JPH034791A - 酵素の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はタンパク質分解酵素の安定化方法に関する。

（従来の技術分野） 酵素は、常温で、特異的、選択的な反応を行う触媒とし
て、多くの分野で利用が進んでいる。タンパク質分解酵
素も、医薬、洗剤、化粧品や、絹の精練などに有効に利
用されている。しかし、こうした生体触媒は熱やｐＨ変
化などに対する安定性が低く、その応用が制限される欠
点がある。

特に酵素を含有する形態が水を含む系であったり、水溶
液の場合、保存中にも速やかに活性が低下する問題点が
あり、実際には、皿々の安定化剤を添加したり、冷蔵保
存する等の対策がとられている。

酵素の失活は、一般には熱運動による構造変化に基づく
、変性失活と考えられるが、タンパク質分解酵素の場合
は、更に酵素相互の分解（自己消化）による失活も起こ
る。

このような酵素の失活要因を考慮し、タンパク質分解酵
素の安定化に関し既に多数の提案がなされている。例え
ば、タンパク質分解酵素の水溶液に、カゼイン、ゼラチ
ンなどを添加する方法（特公昭４ｌ−１８２号公報）、
可溶性高分子に酵素を共有結合させ、その水溶液に更に
アルブミン、ゼラチンなどのタンパク質を添加する方法
（特開昭５５７−１２２７９６号公報）、又酵素を配合
した液体洗剤にカルシウムイオン、ギ酸ナトリウム、ア
ルコールなどを添加する方法（特公昭５８−１１１９８
号公報）、ジカルボン酸及び還元性無機塩類を添加する
方法（特公昭５９−２１７７９９号公報）などが知られ
ている。

しかるに、上記既存の方法は目的によっては、その配合
が制限されたり、タンパク質の油類によっては、その分
解による異臭の発生が問題となる。

又、その効果の点に於いても一応成る程度の有効性は認
められるが、未だ満足すべき効果が得られていない。特
に高温条件下での安定化効果は低く、流通、保存過程で
高温雰囲気下に曝らされると大幅に活性が損われるとと
がある。

（発明が解決しようとする課題） 本発明者らは、上述の問題点を解決すべ（、鋭意研究を
行なった結果、本発明を完成したものであってその目的
とするところは、安定性、特に高温安定性が著しく向上
すると共に、その適用範囲が広い酵素の安定化法を提供
するにある。

（課題を解決するための手段） 上述の目的は、タンパク質分解酵素の水性溶液に多糖類
を０．０６％以上添加することを特徴とする酵素の安定
化方法により達成される。

本発明に用いられるタンパク質分解酵素は特に限定され
ないが、動物起源のペプシン、キモトリプシン、トリプ
シン、バンクレアチン等、植物起源のパパイン、微生物
起源のアスペルギス属、リゾプス属、バチルス属の産生
ずるタンパク質分解酵素等が挙げられる。

本発明の多糖類としては、アラビアガム、グアーガム、
ザンタンガム、ローカストビーンガム。

デンプン、デキストラン、プルラン、アルギン酸。

ヒアルロン酸、カラギーナン、ペクチン、キトサンなど
の天然多糖類、及びそれらの塩や誘導体、又、カルボキ
シメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロ
ース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース
誘導体、及びそれらの塩などが挙げられ、水可溶のもの
であれば用いることができるが、その効果の大きさ、使
い易さなどからヒアルロン酸、アルギン酸及びそれらの
塩が好ましい。用いる多糖類の濃度は多糖類の種類、分
子量により異なるが、高濃度になる程、その効果も大き
くなる傾向があり、Ｏ，ＯＳ重量％以上であることが必
要である。上限は特に限定されないが、過度に添加して
も効果が飽和することや粘性などの物性、溶解度等を考
慮すると好ましくは０．０５〜２０５〜２０重量％まし
くは０．５〜１０重量％の範囲で用いられる。

（発明の効果） 本発明の方法によると、水性溶液中の酵素は安定化され
るが、その程度は多糖類の可類、濃度の他、酵素の種類
、濃度にも依存する。更に、本発明の方法では、３０℃
以上の高温領域で、その安定化能が顕著に高いことが特
長的であり、条件によっては、５０℃で２４時間保存し
ても、殆んどその活性は失われない。

本発明の方法は、化学修飾したｇ累や、不溶性担体に結
合した酵素に適用することもできる。更に、他の安定化
剤と共に添加することもできるばかりでなく、各柵界面
活性剤水溶液系に添加してもその効果を示すことが大き
な特長である。

本発明の方法は、上述した如く、水系媒体中の酵素の安
定性、特に高温安定性を大きく向上させ、その適用範囲
が広く、又、安全な方法であることから、化粧品、薬品
、洗剤などの化成品に好適に応用できるばかりでなく、
それらの商品が流通、保存の間に高温にさらされること
に起因するトラブルを避けることができる。

又、こうした蛋白分解酵素を食品などの製造、処理プロ
セスに応用する場合や、合成反応に利用する場合にも、
有用な方法である。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

なお、実施例における活性測定並びに試桑及び溶液の調
製は下記により行った。

〔活性測定〕

プロテアーゼ活性は、アンソン氏改良法に基づき、以下
の方法で測定した。

カゼイン溶液ｓｍｌを試験管（１８Ｘ１８０ｍｏｘ）　
　に入れ、ｓＯ±０．５℃で１０分間放置した後、試料
溶液ｉ　ｍｌ　を正確に量って加え、直ちに振り混ぜ色
。この液を５０±０．５℃で正確に１゜分間放置し、ト
リクロル酢酸試液１５ｍ１　を加えて振り混ぜ、再び５
０±ｏ、　ｓ　’ｃで５０分間放置した後、濾紙（陽１
３１、φｓｅｍ）で纏過せ乙。濾液２　ｒｎｅ　を正確
に量り、Ｏ，５６Ｍ炭酸ナトリウム試液５ｍｌ及び、フ
ォリン試液１．Ｑｍｌｌ　を加え、４０℃で３０分間放
置した後、粧原基一般試験法、吸光度測定法によりｅ　
ｅ　ｏ　ｎｍにおける吸光度Ａｔ　を測定ぢｂｏ 空試験として別に試験溶液１　ｍｌ　を正確に量り、ト
リクロル酢酸５．０　ｍｌ　を加えて振り混ぜｂ０更に
カゼイン溶液６ｒｒ１１　を加えて振り混ぜ、５０±０
．５℃で３０分間放置し、以下同様に操作して、吸光度
ムｂを測定電ト。

プロテアーゼ力価は、次式により求めｂｏなお、この条
件下で１分間に１μｆのチロシン量に相当する非蛋白性
のフォリン試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を１プ
ロテア一ゼ活性単位と隻り０プロテアーゼ力価（単位／
ｆ）＝（Ａｔ−ムｂ）Ｘ４１５．１ＳＸＮＮ：試料の希
釈倍数（Ｉｆ当り） 〔試薬及び試液〕 １）カゼイン溶液 乳性カゼイン約１ｇを正確に量り、１０５℃で２時間乾
燥し、その減量を測定しさ。その乾燥物１．２Ｏｆに対
応する乳性カゼインを正確に冷却した後１Ｎ水酸化ナト
リウム試液でｐＨ８，０に調製した後、水を加えて２０
０ｍ１と°１５＆。

２）トリクロル酢酸試液 トリクロル酢酸１．８ｇおよび無水酢酸ナトリウム１，
８ｆに６Ｎ酢酸ｒｔ、ｓｍＩおよび水を加えｒｌＱＯｍ
ｇとしｂ０ ３）０．６８Ｍ炭酸ナトリウム試液 無水炭酸ナトリウム６８．５　Ｆに水を加えて溶かし、
１０００　ｍｌ　　とルｂ０ ４）フォリン試液 フェノール試薬（和光紬薬製）を２倍希釈して用いも。

実施例１ バチルス・リケニホルミスの産生ずるタンパク質分解酵
素エスペラーゼ（ノボ社製）を精製し、５０℃における
安定性に対する添加物効果を検討した結果を第１表に示
す。

第１表 同表より明らかな様に、一般に安定化剤として用いられ
る単糖、二糖類にも若干の安定化傾向が認められるが、
多糖類特にアルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸の安定
化効果は著しく高いことがわかる。

実施例２ バチルス属菌由来のタンパク質分解酵素ビオブラーゼコ
ンク（長瀬生化学工業■！！りを精製し、実験例１と同
様の検討を行なった結果を第２表に示す。

第２表 但し 添加物濃度 酵素 熱処理 ｐＨ １％ ４０単位１ｍｅ ５０’Ｃ目 ８．０ ｈｒ、 但し 添加物濃度　　　１％ ひ　素　　　　　４０単位１ｍｌ 熱処理　　　　　６０℃　１５ｈｒ。

ｐ　Ｈ８，０ 同表から明らかな様に本酵素についても多糖類、特にア
ルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸は、著しい安定化効
果が認められた。

実施例３ 実施例１と同様にして調製した酵素を各種溶液に溶解し
、これらにヒアルロン酸０．５重量％添加した場合の安
定性に対する影響を５０℃で検討した。この結果を第３
表に示す。

第３表 同表より、他の安定化剤や界面活性剤中でも、添加効果
が発現することがわかる。

実施例４ 実施例１と同様にして調製した酵素の３７℃安定性をヒ
アルロン酸１％添加、無添加の系について検討した。

１０日後の活性残存率は、無添加の場合８５％であった
が、１．０％ヒアルロン酸を添加すると８２％となった
。

実施例５ 酵素濃度及び添加するヒアルロン酸の濃度と５０℃安定
性の関係について検討した結果を笛４表に示す。

第４表 を検討した結果を第５表に示す。

第６表 同表から特にヒアルロン酸濃度０．０６％以上で大きな
安定化効果が認められ、濃度の増大とともに安定化効果
も増大し、また酵素濃度が低いほど安定化効果は大きい
ことがわかる。

実施例６ 実施例５と同様にして、３１℃における安定性５０℃の
場合はど大きな効果ではないが、ヒアルロン酸添加によ
る安定化は効果が明らかに認められた。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）タンパク質分解酵素の水性溶液に多糖類を０．０
   ５重量％以上添加することを特徴とする酵素の安定化方
   法。
2. （２）タンパク質分解酵素の水性溶液にアルギン酸およ
   び／またはヒアルロン酸あるいはその塩を添加すること
   を特徴とする酵素の安定化方法。