JPH0348792B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はセフアロスポリンの製造における改良
に関する。さらに詳細には本発明はセフアロスポ
リンの製造に有用な〔以前にセフアロスポリウ
ム・アクレモニウム（Cephalosporium
acremonium）として知られていた〕菌株たるア
クレモニウム・クリソゲヌム（Acremonium
chrysogenum）の改良された菌株の産生に関す
る。 セフアロスポリンＣはアクレモニウム・クリソ
ゲヌムの培養および培地からのセフアロスポリン
Ｃの抽出により商業的に製造されている。他の菌
株もセフアロスポリンＣを産生するがそれらはこ
の目的には商業上重要でない。さらに、デスアセ
チル−およびデスアセトキシ−セフアロスポリン
Ｃのような他のセフアロスポリンもまたアクレモ
ニウム・クリソゲヌムの培養により産生されるこ
とが知られている。 セフアロスポリン産生に至適性質を示すアクレ
モニウム・クリソゲヌムの菌株を選択するために
相当の努力がすでになされてきた。求められる第
一の性質は、もちろん、所望のセフアロスポリン
を高収量で産生することである。しかしながら、
表面寒天あるいは深部培養における良好な胞子形
成および高い生長速度のような他の特徴もまた商
業上の生産に使用される菌株に望ましいものであ
る。天然のあるいは誘起された突然変異体からの
所望の菌株の選択は時間のかかる過程である。か
かる作業の進みが遅い主要な理由は（セフアロス
ポリンを高収量で産生するような）一つの望まし
い性質を選択すると、（迅速な生長速度のような）
他の望ましい性質が損なわれるという可能性であ
る。従つて、アクレモニウム・クリソゲヌムの異
なる菌株を交配させて２種の親菌株の最良の特徴
を有する改良された菌株を産生しうることは大い
に望ましいことであろう。 アクレモニウム・クリソゲヌムの異なる菌株の
交配は相当困難な事柄である。この種の菌株は主
に単核の菌糸区画を有しそして性周期を欠いてい
る。アクレモニウム・クリソゲヌムにおいて発芽
中の分生胞子の混合培養により時によりヘテロカ
リオンが合成され得ること、そしてこれが直接に
もしくは好ましくはヘテロ接合体を予め選択した
後に核融合の誘導体を生じ得ることはすでに記載
されている〔Gen.Ind.Microorg.（1973）第１巻第
309〜334頁参照〕。この方法は、本発明者らの経
験では、特にその試みが開散性菌株を交配させる
ためになされる場合に、非常に面倒で、非能率的
でしかも信頼性がない。この方法は若干の理論的
興味はあるが、セフアロスポリンの商業的な生産
のためのアクレモニウム・クリソゲヌムの改良さ
れた菌株を生産するためにはほとんど実施できな
い方法である。 本発明者らは、アクレモニウム・クリソゲヌム
の異なる菌株が、高度に開散性の菌株でさえも原
形体融合を用いて効率的に交配されて組み換え分
離体（recombinant segregant）あるいは他の核
融合生成物を産生し得ることを見出した。 本発明の一つの局面は、アクレモニウム・クリ
ソゲヌムの親菌株を原形体融合および核融合に付
し、改良された菌株をその子孫もしくはその突然
変異体から選択することを包含するアクレモニウ
ム・クリソゲヌムの改良された菌株の製法であ
る。 ここで「改良された菌株」とは、親菌株と比較
してセフアロスポリン産生のための操作上の利点
を有する菌株を意味する。かかる操作上の利点の
例には、胞子形成の改良、セフアロスポリン力価
の改良あるいは生長速度の改良、安定性の改良、
異なる媒質上の生長特性の改良、抽出容易さの改
良等が包含される。 本発明の他の一つの局面はアクレモニウム・ク
リソゲヌムの親菌株を原形体融合および核融合
し、改良された菌株をその子孫あるいはその突然
変異体から選択することにより産生されるアクレ
モニウム・クリソゲヌムの改良された菌株を培養
し、培地から所望のセフアロスポリンあるいはそ
の誘導体を単離することからなるセフアロスポリ
ンの製法である。 改良された菌株を調製するにあたつて、アクレ
モニウム・クリソゲヌムの親菌株は、セフアロス
ポリンの高収量、良好な生長速度および良好な胞
子形成のような交配において（すなわち、核融合
の生成物において）所望される集合的性質を示す
ように選択される。しかしながら、このことは必
須ではなく、時として子孫は親菌株に見られなか
つた有利な性質を示すことがある。 親菌株を子孫の選択を促進するような方法で処
理することが必須ではないにしても望ましい。例
えば、親菌株を例えば栄養要求性標識で遺伝的に
標印する。親菌株の生長を阻止するのに最小
（minimal）の媒質が使用され得るので、栄養要
求性標識の使用は子孫の選択を単純化する。使用
され得るその他の標識には色および薬剤抵抗性が
包含される。 高頻度の標識の反転突然変異を示さず従つて交
配から得られる選択物が非反転体として高い確率
で分類され得る標印された菌株を使用するのが望
ましい。その上、各親菌株中に少くとも２種の栄
養要求性標識があれば選択操作は単純化される。
これは最小媒質上の親菌株の生長速度を実質上ゼ
ロに減少させ、さらに反転体が最小媒質上で有意
に生長する確率を減少させる。 標識は慣用の方法で変異誘発性化学薬品あるい
は照射により親菌株中に導入されうるし、あるい
はまた天然の突然変異から生じる標印された菌株
が慣用の操作により得られる。 別の方法では、親菌株がそれぞれ原形体融合お
よび核融合に先立つて異なる不可逆的な代謝抑制
剤で処理される。かくして各親菌株はその抑制さ
れた代謝の異なつたしかも補足的な局面を有す
る。次いで処理された親菌株は何らかの未反応の
抑制剤を除去したのちに原形体融合および核融合
に付される。誘起された代謝抑制作用の結果とし
て、生長し得る細胞は親菌株の融合から生じるも
ののみであり、各親菌株の非抑制代謝局面が細胞
の生存を確保するに充分に相互に補足しているこ
とが認識されよう。この技法はW.E.Wright氏に
より「Experimental Cell Research」第112巻第
395〜407頁（1978）に記載されている。 原形体の形成に先立つて、親菌株を慣用の方法
で例えば振盪フラスコ中で適当な集団寸法となる
まで培養する。培地の性質は原形体収量に影響し
うるが、一般にアクレモニウム・クリソゲヌムの
生育に慣用のものでよい。また、原形体の最大収
量は指数増殖相の終末近くの培養された親菌株の
菌糸体から得られる。次いで菌糸体を過あるい
は遠心分離により回収し且つ洗浄して培地を除去
する。 原形体の収量は回収された菌糸体をチオールセ
ンシタイザー（ジスルフイド結合形成阻害剤）す
なわち原形体産生を助成するチオール化合物で処
理することにより大いに改良されることが見出さ
れた。好適なチオールセンシタイザーは好ましく
は0.005〜0.1M例えば約0.01Mの濃度でPH６〜8.5
例えばPH約7.3におけるジチオトレイトール
（dithiothreitol）（トランス−４，５−ジヒドロ
キシ−１，２−ジチオール）である。ジチオトレ
イトール（0.01M）を用いて菌糸体を例えば20〜
40℃で15分〜３時間好ましくは約30℃でPH7.3で
30分〜１時間半培養する。他のチオールセンシタ
イザーには２−メルカプトエタノール、システア
ミン（２−アミノエタンチオール）およびチオグ
リコレートが包含される。 処理された菌糸体を次いで洗浄しそして酵素の
原形体原性組み合せで処理する。多数の適当な酵
素組み合せが商業上入手できる。例えばシトフア
ガ（Cytophaga）酵素L₁（BDH社製品）およびオ
キソポルス（Oxoporus）セルラーゼ（E.Merck
社製品）である。これらの製剤はいくつかの酵素
例えばβ−グルカナーゼ、キチナーゼ、プロテア
ーゼおよびリパーゼを含有している不確定な混合
物である。菌糸体は満足すべき原形体収量が得ら
れるまで前記酵素製剤と共に培養される。培地の
PHおよび温度および培養時間は使用される酵素の
性質に応じて選択されなければならない。例えば
シトフアガ酵素L₁の場合には約30℃でPH約6.8で
約３時間である。シトフアガ酵素L₁に対して代
表的な酵素濃度は0.05〜20mg／mlであり例えば約
２mg／mlであり、そしてオキソポルスセルラーゼ
に対しては２〜40mg／mlである。また媒質の浸透
圧が原形体の安定性を確保する範囲にあること、
例えば0.5〜1.0M好ましくは約0.9M塩化ナトリウ
ムに等しいように確保することも重要である。培
地の浸透圧は無機塩例えば塩化ナトリウムを用い
るかあるいは糖もしくは糖アルコールを用いて調
整される。例えば0.005〜0.1M好ましくは約
0.02Mにおいて硫酸マグネシウムとしてマグネシ
ウムを包含させることが好都合である。 以下の標準は原形体を特性化するのに適切であ
ると考えられる。浸透圧脆弱性、球形を生じる固
さの損失、および空の細胞壁のうしろから出る小
孔からの原形体の放出の観察。 培養後、原形体および部分的に消化された菌糸
体の混合物を例えば綿毛の層のような適当な寸法
の小孔を有する媒質を通して過することによる
か、あるいは例えば200〜300ｇで約５分間の穏和
な遠心分離により分離する。必要ならば分離はく
り返される。液もしくは上澄み液は幾分かの菌
糸体フラグメントを伴なう原形体から主としてな
る懸濁液である。原形体を例えば700ｇで５分間
の遠心分離により洗浄し、浸透圧安定化溶液（例
えば0.9M塩化ナトリウム）中に１〜２回再懸濁
し、最後に浸透圧安定化溶液中に再懸濁する。 菌糸体を使用する代りに、同様の技法を用いて
アクレモニウム・クリソゲヌムの分生胞子あるい
は分節胞子から原形体を調製することも可能であ
る。 原形体の生育力は浸透圧的に安定化された（例
えば２％スクロースおよび0.8M塩化ナトリウム
により）生育媒質および安定化されていない生育
媒質上に平板培養することにより吟味されよう。
原形体は浸透圧的に脆弱であり、水洗した懸濁液
から平板培養した後に安定化されてない媒質上で
生き延びない。従つてこれら媒質上での生育はい
ずれも原形体調製物中に汚染物として存在する菌
糸体フラグメントから生ずるものである。安定化
された媒質上では高い割合の原形体が通常生育
し、そして最終的にコロニーを形成する。原形体
の生育度は約５〜80％に変化する。安定化された
寒天上における約５〜20％の生育は菌糸体フラグ
メントによる。原形体は浸透圧上脆弱であるか
ら、媒質の適切な浸透圧緩衝を確保するために、
工程のすべての段階で注意が払われなければなら
ない。 次いで親菌株から得られる原形体が混合され
る。２種もしくはそれ以上の親菌株からの原形体
間に所望の融合が起る確率を最大とするために
は、各菌株からほぼ等しい数の生育し得る原形体
を使用することが好ましい。所望ならば、原形体
の混合物は親菌株からの菌糸体の混合物から調製
されうるが、この操作には一般に何の利点もな
い。 原形体は融合原（fusogen）の存在下に融合さ
れる。若干の融合は自然発生的に生ずるが、かか
る自然発生的な融合の確率は利用するにはあまり
にも低い。多くの試薬が融合誘発性作用を有する
が、ポリアルキレングリコール特にポリエチレン
グリコールが好ましい。好ましくはポリエチレン
グリコールは1000〜8000例えば約6000の分子量を
有する。グリコールは好ましくは20〜60％例えば
約30％の濃度で水性緩衝液中の溶液として使用さ
れる。PHは適当には５〜10例えば約7.5である。
この工程は好ましくは例えば0.002〜1.0M例えば
約0.01Mの濃度のカルシウムイオンにより助けら
れる。原形体の凝集が迅速に起り、試薬は典型的
には０〜30℃例えば25℃の培養温度で１分〜２時
間例えば５〜20分間作用せしめられる。 次いで融合誘発性試薬を浸透圧的に安定化され
た溶液で希釈し、原形体（その幾分かは今や融合
している）を遠心分離し洗浄する。洗浄媒質は原
形体と等張性、例えば0.9M塩化ナトリウム等張
性でなければならない。 所望の核融合生成物の選択は実質上慣用の方法
により行われうる。栄養要求性親菌株が使用され
た場合、融合混合物は時として補給されるが、常
に親菌株は生育し得ないが、ある種の核融合生成
物および場合により形成されるヘテロカリオンは
生育しうるように選択ささた、浸透圧上安定化さ
れた最小の再生媒質上で平板培養される。後記の
二者の型の菌株は原栄養性である。二種の一般的
型の原栄養株は回収されること、すなわち安定お
よび不安定であることが見出された。安定な原栄
養株は完全媒質上の二次培養に続く、等しい平板
密度における完全媒質上および最小媒質上のコロ
ニー数がほぼ等しいことを特徴とする。これらの
菌株は組み換え分離体であり、慣用の技法を用い
て無限に繁殖されうる。これらは両方の親菌株か
ら導かれる特性を示すことが期待される。これら
の安定な原栄養性組み換え分離体はｐ−フルオル
フエニルアラニンあるいはガンマ線のような組み
換え誘発剤による処理によつては分離しない。す
なわちこれらは組み換え工程に使用される標識に
関して遺伝的構成に何の変化も示さない。 不安定な原栄養株は、最小媒質上の培養による
精製後に、栄養要求株を生ずることにより完全媒
質上における最終的不安定性を示す。 上述の原栄養性子孫とは別に、融合混合物を一
連の選択的再生媒質上において平板培養すること
は時として後記実施例１に記載されているような
組み換え工程に使用されるすべての対立遺伝子を
回収せしめうる。得られた核融合生成物の中から
改良された菌株を選択することは慣用の繁殖プロ
グラムと同様の方法で進行することができ、主に
子孫に求められる個々の特性の組合せによるであ
ろう。慣用の実施法により親菌株よりも有意に優
れている菌株が見出される確率を改良するため
に、多数の核融合生成物が試験されなければなら
ない。所望ならば、かかる菌株はさらにそれを改
良することを目的として突然変異プログラムに付
されてもよい。 原形体融合によりアクレモニウム・クリソゲヌ
ム種から導かれるセフアロスポリン産生性核融合
生成物、例えば組み換え分離体は未だ製造されて
いないと信じられ、かかる有機体は本発明のさら
に他の局面を形成する。 改良された菌株は既知の慣用の方法により培養
されて所望のセフアロスポリンを産生する。 すなわち、上記菌株は好気性条件下好ましくは
深部培養により、空気あるいは酸素と振盪もしく
は撹拌しながら培養される。用いられる醗酵媒質
は同化可能な炭素源、消化可能な窒素源および所
望ならば、生長促進物質のみならず無機塩を含有
していなければならない。 適当な炭素源には、例えばグルコース、スクロ
ース、でんぷん、可溶性でんぷん、ｎ−パラフイ
ン、植物ならびに動物油、酢酸、メタノール、グ
リセロール、ソルビトールおよびエタノールが包
含される。 適当な窒素源には例えば肉エキス、ペプトン、
カゼイン、コーンスチープリカー、酵母エキス、
大豆粉、トリプトン、綿実ひきわり、および小麦
ぬかのような天然の窒素含有物質あるいはそれら
から製造される物質が包含される。窒素を含有す
る有機もしくは無機化合物も使用されてよい。例
えば尿素、硝酸塩、および例えば酢酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムおよび
りん酸アンモニウムのようなアンモニウム塩であ
る。 醗酵媒質中に使用されうる無機塩は例えばカリ
ウム、マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、
硝酸塩、塩化物、炭酸塩およびりん酸塩である。 使用される生長促進物質には、例えばシステイ
ン、シスチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、
および特にメチオニンおよびまた鉄、亜鉛、銅お
よびマンガンのような微量元素が包含される。 温度、PHおよび醗酵時間のような培養条件は、
用いられる菌株が最大量の所望のセフアロスポリ
ンを蓄積するように選択される。例えば醗酵は15
〜45℃好ましくは約25℃の温度でPH４〜９好まし
くは約６において１〜20日間好ましくは４〜10日
間行われるのが好ましい。 培養肉汁からの所望のセフアロスポリンの分離
は慣用の手段例えば適当ならばけいそう土のよう
な過助剤の存在下に培養肉汁を過し、細胞を
水洗し、次いで液および洗液からなる混合物か
ら所望のセフアロスポリンを回収することにより
好都合に行われる。 培養肉汁あるいは液は所望ならばはじめに鉱
酸のような酸で処理してわずかに溶解性である塩
および幾分かの蛋白性物質を栄養溶液から沈殿さ
せるか、あるいは存在しうる何らかのペニシリン
Ｎを破壊する。ペニシリンＮもまたペニシリナー
ゼでの処理により破壊されうる。培養肉汁あるい
は液は所望ならば親油性不純物を除去するため
に溶媒抽出によりあるいはイオン交換吸着により
さらに予備精製される。 所望のセフアロスポリンを回収するために、慣
用の方法例えば吸収あるいは吸着クロマトグラフ
イーあるいは沈殿法が使用される。 使用される吸収剤あるいは吸着剤には、活性
炭、イオン交換樹脂および非イオン性吸着樹脂が
包含される。セフアロスポリンの溶離は特に水溶
液を用いて行われる。特に好ましいイオン交換樹
脂は弱塩基性陰イオン交換体であつてこのものか
らセフアロスポリンは例えば緩衝された酢酸アン
モニウム、酢酸ナトリウムあるいは酢酸カリウム
を用いて溶離される。そのものからセフアロスポ
リンが例えば1M酢酸を用いて溶離されうるよう
な強塩基性陰イオン交換樹脂も使用されうる。非
イオン性吸着樹脂にはアンバーライトXAD−４
のようなジビニルベンゼンと交叉結合した大表面
積のスチレン重合体が包含され、セフアロスポリ
ンは水性イソプロパノールあるいは水性アセトン
のような水性アルコールあるいはケトンを用いて
溶離できる。 セフアロスポリンは水溶液から例えばケトン例
えばアセトンあるいは低級アルカノールのような
水混和性有機溶媒を用いて沈殿されうる。 セフアロスポリンは濃厚水溶液からアルカリ金
属塩例えばナトリウムあるいはカリウムのような
金属塩の形で沈殿されてもよい。 醗酵したセフアロスポリンを単離する前に、特
に７−もしくは３−側鎖の反応によりその誘導体
に変換することが望ましい。従つて７−側鎖のア
ミノ基は、アリール基（例えば２，４−ジニトロ
フエニル）、アシル基特に低級アルカノイル基
（例えばアセチル）、ハロ低級アルカノイル基（例
えばクロルアセチルあるいはジクロルアセチル）、
アロイル基（例えばベンゾイル、クロルベンゾイ
ル、ニトロベンゾイルあるいはトシル）、低級ア
ルコキシカルボニル基（例えば第三ブトキシカル
ボニル）、アリール低級アルコキシカルボニル基
（例えばベンジルオキシカルボニル）あるいはフ
タロイルのようなジアシル基のような例えば英国
特許第1041985号、同第1302015号あるいは同第
1313207号各明細書に記載されている型の基によ
つて置換されてよい。７−側鎖はまた例えば英国
特許第1272769号明細書記載の方法により４−カ
ルボキシブタンアミド化合物に、あるいは英国特
許第1355347号明細書記載の方法により５−カル
ボキシ−５−（２，６−ジメチル−３，５−ジカ
ルボエトキシ−１，４−ジヒドロピリド−１−イ
ル）−ペンタンアミド基のようなジヒドロピリジ
ン誘導体に変換されてもよい。セフアロスポリン
Ｃは、例えば英国特許第1080904号明細書あるい
は同第1474519号明細書記載の方法によりエステ
ラーゼで処理することによりデスアセチルセフア
ロスポリンＣに変換されうる。 醗酵したセフアロスポリンの誘導体を単離する
のに使用される方法は、生成物の性質および採用
される反応の如何にもよるがしかし一般に慣用の
技法が用いられる。 本発明がより良く理解されるために以下の実施
例を説明のために掲げる。以下の実施例中に使用
されるアクレモニウム・クリソゲヌムの菌株の記
述はWalter Gams氏著「セフアロスポリウム様
カビ（Cephalosporium−artige Schim−
melpiltze）」（西ドイツ版）1971年第109〜111頁
における記載による。 実施例 １ アクレモニウム・クリソゲヌム菌株M8650
（ATCC14553）から導かれる２種の栄養要求性突
然変異体を交配させる。交配は赤色ArgLeu
（IMI227144）（微工研受託番号第4935号）×白色
Arg Met（IMI227145）（微工研寄託受理番号第
4936号）である。略称Arg、Met、Leuはアルギ
ニン、メチオニンあるいはロイシンに対する要求
をそれぞれ示す。「赤色」は赤色菌糸体色素沈着
を示し「白色」は白色菌糸体色素沈着を示す。
Arg突然変異体は非対立遺伝子性である。 ２種の親菌株は以下の組成を有する水性媒質中
で振盪フラスコで別々に培養される。 スクロース 36ｇ／ Ｌ−アスパラギン 7.5ｇ／ KH₂PO₄ 15ｇ／ K₂HPO₄ 21ｇ／ Na₂SO₄ 0.75ｇ／ MgSO₄・7H₂O 0.18ｇ／ 塩溶液 １ml／ CaCl₂ 0.06ｇ／ 自然のPH 塩溶液は以下のものを含有している。 Fe（NH₄）₂（SO₄）₂・6H₂O， 15ｇ／100ml MnSO₄・4H₂O ３ｇ／100ml ZnSO₄・7H₂O ３ｇ／100ml CuSO₄・5H₂O 0.8ｇ／100ml。 媒質を250mlの円錐フラスコ中ほぼ40mlずつに
分配する。121℃で20分間圧熱滅菌後各フラスコ
中に滅菌グルコース溶液（10.8％Ｗ／Ｖ）１mlを
加える。次いでフラスコに親菌株の適切なアミノ
酸栄養要求性必要物を最終濃度0.01％で補給す
る。加えて各フラスコに以下の組成の滅菌水性媒
質２mlを補給する。 スクロース 25ｇ／ コーンステイープリカー 窒素として0.1％ 酢酸アンモニウム 5.5ｇ／ CaCo₃ ５ｇ／ KOHでPH6.5に調整した後で121℃で20分間圧
熱滅菌する。 各振盪フラスコに次いで適当な菌株を接種し、
白色菌株について48時間また赤色菌株について72
時間培養し（25℃、250rpm）、同じ媒質の第２の
フラスコ（40ml）の接種に使用する。これをそれ
ぞれ48時間あるいは72時間後に収穫し、菌糸体を
紙を通しての真空過により回収する。菌糸体
を蒸留水で２〜３回洗浄したのち、菌糸体（総湿
潤重量１〜２ｇ）をPH7.3のクエン酸塩／りん酸
塩緩衝液中の0.01Mジチオトレイトール（10ml）
中に再懸濁しそして穏やかに振盪しながら30℃で
１時間培養する。 ジチオトレイトールで処理した菌糸体を蒸留水
で洗浄し、シトフアガ酵素L₁（20mg、BDH社から
入手しうる）、およびさらに0.8MNaClおよび
0.02MMgSO₄を含有しているPH6.8の緩衝液（10
ml）中に再懸濁する。この懸濁液を30℃で３時間
穏やかに振盪しながら培養する。 生成する原形体および部分消化された菌糸体の
混合物を綿毛を通して過して菌糸体を除去しそ
して液を700ｇで５分間遠心分離する。小球を
等張食塩水（0.9M塩化ナトリウム）で２回洗い、
終りに等張食塩水中に再懸濁する。 原形体の産生は、未消化の菌糸体断片とは全く
異なる小さい球形細胞の出現により確認される。
原形体の生育力は浸透圧的に安定化された（２％
スクロースおよび0.8MNaCl）そして非安定化ハ
ートインフユージヨン（heart infusion）寒天
〔オキソイド（Oxoid）寒天でゲル化されたバク
ト（Bacto）ハートインフユージヨン肉汁
（Difco）〕上に平板培養することにより測定され
うる。原形体は浸透圧的に脆弱で非安定化寒天上
では生存し得ない。原形体の生育力は約70％であ
り、安定化された寒天上の約15％の生長は菌糸体
断片による。 各親菌株からの原形体（１ml当り各栄養要求株
１〜２×10⁶）を等張食塩水（５ml）中に懸濁し、
混合しそして700ｇで５分間遠心分離する。小球
を0.01M塩化カルシウムを含有しているPH7.5の
グリシン緩衝液中の30％ポリエチレングリコール
（分子量6000）溶液（２ml）（予め30℃に加温され
ている）中に再懸濁し、そして30℃で10分間培養
する。等張食塩水（６ml）で希釈したのち、この
調製物を700ｇで５分間遠心分離し、等張食塩水
で２回洗い、終りに等張食塩水中に再懸濁する。 融合混合物を以下の表の見出し欄に列挙してあ
る一連の浸透圧的に安定化された選択的再生媒質
上で平板培養する。再生媒質上の生育中心から胞
子および菌糸断片をとりそして最小媒質および完
全媒質上に平板培養する。最小媒質および完全媒
質上に生じるコロニーをくり返して順次平板培養
すると子孫が精製されそして安定化試験が得られ
る。 最小媒質（ツアペツク・ドツクス
（CzapekDox）最小寒天）は次の組成を有する
（重量％）。 スクロース ３％ NaNO₃ 0.2％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.05％ KCl 0.05％ FeSO₄ 0.001％ 寒天（オキソイドNo.３） ２％ PHをKOHで6.8に調整しそして次いで121℃で
20分間圧熱滅菌する。 完全媒質〔サブロー（Sabourauds）寒天〕は
以下の組成を有する（重量％）。 マルトース ４％ ペプトン（オキソイド中和細菌） １％ 麦芽エキス（オキソイド） 2.4％ 寒天（オキソイドNo.３） ２％ PHをNaOHで7.5に調整しそして次いで121℃で
20分間圧熱滅菌する。 完全媒質からの生じる精製されたコロニーを、
色および生長要求物に関して以下の表に列挙され
る菌株として特性化する。各選択的媒質から回収
されるかかる多数の菌株を表に示す。菌株にはｐ
−フルオルフエニルアラニンあるいはガンマ線に
よる処理で分離しない原栄養株が包含される。
「MM」は最小媒質を、そして「MM⁺」は浸透圧
的に安定化された最小媒質を示す。

【表】 単離される子孫の生長速度および胞子形成特性
が測定される。 表は親菌株および原栄養株子孫、（菌株Ｐ）
の上記媒質中における深部培養および固形媒質上
の生長速度の比較を示す。 表は親菌株および白色Arg Met子孫（菌株
Ｑ）の胞子形成データの比較を示す。 菌株Ｐは固形媒質上および深部培養の両方にお
いていずれの親菌株のそれよりも有意に大きい生
長速度を示すが、他方菌株Ｑもまたいずれの親菌
株よりも有意に大きい胞子形成度を示す。

【表】

【表】 実施例 ２ アクレモニウム・クリソゲヌムATCC14553か
ら導かれる２種類の高度に開散性の菌株アクレモ
ニウム・クリソゲヌム、菌株ＡおよびＢが共に表
に示される特性を有している。 栄養要求性標識が慣用の突然変異技法により両
菌株中に導入される。かくして各菌株からの胞子
を胞子の約99％が殺滅されるような極度の紫外線
に付す。生存体を生育要求物について試験し、そ
して栄養要求性標識として作用するに適した生育
要件突然変異を示す各菌株の突然変異体を選択す
る。表に示されるニコチンアミド要求に加えア
ノイリン要求を有する菌株Ａの突然変異体および
アルギニンとアノイリンとの両方への要求を有す
る菌株Ｂの突然変異体がかくして選択される。 実施例１の方法に従い、これら２種の標印され
た菌株を48時間別々に培養し、各菌株の菌糸体か
ら原形体を調製し、そして２種の菌株の原形体を
混合し融合させる。 融合混合物を浸透圧的に安定化された最小媒質
上に平板培養する。生育中心部から胞子および菌
糸断片をとり、次に完全媒質上で平板培養する。
最小ならびに完全媒質は実施例１に示される組成
を有する。生じるコロニーを、例えば色、生長お
よびセフアロスポリンＣ産生に関して特性化す
る。 大体600種の原栄養株あるいはニコチンアミド
要求子孫のうち、35種がこのように、同じ条件下
に培養された場合にいずれの親菌株をも越える
（すなわち100単位過剰の）セフアロスポリンＣ力
価を有することが見出された。 一つの子孫（菌株Ｒ）は表中に示される特性
を有する。菌株Ｒはいずれの親菌株より有意に大
きいセフアロスポリンＣ力価を有し、２種の親菌
株のそれの中間の生長速度および胞子形成度を有
する。

【表】 実施例 ３ アクレモニウム・クリソゲヌム菌株M8650
（ATCC 14553）から導かれる栄養要求性突然変
異体と、菌株C0728（IMI237183、微工研受託番号
第4937号）から導かれる栄養要求性突然変異体と
を交配する（菌株C0728は菌株M8650からいつか
の慣用の突然変異段階により導かれたものであ
る）。上記交配はArg Met（M8650）×Leu
（C0728）（微工研受託番号第4938号）で表わされ
る。略称Arg、MetおよびLeuはそれぞれアルギ
ニン、メチオニンあるいはロイシンに対する要求
を示す。２種の栄養要求性親菌株はそれぞれ
IMI227145およびIMI237183の番号で寄託され
ている。 実施例１の方法により、これら２種の標印され
た菌株を別々に48時間培養し、各菌株の菌糸体か
ら原形体を調製しそして２種の菌株の原形体を混
合し且つ融合させる。 融合混合物を浸透圧的に安定化された最小媒質
上で平板培養する。生育中心部から胞子および菌
糸断片を採り、最小媒質および完全媒質上に平板
培養して単離物の安定性を確認する。最小および
完全媒質は実施例１に記載されている組成を有す
る。 この交配から得られる安定な原栄養性組み換え
体および親菌株は以下のように別々に醗酵され
る。菌株をサブロー寒天（実施例１の処方）上で
25℃において10日間培養する。これら培養物から
の胞子の小片および菌糸断片を以下の組成を有す
る媒質（16ml）を含有している振盪フラスコの接
種に使用する。 コーンステイープリカー 窒素として0.1％ 酢酸アンモニウム 5.5ｇ／ スクロース 25ｇ／ 炭酸カルシウム 10ｇ／ PHはNaOHで6.5に調整される。121℃で20分間
圧熱滅菌後、振盪フラスコを48時間培養する（25
℃、250rpm）。各振盪フラスコから接種物0.5ml
を採取し、以下の組成を有する媒質（9.5ml）を
含有している第２の振盪フラスコの接種に使用す
る。 コーンステイープリカー 窒素として0.5％ 乳糖 46ｇ／ グルコース ２ｇ／ メチオニン 2.3ｇ／ フエニルアセチルエタノールアミン
1.5ｇ／ 炭酸カルシウム 16ｇ／ 尿素 0.8ｇ／ 硫酸アンモニウム 3.4ｇ／ とうもろこし油 １フラスコ当り６滴 PHはNaOHを用いて6.6に調整される。121℃で
20分間圧熱滅菌後、振盪フラスコを120時間培養
する（25℃、250rpm）。 単離した組み換え菌株中に観察される特に改良
された性質はデスアセチルセフアロスポリンＣの
改良された力価であり、これは化学的に分析され
る。結果は表に示される。

【表】 以上の例において使用されたアクレモニウム・
クリソゲヌムM8650Red Arg Leu（IMI227144）
は赤色の色素沈着を示し、アルギニンおよびロイ
シンの補給を要する以外は既知のアクレモニウ
ム・クリソゲヌムM8650と等しく、アクレモニウ
ム・クリソゲヌムM8650Arg Met（IMI227145）
はアルギニンおよびメチオニン補給を要する以外
はアクレモニウム・クリソゲヌムM8650に等し
く、アクレモニウム・クリソゲヌムC0728の特色
は前掲の表に示されるように、生成デスアセチ
ルセフアロスポリンＣの高力価であり、アクレモ
ニウム・クリソゲヌムC0728Leuはロイシンの補
給を要する以外前記アクレモニウム・クリソゲヌ
ムC0728に等しい。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アクレモニウム・クリソゲヌム
   （Acremoniumchrysogenum）の異なる親菌株を
   原形体融合および核融合に付し、改良された菌株
   をその子孫もしくはその突然変異体から慣用の方
   法により選択することからなるセフアロスポリン
   の製造のためのアクレモニウム・クリソゲヌムの
   改良された菌株の製法。 ２ 子孫の選択を促進するために親菌株を処理す
   ることからなる前記特許請求の範囲第１項記載の
   方法。 ３ 原形体融合および核融合に先立つて各親菌株
   を栄養要求性標識で遺伝的に標印することからな
   る前記特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 各親菌株を少くとも２種の栄養要求性標識で
   遺伝的に標印することからなる前記特許請求の範
   囲第３項記載の方法。 ５ 原形体融合および核融合に先立つて各親菌株
   を色あるいは薬剤抵抗性により遺伝的に標印する
   ことからなる前記特許請求の範囲第２項記載の方
   法。 ６ 原形体融合および核融合に先立つて親菌株を
   それぞれ、異なつた不可逆的代謝抑制剤で処理し
   てそれぞれ異なりそして補足的な代謝抑制作用を
   行うことからなる前記特許請求の範囲第２項記載
   の方法。 ７ 親菌株の菌糸体、分節胞子または分生子をチ
   オールセンシタイザーで処理して原形体産生を助
   ける、前記特許請求の範囲第１項ないし第６項の
   いずれかの項に記載の方法。 ８ チオールセンシタイザーがジチオトレイトー
   ルからなる前記特許請求の範囲第６項記載の方
   法。 ９ 原形体融合が分子量1000〜8000を有するポリ
   エチレングリコールの存在下に行われる、前記特
   許請求の範囲第１項ないし第８項のいずれかの項
   に記載の方法。 １０ 原形体融合が0.002〜1.0Mの濃度のカルシ
   ウムイオンの存在下に行われる、前記特許請求の
   範囲第１項ないし第９項のいずれかの項に記載の
   方法。