JPH034784A - アミド化酵素及び該酵素によるｃ末端アミド化ペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［：産業上の利用分野〕 本発明は、ブタ心房の可溶性画分より得られ、分子量約
３６０００の新規アミド化酵素、並びに、同アミド化酵
素を使用したＣ末端アミド化ペプチドの製法に関するも
のである。

〔従来の技術〕

従来、ペプチド類が多く知られている。そのペプチド類
中には、Ｃ末端がアミド化されることにより、活性を示
すものが多く存在している。

これらのペプチドは生理活性を有するペプチドとして医
薬等に使用されている。

これらのＣ末端がアミド化されたペプチドが、生体内で
生成される過程については、いくつかの酵素が関与する
ものと推定されている。ペプチドのＣ末端がアミド化さ
れる場合は、そのペプチドのＣ末端にグリシンの付加し
た前駆体が、細胞中に存在するアミド化酵素によって修
飾を受けてＣ末端グリンンの一つ前のアミノ酸がアミド
′化するものと考えられている。

このようなペプチドのＣ末端にグリシンの付加した前駆
体をＣ末端グリンンの一つ前のアミノ酸をアミド化する
酵素の存在を最初に発表したのは、Ｂｒａｄｂｕｒｙら
［：Ｎａｔｕｒｅ、２９８，６８６−６８８（１９８２
）　〕であり、その発表は、ヨードでラベルしたＤ−Ｔ
ｙｒ−ＶａｌＧｌｙがブタ下垂体分泌か粒中のアミド化
酵素によって、Ｄ−Ｔｙｒ−ＶａｌＮＨ２に変換するこ
とを見出したことである。その後多くの研究グループに
よって、このような性質を持つ酵素の研究がなされた。

例えば、Ｍｕｒｔｈｙらは、中下垂体よりＰ　Ａ　Ｌｌ
　−Ａ酵素（分子量５４０００）　、ＰＡＭ−８酵素（
分子量４２０００と３７０００　）を報告しＣＪ、Ｂ、
Ｃ，２６１，１８１５１８２２（１９８６）〕、また、
Ｋｉｚｅｒ　　らはブタ下垂体より分子ｍ　６４０００
の酵素を報告している（　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ
、　１１８．２２６２−２２６７（１９８６）　］。更
に水野らは、アフリカッメガエルの皮膚より分子ｆｆｉ
　３９０００のＡＥ−Ｉ、八Ｅ−１１ａ及び分子量３４
０００の＾Ｅ−ＩＩｂの各酵素を得ている［：ＢＢＲＣ
。

１３７、９８４−９９１（１９８６）、特開昭６２−２
８９１８４号公報］。

また児島らは、ブタ心房の不溶性の膜画分より、分子ｆ
ｆｉ　９２０００の酵素を発表している〔日本化学会抄
録番号２１０２１９（１９８８）　：］。

そして、これらの酵素を用いてサケカルシトニン（特開
昭６２−２０５７９５号公報）、サブスタンスＰ　［Ｂ
ＢＲＣ，ｌ、４８．２４−３０　（１９８７）　　〕の
ような比較的長鎖のＣ末端がアミド化されたペプチドを
得ることについても知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来の技術において、生理活性を有するＣ末端がア
ミド化されたペプチドを得る方法として、ペプチドのＣ
末端にグリシンを付加した前駆体をＣ末端のグリシンの
一つ前のアミノ酸をアミド化する場合に上記酵素を使用
しても反応後の生成物の回収量が少なく、また、これら
の酵素の製造原料の入手の点等で難点があった。

本発明は、これらの難点を解決したペプチドのＣ末端ア
ミド化に基質特異性を有する新規アミド化酵素並びに同
アミド化酵素を用いてＣ末端アミド化ペプチドの製造法
を提供することを目的とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、ペプチドのＣ末端をアミド化する酵素の
探索を、本発明者らが独自に開発した全く新しいアッセ
イ系を使用し、広く天然界に酵素源を求めてスクリーニ
ングした結果、ブタの心房にＤ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｙを
Ｄ−Ｔｙｒ−ＸＮＨ，に変換する基質特異性を有する分
子ｌ　３６０００の新規酵素を見出し、この酵素が、サ
ブスタンス−Ｐ、デスアセチルα−ＭＳＨ，マストバラ
ン等の製造に有用であることを見出し、本発明を完成し
た。

本発明は、（ａ）ブタ心房の可溶性画分より得られ、（
ｂ）分子量約３６０００、（ｃ）安定ｐ　Ｈ範囲が４〜
９（５０℃で１時間処理し安定）、（ｄ）至適ｐ＋＋が
８〜９、（ｅ）等電点が５〜８の性質を有する新規アミ
ド化酵素、並びに、Ｃ末端にグリシン残基を付加したペ
プチド前駆体に上記新規アミド化酵素を作用させてグリ
シン残基が欠失したＣ末端アミド化ペプチドの製法であ
る。

本発明のブタ心房の可溶性画分から得られる分子量約３
６０００のアミド化酵素は、比較的容易に且つ多量に人
手できるブタの心房のミンチ化物を、トリス−塩酸緩衝
液（２０ｍ　Ｍ、ｐＨ７，０）に浮遊させ、ポリトロン
等を用いてホモジナイズして遠心分離し、その上清を分
離した後、沈澱をトリス緩衝液にｇ２しホモジナイズし
て遠心分離する。この操作を繰り返し行い、上清を合わ
せて、５０％飽和硫酸アンモニウムで塩析し、得られた
沈殿をトリス緩衝液に溶解し、透析、ａ縮し、ＤＥＡＥ
−）ヨバール、ブチル−トヨパール、キレ−ティングセ
ファロース６Ｂ、フェニルスーパーロース等にヨリｔｒ
ｉ　’ＪＪして得ることができる。

このアミド化酵素の活性測定は、Ｂｒａｄｂｕｒｙ　（
Ｎａｔｕｒｅ、　２９８．６８６　（１９８２）　）に
よる１２５■でチロシンをヨード化した目Ｊ−Ｄ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ　をアミド化酵素の基質とし、”Ｊ
−Ｄ−Ｔｙｒ−ＶａｌＮＨ，が生成されることを追跡す
る方法、水野！：ＢＢＲＣ，１３７，９８４（１９８６
）　）による１２５１−Ｎ−＾ｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ
−Ｇｌｙを基質とし、２５１−Ｎ−＾ｃ−Ｄ−Ｔｙｒ−
ＶａｌＮＩＩ、が生成されることを追跡する方法で行う
ことができるが、本発明者らが新たに見出したラベル化
合物を使用しないで、アミド化酵素活性を測定する新し
い方法を採用すると、極めて操作簡易に、正確に測定す
ることができる。この方法は、）ＩＰＬＣ（高速液体ク
ロマトグラフィー）検出器として［ＥＣＤ　（エレクト
ロ　ケミカル　ディテクター）を付設したＨ　Ｐ　Ｌ　
Ｃアッセイ系を用いる方法である。

たとえば、本酵素活性のスクリーニング用基質としてＤ
−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｙ　（Ｘは２０種類のアミノ酸）を
合成し、この基質を使用してアミド化酵素がＤ−Ｔｙｒ
Ｘ−ＮＩ（、に変換する状慢を、アミド化反応林了後に
この基質と生成物が分離する溶媒系を設定しであるＨ　
Ｐ　Ｌ　Ｃにかけ、検出器としてＥＣＤ　を使用した系
で検出する。ＥＣＤ上を通過した基質は、電気化学的酸
化を受け、チロシンがキノン型に変換される。

その時に流れる電流を検知して、基質及び生成物に相当
するピークとして表現する。通常、２リボルトの電圧を
かげると、約５−１０マイクロアンペアの電流が流れる
。第１図はＤ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙのポルクモグラ
ムを示す。この実験をＸが２０種類のアミノ酸で構成さ
れるＤ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｙ　について行い、予め合成
したＤ−Ｔｙｒ−ＸＮＩＩｚと分離するＩＩＰＬＣの展
開溶媒系を設定しておき、酵素反応終了後にＨＰＬＣに
かけて、基質と生成物とのピーク面積比によりアミド化
反応の進行を追跡した。

Ｃ末端アミド化酵禦の力価測定は、酵素標品をアスコル
ビン酸０．５ｍ！、Ｉ、カタラーゼ１００　μｇ／ｍ　
１、硫Ｈ’Ｍ　５０ｇＭ１ジイソプロビルフルオロフォ
スフェ）（ＤＦＰ）５ｍＭ　、ペプスタチン１０　μｇ
／ｍβ、基質のＤ−Ｔｙｒ−！、１ｅｔ−Ｇｌｙ　１６
　μＭ　（６μｇ／ｍ　Ａ’）　ヲ含むトリス−塩酸緩
衝液（０，０２！Ｉ、ｐ）１８．０、反応総↑２５０μ
β）中で３７℃で反応し、５分間沸騰することにより反
応を停止する。反応液を遠心分離し、上清をクロマトデ
スク４＾（０，４５μｍ１バイオフイ一ルド社製）で濾
過した後、ＡｓａｈｉｐａＣ０ＤＰ−５０カラムによる
分析を、８％アセトニトリル０，１％トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）流速１　ｍｌ　／　ｍｌの移動相によるＩＩ
　Ｐ　Ｌ　Ｃで行−った。基質のＤ−Ｔｙｒ−！、１ｅ
ｔ−Ｇｌｙ及びアミド化されたＤＴ　ｙ　ｒ　−ｉＡ　
ｅ　ｔ　−Ｘ　Ｎ　Ｈ、の検出をεＣＤ　で行った。Ｈ
ＰＬＣによる分析例を第２図に示した。

酵素単位は上記条件下３７℃、１時間にｌｐｍｏｌの基
質をアミド化する酵素Ｍを１単位とする。

本発明のＣ末端アミド化ペプチドの製造の原イ４（基質
）として用いられるＣ末端にグリシン残基を付加したペ
プチドとしては、サブスタンス−Ｐ前駆体、マストパラ
ン前駆体、デスアセチルαＭ　Ｓ　Ｈ前駆体等のペプチ
ドが具体的に挙げられるが、−船釣にＤ−Ｔｙｒ−Ｘ−
ＧｌｙのペプチドでＸが２０種の有用なペプチドが用い
られる。

本発明の製法において、上記基質に上記酵素を反応させ
てＣ末端アミド化ペプチドを得る場合、Ｃ末端にグリシ
ンを有するペプチドの前駆体と酵素とを水性溶媒中にお
いて酵素反応を行わせることにより得ることができる。

なお、この反応溶媒中には銅イオン、たとえば硫酸銅及
びアスコルビン酸、カタラーゼを存在させ、約２０℃〜
４５℃、好適には３７℃前後、ｐＨ６〜９、好適にはｐ
１１８〜９で行う。反応終了後は煮沸等の手段により反
応を停止させ、この反応液中より高速液体クロマトグラ
フィー等の通常の方法を使用して、目的とするＣ末端ア
ミド化ペプチドを得ることができる。

次に本発明を更に具体的に説明するため、本発明に使用
する酵素の製造例並びにＣ末端アミド化ペプチドの製法
の実施例を挙げる。

〔実施例〕

アミド化酵素の製造例 屠殺直後のブタ心房９．０５ｋｇをミンチスライザーで
細断した後、３０１の２５ｍＭ　）　’）スー塩酸緩衝
液（ｐＨ８，６）に懸濁し、ポリトロンでホモゲナイズ
した後、このホモゲ不一トを１００００　　Ｘ　ｇで３
０分間遠心分離してよ清を分離した。その後、沈殿を再
び３０１のトリス緩衝液に懸濁し、同様にホモゲナイズ
して遠心分離し、この抽出操作を３回繰返した。

得られた上清を合し、これに硫酸アンモニウムを５０％
飽和になるように加えて塩析し、６９．２ｇ（総蛋白量
、８ＳＡ換算）の沈殿を得た。これを８βのトリス緩衝
液に溶解後、ホロウ　ファイバー（ｌｌｏｌｌｏｗｆ　
１ｂｅｒ）　（Ｍｌ’ｌ　１００００　％シュ　／’）
　　でａＷ及びａＫ６Ｌ、２５　ｍ　ＡＩのトリス緩衝
液で平衡化したＤＥＡεトヨバール６５０Ｍ　（１２ｃ
ｍＸ３５ｃｍ）　　に吸着させた。吸着物を０〜０．５
！、１食塩水によるリニアーグラジェントで溶出し、前
述したアッセイ系を使用してアミド化酵累活性を測定し
、活性画分を集めてトリス緩衝液で透析。

濃縮後、再びＤＥ＾巳トヨパール６５０　！、１にかけ
、０−０．３１，１食塩水のリニアーグラジェントで溶
出し、ＭＯ−ＡとＭＯ−８の二つの活性画分に分割した
（第３図参照）。

活性の強かった！、ｌ　Ｄ　−８画分３．５６８をｌＱ
ｍ！、Ｉ）リス−塩酸、ｐＨ８，０で平衡化したブチル
トヨバール６５０　Ｍカラム（３ａｍ　Ｘ　２４　ｃｍ
）　　に吸着させ、１０−０％の硫酸アンモニウム溶液
によるリニアーグラジェントで溶出し、λ１０−８−１
、！、Ｉ　Ｏ−８−２の活性画分に分離した（第４図参
照）。量的に多いＭＯ−８−２１２１ｍｇを０．０５Ｍ
　　）リス−塩酸緩衝液ｐＨ７，０，０，５Ｍ塩化ナト
リウムで平衡化した銅−キレ−ティングセファロース６
Ｂカラム（１，５ｃｍ　Ｘ　１７　ａｍ）　　にかけ、
Ｏ−０，０７Ｍ　イミダゾールを含むトリ不一塩酸緩衝
液１０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液のりニア−グラジェン
トで溶出し、活性画分５ｍｇを得た（第５図参照）。Ｍ
［］−８８２２画を更に１０％硫酸アンモニウム１０．
０２５Ｍ　　）　ＩＪス塩酸緩衝液で平衡化したフェニ
ルスーパーロースカラムクファルマンア、Ｐｈｅｎｙｌ
−ｓｕｐｅｒｏｓｅ　ＨＲ５１５）　　に吸着させ、１
０〜０％の硫酸アンモニウム溶液によるリニアーグラジ
ェントで溶出し、活性画分約５０μｇを得た（第６図参
照）。更に、スーパーロース（ファルマシア、５ｕｐｅ
ｒｏｓｅ　１２）によるゲル濾過を行い、分子ｆｆ１３
６０００の活性画分を得た。

本酵素は、Ｃｕ”イオンが必須であり、酵素反応系から
銅イオンを抜き、５０ＭＭ　□）ＥＤＴＡを添加すると
、酵素は完全に失活する。また、アスコルビン酸がない
と酵素活性は低下し、Ｎ−エチルマレイミドを抜いて１
０　ｍ　Ｍの７ステインを添加すると失活する。また、
ｐＨ４〜９．５０℃で１時間加熱したり、凍結乾燥して
も安定であるが、ρ１（４〜９．７０℃で１時間加熱す
ると完全に失活する。反応の最適なｐＨは８〜９である
。また等電点は５〜８である。

実施例１ 基質としてサブスタンス−Ｐ前駆体〔サブスタンス−Ｐ
のＣ末端に相当するメチオニンにグリシンが付加された
ペプチド。ペプチド合成機Ａ３１４３０Ａ（アプライド
バイオシステムズ社製品）で合成〕２２０ｍ０１　　を
用い、０．０５Ｍ　のトリス塩酸（ｐＨ８，０）、０．
０５ｎ＋Ｍのアスコルビン酸、１００μｇ／ｍβのカタ
ラーゼ、５０μ！、１の硫酸銅、５ｍＭのジイソプロピ
ルフルオロフォスフェート、１０Ｍｇ／ｍ　ｌのペプス
タチン、２８００単位の製造例で製造した酵素の反応容
量計２５０μ！で、３７℃で１２時間反応させた後、５
分間煮沸して反応を停止させ、その後、イナートシルＰ
ＲＥＰ−ＯＤＳを充填した逆本目高速液体クロマトグラ
フィ（ＨＰＬＣ）にかけ、０〜６０％アセトニトリルの
１％トリフルオロ酢酸溶液によるリニアーグラジェント
で溶出し、１９ｎｍｏｌの反応生成物を得た。

この物質をペプチドシーケンサ（ＡＢ１４７０Ａ）　　
によるＣ末端アミド化構造の確認及びモルモットの摘出
回腸を使用した筋収縮実験により生物活性出現の確認を
行った。

ペプチドシーケンサ−によるサブスタンス−Ｐの確３忍 実施例１によりＨＰＬＣで回収したサブスタンス−ｐ　
ｉｎ　ｍｏ＋　を、ペプチドシーケンサ−を使用してア
ミノ酸配列の決定を行った。すなわち、１１番目のアミ
ノ酸に相当するＰＴＨ−Ｍｅｔ　及びＰＴＨ−ＭｅｔＮ
Ｈ２に回収量の差、及びサブスタンス−ＰのＣ末端にＧ
ｌｙの付加した前駆体の１２番目のアミノ酸に相当する
ＰＴＨ−Ｇｌｙの回収量よりＣ末端アミド化の進行が容
易に測定できる。

次の第１表に、評品のサブスタンス−Ｐ１グリシンの付
加した前駆体、及び前駆体の酵素反応後の生成物のＰＴ
）Ｉ　アミノ酸回収ｐ　ｍｏｌ数を示す。

第　　１　　表 以上の結果より、１１番目ＰＴＨ−Ｍｅｔ、　ＰＴＨ−
ＭｅｔＮＨｚの回収量及びＰＴＨ−Ｇｌｙ　の回収量比
より、酵素反応によりサブスタンス−Ｐ前駆体がサブス
タンス−Ｐに変換されたことを確認した。

実施例１によって生成したサブスタンス−Ｐの生物活性 モルモットを放血致死させ、回腸を摘出し、これを１５
ｍｆ！のタイロート圧液を満たしたマグヌス管中に懸垂
した。張力はアイッソトーニックトランスジューサー（
日本電気三栄製品）及び動歪アンプ〈日本電気三栄製品
記＋　８４　”）を介して、ポリグラフ（日本電気三栄
製品３６３−８）　　上に記録した。この結果を第２表
に示す。

第　　　　２　　　　表 実施例Ｉと同一条件で、２５００単位の製造例で製造し
た精製酵素を用いて３７℃で１２時間反応させ、その後
生成物１７ｎ　ｎｏｔ　をＨＰ　１．　Ｃで回収し、ベ
ブチドンーケンサーで生成物の確認を行った。ＰＴＨア
ミノ酸の回収ｐ　ｍｏｌ数を下記第３表に示す。

第３表 以上の結果より、標品のサブスタンス−Ｐ及び反応生成
物は、Ｏ，００１ｍｇ／ｍ　ＥからＯ，Ｉｍｇ／ｍ　ｌ
の範囲で用量依存的にモルモット回陽を収縮させたが、
前駆合いのサブスタンス−ＰＧｌｙは０８１ｍｇ／ｍβ
及び１ｍｇ／ｍｆｆの添加により全く収縮を示さなかっ
た。

実施例２ 基質としてマストバラン前駆体くマストパランのＣ末端
に相当するロインンにグリノンが付加されたＩ５アミノ
酸よりなるペプチド＞２０ｎ　ｍｏｌを用い、以上の結
果より、１４番目のＰＴＨ−Ｌｅｕ　或いはＰＴＩＩｆ
、　ｅ　ｕ　Ｎ　ｌイ２と１５番目のＰＴＨ−ＧＩｙ　
　と（７）　Ｄｏ　収量　比ヨリ、マストパランが生成
したことを５６　ａ、？２した。

実施例３ 基質としてデスアセチルα−Ｍ　Ｓ　Ｎ　前駆体くテス
アチルα−ＭＳＨのＣ末端に相当するバリンにグリシン
が付加された１４アミノ酸よりなるペプチド）２４ｎ　
ｍｏｌ　　を用い、実施例１と同一の条件で２６００単
位の製造例で製造した精製酵素を用いて３７℃、１２時
間反応させた後、２１Ｔｌ　ｍｏｌ　の生成物をＨＰＬ
Ｃで回収し、ペプチドシーケンサ−で生成物の確認を行
った。ＰＴｆ（アミノ酸の回収ｐｍａｌを次の第４表に
示す。

以上の結果より、１３番目のＰＴＨ−Ｖａｌ　又はＰＴ
ＨＶａｌＮＬと１４番目のＰＴＨ−Ｇｌｙ　との回収量
比Ｊｌ）、デスアセチルα−ＭＳＮ　が生成したことを
確認した。

参考例 本酵素によるＤ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｙ　（Ｘは２０種類
の天然に存在するアミノ酸）のアミド化 ０５ｍＭ　のアスコルビン酸、１００μｇ／ｍβのカタ
ラーゼ、５０ＭＭの硫酸銅、５　ｍ　Ｍ　のＤＦＰ　　
（ジイソプロピルフルオロフォスフェート）、ｌＯμｇ
７ｍ　ｆｌのペプスタチン、１００１００ｐ　のＤ−Ｔ
ｙｒ−Ｘ−Ｇｌｙ　、　５００の酵素を含む０．０２Ｍ
（ｐ）Ｉ　８．０）　　のトリス−塩酸緩衝液（反応総
量２５０μりの中で３７℃、３０分反応させた後、５分
間煮沸して反応を停止し、５０μｌの反応液をＥＣＤ　
を付設したＨＰＬＣ系（逆層、イナートンルＰＲＥＰＯ
ＤＳ）にかけ、基質及び生成物の面債比より基質特異性
を検討した。３０分で反応の完結した基質は、反応時間
を縮小することにより特異性を調べた。

その結果、本酵素の基質特異性は、以下の通りであった
。

＋＋＋　νａｌ、　Ａｓｎ、　Ｍｅｔ、＾ｓｐ、＾ｌａ
、　Ｉｌｅ、　Ｌｅｕ、　Ｔｈｒ、　Ｇｉｎ＋＋　　Ｐ
ｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒ
ｇ、Ｓｅｒ＋　　Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、、Ｃｙｓ 〔発明の効果〕 本発明は、ブタ心房の可溶性画分より得られた新規酵素
と、これを用いて生理活性が強く医薬に広く用いられて
いるＣ末端アミド化ペプチドを収率よく工業的に製造す
る極めて有用な発明である。

【図面の簡単な説明】

第１図はアミド化酵素活性測定のために基質として１吏
用したＤ−Ｔｙｒ−！、１ｅｔ−Ｇｌｙ　のポルタモグ
ラフテある。この結果より、活性を検出するためにＨＰ
ＬＣに付設したＥＣＤの検出電位を１ミリボルトに設定
した。 第２図は同検出による酵素反応後の基質と生成物の分離
を示す図である。 第３図はＤＥＡＥ　）ヨバール６５０　Ｍによるブタ心
房中の）、ＩＯ−＾、　ＭＯ−８画分の分離を示す図で
ある。 第４図はブチルトヨパール６５０Ｍによるブタ心房中の
−４０−８画分のＭＯ−８−１，Ｍ［］−８−２画分の
分離を示す図である。 第５図は銅キレーティングセファ０−ス６Ｂによるブタ
心房中の！、Ｉ　Ｄ−Ｂ　−２画分のアミド化活性画分
の分離を示す図である。 第６図はフェニルスーパーロースＨＲ５１５によるブタ
心房中の−１０−Ｂ−２画分のアミド化活性画分の分離
を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の性質、 （ａ）ブタ心房の可溶性画分より得られる、（ｂ）分子
   量約３６０００である、 （ｃ）安定ｐＨ範囲が４〜９（５０℃で１時間処理し安
   定）である、 （ｄ）至適ｐＨが８〜９である、 （ｅ）等電点５〜８である、 （ｆ）ペプチドのＣ末端をアミド化する基質特異性を有
   する、アミド化酵素。 ２、Ｃ末端にグリシン残基を付加したペプチド前駆体に
   、請求項１記載のアミド化酵素を作用させることを特徴
   とするグリシン残基が欠失したＣ末端アミド化ペプチド
   の製法。