JPH0343082A - トランス―４―シアノシクロヘキサンカルボン酸の製造方法およびそれに用いる酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、トランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
ン酸の新規な製造方法に関する。

本発明の目的は、止血剤等の医薬として極めて有効であ
るトラネキサム酸、および抗潰瘍剤として著効を示す塩
酸セトラキサートの製造中間体であるトランス−４−シ
アノシクロヘキサンカルボン酸を工業的に、かつ、高収
率で製造することにある。

（従来の技術） トランス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸の製造
に関する従来の方法としては、例えば、ヘキサテレフタ
ル酸にアンモニアガスを接触させる方法（特公昭４７−
２３５３５）、１．４−ジシアノシクロヘキサンにアン
モニアガスを接触させる方法（特開昭４８−３４１４４
）が知られている。また、微生物を用いる方法として、
本発明者らは、トランス−１，４−ジシアノシクロヘキ
サンに微生物を作用させることによりトランス−４−シ
アノシクロヘキサンカルボン酸を得ている。

（特開昭６３−１０７５２、特開昭６３−１２２９１、
特開昭６３−１２９９８８、特開昭６３−２９４７９３
） （発明が解決しようとする課題） 上記の化学合成的手法は、高温高圧な反応条件を必要と
する。また、立体配置を保持させて製造することが困難
であり、副生物が多く生成するので、目的物の単離精製
工程が極めて煩雑である。

また、従来の微生物を用いる方法においては、原料とし
て、シス、トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン
から精製工程によってシス体を除去したもの、すなわち
、高純度のトランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン
を用いていた。本発明は、シス、トランス−１，４−ジ
シアノシクロヘキサンから簡単な工程でトランス−４−
シアノシクロヘキサンカルボン酸を製造することを課題
とするものである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討を重
ねた結果、常温常圧で、かつ、立体配置を選択、保持さ
せることができ、しかも、極めて効率の良い微生物の生
化学的作用を利用する新規な製造方法を見出した。すな
わち、次式（１）ＣＮ で示されるシス、トランス−１，４−ジシアノシクロヘ
キサンから、微生物の作用により、次式（） ］ で示されるトランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
ン酸を製造する方法である。

本発明者らは、コリネバクテリウム属細菌が化合物（１
）から化合物（ＩＩ）への変換に際して、トランス体を
優先的に化合物（Ｉｆ）に変換し、シス体の変換活性は
極めて低いことを見出した。さらに、コリネバクテリウ
ム属細菌より、化合物（１）から化合物（ＩＩ）への変
換に関与する酵素、すなわち、ニトリルヒドラターゼと
アミダーゼを抽出し、本発明を完成するに至った。

次に、本発明の実施方法について説明する。

（１）使用菌株 本発明で使用する微生物は、コリネバクテリウム属に属
するものであり、これらの属に属する具体的な菌株とし
ては、例えば、コリネバクテリウム　エスピー　Ｃ５株
（微工研菌寄第８９３１号）である。Ｃ５株は微生物工
業技術研究所に寄託されており、菌学的性質は特開昭６
３−１２９９８８号公報に示されている。

（２）培養方法 本発明で使用される微生物の培養は、公知の方法に準じ
て行うことができる。使用する培地は、−ＩＩ微生物の
栄養源として公知のものが利用でき、廃糖蜜、グルコー
ス、グリセリン、エタノール、シュークロース等の炭素
源、硫酸アンモニウムまたは尿素、塩化アンモニウム等
の窒素源、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプト
ン等の有機栄養源、リン酸、マグネシウム、カリウム、
鉄、コバルト等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合
わせて使用できる。また、微生物の式（Ｉ）の化合物か
ら式（Ｉｆ）の化合物への変換活性を促進する物質とし
て、プロピオニトリル、イソブチロニトリル、クロトノ
ニトリルなどのシアノ化合物や、イソブチルアミド、ｎ
−ブチルアミド等のアミド化合物や、さらには、２価の
鉄イオンをそれぞれ適量添加してもよい。培地のｐ　Ｈ
は５〜ｌＯの範囲で選べばよく、培養温度は１８〜３８
℃、好ましくは２５〜３２℃である。培養日数は１〜８
日の範囲で、活性が最大になるまで培養すればよい。

（３）酵素 前記コリネバクテリウム　エスピー　Ｃ５株の菌体から
、式（１）の化合物のトランス体を優先的に式（Ｉｆ）
の化合物に変換し、シス体の変換活性の低い酊素を抽出
単離した。その結果、Ｃ５株における式（１）の化合物
から式（ＩＩ）の化合物への変換は、ニトリルヒドラタ
ーゼとアミダーゼの組み合わせにより起こっていること
が明らかとなった。

また、これらの二酵素は、その酵素作用および基質特異
性から、新規なニトリルヒドラターゼおよびア短ダーゼ
と認めた。このニトリルヒドラターゼ、アミダーゼの理
化学的性質について説明すると、次のとおりである。

（Ａ）ニトリルヒドラターゼ ■酵素作用 ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基をア
ミド基に水和転化させる反応の触媒としての機能を示す
。

■基質特異性 ニトリルヒドラターゼの基質時異姓について検討した。

結果を表１に示す。

表 １ 表１より、本酵素は、ｎ−ブチロニトリル、ｎ−バレロ
ニトリル等の飽和脂肪層ニトリル、アクリロニトリルや
メタアクリロニトリル等の不飽和脂肪族ニトリル、ベン
ゾニトリル等の芳香族ニトリル、３−シアノピリジン等
の複素環式ニトリル、さらに、マロノニトリル、トラン
ス−１，４−ジシアノシクロヘキサン等のジニトリル化
合物に作用することがわかる。

ニトリル基の水和速度が速い化合物という観点では、ｎ
−ブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル、ｉｓｏ〜バレ
ロニトリル等の炭素数が４から５の脂肪族ニトリル化合
物である。

また、１．４−ジシアノシクロヘキサンにおいては、ト
ランス体の水和速度がシス体に比べて著しく大きいこと
が特徴的である。

■分子量 液体クロマトグラフ〔カラ・ム；ＴＳＫ−ｇｅｌＧ３０
０−３Ｗ　（０，７５Ｘ６０Ｃ１１）　）によって分子
量６１，４００と決定した。また、５ＤＳ−ＰＡＧＥ電
気泳動の結果、単一バンドであり、サブユニットの分子
量は２ｐＨ６．９００であった。

■至適ｐＨ 至適ｐｔ−を検討の結果は第１図に示すが、至適ｐＨは
８．０〜８．５であった。

■温度安定性 ニトリルヒドラターゼを１０ｍＭリン酸カリウムバッフ
ァー（ｐＨ７，５（３ｍＭイソバレリアン酸Ｎａ塩を含
む）〕に溶解し、１０〜５０°Ｃに１０分間放置した後
の残存活性を測定することにより求めた。その結果、１
０〜４０°Ｃでは活性の低下は見られず、４５°Ｃでは
残存活性は４０％であった。

■安定化剤 ニトリルヒドラターゼを、各種安定化剤を含む１０ｍＭ
リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７゜５）中で３日間透
析した。透析後の残存活性（透析前の活性を１００％と
する）を表２に示す。

表 イソバレリアン酸が最も良好な安定化剤であった。

■金属および阻害剤の’４３８ ニトリルヒドラターゼを、１００ｍＭリン酸バッファー
（ｐＨ７，５）に溶解した後、下記に示す物質を各々１
ｍＭずつ加えて酵素活性を測定し、トランス−４−シア
ノシクロヘキサンカルボン酸アミド生戒に関与するニト
リルヒドラターゼ活性に及ぼす影響を検討した。結果を
表３に示す。

表３ ニトリルヒドラターゼは、Ｈｇ＋＋、　　フェニルヒド
ラジンで強力に阻害された。

■ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）の存在ニトリルヒド
ラターゼ中のＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）の存在を
以下の方法でｌＩ！認した。

ニトリルヒドラターゼ１５■を６Ｎ塩酸中で１２０℃、
４８時間処理し加水分解した後、濃縮し、苛性ソーダ水
溶液で中和した。処理液を乾固した後、１０％メタノー
ル液に再溶解し、５ｅｐｈａｄｅにＧ−１０（１，ＯＸ
１２０ｃｍ）カラムに供し、通過液２．　１ｊ！ｌ！を
集めた。この液を用いて（ｉ）〜（ｉｖ）の検討を行い
、ＰＱＱの存在を確認できた。

（ｉ）膜結合性Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼアポ酵
素を再活性化したことによりＰＱＱの存在を確認した。

（ｉｉ）ＰＱＱに特徴的な２５２ｎｍ、３６０ｎｍに、
吸収を認めた。

（ｉｉ）蛍光スペクトル（ＩＩＩＴＡｃＩＩＩ　６５０
−１０Ｓ型検出器使用）励起ピーク；３７５ｒｖ＋、放
出ピーク；４６０ｎｓ＋でＰＱＱ標品と一致した。

（ｉｖ）ＰＱＱ要求株であるＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　
ａｃｅｔｉを用いたバイオアッセイ法によりＰＱＱの存
在を確認した。

（Ｂ）アミダーゼ ■酵素作用 アミド化合物のアミド基に作用し、アミド基をカルボキ
シル基とアンモニアに加水分解させる反応の触媒として
の機能を示す。

■基質特異性 アミダーゼの基質特異性について検討した。結果を表４
に示す。

表４ 表４より、本酵素は、プロピオンアミド、ｎ−バレロア
ミド等の飽和脂肪族アミド、トランス−４−シアノシク
ロヘキサンカルボン酸アごド等の環状飽和脂肪族アミド
、メタアクリルアミド等の不飽和脂肪族アミド、ベンズ
アくド等の芳香族アくド、およびニコチン酸アミド等の
？！［ｉ環式アミド化合物に作用することがわかる。ま
た、特に、トランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
ン酸アミドの加水分解速度が大きく、これに対しシス−
４−シアノシクロヘキサンカルボン酸アごドの活性は低
い。

■至適ｐＨ 至適ｐＨ検討の結果は第２図に示すが、至適ＰＨは６．
５から１０．０である。

■至適温度 至適温度検討の結果は第３図に示すが、至適温度は約５
０°Ｃである。

■金属および阻害剤の影響 アミダーゼを１００ｍＭリン酸バッファー（ＰＨ７，５
）に溶解した後、下記に示す物質を各々１ｍＭずつ加え
て酵素活性を測定し、トランス−４−シアノシクロヘキ
サンカルボン酸生＄Ｃに関与するアミダーゼ活性に及ぼ
す影響を検討した。結果を表５に示す。

表５ Ｈｇ“４とｌ−ＣＭ　Ｂによってわずかに阻害された。

（４）反応方法 本発明における式（１）の化合物を式（ＩＩ）の化合物
に変換する反応方法としては、具体的には前記微生物を
式（１）の化合物の存在下に培養する方法と、微生物培
養物、さらに、そこから集めた菌体または菌体処理物（
例えば、菌体の破砕物、菌体の有機溶媒処理物、または
菌体より公知の方法によって分離抽出した酵素）と式（
１）の化合物とを接触させる方法の二つの方法がある。

また、菌体、菌体処理物または菌体から抽出された酵素
を公知の方法、例えば、セライト、アルギン酸カルシウ
ム、カラギーナン等により固定化した後、式（１）の化
合物と反応させてもよい。

反応媒体としては、水、緩衝液などの水性媒体、あるい
はメタノール、クロロホルム、塩化メチレン等の有機溶
媒と水との混合物が使用できる０反応媒体中へは、式（
１）の化合物を粉末あるいはオイル状のままで、または
適当な溶媒に溶かして添加する０式（Ｉ）の化合物の添
加濃度は０．０１〜６０重量％程度、好ましくは１．０
〜４０重量％である。

反応に菌体を使用する場合の菌体の濃度は、通常０．１
〜８！量％の範囲でよい０反応温度は４〜６５℃、望ま
しくは１５〜５５℃、反応ｐＨは４〜１１、好ましくは
６．５〜９．０である０反応時間は通常０．５〜１００
時間の範囲で適当な時間を選べばよい、消費される式（
１）の化合物は連続的にまたは間歇的に補充して、反応
液中の濃度が上記の範囲内に維持されるように添加して
もよい。

原料として使用する式（１）の化合物中のシス体とトラ
ンス体の重量比は０．１：９．９〜９゜５７０．５であ
るが、トランス体に冨むものであれば、生成される式（
ｎ）の化合物のトランス体の純度はより高純度となる。

（５）分Ｍ精製 生成された式（ＩＩ）の化合物は、反応終了液より菌体
等の不溶物を除去した後、公知の方法、例えば、溶媒抽
出あるいは晶析等により容易に高純度の結晶を得ること
ができる。また、未反応のシス−１，４−ジシアノシク
ロヘキサンも容易に回収でき、異性化することによって
再び酵素反応に供することもできる。

（６）　　シス、トランス−１，４−ジシアノシクロヘ
キサン〔化合物（■）〕の製造 化合物（１）は、ジメチル−１，４−シアノシクロヘキ
サンカルボキシレートとアンモニア供給源となりうる化
合物、例えば、アンモニア、尿素等を２００〜３５０”
Ｃ，好ましくは２３０〜３００℃において加熱すること
により製造できる。また、この工程の反応速度を増すた
めに、塩酸、リン酸、硫酸などの鉱酸、またはアルくす
、五酸化リン、酸化スズ等の酸化物、あるいは酢酸、プ
ロピオン酸、安息香酸等の有機酸を触媒として用いても
よい。また、用いるジメチル−１，４−シクロヘキサン
カルボキシレートの立体配置がトランス、シス、または
トランス／シス混合物のいずれであっても、生成する化
合物（１）はトランス／シスの混合物を与える。本発明
では、このようにして製造した化合物（１）を単離精製
せずに、このまま酵素反応原料として用いることができ
る。

（発明の効果） 本発明を利用することにより、トランス−４−シアノシ
クロヘキサンカルボン酸を常温常圧の反応条件下で高濃
度に生成させることができる。さらに、精製の不要なシ
ス、トランス体混合の原料からトランス体を製造するこ
とができるので、経済上極めて有用である。

（実施例） 次に、本発明を実施例および比較例をもって説明するが
、この実施例によって本発明が何ら限定されるものでは
ない。

実施例１ ジメチル−１，４−シクロヘキサンカルボキシレート１
００ｇ　（０，５モル）と酸化スズ１．０ｇを反応器中
に仕込み、２６０〜２８０°Ｃでアンモニアガスを０．
２５モル／Ｈｒの流速で導入しながら１０時間反応を行
った。反応終了後、メタノール２．０００ｄを加え、メ
タノールに不溶な物質を濾取した後、濾液を濃縮、冷却
して、シス。

トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン７０ｇ（純
度９７．５％）を得た。本製品はシス体４２％、トラン
ス体５８％を含んでいた。

実施例２ グリセロール０．５ｇ、ポリペプトン０．３ｇ、リン酸
−カリウム０．０８ｇ、リン酸二カリウム０．１２ｇ、
塩化ナトリウム０．１ｇ、イソブチロニトリル０．０５
ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．０２ｇ、硫酸鉄７水塩
０．００４ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１
００μｇを含み、ｐＨ７，Ｏとした殺菌培地１００ｄに
、あらかしめ同培地で培養したコリネバクテリウム　エ
スピー　　Ｃ５株を植菌し、３０℃で２日間培養した。

培養終了後、遠心分離にて菌体を集め、このうち、０．
４ｇＤＣＷ（乾菌体重量）を０．０５Ｍカリウムリン酸
バッフｙ　−（ｐ　Ｈ７，５）　１００ｒａｌの入った
三角フラスコ中に懸濁した後、実施例１で製造したシス
、トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン（シス：
トランス＝４２：５８）を２０ｇ加え、３０℃で振とう
しながら、反応させた。

５０時間後に反応を終了した。反応液を高速液体クロマ
ト分析した結果、トランス−４−シアノシクロヘキサン
カルボン酸が１０．６ｇ、シス−４−シアノシクロヘキ
サンカルボン酸が０．４５ｇ生戒生威いた０反応液から
遠心分離によって菌体を除き、抽出、濃縮、晶析等の操
作により、トランス−４−シアノシクロヘキサンカルボ
ン酸の結晶８．４ｇを得た。

本製品は高速液体クロマト分析で単一ピークを示した。

融点　１５０〜１５２°Ｃ ＩＲ（ＫＢｒ） ２２３０ｃｍ−’　Ｃｖ　＝ＣＨ） 元素分析 ＣＨ 計算値　　６２．７５　＄　　　７．１９　Ｘ実測値　
　６１．５　　＄　　　７．３５％なお、高速液体クロ
マト分析は以下のようにして行った。分析装置；ウォー
ターズ社製６０００Ａ型ポンプ、東ソー製ｔ−８型示差
屈折計、カラムニッパパック　Ｃ１８、溶媒；水／アセ
トニトリル＝７７／２３（容量比）→−ＰＩＣＢ−７（
ウォーターズ社製）１．５容量％。

比較例 グルコース５．０ｇ、ポリペプトン３．０ｇ、リン酸−
カリウム０．８ｇ、リン酸二カリウム１゜２ｇ１塩化ナ
トリウム１．０ｇ、イソブチロニトリル０．５ｇ、硫酸
マグネシウム７水塩０．２ｇ、硫酸鉄７水塩０．０４ｇ
、ビオチン１ｍｇ、チアミン塩酸塩１■を含み、ｐＨ７
，５とした殺菌培地ｉ、ｏｏｏＩｄに、あらかしめ同袷
地で培−養したキャンディダ　ギアモンディ（Ｃａｎｄ
ｉｄａ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　）　ＩＦｏ　
　０４５４を植菌し、３２°Ｃで５日間培養した後、遠
心分離により菌体を集めた。

４．ＯｇＤＣＷ（乾菌体重量）を０．０５Ｍカリウムリ
ン酸バッファー（ｐＨ７，５）２０−の入った三角フラ
スコ中に懸濁した後、実施例１で製造したシス、トラン
ス−１，４−ジシアノシクロヘキサン（シス：トランス
＝４２：５Ｂ）を２ｇ加え、３０°Ｃで振とうしながら
、反応させた。８０時間後に反応を終了し、反応液を高
速液体クロマト分析した結果、トランス−４−シアノシ
クロヘキサンカルボン酸が０．１２ｇ、シス−４−シア
ノシクロヘキサンカルボン酸が０．２６ｇ生成していた
。

実施例３ コリネバクテリウム　エスピー　０５株のニトリルヒド
ラターゼの単離精製 コリネバクテリウム　エスピー　Ｃ５株を実施例２と同
様の培地で培養した後、８．ＯＯＯｘｇ。

２０分間遠心分離することによって、菌体を得た。

菌体を洗浄した後、ダイノξルにより冷却しながら破砕
した。破砕液を遠心分離し、得られた上清液を無細胞抽
出液とした。

無細胞抽出液をＤＥＡＥ−セルロース〔１０ｍＭリン酸
バッファーＣｐＨ１，５）に懸濁〕に加え、３０分間攪
拌した。ＤＥＡＥ−セルロースを除去した後、０．４Ｍ
ＮａＣ１を含む１００ｍＭバッファーに再懸濁し、３０
分間ゆっくりと混合した。濾過した濾液中に硫酸アンモ
ニウムを加え、飽和度６０％にした後、ＰＨを７．５に
調整し、１時間攪拌した０次いで、遠心分離を行い、析
出したタンパク群を回収した。少量の１０ｍＭリン酸バ
ッファーで回収タンパクを溶解した後、これをセロファ
ンチューブに入れ、４℃、同上のバッファー中で１８時
間放置し、タンパク群水溶液中の硫酸アンモニウムを透
析除去した。

透析操作を終えたタンパク群水溶液をＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｃｅｌ　（５Ｘ　２５　Ｃｍ）によりクロマト分離
した。ｔ８離液は１００ｍＭリン酸バッファー（ＮａＣ
ｌ濃度Ｏ〜０．３Ｍ）を用いた。各クロマト溶離フラク
ション液の一部を取得し、トランス−１゜４−ジシアノ
シクロヘキサンを添加し、ニトリル基の水和活性能の有
無を液体クロマト分析によって調べた。活性を示したフ
ラクションを集め、硫酸アンモニウムを加え、タンパク
を析出させた後、遠心分離によって回収した。透析した
後、硫酸アンモニウムを加えて１５％飽和にした後、Ｐ
ｈｅｎｙｌ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　　ＣＬ　−４Ｂ　　
カラム（２Ｘ１６Ｃ１１）によりクロマト分離した。活
性を有するフラクションを集め、上記と同様の方法で回
収した後、透析処理を行った。なお、本工程から酵素の
安定剤として３０ｍＭインバレリアン酸を添加して用い
た。

透析終了液を再びＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−５ｅｐｈａｃｅｌカ
ラムクロマトに供し活性画分を集めた後、さらに、Ｐｈ
ｅｎｙｌ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　　ＣＬ　−４Ｂ　　カ
ラムクロマト分離を行うことによって、ニトリルヒドラ
ターゼの精製を終了した。上記一連の操作により、比活
性は約１３０倍に上昇した。また、分子量を液体クロマ
トグラフ〔カラム；ＴＳＫ　−ｇｅｔ　Ｇ　　３０００
−３Ｗ　（０，７５Ｘ　６０ｃｍ）　）によって、６１
゜４００と決定した。また、５０Ｓ−ＰＡＧＥ電気泳動
の結果、単一バンドであり、サブユニットの分子量は２
ｐＨ６．９００であった。また、可視・紫外スペクトル
を測定した結果、７１０ｎ園に最大吸゛収を有するブロ
ードなピークがあり、４１０ｎｓ＋にはシッルダービー
クがあった。

実施例４ コリネバクテリウム　エスピー　Ｃ５株のアもダーゼの
単離精製 実施例３と同様の方法で無細胞抽出液を得た。

無細胞抽出液をＤＥＡＥ−セルロース（］ＯｍＭリン酸
バッファー（ｐＨ７，５）に懸濁〕にｍｔ、３０分間攪
拌した。ＤＥＡＥ−セルロースを除去した後、０．　４
Ｍ　　ＮａＣｌ２を含む１００ｍＭバッファーに再懸濁
し、３０分間ゆっくりと混合した。

濾過した濾液中に硫酸アンモニウムを加え、飽和度６０
％にした後、ｐＨを７．５に調整し、１時間攪拌した。

次いで、遠心分離を行い、析出したタンパク群を回収し
た。少量の１０　ｍ　Ｍリン酸バッファーで回収タンパ
クを溶解した後、これをセロファンチューブに入れ、４
℃、同上のバッファ−中で１８時間放置し、タンパク群
水溶液中の硫酸アンモニウムを透析除去した。

透析操作を終えたタンパク群水溶液をＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｃｅｌ　（５Ｘ　２５　ｃｎ＋）によりクロマト分
離した。溶離液は１００ｍＭリン酸バッファー（ＮａＣ
７！濃度０〜０．４Ｍ）を用いた。

各クロマト溶離フラクション液の一部を取得し、トラン
ス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸アミドを基質
とするアミダーゼ活性画分を集めた。

活性画分に硫酸アンモニウムを加え、タンパクを析出さ
せた後、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７，
５）に溶解し、透析を行った。透析終了後、ハイドロキ
シアパタイト（５Ｘ２０Ｃ１１）カラムに通した。酵素
は吸着されず、１０ｍＭ’Ｊン酸カリウムバッファーで
洗い出した。活性画分を集め、３０％飽和の硫酸アンモ
ニウムを加え、沈澱物は遠心分離で除いた。上清はＰｈ
ｅｎｙｌ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　　ＣＬ　−４Ｂ　　カ
ラム（１，５Ｘ２Ｂｃｍ、　３０％飽和硫酸アンモニウ
ムを含有する１０ｍＭバッファーで充填）によりクロマ
ト分離した。溶離は１０ｍＭリン酸バッファー中の硫酸
アンモニウム濃度を３０％からＯ％ヘグラジエントする
ことにより行った。活性画分を集め、６０％飽和硫酸ア
ンモニウムにより沈澱させた。沈澱は０．２ＭのＮａＣ
ｉを含む１０ｍＭリン酸カリウムバッファーに溶解し、
透析を行った。透析終了液はＣｅ１ｌｕ１ｏｆｉｎｅ　
　ＧＣ−７００ｍカラム（２Ｘ８３ｃｍ）により分離し
、活性画分に４５％飽和の硫酸アンモニウムを加えた。

生じた沈澱は遠心分離により除去し、上清は５５％飽和
の硫酸アンモニウムを加えることにより沈澱させ、沈澱
物は２０％グリセロールを含む１０ｍＭリン酸バッファ
ーに溶解し、透析を行った。透析終了後、Ｄ　Ｅ　Ａ　
Ｅ　−５ｅｐｈａｃｃｌカラム（１，７５Ｘ２１．５ｃ
ｍ）によりクロマト分離を行った。溶離はバッファー中
のＮａＣｉ　濃度をＯから０．３Ｍに上げることにより
行った。活性画分は再びＰｈｅｎｙｌ−３ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ　　ＣＬ　　４　Ｂ　　カラムにより分離し、活性
画分を集め、硫酸アンモニウムにより沈澱させた後、透
析を行った。透析終了液をＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−５ｅｐｈａ
ｃｅｌカラムによる分画を２回行い、無細胞抽出液の約
２２０倍の比活性まで精製することができた。

実施例５ 実施例３で調製したニトリルヒドラターゼ２■、実施例
４で調製したアミダーゼ１５■を０．１Ｍリン酸カリウ
ムバッファー（ｐＨ７，５）ＬＯｍｌに溶解した後、シ
ス、トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン（シス
：トランス＝４２：５８）２ｇを加え、８時間３０℃で
反応を行った。

反応終了液の高速液体クロマト分析を行ったところ、ト
ランス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸１．２８
ｇ、シス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸０．０
６ｇが生成していた。

【図面の簡単な説明】

第１図はニトリルヒドラターゼの至適ｐ　Ｈを求めた結
果を示すグラフ、第２図はアミダーゼの至適ｐＨを求め
た結果を示すグラフ、第３図はアミダーゼの至適温度を
求めた結果を示すグラフである。 第１ 図 反応液のｐＨ ０−ｍ−〇　；　　カリウムリン匹□ノｖツファ一口一
一一−０；　トリス塩酸バッファーか一一一→　：　グ
リシン−ＮａＯＨバッファ−第２図 ｐＨ ｅ−＋；　　クエン酸−ＮｃＬＯＨバッファーΔ−一Δ
　；　トリス−マレイン酸バッファー・−ｍ−・　；　
　ＭＯＰＳバッファーに−−１；　トリスＭＬ酸バッフ
ァー ０−一０　；、グリシン−ＮａＯＨバッファー第３図 良 （°Ｃ）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
   ｉｕｍ）属に属する微生物またはその調製物の作用によ
   り、シス，トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサン
   からトランス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸を
   得ることを特徴とするトランス−４−シアノシクロヘキ
   サンカルボン酸の製造方法。
2. （２）コリネバクテリウム属細菌から調製され、下記の
   理化学的性質を有するニトリルヒドラターゼ。 ［１］酵素作用 ニトリル化合物のニトリル基に作用し、ニトリル基をア
   ミド基に水和転化させる反応の触媒としての機能を示す
   。 ［２］基質特異性 ｎ−ブチロニトリル、ｎ−バレロニトリル等の飽和脂肪
   族ニトリル、アクロニトリル、メタアクロニトリル等の
   不飽和脂肪族ニトリル、ベンゾニトリル等の芳香族ニト
   リル、３−シアノピリジン等の複素環式ニトリル、マロ
   ノニトリル、トランス−１，４−ジシアノシクロヘキサ
   ン等のジニトリル化合物に作用する。特に、ｎ−バレロ
   ニトリル、ｉｓｏ−バレロニトリルの水和速度が大きい
   。さらに、１，４−ジシアノシクロヘキサンにおいては
   、トランス体の水和速度がシス体に比べて著しく大きい
   。 ［３］分子量 分子量６１，４００（液クロ法）であり、サブユニット
   の分子量は２６，９００である。（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ［４］至適ｐＨ ｐＨ８．０〜８．５でニトリル基の水和作用は至適であ
   る。 ［５］温度安定性 ｐＨ７．５で１０〜４０℃、１０分間処理しても水和活
   性は低下しない。 ［６］安定化剤 イソバレリアン酸を加えることにより安定化される。 ［７］阻害剤 Ｈｇ＾＋＾＋、フェニルヒドラジン等で阻害される。 ［８］分子内にＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）を含む
   。
3. （３）コリネバクテリウム属細菌から調製され、下記の
   理化学的性質を有するアミダーゼ。 ［１］酵素作用 アミド化合物のアミド基に作用し、アミド基をカルボキ
   シル基とアンモニアに加水分解させる反応の触媒として
   の機能を示す。 ［２］基質特異性 プロピオンアミド、ｎ−バレロアミド等の飽和脂肪族ア
   ミド、トランス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸
   アミド等の環状飽和脂肪族アミド、メタアクリルアミド
   等の不飽和脂肪族アミド、ベンズアミド等の芳香族アミ
   ド、およびニコチン酸アミド等の複素環式アミド化合物
   に作用する。また、特に、トランス−４−シアノシクロ
   ヘキサンカルボン酸アミドの加水分解速度が大きく、こ
   れに対しシス−４−シアノシクロヘキサンカルボン酸ア
   ミドの活性は低い。 ［３］至適ｐＨ ｐＨ６．５から１０．０でアミド基の加水分解作用は至
   適である。 ［４］至適温度 至適温度は約５０℃である。 ［５］阻害剤 Ｈｇ＾＋＾＋と￥ｐ￥−ＣＭＢ等で阻害される。