る。寒天平板培地上の増殖コロニーの数から次に被検試
料中の細菌数を知ることができる。この方法は極めて時
間浪費的であるのみならず、極めて費用浪費的である、
それとゆうのも寒天平板培地の評価まで相応の供給原料
はこの時間の間冷却下に保存されなければならない。こ
の方法の他の欠点は、該方法では胞子形成菌、例えばセ
レウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）はかなり
不正確にしか検出されずもしくは胞子形成菌の存在では
コロニーを数えることが極めて困難になることである。
【０００３】ドイツ国特許出願公開第２８３１５５９号
明細書からは、牛乳中で体細胞を測定する方法が公知で
ある。この方法は、公知のルシフェリン−ルシフェラー
ゼ−反応を基礎にしているが、この反応では酵素方法で
ＡＴＰ（ＡＴＰ＝アデノシン三燐酸）がＡＭＰ（ＡＭＰ
＝アデノシン一燐酸）に変化される。この反応で発生す
る生物発光は定量的に測定され、放出する光量は試料中
に含有されたＡＴＰの量に比例する。各細胞はＡＴＰを
含有するので、ＡＴＰの濃度から体細胞の数を測定され
た試料と公知の基準との相関関係から計算することがで
きる。
明細書からは、牛乳中で体細胞を測定する方法が公知で
ある。この方法は、公知のルシフェリン−ルシフェラー
ゼ−反応を基礎にしているが、この反応では酵素方法で
ＡＴＰ（ＡＴＰ＝アデノシン三燐酸）がＡＭＰ（ＡＭＰ
＝アデノシン一燐酸）に変化される。この反応で発生す
る生物発光は定量的に測定され、放出する光量は試料中
に含有されたＡＴＰの量に比例する。各細胞はＡＴＰを
含有するので、ＡＴＰの濃度から体細胞の数を測定され
た試料と公知の基準との相関関係から計算することがで
きる。
【０００４】ＡＴＰの含分はそれぞれの細胞種にとって
特徴的である。すなわち細菌細胞は著しく大きい体細胞
よりもはるかに少ないＡＴＰを含有している。また酵母
細胞では、ＡＴＰの含分は細菌細胞よりはるかに高い。
特徴的である。すなわち細菌細胞は著しく大きい体細胞
よりもはるかに少ないＡＴＰを含有している。また酵母
細胞では、ＡＴＰの含分は細菌細胞よりはるかに高い。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、乳清
及び乳清含有物質中の細菌数の測定方法において、細菌
密度を迅速に測定することができる該方法を提供するこ
とであった。本発明の他の課題は、乳清及び乳清含有物
質中の胞子形成菌を迅速に検出することができる方法を
提供することであった。
及び乳清含有物質中の細菌数の測定方法において、細菌
密度を迅速に測定することができる該方法を提供するこ
とであった。本発明の他の課題は、乳清及び乳清含有物
質中の胞子形成菌を迅速に検出することができる方法を
提供することであった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】ところで、ルシフェリン
−ルシフェラーゼ−生物発光法を用いて乳清及び乳清含
有物質中の細菌を検出することができる方法が見出され
た。ここで乳清とは乳清コンセントレート及希薄乳清も
意味する。本発明による乳清含有物質は乳清から得られ
るすべての含有物質、特にラクトース及び乳清タンパク
質、例えばラクトース粉末又は乳清タンパク質粉末すな
わち乳清タンパク質コンセントレート粉末である。
−ルシフェラーゼ−生物発光法を用いて乳清及び乳清含
有物質中の細菌を検出することができる方法が見出され
た。ここで乳清とは乳清コンセントレート及希薄乳清も
意味する。本発明による乳清含有物質は乳清から得られ
るすべての含有物質、特にラクトース及び乳清タンパク
質、例えばラクトース粉末又は乳清タンパク質粉末すな
わち乳清タンパク質コンセントレート粉末である。
【０００７】本発明の対象は、乳清又は乳清含有物質中
の細菌数を測定するに当たり、被分析試料中で、 ａ） ｐＨ７．０〜７．９を調整し、 ｂ） 細菌細胞から溶解剤によって細菌のＡＴＰを遊離
し、 ｃ） ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬を加え、 ｄ） ルシフェラーゼ−ルシフェリン−反応の間に放出
された生物発光の光量を定量的に測定しかつこの測定光
量から被分析試料中に含有するＡＴＰ量を測定する ことからなる乳清及び乳清含有物質中の細菌数の測定方
法である。
の細菌数を測定するに当たり、被分析試料中で、 ａ） ｐＨ７．０〜７．９を調整し、 ｂ） 細菌細胞から溶解剤によって細菌のＡＴＰを遊離
し、 ｃ） ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬を加え、 ｄ） ルシフェラーゼ−ルシフェリン−反応の間に放出
された生物発光の光量を定量的に測定しかつこの測定光
量から被分析試料中に含有するＡＴＰ量を測定する ことからなる乳清及び乳清含有物質中の細菌数の測定方
法である。
【０００８】方法段階ａ）では、被分析試料中でｐＨを
７．０〜７．９の範囲で調整する。好ましくはｐＨ値は
７．３〜７．５であり、特に７．４ある。通常は室温で
ｐＨの調整を行う。
７．０〜７．９の範囲で調整する。好ましくはｐＨ値は
７．３〜７．５であり、特に７．４ある。通常は室温で
ｐＨの調整を行う。
【０００９】方法段階ａ）でのｐＨ値の調整は、被分析
試料に応じて種々の方法で行ってよい。ラクトース粉末
又は乳清タンパク質粉末中の細菌数の測定の場合には、
ｐＨ値は、例えばラクトース粉末又は乳清タンパク質粉
末を、無菌等張溶液、特に無菌生理学的食塩水、例えば
自体公知のリンゲル液中に溶かすことによって調整す
る。有利にはラクトース粉末又は乳清タンパク質を溶か
すためにリンゲル液を使用する。牛乳及び乳清中の細菌
数を測定しようとする場合には、方法段階ａ）でｐＨ値
を、有利には、無菌水で調製され、生化学的分析でｐＨ
範囲７．０〜８．０に対して使用される緩衝液、例えば
ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて調整する。好ましくは１ｍｏ
ｌ／ｌの濃度のＨＥＰＥＳ緩衝液、特にｐＨ値７．５だ
け緩衝するＨＥＰＥＳ緩衝液を使用する。
試料に応じて種々の方法で行ってよい。ラクトース粉末
又は乳清タンパク質粉末中の細菌数の測定の場合には、
ｐＨ値は、例えばラクトース粉末又は乳清タンパク質粉
末を、無菌等張溶液、特に無菌生理学的食塩水、例えば
自体公知のリンゲル液中に溶かすことによって調整す
る。有利にはラクトース粉末又は乳清タンパク質を溶か
すためにリンゲル液を使用する。牛乳及び乳清中の細菌
数を測定しようとする場合には、方法段階ａ）でｐＨ値
を、有利には、無菌水で調製され、生化学的分析でｐＨ
範囲７．０〜８．０に対して使用される緩衝液、例えば
ＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて調整する。好ましくは１ｍｏ
ｌ／ｌの濃度のＨＥＰＥＳ緩衝液、特にｐＨ値７．５だ
け緩衝するＨＥＰＥＳ緩衝液を使用する。
【００１０】方法段階ｂ）での細菌ＡＴＰの遊離は、細
菌細胞膜の溶解のために適する試薬によって達成され
る。これは酵素的には、例えばリゾチームによって、例
えばリゾチームとトリクロル酢酸約１．５重量％とから
成る溶液を用いて行い、又は化学的には、例えば細菌細
胞膜の可溶化のために適する界面活性剤によって行うこ
とができる。好ましくは、濃度約０．１〜２重量％のイ
オン界面活性剤を含有する、公知の所謂ＭＲＢ試薬（Ｎ
ＲＢ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｒｅｌｅａｓｉｎｇｒｅａ
ｇｅｎｔ ｆｏｒ ｍｉｋｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌ）を
使用する。
菌細胞膜の溶解のために適する試薬によって達成され
る。これは酵素的には、例えばリゾチームによって、例
えばリゾチームとトリクロル酢酸約１．５重量％とから
成る溶液を用いて行い、又は化学的には、例えば細菌細
胞膜の可溶化のために適する界面活性剤によって行うこ
とができる。好ましくは、濃度約０．１〜２重量％のイ
オン界面活性剤を含有する、公知の所謂ＭＲＢ試薬（Ｎ
ＲＢ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｒｅｌｅａｓｉｎｇｒｅａ
ｇｅｎｔ ｆｏｒ ｍｉｋｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌ）を
使用する。
【００１１】方法段階ｃ）では、生物発光の能力のある
生物から得られるようなルシフェリン−ルシフェラーゼ
−試薬を使用する。特に、ツチボタルから得られたルシ
フェリン−ルシフェラーゼ−試薬を使用する。これは一
般に市販されている。
生物から得られるようなルシフェリン−ルシフェラーゼ
−試薬を使用する。特に、ツチボタルから得られたルシ
フェリン−ルシフェラーゼ−試薬を使用する。これは一
般に市販されている。
【００１２】方法段階ｃ）での生物発光の光量の測定の
ためには市販の光子測定装置、例えば光度計又は光子計
数管を使用することができる。極めて僅かな光量を検出
しなければならないので、有利には光子計数管、特に個
々の光子を測定するために適した光子計数管を使用す
る。使用された光子計数管の校正は、例えば、被分析試
料について、その細菌数をコッホの平板培養法により測
定し、生物発光の光量を本発明方法により求め、これら
の値を相関させるように行うことができる。また、被分
析試料の測定された生物発光の光量は、同じ測定条件下
で予め定量的に測定された生物発光の光量を有するＡＴ
Ｐの標準濃度にも関連しうる。さらに実際の測定前に、
使用される溶液及び試薬について被分析試料無しに測定
される所謂方法空値も求める。被分析試料の実際の生物
発光の光量を計算するためには、得られた測定値を方法
空値について補正しなければならない。
ためには市販の光子測定装置、例えば光度計又は光子計
数管を使用することができる。極めて僅かな光量を検出
しなければならないので、有利には光子計数管、特に個
々の光子を測定するために適した光子計数管を使用す
る。使用された光子計数管の校正は、例えば、被分析試
料について、その細菌数をコッホの平板培養法により測
定し、生物発光の光量を本発明方法により求め、これら
の値を相関させるように行うことができる。また、被分
析試料の測定された生物発光の光量は、同じ測定条件下
で予め定量的に測定された生物発光の光量を有するＡＴ
Ｐの標準濃度にも関連しうる。さらに実際の測定前に、
使用される溶液及び試薬について被分析試料無しに測定
される所謂方法空値も求める。被分析試料の実際の生物
発光の光量を計算するためには、得られた測定値を方法
空値について補正しなければならない。
【００１３】本発明の方法は、酪農場又は牛乳加工工場
で牛乳から食品を製造する際に得られるような乳清及び
乳清含有物質中の細菌数を迅速に測定するのに適してい
る。被分析試料は一般に、酵母細胞又は体細胞を含有し
ていない、これらの細胞はおそらくＡＴＰの含分によっ
て本発明の細菌数の測定を妨害するであろう。しかし、
被分析試料中に非細菌ＡＴＰが存在する場合には、非細
菌細胞を破壊し、非細菌ＡＴＰを分解しなければならな
い。酵母細胞は例えば特定の抗生物質によって殺すこと
ができる。本発明の変法では、被分析試料中に場合によ
り存在する非細菌ＡＴＰを方法段階ａ）の実施後に先ず
分解する。例えば体細胞又は酵母細胞からの非細菌ＡＴ
Ｐの分解は、物理的、化学的又は酵素的方法で行うこと
ができる。このためには好ましくはＡＴＰ加水分解試
薬、特に酵素、好ましくはＡＴＰアーゼ例えばソマーゼ
を使用する。被分析試料中で存在する非細菌ＡＴＰをＡ
ＴＰ加水分解試薬によって分解しうる前に、ＡＴＰを予
め非細菌細胞から遊離しなければならない。このために
は通常所謂ＮＲＳ試薬（ＮＲＳ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｒ
ｅｌｅａｓｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｓｏｍａ
ｔｉｃ ｃｅｌｌ）を使用する。同試薬は大体において
トリクロル酢酸２〜７重量％及び３〜４ｍｇ／１ｍｌ溶
液の濃度のＥＤＴＡを含有する溶液である。好ましくは
トリクロル酢酸５重量％及び約４２ｍｇ／１１．２ｍｌ
溶液の濃度のＥＤＴＡが含有されている。
で牛乳から食品を製造する際に得られるような乳清及び
乳清含有物質中の細菌数を迅速に測定するのに適してい
る。被分析試料は一般に、酵母細胞又は体細胞を含有し
ていない、これらの細胞はおそらくＡＴＰの含分によっ
て本発明の細菌数の測定を妨害するであろう。しかし、
被分析試料中に非細菌ＡＴＰが存在する場合には、非細
菌細胞を破壊し、非細菌ＡＴＰを分解しなければならな
い。酵母細胞は例えば特定の抗生物質によって殺すこと
ができる。本発明の変法では、被分析試料中に場合によ
り存在する非細菌ＡＴＰを方法段階ａ）の実施後に先ず
分解する。例えば体細胞又は酵母細胞からの非細菌ＡＴ
Ｐの分解は、物理的、化学的又は酵素的方法で行うこと
ができる。このためには好ましくはＡＴＰ加水分解試
薬、特に酵素、好ましくはＡＴＰアーゼ例えばソマーゼ
を使用する。被分析試料中で存在する非細菌ＡＴＰをＡ
ＴＰ加水分解試薬によって分解しうる前に、ＡＴＰを予
め非細菌細胞から遊離しなければならない。このために
は通常所謂ＮＲＳ試薬（ＮＲＳ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｒ
ｅｌｅａｓｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｓｏｍａ
ｔｉｃ ｃｅｌｌ）を使用する。同試薬は大体において
トリクロル酢酸２〜７重量％及び３〜４ｍｇ／１ｍｌ溶
液の濃度のＥＤＴＡを含有する溶液である。好ましくは
トリクロル酢酸５重量％及び約４２ｍｇ／１１．２ｍｌ
溶液の濃度のＥＤＴＡが含有されている。
【００１４】好ましい実施態様では、非細菌細胞の破壊
及び非細菌ＡＴＰの分解は、好ましくいはＮＲＳ試薬と
酵素ソマーゼとから成る混合物を加えて同時に行う。
及び非細菌ＡＴＰの分解は、好ましくいはＮＲＳ試薬と
酵素ソマーゼとから成る混合物を加えて同時に行う。
【００１５】本発明の他の変法においては、方法段階
ａ）の実施後に、被分析試料を無菌濾過し、フィルター
を細菌の培養に適した培養液中に移し、細菌の培養にと
って適当な温度、例えば２８〜３８℃、例えば３５℃で
フィルター上に存在する液と一緒に１〜９時間、特に１
〜３時間インキュベートした後方法段階ｂ）〜ｄ）によ
り方法を行う。この追加的方法段階によって細菌数の増
大が有利に達成され、その結果本発明方法によって乳清
及び乳清含有物質中の僅かな細菌汚染も検出することが
できる。
ａ）の実施後に、被分析試料を無菌濾過し、フィルター
を細菌の培養に適した培養液中に移し、細菌の培養にと
って適当な温度、例えば２８〜３８℃、例えば３５℃で
フィルター上に存在する液と一緒に１〜９時間、特に１
〜３時間インキュベートした後方法段階ｂ）〜ｄ）によ
り方法を行う。この追加的方法段階によって細菌数の増
大が有利に達成され、その結果本発明方法によって乳清
及び乳清含有物質中の僅かな細菌汚染も検出することが
できる。
【００１６】特にラクトース粉末に関して、本発明方法
を有利に実施することができる、すなわち被分析試料を
約８〜１２倍量の無菌等張溶液、例えばリンゲル液中に
溶かしかつ水浴中で軽く撹伴しながら約２０〜４０分間
４０〜６０℃に加熱する。次に無菌真空フィルターによ
って濾過し、約５〜１０倍量の無菌等張溶液で洗浄す
る。次いでフィルターを無菌容器、例えばペトリシャー
レに移し、無菌の細菌培養液で被覆しかつ２８〜３８
℃、好ましくは３５℃で約３０〜１２０分間インキュベ
ートする。次に細菌細胞から細菌ＡＴＰを遊離するため
に、フィルターの被覆のために使用した培養液の量に対
して約０．５〜２倍量の、所謂ＮＲＢ試薬（ＮＲＢ＝ｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｒｅａｇｅｎ
ｔ ｆｏｒｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を加えて
混合する。ＮＲＢ試薬としては、例えば等張界面活性剤
の０．１〜２％水溶液又はトリクロル酢酸約１〜２重量
％及び酵素リゾチームを含有する水溶液を使用する。Ｎ
ＲＢ試薬を加えた後、例えばペトリシャーレを注意深く
振盪することによって十分な混合を行い、１〜２分後に
５０〜５００μｌ、好ましくは２００μｌのアリコート
を取りだし、透明なキュベット中に注入する。使用され
るキュベットは検出すべき生物発光の光（５６２ｎｍ）
に対して高い透明度を有するべきである。このキュベッ
トを発光の測定用に適した光子測定装置に取付け、公知
のルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬１０〜１０００
μｌ、好ましくは１００μｌを加え、試料中で放出され
る生物発光を定量的に測定する。次に測定された生物発
光の光量から、測定試料と公知の標準との相関関係によ
り試料中の細菌数を計算することができる。
を有利に実施することができる、すなわち被分析試料を
約８〜１２倍量の無菌等張溶液、例えばリンゲル液中に
溶かしかつ水浴中で軽く撹伴しながら約２０〜４０分間
４０〜６０℃に加熱する。次に無菌真空フィルターによ
って濾過し、約５〜１０倍量の無菌等張溶液で洗浄す
る。次いでフィルターを無菌容器、例えばペトリシャー
レに移し、無菌の細菌培養液で被覆しかつ２８〜３８
℃、好ましくは３５℃で約３０〜１２０分間インキュベ
ートする。次に細菌細胞から細菌ＡＴＰを遊離するため
に、フィルターの被覆のために使用した培養液の量に対
して約０．５〜２倍量の、所謂ＮＲＢ試薬（ＮＲＢ＝ｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｒｅａｇｅｎ
ｔ ｆｏｒｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌｓ）を加えて
混合する。ＮＲＢ試薬としては、例えば等張界面活性剤
の０．１〜２％水溶液又はトリクロル酢酸約１〜２重量
％及び酵素リゾチームを含有する水溶液を使用する。Ｎ
ＲＢ試薬を加えた後、例えばペトリシャーレを注意深く
振盪することによって十分な混合を行い、１〜２分後に
５０〜５００μｌ、好ましくは２００μｌのアリコート
を取りだし、透明なキュベット中に注入する。使用され
るキュベットは検出すべき生物発光の光（５６２ｎｍ）
に対して高い透明度を有するべきである。このキュベッ
トを発光の測定用に適した光子測定装置に取付け、公知
のルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬１０〜１０００
μｌ、好ましくは１００μｌを加え、試料中で放出され
る生物発光を定量的に測定する。次に測定された生物発
光の光量から、測定試料と公知の標準との相関関係によ
り試料中の細菌数を計算することができる。
【００１７】ラクトース粉末に関して記載したのと同様
にして、乳清タンパク質粉末中の細菌数を測定するため
にも本発明方法を実施することができる。
にして、乳清タンパク質粉末中の細菌数を測定するため
にも本発明方法を実施することができる。
【００１８】本発明方法により、ルシフェリン−ルシフ
ェラーゼ−生物発光法を乳清及び乳清含有物質中の細菌
数を測定するために適用することができる。ここで乳清
生成物とは、特にラクトース粉末及び乳清タンパク質粉
末のことであって、それらの中で細菌数は本発明方法に
より迅速かつ確実に測定することができる。本発明方法
は従来の平板培養法と比べて著しく迅速に行うことがで
きる。また胞子形成菌、例えばセレウス菌が被分析試料
中に存在するかどうかとゆうことも、本発明方法を用い
て極めて迅速に調べることができる。胞子形成菌の存在
する場合には、測定される生物発光の光量は方法空値よ
りも明らかに大きいので、方法空値よりも特定の値だけ
お大きい、特定の生物発光の光量から、試料中の胞子形
成菌の存在を検出することができる。この特定の値（胞
子形成菌の存在する場合には方法空値はこの値だけ高め
られている）は、胞子形成菌を含有する参照試料を用い
る予備実験で見出さなければならない。
ェラーゼ−生物発光法を乳清及び乳清含有物質中の細菌
数を測定するために適用することができる。ここで乳清
生成物とは、特にラクトース粉末及び乳清タンパク質粉
末のことであって、それらの中で細菌数は本発明方法に
より迅速かつ確実に測定することができる。本発明方法
は従来の平板培養法と比べて著しく迅速に行うことがで
きる。また胞子形成菌、例えばセレウス菌が被分析試料
中に存在するかどうかとゆうことも、本発明方法を用い
て極めて迅速に調べることができる。胞子形成菌の存在
する場合には、測定される生物発光の光量は方法空値よ
りも明らかに大きいので、方法空値よりも特定の値だけ
お大きい、特定の生物発光の光量から、試料中の胞子形
成菌の存在を検出することができる。この特定の値（胞
子形成菌の存在する場合には方法空値はこの値だけ高め
られている）は、胞子形成菌を含有する参照試料を用い
る予備実験で見出さなければならない。
【００１９】さらに本発明は、乳清及び乳清含有物質中
の細菌数を測定するに当たり、被分析試料中で７．０〜
７．９のｐＨ値を調整し、細菌細胞から溶解試薬によっ
て細菌アデノシン三燐酸を遊離し、ルシフェリン−ルシ
フェラーゼ−試薬を加え、ルシフェラーゼ−ルシフェリ
ン−反応の間に放出された生物発光の光量を定量的に測
定しかつ測定された光量から試料中に含有しているアデ
ノシン三燐酸の量を測定することからなる、前記方法の
ための分析キットを包含し、この際該分析キットは、 ａ） ｐＨ値７．０〜８．０で緩衝する試薬、 ｂ） 細菌細胞の溶解のために適する試薬、 ｃ） ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬及び場合に
より ｄ） アデノシン三燐酸加水分解試薬を含有する。
の細菌数を測定するに当たり、被分析試料中で７．０〜
７．９のｐＨ値を調整し、細菌細胞から溶解試薬によっ
て細菌アデノシン三燐酸を遊離し、ルシフェリン−ルシ
フェラーゼ−試薬を加え、ルシフェラーゼ−ルシフェリ
ン−反応の間に放出された生物発光の光量を定量的に測
定しかつ測定された光量から試料中に含有しているアデ
ノシン三燐酸の量を測定することからなる、前記方法の
ための分析キットを包含し、この際該分析キットは、 ａ） ｐＨ値７．０〜８．０で緩衝する試薬、 ｂ） 細菌細胞の溶解のために適する試薬、 ｃ） ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬及び場合に
より ｄ） アデノシン三燐酸加水分解試薬を含有する。
【００２０】ラクトース粉末又は乳清タンパク質粉末中
の細菌数を測定する場合、分析キット中の緩衝試薬とし
ては、無菌等張溶液、好ましくは無菌生理学的食塩水、
特に公知のリンゲル液を使用する。
の細菌数を測定する場合、分析キット中の緩衝試薬とし
ては、無菌等張溶液、好ましくは無菌生理学的食塩水、
特に公知のリンゲル液を使用する。
【００２１】牛乳又は乳清中で細菌数を測定するために
は、有利には生化学的分析でｐＨ範囲７．０〜８．０に
対して使用する緩衝液を含有する緩衝試薬を使用する。
牛乳又は乳清中の細菌数測定のためには、該分析キット
中で、ＨＥＰＥＳ緩衝液、特にｐＨ値７．５で緩衝する
ＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する緩衝試薬を使用する。この
ＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度は好ましくは１ｍｏｌ／ｌであ
るべきである。
は、有利には生化学的分析でｐＨ範囲７．０〜８．０に
対して使用する緩衝液を含有する緩衝試薬を使用する。
牛乳又は乳清中の細菌数測定のためには、該分析キット
中で、ＨＥＰＥＳ緩衝液、特にｐＨ値７．５で緩衝する
ＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する緩衝試薬を使用する。この
ＨＥＰＥＳ緩衝液の濃度は好ましくは１ｍｏｌ／ｌであ
るべきである。
【００２２】被分析試料中になお体細胞含有されている
場合には、これらの体細胞は細菌数の測定前に破壊し、
非細菌ＡＴＰ分解しなければならない。この場合には本
発明の分析キットは、場合によりなおＡＴＰ加水分解試
薬も含有する。ＡＴＰ加水分解試薬は、好ましくは酵
素、特にＡＴＰアーゼ例えばソマーゼを含有する。非細
菌細胞の破壊及び非細菌細胞の分解を同時に行おうとす
る場合には、好ましい実施態様では、ＡＴＰ加水分解試
薬は、酵素のほかにさらにトリクロル酢酸２〜７重量％
とＥＤＴＡ３〜４ｍｇ／１ｍｌ溶液とから成る水溶液を
含有する。この水溶液は好ましくはトリクロル酢酸５重
量％及び３．７５ｍｇ／１ｍｌ溶液の濃度のＥＤＴＡを
含有する。
場合には、これらの体細胞は細菌数の測定前に破壊し、
非細菌ＡＴＰ分解しなければならない。この場合には本
発明の分析キットは、場合によりなおＡＴＰ加水分解試
薬も含有する。ＡＴＰ加水分解試薬は、好ましくは酵
素、特にＡＴＰアーゼ例えばソマーゼを含有する。非細
菌細胞の破壊及び非細菌細胞の分解を同時に行おうとす
る場合には、好ましい実施態様では、ＡＴＰ加水分解試
薬は、酵素のほかにさらにトリクロル酢酸２〜７重量％
とＥＤＴＡ３〜４ｍｇ／１ｍｌ溶液とから成る水溶液を
含有する。この水溶液は好ましくはトリクロル酢酸５重
量％及び３．７５ｍｇ／１ｍｌ溶液の濃度のＥＤＴＡを
含有する。
【００２３】前記試薬の組合せである本発明の分析キッ
トを用いると、乳清及び乳清含有物質中の細菌数をルシ
フェラーゼ−ルシフェリン−反応の適用下に迅速にして
再現可能に測定することができる。
トを用いると、乳清及び乳清含有物質中の細菌数をルシ
フェラーゼ−ルシフェリン−反応の適用下に迅速にして
再現可能に測定することができる。
【００２４】乳清及び乳清含有物質中の測定がそもそも
前記方法により可能であることは意外である、それとゆ
うのも細菌細胞は例えば体細胞又は酵母細胞よりもはる
かに少ないＡＴＰを含有するからである。また、本発明
方法でルシフェリン−ルシフェラーゼ−生物発光の検出
が小さい細菌密度でも成功することも意外である。例え
ば乳清含有物質によって惹起される所謂化学的消光及び
乳清から得られる試料の強い呈色又は混濁によって生じ
る光学的消光は、実際には起こらない。本発明による方
法及同方法を実施する分析キットを用いると、小さい時
間的及び空間的消費で乳清及び乳清含有物質の細菌負荷
に関する信頼できる情報が迅速かつ再現可能に得られる
方法が提供される。
前記方法により可能であることは意外である、それとゆ
うのも細菌細胞は例えば体細胞又は酵母細胞よりもはる
かに少ないＡＴＰを含有するからである。また、本発明
方法でルシフェリン−ルシフェラーゼ−生物発光の検出
が小さい細菌密度でも成功することも意外である。例え
ば乳清含有物質によって惹起される所謂化学的消光及び
乳清から得られる試料の強い呈色又は混濁によって生じ
る光学的消光は、実際には起こらない。本発明による方
法及同方法を実施する分析キットを用いると、小さい時
間的及び空間的消費で乳清及び乳清含有物質の細菌負荷
に関する信頼できる情報が迅速かつ再現可能に得られる
方法が提供される。
【００２５】次に実施例により本発明を詳述する、しか
しこれらの例は本発明を限定するものではない。
しこれらの例は本発明を限定するものではない。
【００２６】
【実施例】次の実施例では、生物発光の定量的測定のた
めに光子計数管として、生物カウンターＭ２５００（ス
イス国、バーゼル市在Ｌｕｍａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社
製）を使用した。生物カウンターＭ２５００は１個のビ
アルカリ−光電電極を有しており、同電極を用いて波長
３５０〜６５０ｎｍの光を毎時５０，０００単位の最大
計数速度で測定することができる。装置の校正は、被分
析試料に関して次に記載するような条件下でＡＴＰ標準
２００ピコグラムにより行う。各回の測定前に、注入装
置及びキュベットを無菌蒸留水で少なくとも４回洗浄し
た。装置におけるすべての測定はできるだけ無菌条件下
で行った。
めに光子計数管として、生物カウンターＭ２５００（ス
イス国、バーゼル市在Ｌｕｍａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社
製）を使用した。生物カウンターＭ２５００は１個のビ
アルカリ−光電電極を有しており、同電極を用いて波長
３５０〜６５０ｎｍの光を毎時５０，０００単位の最大
計数速度で測定することができる。装置の校正は、被分
析試料に関して次に記載するような条件下でＡＴＰ標準
２００ピコグラムにより行う。各回の測定前に、注入装
置及びキュベットを無菌蒸留水で少なくとも４回洗浄し
た。装置におけるすべての測定はできるだけ無菌条件下
で行った。
【００２７】すべての使用した試薬、培養液及び緩衝液
は無菌媒体と一緒に調製した。培養液は使用前に加圧滅
菌した。使用したすべての試薬、緩衝液及び培養液に関
しては、予備試験で生物発光の空値を測定しておいた。
は無菌媒体と一緒に調製した。培養液は使用前に加圧滅
菌した。使用したすべての試薬、緩衝液及び培養液に関
しては、予備試験で生物発光の空値を測定しておいた。
【００２８】使用した試薬、緩衝液及び培養液： １．リンゲル液：自体公知の等張食塩溶液をリンゲル液
と呼ぶ。リンゲル液はＮａＣｌ ０．８重量％、ＫＣｌ
０．０２重量％、ＣａＣｌ2 ０．０２重量％及びＮ
ａＨＣＯ3０．１重量％から成る水溶液である。
と呼ぶ。リンゲル液はＮａＣｌ ０．８重量％、ＫＣｌ
０．０２重量％、ＣａＣｌ2 ０．０２重量％及びＮ
ａＨＣＯ3０．１重量％から成る水溶液である。
【００２９】２．細菌培養液：細菌細胞の活動性を活性
化しかつ少し汚染した試料を増量するために、ここに記
載した例中では、細菌培養液として、Ｌｕｍａｃｕｌｔ
という登録商標名を有する市販培養液（Ｌｕｍａｃ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ ＡＧ社製）を使用した。
化しかつ少し汚染した試料を増量するために、ここに記
載した例中では、細菌培養液として、Ｌｕｍａｃｕｌｔ
という登録商標名を有する市販培養液（Ｌｕｍａｃ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ ＡＧ社製）を使用した。
【００３０】３．ＨＥＰＥＳ緩衝液：濃度１ｍｏｌ／ｌ
有し、７．５に調整されたｐＨ値を有するＨＥＰＥＳ緩
衝液（ＨＥＰＥＳ＝Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）を使用した。
有し、７．５に調整されたｐＨ値を有するＨＥＰＥＳ緩
衝液（ＨＥＰＥＳ＝Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）を使用した。
【００３１】４．ＮＲＢ試薬：ＮＲＢ試薬としては、
０．１〜２重量％の濃度を有する等張界面活性剤の水溶
液を使用することができる。ここに記載した実験では、
Ｌｕｍａｃ Ｓｙｓｅｍｓ社（スイス国、バーゼル市
在）製の市販試薬Ｌ−ＮＲＢ（登録商標）を使用した。
０．１〜２重量％の濃度を有する等張界面活性剤の水溶
液を使用することができる。ここに記載した実験では、
Ｌｕｍａｃ Ｓｙｓｅｍｓ社（スイス国、バーゼル市
在）製の市販試薬Ｌ−ＮＲＢ（登録商標）を使用した。
【００３２】５．ＮＲＳ試薬 ＮＲＳ試薬としては、トリクロル酢酸５重量％とＥＤＴ
Ａ４２ｍｇ／１１．２ｍｌ（ＥＤＴＡ＝エチレンジアミ
ンテトラ酢酸二ナトリュウム塩）とよりなる水溶液を使
用することができる。ここに記載した実験においては、
Ｌｕｍａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製の市販試薬ＮＲＳ（登
録商標）を使用した。
Ａ４２ｍｇ／１１．２ｍｌ（ＥＤＴＡ＝エチレンジアミ
ンテトラ酢酸二ナトリュウム塩）とよりなる水溶液を使
用することができる。ここに記載した実験においては、
Ｌｕｍａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製の市販試薬ＮＲＳ（登
録商標）を使用した。
【００３３】６．ソマーゼ溶液：凍結乾燥した市販のソ
マーゼを使用した。同ソマーゼを使用前に相応の緩衝液
で再構成した。このためにＬｕｍａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ
ＡＧ社製のＬｕｍｉｔ（登録商標）の名称で市販され
ている緩衝液を使用した。ソマーゼ溶液１ｍｌに対して
ＮＲＳ溶液５ｍｌを加えた。
マーゼを使用した。同ソマーゼを使用前に相応の緩衝液
で再構成した。このためにＬｕｍａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ
ＡＧ社製のＬｕｍｉｔ（登録商標）の名称で市販され
ている緩衝液を使用した。ソマーゼ溶液１ｍｌに対して
ＮＲＳ溶液５ｍｌを加えた。
【００３４】７．ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試
薬：ホタル−ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬は凍
結乾燥された形で市販されている。市販製品はさらに大
部分牛血清アルブミン及びジチオトレイトールも含有し
ている。実施例で記載した測定の場合には、Ｌｕｍａｃ
ＳｙｓｔｅｍｓＡＧ社から商標名Ｌｕｍｉｔ−ＰＭで
得られるルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬を使用し
た。ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬のすぐ使用で
きる溶液は、凍結乾燥されたルシフェリン−ルシフェラ
ーゼ−試薬をｐＨ値７．７５の緩衝液に溶かすことによ
って製造した。この緩衝液はＨＥＰＥＳ２５ｍＭ、硫酸
マグネシウム７．５ｍＭ及びＥＤＴＡ１ｍＭから成る。
記載した実施例のおいては、Ｌｕｍｉｔの登録名でＬｕ
ｍａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧ社から市販されている緩
衝液を使用した。
薬：ホタル−ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬は凍
結乾燥された形で市販されている。市販製品はさらに大
部分牛血清アルブミン及びジチオトレイトールも含有し
ている。実施例で記載した測定の場合には、Ｌｕｍａｃ
ＳｙｓｔｅｍｓＡＧ社から商標名Ｌｕｍｉｔ−ＰＭで
得られるルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬を使用し
た。ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬のすぐ使用で
きる溶液は、凍結乾燥されたルシフェリン−ルシフェラ
ーゼ−試薬をｐＨ値７．７５の緩衝液に溶かすことによ
って製造した。この緩衝液はＨＥＰＥＳ２５ｍＭ、硫酸
マグネシウム７．５ｍＭ及びＥＤＴＡ１ｍＭから成る。
記載した実施例のおいては、Ｌｕｍｉｔの登録名でＬｕ
ｍａｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＧ社から市販されている緩
衝液を使用した。
【００３５】次の例Ｉ、ＩＩＩ、及びＩＶにおける分析
キットの場合には、ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試
薬の他に、緩衝試薬としてはリンゲル液を使用し、細菌
細胞膜を溶解するのに適した試薬としては前記のＮＲＢ
試薬を使用した。例ＩＩでは、緩衝試薬として前記のＨ
ＥＰＥＳ緩衝液を使用した。例ＩＩ〜ＩＶの分析キット
はさらにＡＴＰ加水分解試薬として前記のソマーゼ溶液
を含有していた。
キットの場合には、ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試
薬の他に、緩衝試薬としてはリンゲル液を使用し、細菌
細胞膜を溶解するのに適した試薬としては前記のＮＲＢ
試薬を使用した。例ＩＩでは、緩衝試薬として前記のＨ
ＥＰＥＳ緩衝液を使用した。例ＩＩ〜ＩＶの分析キット
はさらにＡＴＰ加水分解試薬として前記のソマーゼ溶液
を含有していた。
【００３６】Ｉ．ラクトース粉末中の細菌数の測定 無菌蒸留水で希釈したリンゲル液（０．２５倍濃縮）９
９ｍｌ中に秤量したラクトース粉末１１ｇに無菌的に溶
解させた。この無菌溶液を数回振盪し、約５０℃の温度
を有する水浴で３０分間加熱した。この時間内に試料を
数回動揺させた。次にこの溶液を無菌真空フィルター
（細孔直径０．４５μｍ、パル−ポジチヴ−フィルター
（Ｐａｌｌ−ｐｏｓｉｔｉｖ−Ｆｉｌｔｅｒ））によっ
て濾過し、リンゲル液約５０ｍｌで洗浄した。フィルタ
ーを無菌ペトリシャーレ中に入れ、細菌培養液０．５ｍ
ｌで完全に被覆した。このペトリシャーレを約３５℃で
８０分間インキュベートした後、ＮＲＢ試薬０．５ｍｌ
を加えた。次にシャーレをなお９０秒注意深く振り動か
した。混合を良好にするために、フィルター上の液２０
０μｌを３回無菌ピペットで吸い取り、再び捨てた。次
に試料２００μｌをキュベットに満たし、光子計数管に
入れた。光子計数管の注入装置により、ルシフェリン−
ルシフェラーゼ−試薬１００μｌを自動的の供給し、生
物発光の光量を測定した。集積時間１０秒後に、測定さ
れた光量が光子計数管からＲＬＵ値（ＲＬＵ＝相対的光
単位）として伝達された。測定されたＲＬＵ値からＡＴ
Ｐ標準のＲＬＵ値に対する関係で試料中に存在するＡＴ
Ｐ量を計算することができた。
９ｍｌ中に秤量したラクトース粉末１１ｇに無菌的に溶
解させた。この無菌溶液を数回振盪し、約５０℃の温度
を有する水浴で３０分間加熱した。この時間内に試料を
数回動揺させた。次にこの溶液を無菌真空フィルター
（細孔直径０．４５μｍ、パル−ポジチヴ−フィルター
（Ｐａｌｌ−ｐｏｓｉｔｉｖ−Ｆｉｌｔｅｒ））によっ
て濾過し、リンゲル液約５０ｍｌで洗浄した。フィルタ
ーを無菌ペトリシャーレ中に入れ、細菌培養液０．５ｍ
ｌで完全に被覆した。このペトリシャーレを約３５℃で
８０分間インキュベートした後、ＮＲＢ試薬０．５ｍｌ
を加えた。次にシャーレをなお９０秒注意深く振り動か
した。混合を良好にするために、フィルター上の液２０
０μｌを３回無菌ピペットで吸い取り、再び捨てた。次
に試料２００μｌをキュベットに満たし、光子計数管に
入れた。光子計数管の注入装置により、ルシフェリン−
ルシフェラーゼ−試薬１００μｌを自動的の供給し、生
物発光の光量を測定した。集積時間１０秒後に、測定さ
れた光量が光子計数管からＲＬＵ値（ＲＬＵ＝相対的光
単位）として伝達された。測定されたＲＬＵ値からＡＴ
Ｐ標準のＲＬＵ値に対する関係で試料中に存在するＡＴ
Ｐ量を計算することができた。
【００３７】生物発光の空値を求めるためには、同一条
件下でラクトース粉末無しに全測定をもう１回行った。
件下でラクトース粉末無しに全測定をもう１回行った。
【００３８】ＩＩ．乳清中の細菌数の測定 乳清０．５ｍｌをキュベット中に入れ、ＨＥＰＥＳ試薬
０．４ｍｌ及びＮＲＳ試薬中にソマーゼを含有している
溶液１００μｌを加えた。次に室温で約２０分間振盪機
（ＩＫＡ−Ｖｉｂｒａｘ−ＶＸＲ型）で振盪した。この
溶液１００μｌを無菌ピペットで他のキュベットに入
れ、次にこのキュベットを光子計数管に装着した。光子
計数管の注入装置を介してＮＲＢ試薬１００μｌを自動
的に供給し、次にルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬
１００μｌを供給し、生物発光の光量を測定した。集積
時間６０秒後に、ＲＬＵ値が伝達され、この値からＡＴ
Ｐ標準のＲＬＵ値に対する関係で試料中に存在するＡＴ
Ｐ量を計算した。
０．４ｍｌ及びＮＲＳ試薬中にソマーゼを含有している
溶液１００μｌを加えた。次に室温で約２０分間振盪機
（ＩＫＡ−Ｖｉｂｒａｘ−ＶＸＲ型）で振盪した。この
溶液１００μｌを無菌ピペットで他のキュベットに入
れ、次にこのキュベットを光子計数管に装着した。光子
計数管の注入装置を介してＮＲＢ試薬１００μｌを自動
的に供給し、次にルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬
１００μｌを供給し、生物発光の光量を測定した。集積
時間６０秒後に、ＲＬＵ値が伝達され、この値からＡＴ
Ｐ標準のＲＬＵ値に対する関係で試料中に存在するＡＴ
Ｐ量を計算した。
【００３９】生物発光の空値は例Ｉで記載したようにし
て測定した。
て測定した。
【００４０】ＩＩＩ．乳清タンパク質粉末中の細菌数の
測定 リンゲル液９９ｍｌ中に秤量した乳清タンパク質粉末１
１ｇを溶かした。この溶液を２０℃で２０分間放置し、
数回振盪した。溶液０．５ｍｌを無菌ピペットで取りだ
し、キュベットに移した。ＮＲＳ試薬中にソマーゼを含
有する溶液１００μｌ及びＨＥＰＥＳ試薬０．４ｍｌを
加えた後、室温で４０分間インキュベートした。次に１
００μｌを無菌ピペットで他のキュベットに移し、この
キュベットを光子計数管に取付けた。光子計数管の自動
注入装置を介してＮＲＢ試薬１００μｌを加え、次にル
シフェリン−ルシフェラーゼ−試薬１００μｌを加えた
後、放出された生物発光の光量を測定した。集積時間６
０秒後に、ＲＬＵ値が表示され、この値からＡＴＰ標準
のＲＬＵ値に対する関係で試料中に存在するＡＴＰ量を
計算した。
測定 リンゲル液９９ｍｌ中に秤量した乳清タンパク質粉末１
１ｇを溶かした。この溶液を２０℃で２０分間放置し、
数回振盪した。溶液０．５ｍｌを無菌ピペットで取りだ
し、キュベットに移した。ＮＲＳ試薬中にソマーゼを含
有する溶液１００μｌ及びＨＥＰＥＳ試薬０．４ｍｌを
加えた後、室温で４０分間インキュベートした。次に１
００μｌを無菌ピペットで他のキュベットに移し、この
キュベットを光子計数管に取付けた。光子計数管の自動
注入装置を介してＮＲＢ試薬１００μｌを加え、次にル
シフェリン−ルシフェラーゼ−試薬１００μｌを加えた
後、放出された生物発光の光量を測定した。集積時間６
０秒後に、ＲＬＵ値が表示され、この値からＡＴＰ標準
のＲＬＵ値に対する関係で試料中に存在するＡＴＰ量を
計算した。
【００４１】ＩＶ．ラクトース粉末中の胞子形成菌の検
出 ラクトース粉末１１ｇをリンゲル液９９ｍｌ中に溶か
し、８５℃で振盪しながら１２時間水浴で加熱した。次
にこの溶液を真空フィルター（細孔直径０．４５μｍ、
パル−ポジチブ−フィルター）によって無菌的に濾過し
た。次にフィルターを無菌ペトリシャーレ内で細菌培養
液０．５ｍｌで完全に被覆し、３５℃で約６時間インキ
ュベートした。ソマーゼ４０μｌを加えた後室温で１時
間インキュベートした。次いでＮＲＢ試薬０．５ｍｌを
加え、ペトリシャーレをさらに約６０秒間注意深く振盪
した。無菌ピペットでフィルター上に存在する液をキュ
ベットに移し、このキュベットを光子計数管に装着し
た。光子計数管の自動注入装置を介してルシフェリン−
ルシフェラーゼ−試薬１００μｌを加え、生物発光の光
量を測定した。１０秒の集積時間後にＲＬＵ値が得られ
た。方法空値よりもＲＬＵ値２０単位大きいＲＬＵ値か
ら胞子形成菌の存在を検出することができた。
出 ラクトース粉末１１ｇをリンゲル液９９ｍｌ中に溶か
し、８５℃で振盪しながら１２時間水浴で加熱した。次
にこの溶液を真空フィルター（細孔直径０．４５μｍ、
パル−ポジチブ−フィルター）によって無菌的に濾過し
た。次にフィルターを無菌ペトリシャーレ内で細菌培養
液０．５ｍｌで完全に被覆し、３５℃で約６時間インキ
ュベートした。ソマーゼ４０μｌを加えた後室温で１時
間インキュベートした。次いでＮＲＢ試薬０．５ｍｌを
加え、ペトリシャーレをさらに約６０秒間注意深く振盪
した。無菌ピペットでフィルター上に存在する液をキュ
ベットに移し、このキュベットを光子計数管に装着し
た。光子計数管の自動注入装置を介してルシフェリン−
ルシフェラーゼ−試薬１００μｌを加え、生物発光の光
量を測定した。１０秒の集積時間後にＲＬＵ値が得られ
た。方法空値よりもＲＬＵ値２０単位大きいＲＬＵ値か
ら胞子形成菌の存在を検出することができた。
Claims (11)
- 【請求項１】 乳清及び乳清含有物質中の細菌数の測定
方法において、被分析試料中で、 ａ） ７．０〜７．９のｐＨ値を調整し、 ｂ） 細菌細胞から溶解試薬によって細菌のアデノシン
三燐酸を遊離し、 ｃ） ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬を加えかつ ｄ） ルシフェラーゼ−ルシフェリン−反応の間に放出
された生物発光の光量を定量的に測定し、測定された光
量から試料中に含有しているアデノシン三燐酸の量を測
定する ことを特徴とする前記測定方法。 - 【請求項２】 方法段階ａ）を行った後、被分析試料を
滅菌濾過し、フィルターを細菌培養のために適した培養
液に移しかつフィルター上に存在する液と一緒に２８〜
３８℃で１〜９時間インキュベートした後，方法段階
ｂ）〜ｄ）により方法を実施する、請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 方法段階ａ）で７．３〜７．５のｐＨ値
を調整する、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 方法段階ｂ）〜ｄ）を行う前に、先ず被
分析試料中の非細菌アデノシン三燐酸をアデノシン三燐
酸加水分解試薬によって分解する、請求項１記載の方
法。 - 【請求項５】 細菌数の測定方法をラクトース粉末中で
行う、請求項１から請求項４までのいずれか１項記載の
方法。 - 【請求項６】 細菌数の測定方法を乳清タンパク質中で
行う、請求項１から請求項４までのいずれか１項記載の
方法。 - 【請求項７】 被分析試料中で７．０〜７．９のｐＨ値
を調整し、細菌細胞から溶解試薬によって細菌アデノシ
ン三燐酸を遊離し、ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試
薬を加え、ルシフェラーゼ−ルシフェリン−反応の間に
放出された生物発光の光量を測定しかつ測定された光量
から試料中に含有するアデノシン三燐酸の量を測定する
ことから成る、乳清及び乳清含有物質中の細菌数の測定
方法を実施するための分析キットにおいて、該キットが ａ） ｐＨ値７．０〜８．０で緩衝する試薬、 ｂ） 細菌細胞膜の溶解のために適した試薬、 ｃ） ルシフェリン−ルシフェラーゼ−試薬及び場合に
より ｄ） アデノシン三燐酸加水分解試薬を含有する ことを特徴とする分析キット。 - 【請求項８】 緩衝試薬としてリンゲル液を含有する、
請求項７記載の分析キット。 - 【請求項９】 緩衝試薬としてｐＨ値７．５で緩衝する
ＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する、請求項７記載の分析キッ
ト。 - 【請求項１０】 アデノシン三燐酸加水分解試薬として
ＡＴＰア−ゼを含有する、請求項７記載の分析キット。 - 【請求項１１】 アデノシン三燐酸加水分解試薬が溶液
１ｍｌ当たりトリクロル酢酸２〜７重量％及びＥＤＴＡ
３〜４ｍｇから成る水性溶液を含有する、請求項１０記
載の分析キット。
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