JPH02219571A

JPH02219571A - 修飾プロテアーゼ及びその製造法

Info

Publication number: JPH02219571A
Application number: JP1041064A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Nakayama; 博中山; Shinichi Fukunaga; 真一福永; Yasumitsu Fujino; 泰光藤野; Kenji Mori; 憲治森
Original assignee: Kanebo Ltd
Current assignee: Kanebo Ltd
Priority date: 1989-02-20
Filing date: 1989-02-20
Publication date: 1990-09-03
Also published as: DE69021724D1; EP0471125A1; ATE126532T1; EP0471125B1; DE69021724T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、多糖類で化学修飾された修飾プロテアーゼ及
びその製造法に関する。

（従来の技術）一般に、動物、植物、もしくは微生物などを起源とする
プロテアーゼが、洗型、消化剤や抗炎症剤などの医薬品
、化粧品、肉の軟化剤、絹の精練。

及びビールの製造過程など各種の産業分野に於いて広く
有効に利用されている。

しかしながら、プロテアーゼを洗剤、化粧品、もしくは
成る踵の医薬品などへ応用するに際しては、プロテアー
ゼが人体にとって異種起源の蛋白であるため抗原性や皮
膚感作性を示し、人によっては強い刺漱を与えることが
指摘されている。また、他の問題として、プロテアーゼ
の安定性が充分でないことも挙げられる。特に水分率の
高い媒体や、水溶液などの剤形中では、変性の他に自己
消化分解が起り、室温で保存すると速やかに失活するの
で、安定な商品を供給する事は難しいのが現状である。

酵素の抗原性など安全性の問題解決に対しては、例えば
、治療用酵素の体内投与を目的として、抗原性を抑制し
、血中半減期を改善延長するため。

ウリカーゼ、アスパラギナーゼをポリエチレングリコー
ルで修飾する方法（特公昭６１−４２６５ＪＩ号公報）
、ストレプトキナーゼをポリエチレングリコールで修飾
する方法（特開昭６７−１１８７８９号公報）などが提
案されている。また、安定性の問題解決に対しては１分
子内架橋に寄与する修飾が有効であることがキモトリプ
シンなどの酵素について示されているー　（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｔｃａλｃｔａ、５
２２．２７７〜２ｇ！（１９７ｇ）６同、４８５．１〜
１２（１９７７））。更に、マンガン型スーパーオキシ
ドジスムターゼに、多糖類、ポリエチレングリコール、
蛋白質などの水溶性高分子を結合させたものは抗原性が
抑制されると共１ζ、熱安定性が向上することが示され
ている（特開昭６８−１６６８５号公報）。

しかしながら、プロテアーゼに対して、抗原性。

皮膚感作性などの抑制と共に安定性を改良し、実用化を
計ったものは知られていない。なかでも、皮膚感作は鋭
敏な反応であるため、その抑制は極めて難しい。また、
プロテアーゼは基質が通常高分子量であるため、修飾の
方法やその程度によっては、プロテアーゼの活性が殆ん
ど消失したり、熱安定性が低下した抄してしまう。

（発明が解決しようとする課題）本発明者らは、プロテアーゼを洗剤、化粧品、医薬品な
どの分野で広く用いるため、安全化と共に安定化を計る
ことを目的として置皿の修飾方法を鋭意探索、研究した
結果、本発明を完成したものである。

即ち、本発明の目的は、抗原性、皮ｍｓ作性が抑制され
ると共に、安定性に優れた修飾プロテアーゼ及びその製
造法を提供することにある。

（課題を解決するための手段）上述の目的は、臭化シアンにより反応活性基を導入した
多糖類とプロテアーゼとが結合した修飾プロテアーゼで
あって、該プロテアーゼの表面アミノ基の修飾率がＴＮ
Ｂ８法で測定して１５％以上である修飾プロテアーゼ、
並びに臭化シアンにより反応活性基を導入した多糖類と
プロテアーゼとを反応させるに際し、該多糖類を重量比
でプロテアーゼに対して３倍以上含む系で反応させる修
飾プロテアーゼの製造法によって達成される。

次に１本発明の詳細な説明する。

本発明に使用されるプロテアーゼとしては、例えば、ト
リプシン、キモトリプシンなどの動物由来のプロテアー
ゼ、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。本発明
の修飾プロテアーゼはいずれも抗原性や皮膚感作性が抑
制されており、また安定性も大きく向上する。しかし、
プロテアーゼの違いにより相対的に安定性は異なる。安
定性の点からは、動物由来のプロテアーゼと比較すると
微生物由来のプロテアーゼに優れているものが多い。し
たがって、好ましくは微生物由来のプロテアーゼ、特に
好ましくはバチルス属由来のプロテアーゼを用いると好
結果が得られる。

また、本発明に用いられる多糖類の一例としては、アガ
ロース、グアーガム、イヌリン、デンプン、デキストラ
ン、プルラン、ザンタンガム、カラギーナン、ペクチン
、アルギン酸などの天然多糖類及びその誘導体や、ヒド
ロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチル
セルロース、カルボキシメチルセルロースなどが挙げら
れる。

なかでもデキストラン、プルランは、かなりの高分子量
のものを用いても溶液粘度が低く１反応操作が容易で、
かつ、得られる修飾プロテアーゼの性能も安定で、均一
な好ましい結果を与える。

多糖類の分子量は、特に著しく小さいものでなければ、
修飾プロテアーゼの安定性は良好な結果を与えるが、抗
原性などはかなり分子量の影響を受けるため、その平均
分°子量は１０．０００以上、特に好ましくは４０．　
ＯＯ０以上のものを用いると好結果が得られる。

本発明の修飾プロテアーゼのプロテアーゼの表面アミノ
基の修飾率は、用いる多＄１ｉ頚の種類、混合比、反応
条件によって異なるが、得られた修飾プロテアーゼの安
全性、安定性の各性能を確保するためには、この修飾率
をＴＮＢＳ法で測定して１５％以上とすることが必要で
ある。

本発明の修飾プロテアーゼは、プロテアーゼと臭化シア
ンによって活性化された多糖類とを結合させて得られる
。この臭化シアンによる多糖類の活性化、及びこの活性
化体とプロテアーゼとの結合反応は、一般に用いられる
方法に従って行えばよい。

しかし、活性化体とプロテアーゼとの結合反応において
、活性化体は、重量比にしてプロテアーゼの５倍以上を
用いることが必要である。３倍未満では、抗原性、皮膚
感作性の抑制が十分な修飾プロテアーゼを得ることがで
きず、良好な結果が得られない。また、過剰に多糖類を
加えても得られる修飾プロテアーゼの性能は飽和するた
め、その使用猷は２０倍以下にすることが好ましい。

また、上記製造法において、多糖類の活性化反応は、ｐ
ＥＩＩＯ〜１１．２５℃以下、また、結合反応は、ｐＨ
８，５〜９．５．５℃以下で行うことが好ましい。

また、多糖類とプロテアーゼの結合反応に於ける酵素濃
度も、得られた修飾プロテアーゼの各性質に影響を与え
る。酵素濃度が過変に大きいと、抗原性や皮膚感作性の
抑制が完全でなくなる場合もあるため、酵素濃度は１重
量％以下とすることが好ましい。

プロテアーゼと活性化体との結合反応の後、多糖類の余
剰活性基に対しては、リジン、グリシン、アミノエタノ
ール等を添加し、後処理を行うことにより安定な品質を
得ることができる。また、得られた修飾プロテアーゼは
、限外濾過、ゲル口過液体クロマト法などによりｗＩ製
することができる。

（発明の効果）以上のように、本発明の修飾プロテアーゼは、その抗原
性、皮膚感作性が殆んど、或いは完全に抑制されると共
に、熱安定性が著しく向上する。

また、その自己分解失活も抑制されるため、水系での保
存性に優れ、洗剤、化粧品、医薬品等に有効に用いるこ
とができる。

尚本発明に於いて、熱安定性、抗原性、皮膚感作性、及
びプロテアーゼの表面アミノ基修飾率の測定、評価は吹
下に記す方法で行った。

（１）　　熱安定性の測定５０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，８）に修飾プロテア
ーゼを溶解し、０．６　ｍｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ　
としたものを検液として用いた。検液を６０″Ｃで６時
間インキュページ璽ンを行った後、検液中の酵素活性を
測定した。

（２）　　抗原性の評価所定濃度の修飾プロテアーゼ溶液（０〜１　ｍｆｐｒｏ
ｔｅｉｎ／ｍｌ　）　０．４　ｍｌに、あらかじめ別に
用意した抗血清０．４　ｍｌを加え、３０°Ｃで２時間
インキュベーションを行った。生成した沈殿を遠心分離
により分取し、７５ｍＭリン酸Ｍ衝液（１）Ｈ７，８）
１ｒＭ？で３回洗浄した後０．　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ５ｍ
ｌを加えてこれを溶解し、２８５１ｍに於ける吸光度を
測定した。

（３）　　皮膚感作性の評価マキシミゼーシ−ａ　ン（Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ）
法（Ｂｅｒｔｉｌ。

Ｍ　ａｎｄ　Ａｌｂｅｒｔ、　Ｍ、Ｌ、　Ｊ、Ｉｎｖｅ
ｓｔ、　ｌ）ｅｒｍ、、　５２　Ｑ）。

２６ｇ（１ｇ８））に基づき、皮膚感作性試験行った。

誘導及び惹起濃度は、プロテアーゼ、修飾プロテアーゼ
共、蛋白量として０．０２重量％になるように設定した
。皮Ａ’１１６作性の程度を以下に示す方法で求めた平
均評価点により、評価した。

（４）　　プロテアーゼの表面アミノ基修飾率の測定ハ
インズ（Ｈａｙｎｅｓ　）　　らの方法（Ｈａｙｎｅｓ
、　Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　６．５４１　（１９６７
）　）により、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢ
８）の反応量として修飾プロテアーゼ表面の未反応のア
ミノ基處を測定し、未修飾体の表面アミノ基量との比か
ら表面アミノ基の修飾率を算出した。

以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

（実施例１）デキストラン（平均分子ｆｆ１６〜９Ｘ１０’）１．０
ダを２Ｑｒｒｌの水に溶解した。これにＩＮ　ＮａＯＨ
を加えｐＨ１０，４とした。臭化シアン２５０　ｍｆｌ
をＳｍｌの水に溶解し、この溶液を室温にてデキストラ
ン水溶液に徐々化加え、その際、ＩＮＮａＱＨを同時に
加えてｐＨを１０前後に保った。この操作を約１５分で
終えた後、約１０分間撹拌し、４％ＮａｋｌＣＯ３溶液
を加えてｐＨ９とした。次に、この活性化したデキスト
ラン溶液にバチルス・リケ二ホルミス菌（Ｂａｃｉｌｕ
ｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）　　出来のプロテ
アーゼくノボ社製、商品名エスペラーゼ〉（以下エスペ
ラーゼと記す）１００ｍＦを加え。

４℃にて２４時間反応せしめた。この反応液にグリシン
４０ｍ１を加え、２時間処理した後、溶液を限外濾過し
、精１１！濃縮した後、凍結乾燥した。

得られた修飾プロテアーゼの表面アミノ基修飾率は１１
％、酵素活性保持率は２１％であった。

（実施例２）実施例１に於いて、デキストラン（平均分子量６〜９Ｘ
１ｏ　）を加えるかわりにプルラン（平均分子［６Ｇ、
０００）及びプロテアーゼとしてビオプラーゼ（ナガセ
庄化学社製）を用いて同様の操作を行い、生成物を得た
。

得られた修飾プロテアーゼの表面アミノ基修飾率は２２
％、活性保持率は３３％であった。

（実施例３）実施例１に於いて、デキストランを加えるかわりにメチ
ルセルロース（和光純薬社Ｎ２５ＣＩ））を用いて同様
の操作を行い、生成物を得た。

得られた修飾プロテアーゼの表面アミノ基修飾率は２０
％、活°性保持率は３０％であった。

（実施例４）実施例１に於いて、デキストランを加えるかわりにイヌ
リン（平均分子ｔ６０．Ｇｏｏ）、及びプロテアーゼと
してキモトリプシン（シグマ社製）を用いて同様の操作
を行い、生成物を得た。

得られた修飾プロテアーゼの表面アミノ基修飾率は１８
％、活性保持率は２７％であった。

（比較伊１１）モノメトキシポリエチレングリコール（平均分子量６．
Ｇｏｏ）５．Ｏｆ、Ｉ）−二トロフェニルク口ロホルマ
ートｏ、ｅｙを無ホアセトニトリル３０ｍ１に溶解した
。これにトリエチルアミン０．３ｇを加え、この溶液を
室温２５℃にて一昼夜撹拌した後、ジエチルエーテル２
００ｒｒｌを加え一昼夜４℃に保ち結晶を析出させた。

析出した結晶を炉別した後、ジエチルエーテル−アセト
ニトリル混合溶媒にて再結晶を行い、ジエチルエーテル
でよく洗浄し、減圧乾燥して活性化ポリエチレングリコ
ールの白色結晶４．５ｇを得た。

次にエスペラーゼｓｏｍｙをｐＨ７，８に調整した７５
ｍＭリン酸カリウム緩衝液’ｌｏｍｌに溶解し、上記で
得られた活性化ポリエチレングリコール１００１Ｍを加
えた後、４℃で一昼夜撹拌した。

得られた反応液にグリシン１００ｎｌＦを加え、５時間
処理した後、溶液を限外濾過により精製、ａ縮し、凍結
乾燥した。

得られた修飾プロテアーゼの活性保持率は２８％であっ
た。

（比較例２）エスペラーゼｓｏｍｙを０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６，６）　２６ｍｌに溶解した後、１．４％グルタルア
ルデヒド水溶１１．５ｒｒｌを室温下で撹拌しながら２
６分間で滴下した。溶液を更に２時間撹拌した後、グリ
シン１０ｍｆを加え５時間処理した。得られた反応液に
、水素化ホウ素ナトリウム１０１Ｍを加え還元処理した
後、限外濾過により精製、濃縮し、凍結乾燥した。

得られた修飾プロテアーゼの活性保持率は４８％であっ
た。

（比較例３）カルボキシメチルセルロース２００ｍＦを２０ｍ１の水
に溶解した。これにＩＮＨ（Ｊ　を加え。

ｐＨ４，７５とした後、１−エチル−５−（Ｓ−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩３８０ｍＦ、
及びエスペラーゼ’ｉｏｍｙを加え、４°Ｃにて２時間
撹拌した。この反応液に酢酸１２０μｌ　モノエタノー
ルアミン１２０μｌを加え、２０分間撹拌した後、溶液
を限外濾過により精製。

濃縮し、凍結乾燥した。

得られた修飾プロテアーゼの活性保持率は５２％であっ
た。

（比較例４）デキストラン（平均分子量６〜９ＸＩＧ’）０．５ｆを
１００ｍ１の水に溶解し、これに過ヨウ素酸ナトリウム
０．　Ｓ　２１／を加え、５０℃にて５時間反応させた
。その後、エチレングリコールＳｏｍｅを加え反応を停
止し、限外濾過により未反応物を除去した。更に７５ｍ
Ｍリン酸ａｍ液（ｐＨ７，８）で洗浄後、１０ｍ１に１
１縮した。これにエスペラーゼｓｏｍｐを加え、４°Ｃ
にて２４時間反応させた後、　ＮａＢＨ４で還元処理を
行ない、限外濾過により精製濃縮後、凍結乾燥した。

得られた修飾プロテアーゼの酵素活性保持率は４５％で
あった。

以上の実施例１〜４．及び比較例１〜４によって得られ
た修飾プロテアーゼの抗原性を第１図に。

また、熱安定性、皮膚感作性の試験結果を第１表に示す
。

第１図は、実施例及び比較例によって得られた修飾プロ
テアーゼについて抗原としての添加量と添加の結果生成
する抗原抗体反応による免疫複合体量（２８０ｎｍの吸
光度）との関係を示すグラ第　　１表ａ）修飾プロテアーゼ溶液を熱処理後の活性残存率ｂ）平均評価点以上の結果から、本発明以外の修飾プロテアーゼであっ
ても元のプロテアーゼに対し、熱安定性向上、抗原性、
皮膚感作性抑制の効果が認められるが、その程度は十分
でなく、また全てを満足するものではなかった。しかし
１本発明の修飾プロテアーゼは、熱安定性が著しく向上
すると共に、抗原性、皮膚感作性がほぼ完全に抑制され
ており。

本発明の修飾プロテアーゼが優れていることが明らかで
ある。

（実施例５）実施例１の修飾操作に於て、活性化デキストラ第２表の
結果より明らかな如く反応条件は適及びデキストラン分子量が得られた修飾プロテアきいこ
とがわかった。

即ち、安全性、安定性の両面で、優れた修飾プロテアー
ゼを得るためには、活性化デキストラン／プロテアーゼ
の重量比がＳ以上であることが必要である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例及び比較例によって得られた修飾プロ
テアーゼについて抗原としての添加量と添加の結果生成
する抗原抗体反応による免疫複合体ｉｎ（２８０ｎｍの
吸光度）との関係を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）臭化シアンにより反応活性基を導入した多糖類と
プロテアーゼとが結合した修飾プロテアーゼであって、
該プロテアーゼの表面アミノ基の修飾率がＴＮＢＳ法で
測定して１５％以上であることを特徴とする修飾プロテ
アーゼ。
（２）臭化シアンにより反応活性基を導入した多糖類と
プロテアーゼとを反応させるに際し、該多糖類を重量比
でプロテアーゼに対して３倍以上含む系で反応させるこ
とを特徴とする修飾プロテアーゼの製造法。