JPH0349920B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明はポリペプチド及びそれを有効成分とし
て含有する昇圧用医薬組成物に関する。 〔従来の技術〕 天然産のバソプレシンが抗利尿活性のような生
物学的作用をもつことは古くから認められてい
る。しかし、その利用は、それが血液流中におけ
る半減期が比較的短いこと並びに周知のように増
圧作用をもつことによつて限られている。従つ
て、バソプレシンの性質を改質し、その医薬用途
を増大せしめた生成物を得んとして様々なバソプ
レシン類似体が合成されて来た。 バソプレシンの半減期を長くしようとする試み
として酵素分割及びそれによるバソプレシン分子
の不活性化を抑制するよう改質することが試みら
れている。例えば、〔８−Ｄ−アルギニン〕バソ
プレシンを１−位で脱アミノ化して、１−２炭素
−窒素結合のアミノペプチダーゼ分割に免疫性の
“デスモプレシン（desmopressin）”を生成せし
め、その結果としてデスモプレシンが高い抗利尿
活性をもつことが認められた。米国特許第
3497491号参照。更に、ジスルフイドブリツジを
チオエーテル結合（−CH₂S−又は−SCH₂−）
で置き換えることによつて、より高い効力と半減
期をもつ更に他の類似体が生成する。米国特許第
3980631号参照。 新規で潜在的に一層有効なバソプレシン類似体
に対する更に別のアプローチとして、活性分子に
結合した分割性又は開裂性ペプチド残鎖を有する
ホルモン源形態、即ちバソプレシン類似体の調製
があげられる。これらの類似体はそれ自体不活性
であるが、活性分子の保有体として機能し、付加
残基の酵素分割によつて活性分子を徐々に放出す
る。このアプローチは、米国特許第3558590号に
示されるように、分子のＮ−末端に１個もしくは
それ以上のペプチド残基を結合せしめることによ
つて得られる一連の類似体を含む。これらの類似
体のうち、N〓−グリシル−グリシル−グリシル
−８−リシン−バソプレシン、即ちtGLVP、が
もつとも興味深いものである。この改質は長持続
性薬剤を提供するのに有効ではあるが、依然とし
て所望通り有効とはいえない。例えば、ホルモン
源の分割が分子の活性ノナペプチド部分の様々な
位置でも起るので投与tGLVPの僅か約１〜５％
が実際に活性な形で放出されるに過ぎない。その
結果、tGLVPの多量の投与が必要となる。 〔発明が解決しようとする課題〕 前記したように、バソプレシン及びその類似体
を酵素分解から保護しかつ活性ホルモンを十分な
収率で放出せしめて比較的少ない投与量を用いる
ことができるようにバソプレシン及びその類似体
を改質することは望ましいことである。 本発明の目的は長期活性能を有するバソプレシ
ン類の新規な類似体であるポリペプチドを提供す
ることにある。 本発明の他の目的は前記ポリペプチドを有効成
分とした、胃腸出血、子宮出血、火傷もしくは出
血性シヨツク又は外科手術の際の出血などの治療
に有効な、昇圧用医薬組成物を提供することにあ
る。 本発明の更に他の目的は本発明を実施可能にす
る明細書の記載および特許請求の範囲の記載から
明らかな通りである。 〔課題を解決するための手段〕 本発明に従えば、式（）： （式中、８位のリシン部分の立体配置はＤ又は
Ｌである）で表されるポリペプチド及びそれを有
効成分として含む医薬組成物が提供される。 本発明のポリペプチドは高い活性を与えかつ活
性ホルモンの有効寿命を長くする活性能によつて
特徴づけられる。これらはバソプレシン様の活性
をもつバソプレシンの誘導体及びその類似体〔以
下バソプレシン類（Vasopressins）と総称する〕
である。 本発明の前記目的は、以下に定義する“側ペプ
チド鎖（side peptide chain）”を塩基性側鎖を
もつα−アミノ酸を含むバソプレシン類に導入す
ることによつて達せられる。これらのアミノ酸残
基は次の一般式で表わすことができる。 （式中、Ｒは２価の飽和脂肪族もしくは芳香族
基、好ましくは炭素数６までの飽和脂肪族基であ
り、アミノ側基の一つの水素原子はアミド結合と
して利用できる。） 前記塩基性アミノ酸残基の代表例はリシン、ホ
モリシン、オルニチンなどである。 バソプレシン鎖に前記塩基性アミノ酸残基、又
は前記塩基性アミノ酸残基で置換できる、アルギ
ニンの如きグアニジン残基を有するバソプレシン
類はトリプシン様の酵素による酵素作用を受け易
い。これらの酵素は隣接炭素−窒素結合の一つの
位置でポリペプチド結合を切断する。本発明に従
えば、前記塩基性残基の一つのω−末端アミンプ
ロトン（水素）を“側ペプチド鎖”で置換した場
合に、生成ポリペプチドが前記分割に免疫性とな
ることが発見された。しかしながら、この側ペプ
チド鎖はアミノ−ペプチダーゼによつて除去する
ことができ、それによつて活性なバソプレシン又
はその類似体分子が放出されることも発見した。
このようにして本発明のポリペプチドは長期間に
亘つて活性ホルモンを放出し、活性分子の有用な
半減期を長くすることができる。 本明細書において使用する“側ペプチド鎖”な
る語は、１〜約３個のアミノ酸残基鎖を意味す
る。好ましいアミノ酸残基は飽和もしくは芳香族
部分から専ら成るα−アミノ酸、例えばグリシン
（Gly）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイ
シン（Leu）、イソロイシン（Ile）およびフエニ
ルアラニン（Phe）などから誘導されたものであ
る。更にGly残基以外の残基は、有用なレベルの
活性度をもつ本発明の誘導体を得るためには、Ｌ
−立体配置になければならない。Ｄ−アラニンが
側−置換体の場合には生成化合物が比較的不活性
でホルモン源としては作用しなかつた。側ペプチ
ド鎖としてはグリシン残基が特に好ましく、トリ
ペプチドGly−Gly−Gly鎖が最も好ましい。 特に興味深い、本発明のポリペプチドは、１−
デアミノ−バソプレシン及びその類似体の８−
N〓−ペプチドホルモン源であり、これらは米国
特許第3558590号のN〓−ペプチドホルモン源又は
その類似体よりその作用の点において一層効力が
ありかつ長期間活性が持続する。 本発明の新規なポリペプチドはポリペプチド合
成用の一般的な方法によつて容易に調製すること
ができる。好ましい手順として、Stewart及び
Youngの“Solid Phase Peptide Synthesis”，
W.H.Freeman＆Co.，サンフランシスコ（1969）
に記載されているような、段階的固相合成法があ
げられる。この合成法の原理及び手順は周知のも
のであるので、これ以上ここでは記載しない。 〔実施例〕 以下に本発明に従つたN〓−置換類似体の合成
例を掲げるが、これらは単なる例示であつて、本
発明の範囲をこれらに限定するものでないことは
いうまでもない。 例 １−デスアミノ−〔２−Phe，８−N〓−Lys
（Gly）〕−バソプレシン 本発明に係るバソプレシン類似体を以下の様に
して製造した。 樹脂ｇ当り0.51ミリ当量の有効アミンを有する
ベンツヒドリルアミン−HCl樹脂（Beckman）
の3.0ｇをベガ96型（Vega Model 96）自動プロ
グラム可能な合成器の135ml反応容器に装入した。 Gly，N〓−（カルボベンゾキシ）Lys，Pro，Ｓ
−（ｐ−メトキシベンジル）Cys，Asn，Gln，
Phe及びＳ−（ｐ−メチルベンジル）−β−プロピ
オン酸のN〓−（ｔ−ブチルオキシ−カルボニル）
〔N〓−（ｔ−Boc）〕誘導体を順次反応させること
によつてペプチド鎖を作り、4.52ｇの樹脂−結合
したペプチドＳ−ｐ−MeBzl−β−メルカプト
プロピオン酸−Phe−Phe−Gln−Asn−Ｓ−ｐ−
MeOBzlCys−Pro−Lys（CBZ）−Gly−NH₂−樹
脂を生成せしめた。全体収率は87％であつた。ｔ
−Bocアミノ酸はすべてVega Laboratories，
Inc.より入手し適当な溶剤に溶解した。即ち、ｐ
−MeOBzlCys，Gly，Pro及びPheのｔ−Boc誘
導体はジクロロメタンに溶解し、一方Asn及び
Glnの誘導体はジメチルホルムアミド（DMF）
及び２倍過剰のヒドロベンゾトリアゾールモノヒ
ドレート（HOBzt）に溶解した。合成は、第１
表及び第２表の手順に従つて、保護された残基の
それぞれに対して３倍モル過剰の二重カツプリン
グを用いて実施した。すべての場合に、Anal.
Biochem.，34，595（1970）に記載された、
Kaiserらの方法によつて求めたところでは、前
記樹脂は第二カツプリング後の遊離アミノ基に対
して負であつた。

【表】

【表】 アミノ酸はｔ−Boc誘導体の3.0M過剰溶液と
した。DCCは保護されたアミノ酸と等モルであ
つた。

【表】

【表】 アミノ酸はDMF中の3.0倍モル過剰のｔ−Boc
誘導体であつた。HOBztはアミノ酸濃度に対し
て２倍モル過剰で使用した。DCCは等モルであ
つた。 このようにして得たペプチド樹脂の試料400mg
をPeninsula Laboratoriesから供給されている。 HF装置の50mlテフロン−ケル（Kel）−Ｆ容器
に装入し、小さなテフロン被覆電磁撹拌棒及びア
ニソール１mlを添加した。フリツト（frit）を容
器の頂部近くに固定し、次いでHF装置に接続し
た。HF装置を真空ポンプで真空にし、試料容器
をドライアイス／アセトン浴中に浸漬した。20分
後、試料容器を真空系から切り離し、HF貯蔵器
に接続した。この容器中に全液体容積が約10mlに
なるまで（約５分）、HFを蒸留した。ドライア
イス／アセトン浴を水／氷浴に置き換え、電磁撹
拌機を容器の下に入れ容器を系の他の部分から密
閉した。75分後、容器を注意深くポンプに通じさ
せ、HFを約60分間にわたつて蒸発させた。残存
な試料容器をこの間ずつと０℃に浸漬した。次に
系を窒素で充満して大気圧に戻し、開裂容器をす
ばやく取り出しパラフイルム（parafilm）でシ
ールした。 容器から粗粒ガラスロート（coarse fritted
funnel）中に内容物を脱気酢酸エチルで数回（全
量約100ml）洗い出した。次にロート及び容器を
真空デシケーター中に入れ、30分間吸引して残留
酢酸エチルを除去した。次いで開裂容器及びロー
ト中の樹脂を脱気IM酢酸（合計100ml）で数回洗
浄し、更に脱気水300mlで数回に分けて洗浄した。
この溶液を3M NH₄OHでPH6.9に調整し、そし
て0.01Mフエリシアン化カリ溶液25mlを添加し
た。この黄色溶液を約30分撹拌し、50％酢酸でPH
を５に調整し、AG−３アニオン交換樹脂（TFA
形）を添加し、そして混合物を更に20分間撹拌し
た。次にスラリーを濾過して透明な無色の溶液を
生成せしめ、そして樹脂を少量の水で洗浄し、溶
液を凍結乾燥した。 生成粉体を50％酢酸約15mlにとり、濾過して透
明な淡黄色溶液を得、これを予じめ50％酢酸で平
衡にしたセフアデツクスＧ−15カラム（2.6×90
cm）に適用した。溶離は速度１ml／mmで画分３ml
を集めた。２つの重複ピークはOD₂₆₅で検出する
ことによつて溶離した。ピーク１は僅黄色で画分
45〜53にあらわれ、ピーク２は画分54〜79にあら
われた。ピーク２の物質を同一条件下に再度クロ
マトグラフにかけたところ、第二のピークが所望
の生成物、（１−デスアミノ〔２−Phe，８−
Lys〕バソプレシン）であり収量は62.5mgであつ
た。6MHClで24時間加水分解した後のアミ酸分
析は、Lys l.1，Pro 1.0，Glu 1.2，Phe 1.8，
Asp 1.0、ヘミーCys（HCl加水分解後で信頼性な
し）0.6であつた。

【表】 た。
DMF（１ml）中の１−デスアミノ−〔２−Phe，
８−Lys〕−バソプレシン50mgの溶液にトリエチ
ルアミン（0.007ml）を添加し、次いでＮ−ｔ−
Boc−グリシンｐ−ニトロフエニルエステル（69
mg）及び１−HOBzt（10mg）を添加した。室温で
1.5時間撹拌後、シリカゲル上でのTLC（CHCl₃−
MeOH−H₂O，200：75：13）でニンヒドリンを
用いて可視化して判断したところ、すべてのペプ
チドが反応していた。 次にこの反応混液を２−プロパノール（10ml）
及びエーテル（50ml）で希釈し、４℃に冷却しそ
して濾過した。生成物を熱アセトン（15ml）で処
理し、冷エーテル（50ml）で希釈し、そして遠心
分離により集めた。収量は38mgであつた。保護さ
れたデカペプチドをトリフルオロ酢酸（１ml）中
で30分間保護をとき、そしてエーテル沈澱化の後
遠心分離により単離した。１−デスアミノ−〔２
−Phe，８−N〓−Lys（Gly）〕−バソプレシンの最
終収量は29.14mg（54.5％）であつた。 アミノ酸分析：（6M HCl中で24時間加水分解）
Lys1.0，Asp 1.0，Glu1.0，Pro0.9，Gly2.1，
Phe1.7、ヘミ−Cys 0.6。

【表】 ニンヒドリンによる可視化。Ｏ−トルイジンは
追加のスポツトを示さなかつた。 例 １−デスアミノ−〔８−N〓−Lys（Gly−Gly−
Gly）〕−バソプレシン チロシン（Tyr）を位置２のフエニルアラニン
（Phe）に代えて用いた以外は例の手順と同様
にして１−デスアミノ−〔８−Lys〕−バソプレシ
ンを合成した。アミノ酸分析：Lys1.0，Asp1.0，
Glu1.0，Pro0.9，Gly0.9，Phe0.9，Tyr1.1、ヘミ
−Cys0.7。 Gly−Gly−Gly（Vega Laboratories，Inc.）
2.98ｇを50％ジオキサン100mlに懸濁し、PHを約
10.0に調整して懸濁物質を溶解せしめた。ジ−ｔ
−ブチル−ジカーボネート2.2ｇを添加し、反応
をTLC（ブタノール−ピリジン−酢酸−水、15：
10：３：６）で追跡した。３時間後にジ−ｔ−ブ
チル−ジカーボネート１ｇを追加添加し、そして
更に３時間後トリペプチドのＮ−末端を保護する
反応を完了した。次にこの溶液をヘキサン30mlず
つで３回抽出した。水相のPHを2.5に調整し、酢
酸エチル50mlずつで３回抽出し、MgSO₄上で乾
燥しそして油状に濃縮した。残渣を酢酸エチル−
エーテルから結晶化した。収量は750mgであつた。
この物質を常法に従つてＮ−ｔ−Boc−Gly−
Gly−Gly ｐ−ニトロフエニルエステルに転換せ
しめてエステル750mgを生成せしめた。 例の手順と同様な方法を用いてＮ−ｔ−Boc
−Gly−Gly−Gly ｐ−ニトロフエニルエステル
を８−Lysのイプシロンアミノ基にカツプリング
させ、次にＮ−ｔ−Boc基を除いて１−デスアミ
ノ−〔８−N〓−Lys（Gly−Gly−Gly）〕−バソプレ
シンを生成せしめた。アミノ酸分析：Lys1.0，
Asp1.0，Glu1.0，Pro0.9，Gly3.8，Phe1.0，
Tyr1.1、ヘミ−Lys0.6。 例 １−デスアミノ−〔８−Ｄ−N〓−Lys（Gly−
Gly−Gly）〕−バソプレシン 位置８のＬ−LysをＤ−Lysに置換換えた以外
は、例の手順と同様な手順を用いて１−デスア
ミノ−〔８−Ｄ−N〓−Lys（Gly−Gly−Gly）〕−バ
ソプレシンを調製した。 式（）で代表される、哺乳動物に投与する際
に好ましい、本発明に係るポリペプチドはNΩ−
ペプチド鎖の分割（又は開裂）によつて活性化さ
れて、活性な原ポリペプチド−勿論当初の活性を
依然として有する−を放出する。例えば及び
のような化合物は延長された昇圧活性をもつこと
が期待され、そしてシヨツク治療、胃腸出血、子
宮出血、火傷、妊娠過程での障害、血尿症及びす
い臓病などの治療に有用である。 例えば、例及びのような化合物は延長され
た昇圧活性をもつことが期待され、そしてシヨツ
ク治療、胃腸出血、子宮出血、火傷、妊娠過程で
の障害、血尿症及びすい臓病などの治療に有用で
ある。 例〜の化合物の昇圧及び抗利尿作用評価分
析を、Schaechtelinらの“Enhancement of the
Activity of Angiotensin by Certain
Cations”，Molec.Pharmacol.，10，57〜67
（1974）及びCortらの“Role of the Disulfide
Bridge and the Ｃ−Terminal Tripeptide in
the Anti−diuretic Action of Vasopressin in
Man and the Rat”，Kidney Internat.，８，
292−302（1975）に記載の方法を用いて、体重200
ｇの雄のスプラグ−ドーリー（Sprague−
Dawley）ラツトについて実施した。既知の活性
をもつ高精製アルギニン−バソプレシンを用いて
３点曲線に対する応答を検定した。比較のために
同様の試験を公知のバソプレシン類似体に対して
も実施した。更に例〜の化合物の第因子の
放出性をBrit.J.Haematol.，41，437（1979）に記
載のProwseらの凝血評価分析（clotling assay）
を用いて雄犬のクエン酸塩加血漿で試験し、その
結果をデスモプレシンの第因子放出活性に対し
て検定した。すべての場合に応答の半減期は等ピ
ーク効力レベル（equi−peak−potent levels）
での標準と比較した。これらの試験結果を以下の
第３表〜第５表に纏めた。

【表】 第３表の結果から、例及びの化合物はすべ
てtGLVPより効力の高い昇圧活性がより長い時
間持続することが明らかである。

【表】 第４表のデータから明らかなように、例の化
合物は相当高い抗利尿活性を有し、そしてすべて
の化合物がtGLVPより大きい抗利尿活性を有し
ていた。第３表の結果も考慮すると、例及び
の化合物は、低抗利尿活性とカツプリングした、
tGLVPより高いピーク効力（potency）を有しか
つ長い昇圧活性の持続性を有する。

【表】 第３表〜第５表に纏めたデータに基づけば、例
及びの化合物はシヨツク、胃腸出血、子宮出
血、火傷、妊娠過程での障害、血尿症及びすい臓
病などの治療に有用であり、例での化合物は抗
利尿剤としての活性が特に高く、従つて抗利尿剤
として使用することができる。 本発明のポリペプチドは一般に知られた方法に
従つて治療すべき宿主（host）に投薬する。例え
ば、静脈内注射もしくは注入によつて投薬するこ
とができ、また点鼻剤の形状で鼻内に投薬するこ
ともできる。いずれの場合にもポリペプチドは適
当な溶媒、好ましくは水中の溶液で投薬される。
この溶液は業界において一般的に知られた、様々
な添加剤を含むことができる。好ましい媒質は生
理的食塩水溶液である。この溶液は、好ましくは
PH約３〜約５、特に好ましくは約４の酸性にして
ポリペプチドを安定化する。また少量の制菌剤、
例えばクロロブタノールを含ませて鼻内製剤の菌
汚染を最少にするのも望ましい。 溶液中のポリペプチドの濃度については、特に
狭い限定はなく、約1μg／ml〜1000μg／mlもしく
はそれ以上の広い範囲において、意図する投薬の
形態及び投薬量に依つて、変化させることができ
る。一般には、鼻内投与用の溶液は注射投与用の
溶液より高濃度である。すなわち、鼻内投与用の
溶液はml当り約100〜約400μgのポリペプチドを
含み、これに対し注射溶液はml当り約10〜約
40μg程度のポリペプチドを含む。 投与されるポリペプチドの投薬量は、ポリペプ
チドの特定の作用、その作用のレベル、意図する
効果及び投与形態に大幅に依存する。例えば、点
鼻剤の形態で投与する場合には、投与薬量は静脈
内経路による投与薬量の約10倍量でなければなら
ない。 本発明の化合物を第因子レベルを上昇させる
のに使用する場合には、高効力第因子製剤を調
製する方法に使用することができる。このような
方法では、本発明の化合物は篤志供血者に投与さ
れ、供給者の血液流の第因子レベルを増大させ
ることができる。第因子レベルの上昇はポリペ
プチドの投与後約15分以内に始まり、そして少な
くとも４時間レベルの上昇が持続する。第因子
の血行レベルが所望レベルに到達した時、一般に
は投与後30分もしくはその程度経過後、供給者の
血液は任意の一般的方法で集めることができる。
このようにして得た血液は、一般的方法、例えば
低温沈澱（cryo−precipitating）によつて処理
して第因子含有製剤（AHG）を生成せしめる。
血液中の第因子の濃度が増大するので、一定容
量の血液から回収された製剤中の第因子の量
は、それに符号して、本発明のポリペプチドで処
理していない篤志家から得たのより増大してい
る。更に第因子（及びプラズミン源
（plasminogen）活性化剤）以外の血液構成因子
の量は影響を受けないので、第因子中の不純物
の割合は減少する。 更にこれらと同一第因子放出ポリペプチドは
ホン・ウイルブランド病（von Willebrond′s
disease）をもつ女性の低第因子レベルに関係
する月経過多を治療するのに使用することができ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式（）： （式中、８位のリシン部分の立体配置はＤ又は
   Ｌである）で表されるポリペプチド。 ２ ノーデスアミノ〔Ｎ−Ｎ−ε−トリグリシ
   ル）−８−Ｌ−リシン〕バソプレシンである特許
   請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ３ 式（）： （式中、８位のリシン部分の立体配置はＤ又は
   Ｌである）で表されるポリペプチドの有効量と医
   薬用担体とを含んで成る昇圧用医薬組成物。 ４ 胃腸出血に伴なう血圧降下の治療に用いる特
   許請求の範囲第３項記載の昇圧用医薬組成物。 ５ 子宮出血に伴なう血圧降下の治療に用いる特
   許請求の範囲第３項記載の昇圧用医薬組成物。 ６ 火傷又は出血性シヨツクに伴なう血圧降下の
   治療に用いる特許請求の範囲第３項記載の昇圧用
   医薬組成物。 ７ 外科手術に際する出血の治療に用いる特許請
   求の範囲第３項記載の昇圧用医薬組成物。