JPH0346112B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

＜産業上の利用分野＞ 本発明は、発酵法によるＬ−スレオニンの製造
方法に関する。 Ｌ−スレオニンは必須アミノ酸の１つであり、
医薬用、飼料添加物として重量であり、その安価
な製造方法が望まれている。 ＜従来の技術＞ ブレビバクテリウム属に属する微生物を用いる
発酵法によるＬ−スレオニンの製造方法として
は、α−アミノ−β−ヒドロシキ吉草酸（以下、
AHVと記す）に耐性を有する変異株（特公昭45
−26708号公報）AHVに耐性を有し、Ｌ−リジ
ンまたはＬ−イソロイシン要求性を有する変異株
（特公昭48−44876号公報）、AHVとＳ−（２−ア
ミノエチル）−Ｌ−システイン（以下、AECと記
す）に耐性を有し、Ｌ−リジンを併産する人工変
異株（米国特許3732144号公報）、AHVおよび
AECに耐性を有し、Ｌ−ロイシン要求性を有し、
Ｌ−リジンを併産する変異株（特開昭50−31093
号公報）、AHVにＳ−メチルシステインスルホ
キサイド（以下、Ｓ−MCSと記す）に耐性を有
する変異株（特公昭56−3038号公報）などを用い
る方法が知られている。 ＜発明が解決しようとする問題点＞ しかし、これらの方法によるＬ−スレオニンの
蓄積濃度、または、糖などの原料からのＬ−スレ
オニン生成収率は、十分に満足できるものではな
かつた。 ＜問題点を解決するための手段および作用＞ 本発明者らは、さらに生産性の高いＬ−スレオ
ニンの製造方法について鋭意研究した結果、ブレ
ビバクテリウム属に属し、スレオニン生産能を有
する微生物にＬ−アスパラギン酸代謝拮抗物質に
対する耐性を付与することによつて、Ｌ−スレオ
ニンの蓄積濃度、生成収率が著しく向上すること
を見出し、本発明に到達した。 すなわち、本発明はブレビバクテリウム
（Brevibacterium）属に属し、アスパラギン酸代
謝拮抗物質に耐性を有し、かつＬ−スレオニン生
産能を有する微生物を培養して、培養液中にＬ−
スレオニンを生成蓄積せしめ、前記培養液よりＬ
−スレオニンを採取することを特徴とする発酵法
によるＬ−スレオニンの製造方法である。 ブレビバクテリウム属に属する微生物のアスパ
ラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有する変異株は、
これまで分離されたことがない。また、ブレビバ
クテリウム属に属する微生物のアスパラギン酸代
謝拮抗物質に耐性を有する変異株が、Ｌ−スレオ
ニンを著量生成蓄積せしめ得ることは、まつたく
知られていない。 ここでアスパラギン酸代謝拮抗物質とは、ブレ
ビバクテリウム属に属する微生物の(A)生育を阻害
し、その生育阻害がＬ−アスパラギン酸の添加に
より回復する物質または、(B)Ｌ−アスパラギン酸
の生合成系に関与する酵素の抑制作用または阻害
作用を示す物質のことである。 アスパラギン酸代謝拮抗物質としては、例え
ば、アスパラギン酸ヒドロキサメート、α−メチ
ルアスパラギン酸、β−メチルアスパラギン酸、
システインスルフイン酸、ジフルオロコハク酸、
ハダシジン、メソ−２，３−ジアミノコハク酸な
どが挙げられる。 本発明で用いられる微生物はブレビバクテリウ
ム属に属し（日本農芸化学会誌第36巻、第２号、
P141〜159（1962）に従う）アスパラギン酸代謝
拮抗物質に耐性を有する微生物である。 かかる性質を有していれば、他の要求性、他の
薬剤抵抗性を持つものでも本発明の範囲に含まれ
る。また、Ｌ−イソロイシンに対する栄養要求性
およびＬ−ロイシンに対する栄養要求性、AHV
などスレオニンアナローグに対する耐性およびＳ
−MCSに対する耐性はＬ−スレオニン生産能に
有効に作用するので、これらのうちいくつかの特
性ないしはすべての特性を合わせ持つ微生物が親
株としてより好ましく用いられる。ここでいう栄
養要求性とは広義の意味であり、不完全欠失型
（いわゆるleaky型）も含むものである。さらに
その要求物質の生合成前駆物質で要求性が満足さ
れる場合も含むものである。 本発明で用いられる変異株の代表的なものとし
ては、例えば以下のものがある。ブレビバクテリ
ウム・ラクトフアーメンタムAHXR−11（FERM
Ｐ−8774）。 この変異株はブレビバクテリウム・ラクトフア
ーメンタムFERM Ｐ−4190（AHV耐性、Ｌ−イ
ソロイシン要求性、Ｌ−ロイシン要求性、Ｓ−
MCS耐性）を親株として、通常の変異処理方法
によつて得られたもので、アスパラギン酸ヒドロ
キサメートに耐性な変異株である。 変異株の誘導は親株を紫外線照射するか、ある
いは変異誘発剤（例えば、Ｎ−メチル−N′−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンス
ルホン酸など）で処理したのち、親株が生育でき
ないような濃度のアスパラギン酸代謝拮抗物質を
含む固体培地で生育可能な菌株を採取すればよ
い。 アスパラギン酸代謝拮抗阻害剤耐性変異株と
は、親株よりアスパラギン酸代謝拮抗物質に強い
耐性を有する株のことであり、好ましくは親株の
相対生育度が30％以下を示すアスパラギン酸代謝
拮抗物質の濃度範囲において60％以上の相対生育
度を示す変異株のことである。ここで相対生育度
は培養液の660nｍにおける吸光度を測定し、各
菌株のアスパラギン酸代謝拮抗物質を添加してい
ない培養液の吸光度を100％として表わした場合
の相対吸光度で示す。耐性を検定する場合のアス
パラギン酸代謝拮抗物質は市販のものを用いた。 本発明において用いる菌株とその親株のDL−
アスパラギン酸ヒドロキサメートに対する耐性を
検定した結果を実施例２に示す。 本発明におけるＬ−スレオニン生産用の培地は
炭素源、窒素源、無機イオンおよびさらに必要に
応じてその他の有機微量栄養素を含有する通常の
培地である。 炭素源としては、グルコース、シユークロース
およびこれらを含有する糖蜜、澱粉加水分解物な
どの炭水化物、クエン酸、コハク酸などの有機
酸、グリセロールなどのアルコール、その他が使
用できる。窒素源としては、アンモニアガス、ア
ンモニア水、アンモニウム塩、尿素などが好適で
ある。無機イオンとしては、カリウムイオン、リ
ン酸イオン、マグネシウムイオンなどが必要に応
じて適宜添加される。有機微量栄養素としては、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシンなどの被要求物
質が培地に添加されるが、さらに必要に応じてビ
タミンなどが適宜使用される。 培養は好気的条件が好ましい。培養の間、培地
のPHは５〜９に、温度は24〜37℃に調節すれば最
も好ましい結果が得られる。 発酵液からのＬ−スレオニンの採取は常法で行
なうことができ、たとえばイオン交換樹脂法によ
り行われる。 ＜実施例＞ 以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ （DL−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性
株の分離） ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
FERM−P4190（AHV耐性、Ｌ−イソロイシン要
求性、Ｌ−ロイシン要求性、Ｓ−MCS耐性）の
菌体に常法によりＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン処理（300μｇ／ml、37℃
で10分）したのち、この細胞をDL−アスパラギ
ン酸ヒドロキサメート0.3ｇ／添加した寒天培
地（グルコース0.5％、硫安0.15％、リン酸第１
カリウム0.1％、リン酸第２カリウム0.3％、硫酸
マグネシウム７水和物0.01％、塩化カルシウム２
水和物0.0001％、尿素0.15％、ビオチン0.000005
％、チアミン・塩酸塩0.00001％、Ｌ−イソロイ
シン0.01％、Ｌ−ロイシン0.01％を含む最少培
地）に塗布した。次に37℃で５日培養し、生じた
大きなコロニーを釣菌分離して、DL−アスパラ
ギン酸ヒドロキサメート耐性株（ブレビバクテリ
ウム・ラクトフアーメンタムAHXR−11（FERM
Ｐ−8774）を取得した。 実施例 ２ （DL−アスパラギン酸ヒドロキサメート耐性
変異株の耐性度） 下記第１表に示す各菌株を液体ブイヨン培地を
用いて30℃で16時間振盪培養し、生育した菌体を
集菌し生理食塩水で洗浄した。この菌体懸濁液を
DL−アスパラギン酸ヒドロキサメート０、0.1、
0.2、0.3、0.4、0.5ｇ／の濃度で含む最少培地
（グルコース0.5％、硫安0.15％、リン酸第１カリ
ウム0.1％、リン酸第２カリウム0.3％、硫酸マグ
ネシウム・７水和物0.01％、塩化カルシウム・２
水和物0.0001％、尿素0.15％、ビオチン0.000005
％、チアミン・塩酸塩0.00001％、Ｌ−イソロイ
シン0.01％、Ｌ−ロイシン0.01％を含む最少培
地）５mlに植菌して、30℃で48時間培養し、各菌
株の生育度を調べた。その結果は第１表に示すと
おりである。 本発明で使用するDL−アスパラギン酸ヒドロ
キサメートに耐性な変異株（ブレビバクテリウ
ム・ラクトフアーメンタムAHXR−11（FERM
Ｐ−8774））では、親株のブレビバクテリウム・
ラクトフアーメンタムFERM−P4190と比較して
高濃度のDL−アスパラギン酸ヒドロキサメート
によつて生育が阻害されず、強いDL−アスパラ
キン酸ヒドロキサメート耐性を獲得していること
を示している。

【表】 実施例 ３ （Ｌ−スレオニン生産菌の培養およびＬ−スレ
オニン生産） 第２表に示す各菌株をそれぞれ液体ブイヨン培
地で30℃、16時間振盪して前培養したのち、予め
120℃、10分間蒸気滅菌した下記組成の発酵培地
50mlを含む１容エーレンマイヤーフラスコに前
記培養液を各々５mlづつ植継ぎ、30℃で150回
転／分、振幅３cmの条件下で５日間培養した。 発酵用培地組成 グルコース 10％ 硫 安 4.5％ リン酸第１カリウム 0.1％ 硫酸マグネシウム・７水和物 0.1％ 硫酸第２鉄・７水和物 0.001％ 硫酸マンガン・４水和物 0.001％ チアミン・塩酸塩 0.00003％ ビオチン 0.00001％ 大豆蛋白塩酸加水分解物 1.5％ 炭酸カルシウム（別滅菌） ５％ PH 7.2（KOHで中和） 培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去し、
培養液中のＬ−スレオニン濃度を、アミノ酸自動
分析計（日本電子(株)社製JLC−200A）で定量し
たところ、第２表に示すような結果を得た。

【表】 スレオニン生成収率は、消費グルコースに対す
る生成スレオニンの重量収率で表わした。ブレビ
バクテリウム・ラクトフアーメンタムAHXR−
11の培養液より菌体を除き、その200mlを強カオ
チン交換樹脂ダイヤイオンSK−1B（Ｈ型）のカ
ラムに通した。カラムを水洗後、2Nアンモニア
水でカラムの吸着成分を溶出し、脱色後減圧濃縮
した。これにエタノールを加え、冷却し、生成し
た結晶を集めて乾燥した結果、純度96％以上のＬ
−スレオニンの結晶2.4ｇを得た。 ＜発明の効果＞ 本発明により、高収率でＬ−スレオニンの生成
が可能となり、より安価なＬ−スレオニンの生産
が可能となる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
   に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有
   し、かつＬ−スレオニン生産能を有する微生物を
   培養して、培養液中にＬ−スレオニンを生成蓄積
   せしめ、前記培養液よりＬ−スレオニンを採取す
   ることを特徴とする発酵法によるＬ−スレオニン
   の製造方法。 ２ アスパラギン酸代謝拮抗物質が、アスパラギ
   ン酸ヒドロキサメートである特許請求の範囲第１
   項記載の発酵法によるＬ−スレオニンの製造方
   法。