JPH0346116B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、抗ヒト膵型α−アミラーゼ モノク
ローナル抗体（以下、抗Ｐ−Amyモノクローナ
ル抗体という）に関する。 本発明の抗Ｐ−Amyモノクローナル抗体はヒ
ト膵型α−アミラーゼ（以下、Ｐ−Amyという）
とヒト唾液腺型α−アミラーゼ（以下、Ｓ−
Amyという）との分別定量に有用である。血清
の如きヒト体液中のＰ−AmyとＳ−Amyを分別
定量すれば、種々の疾患、特に膵疾患の診断がで
きる。 従来技術および本発明が解決せんとする問題点 血清の如きヒト体液中のα−アミラーゼの増減
を知ることは種々の疾患、特に膵疾患の診断に有
用であるのでα−アミラーゼの測定は高頻度に実
施される臨床検査項目の一つとなつている。ヒト
α−アミラーゼには２種のアイソザイム、すなわ
ちＰ−AmyとＳ−Amyが知られており、総α−
アミラーゼ活性を測定するだけでは正確な診断が
できないこともあるので上記２種のアイソザイム
の分別定量が行われている。従来の分別定量法と
しては、例えば電気泳動法や阻害法などがある。 電気泳動法は、各種の支持体上に検体をスポツ
トして泳動を行い、分離したアイソザイムを染色
し、その濃さからＰ−AmyとＳ−Amyの活性を
知る方法である。しかし、この方法は、Ｐ−
AmyとＳ−Amyの分離が完全でないので正確な
分別定量ができない。しかも、この方法は全操作
に長時間を要するので多数の検体を処理するには
全く不都合である。 一方、阻害法は、小麦由来のＳ−Amy阻害剤
を用い、その阻害率の差からＳ−AmyとＰ−
Amyの活性化を計算する方法である。しかし、
この方法はＳ−Amyに対する特異的阻害度が低
いために厳密な定量法であるとはいえない。更に
この方法では阻害剤の阻害度にロツト間の差があ
るので標準曲線を作成しなければならず、その作
成に手間がかかる。 このように従来法は迅速性、定量性等の要請を
満足するものではない。 ところで、Ｐ−AmyとＳ−Amyとは極めて近
似したアミノ酸配列を有することが知られてお
り、その相同性（homology）は94％に達するこ
とが報告されている［ジーン（Gene）28 263−
270（1984）］。すなわち両者のアミノ酸配列の違い
は６％にすぎない。従つて、このようなＰ−
AmyまたはＳ−Amyに対するモノクローナル抗
体は、これら個々の抗原のわずかな違いを区別し
て認識し得るものでなければならない。またＳ−
Amyと特異的に結合する抗Ｓ−Amyモノクロー
ナル抗体が存在する場合、抗Ｐ−Amyモノクロ
ーナル抗体が認識すべきエピトープ（抗原決定
基）は更に狭い範囲から選択されなければならな
いことになる。このようにＰ−Amyと特異的に
結合する抗Ｐ−Amyモノクローナル抗体を得る
ことは極めて困難である。 さらに、Ｓ−Amyは市販されているがＰ−
Amyは市販されていないためＰ−Amyの入手は
Ｓ−Amyの場合よりも容易でなく、しかも本発
明者らの研究によればフロインド完全アジユバン
トと共にヒト膵液そのものを動物に投与しても十
分免疫されないことが見い出された。以上のこと
は抗Ｐ−Amyモノクローナル抗体の製造をより
一層困難なものにしている。 問題を解決するための手段 本発明は下記の性質を有する抗Ｐ−Amyモノ
クローナル抗体に関する： Ｐ−Amyを認識する、 実質的にＳ−Amyを認識しない、 抗原たるＰ−Amyとの免疫反応後において
も該酵素が失活しない。 本発明のモノクローナル抗体は、細胞融合技法
により製造できる。更に詳細には、本発明のモノ
クローナル抗体は次の(1)〜(4)の工程、すなわち、 (1) 抗原ならびにＢ細胞調製工程、 (2) 融合・スクリーニング・クローニング工程、 (3) ハイブリドーマ培養工程、および (4) 必要に応じて行われる精製工程、 を実施することにより得られる。以下、各工程に
ついて説明する。 (1) 抗原ならびにＢ細胞調製工程 Ｂ細胞は抗原たるＰ−Amyで十分免疫した
動物の脾臓より採取できる。 抗原たるＰ−Amyは高純度のものを大量に
用いるのが最も好ましい。しかし、Ｐ−Amy
の純度はそれ程高いものでなくとも十分に目的
は達成できる。例えば、ヒト膵液の部分精製物
が抗原として用いられる。ヒト膵液からのＰ−
Amyの部分精製は、例えば、硫安分画法によ
り行える。 免疫は、抗原たるＰ−Amyをマウスやラツ
トの如き哺乳動物に投与することにより行え
る。免疫条件、例えば抗原たるＰ−Amyの使
用量、投与部位、アジユバントの種類やその使
用量等の条件は、従来の抗血清を得る場合の条
件が採用される。通常、免疫は、フロインド完
全アジユバントとＰ−Amyを含む乳濁液をマ
ウスの如き哺乳動物に非経口投与し、同様にし
て約１週間の間隔をおいて追加免疫をすること
により行われる。この追加免疫は４〜７回行わ
れる。最終免疫後３〜５日に十分免疫した哺乳
動物の脾臓からＢ細胞を採取する。 (2) 融合・スクリーニング・クローニング工程融
合は、融合促進剤の存在下、上記Ｂ細胞ならび
に公知の骨髄腫細胞（以下ミエローマ細胞とい
う）を公知の融合用無血清培地に懸濁し、これ
を混合することにより行える。 一般的にミエローマ細胞は、工程(1)で用いた
被免疫動物と同種の動物由来のものであつてハ
イブリドーマ選択培地で生育できず、かつ、そ
れ自身が抗体を分泌しないものが好ましい。こ
のようなミエローマ細胞としては、例えば市販
されているマウスミエローマ細胞P3−X63−
Ag8−U1あるいはこれと同等物が挙げられる。 両細胞の混合比は、通常、ミエローマ細胞１
に対しＢ細胞１〜20である。細胞融合促進剤と
しては、例えばポリエチレングリコールが用い
られ、分子量1000〜7500のものが好ましい。 融合細胞、すなわちハイブリドーマの培養
は、融合促進剤を洗浄除去しミエローマ細胞用
培地に懸濁したハイブリドーマの0.1〜0.2mlず
つを96穴培養皿（以下穴ということもある）に
まき、約37℃において５％炭酸ガス−空気中で
温置することにより行える。培養中、HAT培
地の如き公知のハイブリドーマ選択培地を添加
し、その割合を徐々に高める。このような培地
交換によりハイブリドーマ以外の細胞は死滅す
る。最終的には同様にして、再びハイブリドー
マ選択培地をミエローマ細胞用培地、すなわち
ハイブリドーマ用培地と交換する。 目的とするハイブリドーマのスクリーニング
は、培養液中の抗体価および交差度を調べるこ
とにより行える。すなわち、培養液の一部にＰ
−AmyまたはＳ−Amyおよび後述の不溶化第
二抗体を加えて温置し、遠心し、得られるペレ
ツト中の酵素活性を後述の定量法で測定するこ
とによりその抗体価およびＰ−AmyとＳ−
Amyに対する交差の程度を知ことができる。 スクリーニングしたハイブリドーマについて
限界希釈法を適用することにより目的とする実
質的にＰ−Amyのみを認識するハイブリドー
マが創製できる。このハイブリドーマは継代培
養または凍結により半永久的に保存できる。 (3) ハイブリドーマの培養工程 前工程で得たハイブリドーマをin vitroまた
はin vivoで培養すれば目的のモノクローナル
抗体が生産できる。 in vitroの培養は、数個のハイブリドーマの
96穴培養皿中での培養から始め、徐々にスケー
ルアツプすることにより行える。またin vivo
での培養は、融合細胞の増殖を容易にさせるた
めのプリスタン（pristane）処理をしたマウス
にハイブリドーマを腹腔内に接種することによ
り実施でき、10〜20日後にはモノクローナル抗
体を含む腹水が蓄積される。 一般に、in vitroでの培養は高純度のモノク
ローナル抗体を得たいときに行われ、in vivo
での培養はモノクローナル抗体を大量に得たい
ときに行われる。通常in vivoでの培養により、
マウス１匹あたり10〜100mgの抗Ｐ−Amyモノ
クローナル抗体が得られる。免疫分析にはin
vivoでの培養で蓄積された腹水をそのまま利用
することもできるが、必要に応じ更に精製して
もよい。 (4) 精製工程 必要に応じて行われるin vitroでの培養物ま
たはin vivoの培養で蓄積された腹水からのモ
ノクローナル抗体の分離精製は、通常の物理化
学的手段、例えば塩析、遠心分離、透析、不溶
性担体と結合しているプロテインＡを用いるア
フイニテイークロマトグラフイーの如き各種カ
ラムクロマトグラフイー等の手段を合理的に組
み合せることにより行える。 かくして得られる本発明の抗Ｐ−Amyモノ
クローナル抗体は、Ｐ−AmyとＳ−Amyとを
確実に識別できる。また、Ｐ−Amyは、本発
明のモノクローナル抗体との免疫反応後におい
ても、低分子のｐ−ニトロフエニルマルトヘプ
タオシド（以下PNPという）（ベーリンガーマ
ンハイムGmbH）や高分子の不溶性青色デン
プンポリマー（第一化学薬品株式会社）の如き
種々の分子量の基質を分解することができる。 本発明のモノクローナル抗体はＰ−AmyとＳ
−Amyの分別定量用試薬として有用である。 Ｐ−Amyの定量は、 検体に本発明のモノクローナル抗体を加えて
温置する工程（免疫反応工程）、 生成する抗原抗体複合物とそれ以外のものを
分離（通常遠心分離）する工程（抗原抗体複合
物分離工程）、および 分離した抗原抗体複合物（通常沈殿）中のα
−アミラーゼ活性を測定する工程（α−アミラ
ーゼ測定工程）、 を実施することにより行える。このように本方法
では直接Ｐ−Amyの活性を知ることができる。 Ｐ−AmyとＳ−Amyとの分別定量は、前記
の工程で分離した抗原抗体複合物およびそれ以外
のもの（通常は上清）のα−アミラーゼ活性を測
定するとか、別に求めた総α−アミラーゼ活性か
ら上記の方法により求めたＰ−Amyの活性を差
し引くことにより実施できる。 Ｐ−Amyの定量工程〜は、すべて約37℃
前後で行われる。工程における抗Ｐ−Amyモ
ノクローナル抗体は一般に、検体中のＰ−Amy
に対応する量よりも過剰に用いられる。工程
は、エンザイム イムノ アツセイ法における
Ｂ／Ｆ分離の技術を応用することにより行える。
例えば工程において抗Ｐ−Amyモノクローナ
ル抗体の代わりに不溶化抗Ｐ−Amyモノクロー
ナル抗体を用い免疫反応後に抗原抗体複合物を遠
心分離するとか、抗原抗体複合物に対する抗体を
不溶化したもの、すなわち不溶化第二抗体を工程
において更に反応せしめ生ずる複合物を遠心分
離することにより行える。ここにおける抗体の不
溶化は、常法により不溶性担体と抗Ｐ−Amyモ
ノクローナル抗体もしくは第二抗体とを結合させ
ることにより行える。不溶性担体としては公知の
ものがいずれも使えるが、米国特許第4166767号
記載の細菌細胞壁片が好ましく用いられる。工程
および総α−アミラーゼ活性の測定は公知の方
法、例えば市販されているα−アミラーゼ定量用
キツトを用いることにより実施できる。そのよう
なキツトの例としてはベーリンガーマンハイム−
山之内株式会社から発売されているオートパツク
α−アミラーゼキツトが挙げられる。このキツト
ではPNPおよびα−グルコシダーゼを含む溶液
（以下 PNP試薬という）を基質として用いてい
る。 Ｐ−AmyとＳ−Amyを分離する試薬は市販さ
れている総てのα−アミラーゼ定量用キツトと任
意に組み合わせることができる。Ｐ−AmyとＳ
−Amyとを分離するための試薬は、少くとも (1) 不溶性担体と結合した抗Ｐ−Amyモノクロ
ーナル抗体、または (2) 抗Ｐ−Amyモノクローナル抗体および
不溶性担体と結合した第二抗体（不溶化第二抗
体） を含むものである。この試薬には更に緩衝剤、防
腐剤、安定化剤、賦形剤等が含まれ得る。上記(2)
の場合にはキツトの形にするのが好ましい。 具体例 次に実施例を挙げて更に詳細に説明する。 なお、以下では次の培地を用いた。 細胞融合用無血清培地、すなわちRPM1
1640培地（ギブコ ラボラトリー） ミエローマ細胞（またはハイブリドーマ）用
培地上記培地に以下のものを添加した培地。 10％ウシ胎児血清（FCS）、 ４ｍＭグルタミン、 50μMβ−メルカプトエタノール、 100U／mlペニシリンＧ、および100μｇ／ml
ストレプトマイシン。 HAT培地（ハイブリドーマ選択培地）上記
培地に以下のものを添加した培地。 0.1ｍＭ ヒポキサンチン、 0.4μM アミノプテリン、および16μMチミ
ジン。 また、以下ではリン酸緩衝液はPBSと、牛血
清アルブミンはBSAと略称する。 実施例 １ 抗Ｐ−Amyモノクローナル抗体の製造 (1) ハイブリドーマの創製 抗原ならびに細胞の調製 ４℃においてヒト膵液２mlに硫安554mgを加
え（飽和度45％）、０℃で３時間放置後、生ず
るペレツトを遠心分離（5000×ｇ、30分）し、
このペレツトを生理食塩水0.5mlに溶解する。 この溶液に等量のフロインド完全アジユバン
ト（半井化学薬品株式会社）を加えて乳化した
もの0.5mlをBALB／ｃマウス（静岡実験動物
協同組合）の腹腔内に投与し、１週間後に同様
にして免疫する。更に１週間後に追加免疫（静
注）し、以後同様に６回の追加免疫を行い３日
後に脾臓を取り出してＢ細胞を採取する。 スクリーニング・クローニング 対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞P3
−X63−Ag8−U1（ATGG カタログ番号GRL
1597）の１×10⁷個と脾臓細胞の１×10⁸個を混
合し、培地で遠心（400×ｇ、10分）洗浄後、
37℃に保温した50％ポリエチレングリコール
1500（和光純薬工業株式会社）１mlを１分間か
けて加え、ゆつくり撹拌する。１分後、37℃に
保温した１mlの培地を同様にして加える。更
に20mlの培地を30秒毎に１mlずつ加えた後、
遠心（400×ｇ、10分）し、上清を除去する。
得られるペレツトに12mlの培地を徐々に加え
る。この0.1mlずつを96穴培養皿にまき、37℃
において５％炭酸ガス−空気中で培養する。20
時間後、培地0.1mlずつを穴に加える。２日、
３日、５日、８日、11日、13日および15日後の
計７回にわたつて0.1mlの培地を捨て新しい
培地0.1mlを加える。この培地交換によりハイ
ブリドーマ以外の細胞は死滅する。16日以降は
再び培地に交換し、培養する。培養開始後７
日目にハイブリドーマの生育が始り、15日目に
は80％の穴に生育が認められる。 抗体価および交差度の検定 培養15日後の培養液の抗体価および交差度を
次のようにして調べた。 検定用試薬 (1) Ｐ−Amy溶液 膵液250μ（92000IU／）を下記緩衝液
Ａで希釈し、全量を50mlとなしたもの。 (2) Ｓ−Amy溶液 １mgのＳ−Amy（シグマケミカル Co.）
を下記緩衝液Ａで溶解・希釈し全量を50mlと
なしたもの。 (3) 緩衝液Ａ（PH7.0） 0.1％BSA−0.9％NaCl−0.04M−PBS（PH
7.0）からなる緩衝液。 (4) 不溶化第二抗体の懸濁液 米国特許第4166767号明細書の実施例１の
方法により調製したもの。すなわち、ラクト
バチルスプランタルムATCC 8014の細胞壁
片125mgを水2.5mlに懸濁し、これにマイルス
−イエダ Ltd.社製の抗マウスIgGウサギ抗
体溶液［タンパク25mg／0.05M−PBS（PH
7.0）2.5ml］、水2.5mlおよび0.1M−PBS（PH
7.0）2.5mlを加えてよく混和する。これに撹
拌下、2.5％のグルタールアルデヒド溶液2.5
mlを滴下する。１時間撹拌後、遠心（2000×
ｇ、10分）し、沈殿を５mlの0.9％NaC1−
0.02Mトリス緩衝液（PH7.0）で３回洗浄し、
目的とする不溶化第二抗体を得る。これを
5.2mlの0.2％BSA−0.9％NaC1−0.1％NaN₃
トリス緩衝液（PH7.0）に懸濁し、さらに超
音波処理をする。 検定操作 抗体価は次のようにして検定した。 すなわち、ハイブリドーマ培養液50μ、Ｐ
−Amy溶液25μ、不溶化第二抗体懸濁液50μ
を混合し、37℃で30分間温置後、４mlの生理
食塩水を加え遠心（3000×ｇ、５分）して上清
をすてる。ペレツトにPNP試薬１mlを加え撹
拌後37℃で温置する。30分後、２mlの反応停止
液［0.1M−PBS（PH11）］を加えて遠心し、上
清の吸光度（405nｍ）を測定する。吸光度が
高い穴に高抗体価を有する抗Ｐ−Amyモノク
ローナル抗体が含まれていると判定した。 交差度は抗体価が高い培養液について検討し
た。すなわち、Ｐ−Amy溶液の代わりにＳ−
Amy溶液を用いるほかは抗体価検定の場合と
同じ操作により交差度を検定した。405nｍに
おける吸光度が低い検体ほど交差度が低いと判
定した。 すなわち、全部で768個の穴（ウエル）のな
かで615個のウエルにおいてハイブリドーマの
発育がみられ、そのなかで発育良好な307個の
ウエルを選択し、これらの内からＰ−Amy抗
体価が高い５個のウエルを選択した。これらに
ついて、再度、限界希釈培養（全ウエル数：
480）を行つた。培養10日後には全ウエルでハ
イブリドーマの発育が認められた。１ウエルあ
たり１個のコロニーをもち、良好にハイブリド
ーマが発育したウエルを１群４個ずつ合計20個
を選択し、その内からＰ−Amy抗体価が高い
５個のウエルを選択し、それらのＳ−Amy抗
体価を測定して次の結果を得た。

【表】 上記の結果から、Ｐ−Amy抗体価が高く、
かつ、Ｓ−Amy抗体価が低い（すなわち交差
性が低い）ものとして、ウエル番号96のハイブ
リドーマを最終的に選択した。 このハイブリドーマは凍結または継代培養に
より保存できる。 (2) モノクローナル抗体の製造 予めプリスタン（pristane）0.5mlを腹腔内
投与したBALB／ｃマウスの腹腔内に、前項
で得たハイブリドーマ１×10⁷個を接種する。
15日目に目的とするモノクローナル抗体を含む
腹水３ml／マウスを得る。次に４℃において、
腹水に等量の飽和硫安溶液を加え30分間撹拌
後、遠心（5000×ｇ、30分）し上清をすてる。
ペレツトを0.05M−PBS（PH7.4）−0.14M塩化ナ
トリウム溶液に溶解後、４℃で一夜透析し、30
分遠心（5000×ｇ）し、上清を凍結乾燥して目
的の粗モノクローナル抗体を得る。 免疫拡散法による検定によれば、このモノク
ローナル抗体はIgG1サブクラスに属し、その
Ｌ鎖はカツパーに属するものであつた。 実施例 ２ 分別定量 Ｐ−AmyとＳ−Amyを等量含む溶液を倍数希
釈したものを検体とし、以下の方法により分別定
量を行う。 総α−アミラーゼ活性の定量 検体25μにPNP試薬１mlを加え37℃で温置し
30分後、２mlの0.1M−PBS（PH11）（反応停止液）
を加え405nｍにおける吸光度を測定する。 Ｐ−Amyの定量 検体25μ、抗Ｐ−Amyモノクローナル抗体
［実施例１の(2)項で得た腹水を緩衝液Ａで1000倍
希釈したもの］50μおよび不溶化第二抗体懸濁
液50μを混合し、37℃で温置し、30分後に生理
食塩水４mlを加えて遠心（3000×ｇ、５分）す
る。得られるペレツトにPNP試薬１mlを加え37
℃で温置し、30分後、２mlの反応停止液を加え不
溶化第二抗体を遠心分離（3000×ｇ、５分）し、
その上清について405nｍにおける吸光度を光路
１cmのキユベツト中で測定する。 Ｓ−Amyの算出 総α−アミラーゼ活性からＰ−Amy活性を差
し引いたものをＳ−Amy活性とした。 定量結果 第１表に定量結果を示す。

【表】 第１表に示すようにＰ−AmyとＳ−Amyとの
比、すなわちｂ／ａは常にほぼ1.00であり、本法
は両者の分別定量法として極めて優れている。 実施例 ３ 分別定量 Ｐ−Amy単独、Ｓ−Amy単独および両者の混
合物（混合比は後記第２表に示す）を検体とし以
下の方法により分別定量を行い第２表に示す結果
を得た。 総α−アミラーゼ活性の定量 40μの検体に緩衝液Ａの150μを加え37℃で
10分間温置する。その25μをとり、これにPNP
試薬１mlを加え37℃で温置し、30分後、２mlの反
応停止液を加え405nｍにおける吸光度を光路１
cmのキユベツト中で測定する。 Ｓ−Amyの定量 40μの検体に、抗体価検定の項で述べたのと
同じ方法で調製した不溶化抗Ｐ−Amyモノクロ
ーナル抗体懸濁液150μを加え37℃で10分間温
置後遠心（3000×ｇ、５分）する。上清の25μ
をとり、これにPNP試薬１mlを加え37℃で温置
し30分後、２mlの反応停止液を加え405nｍにお
ける吸光度を光路１cmのキユベツト中で測定す
る。 定量結果 第２表に定量結果を示す。

【表】 検体中のＰ−Amyは不溶化抗Ｐ−Amyモノク
ローナル抗体によつて系から沈殿として除かれて
いる。従つて第２表に示すようにＰ−Amyのみ
を含有する検体(1)、(4)および(7)の(b)値（Ｓ−
Amy活性に相当）は総てほぼゼロである。一方、
Ｓ−Amyは系から除かれないのでＳ−Amyのみ
を含有する検体(2)、(5)および(8)の(b)値（Ｓ−
Amy活性に相当）は、(a)値（総α−アミラーゼ
活性）とほぼ等しい。また第２表に示すように、
Ｐ−AmyとＳ−Amyの混合比［Ｐ／（Ｐ＋Ｓ）］
とｂ／ａの値はほぼ一致している。このように本
法の分別定量法は極めて優れている。 実施例 ４ ヒト血清の分別定量 膵疾患々者および健常人の血清を検体とし、実
施例２と同様にしてＰ−Amyの定量を行い第３
表の結果を得た。

【表】 第３表に示すように、総α−アミラーゼに対す
るＰ−Amyの割合（ｂ／ａ）は、膵炎患者血清
（NO、GO、NI）の方が健常人よりも高く、また
唾液腺炎患者（SN）では逆に低い成積が得られ
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の性質を有することを特徴とする抗ヒト
   膵型α−アミラーゼ モノクローナル抗体： ヒト膵型α−アミラーゼを認識する、 実質的にヒト唾液型α−アミラーゼを認識し
   ない、 抗原たるヒト膵型α−アミラーゼとの免疫反
   応後においても該酵素が失活しない。 ２ 不溶性担体が結合した特許請求の範囲第１項
   記載の抗ヒト膵型α−アミラーゼ モノクローナ
   ル抗体。 ３ 不溶性担体が細菌細胞壁片である特許請求の
   範囲第２項記載の抗ヒト膵型α−アミラーゼ モ
   ノクローナル抗体。 ４ 不溶性担体がラクトバチルス プランタラム
   の細菌細胞壁片である特許請求の範囲第２または
   ３項記載の抗ヒト膵型α−アミラーゼ モノクロ
   ーナル抗体。 ５ 細胞融合技法によつて製造された特許請求の
   範囲第１項記載の抗ヒト膵型α−アミラーゼ モ
   ノクローナル抗体。