【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
遺伝子工学的に得られた融合タンパク質をコラゲナーゼによって特異的に分解す
ることｊこよってペプチドを製造する方法
背景技術
遺伝子工学によって、特に比較的長いアミノ酸配列の場合には従来の化学的合成
法よりもはるかに優れている、ペプチド及びタンパク質の新規製造方法が開発さ
れた。これによって初めて、かつては入手し難かった物質、例えば成長ホルモン
、インターフェロン及び多数のペプチドホルモンが十分な量で利用されうる［Ｅ
、 Ａ、 Ｏ，Ｍａｒｓｔｏｎ、 Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、 Ｊ 、２４０． １〜
１２（１９８６）］。
ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法は、製造すべきアミノ酸配列のコドンを有
する適当なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、新しく導入される遺伝子情報の複製
及び発現を可能にする形で、適当な宿主細胞に移すことを基礎にしている。宿主
細胞としては、小乃至中の大きさのペプチド（約１００個未満のアミノ酸）の場
合には、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌を使用する
。
ところで、前記範囲の大きさのポリペプチドは、顕著な三次構造によって保護さ
れていないために、細胞内ノ細菌プロテアーゼによって極めて容易に攻撃される
ことが判明した。この事実は、発現が製造すべきポリペプチドが直接最終的な形
で又は場合によってハ付加的なＮ末端メチオニン基をもって形成される（所謂直
接発現）ように制御される場合には、著しい収量の減少又は−凍土合成生成物の
多大な損失をもたらす。
これに対して所望のアミノ酸配列は、先づはるかに大きい先駆物質分子、所謂融
合タンパク質として合成される場合Ｊこは一般Ｉこ良好な収量で製造することが
できる。
従って小さい及び中等大のペプチドを製造するためには、良好に発現可能であり
、またできるだけ調節可能でもある細菌遺伝子と製造すべきペプチドのＤＮＡ配
列七から試験管内の新しい結合によってプラスミドベクター上にハイブリッド遺
伝子を形成することより成る変法が有利になる。前記ハイブリッド遺伝子は、細
菌の原調節要素（プロモーター、リポソームの結合位置及びターミネータ−）な
らびに細菌の遺伝子生成物のＮ末端アミノ酸のコドンのできるだけ大きい部分を
有し、その後に新しいペプチドのコドン及び終結コドンが続く。プラスミドベク
ターを適当な細菌宿主細胞中に移した後形質転換によって、ハイブリッド遺伝子
は、相応の細菌タンパク質から誘導されるＮ−末端部分及び製造すべきペプチド
のアミノ酸配列から成るＣ−末端部分を有する融合タンパク質の生合成を制御す
るゎこの融合タンパク質は形質転換された細胞の発酵によって容易に多量に製造
され、単離されうる。ハイブリッド遺伝子を形成するためには種々の細菌遺伝子
が使用されｔ：、しかし好ましくは酵素、すなわちβ−ガラクトシダーゼ、β−
ラクタマーゼ、アントラニル酸シシテターゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びク
ロルアンフェニコール−アセチルトランスフェラーゼの遺伝子が使用された。
前記方法によりペプチドを製造する場合の最終段階は、融合タンパク質の正確な
分解である。このような分解を可能にするためには、ハイブリッド遺伝子は、後
期の融合タンパク質の細菌部分と新しく製造すべきペプチド配列との間に、容易
にかつ選択的に分解できるペプチド結合が存在するよう＋： ＠成されなければ
ならない、小さい及び中等大のペプチドを遺伝子工学的に製造する場合、融合タ
ンパク質を分解するための、できるだけ広範囲に適用できる特異的方法の開発は
、従来は、十分に満足のいくように解決されない大きな問題でありた。
本発明の対象は、Ｎ末端に不所望な余分のアミノ酸を残すことなく、所望なペプ
チドの正確なアミノ酸配列を供給する、融合タンパク質を分解するだめの一般に
適用できる特異的方法である。
遺伝子工学的Ｊこ製造された最初のペプチド、例えば１０５６〜１０６３．１９
７７）又はヒトインシュリンのＡ鎖及びＢ 鎖（Ｄ、 Ｖ、 Ｇｏｅｄｄａｌ等
、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＴＪＳＡ ７６、 １０６−１１０． １９７９）は、
β−ガラクトシダーゼから誘導される相応の融合タンパク質からブロムシアン分
解によって遊離された。ブロムシアンは、メチオニンと次のカルボキシル位のア
ミノｌｌ［Ｎｅｔ−Ｘ、この際Ｘは遺伝コードによって固定され７２２０個の何
らかのアミノ酸であってよい］との間の結合を選択的に分解する。この方法は、
当然メチオニンすら有しないペプチドに関して適用できるにすぎない。これは前
記３種のペプチドに関しても該当する。
同様な制限は、個々のアミノ酸の認識を基礎とする、すべての融合タンパク質分
解方法について認められる。さて、Ｎ末端部分とＣ末端部分との間の結合として
リシン、アルギニン又はグルタミン酸を含有する融合タンパク質が製造される。
この分解のためには、酵素トリプシン（Ｊ、 ５ｈｉｎｅ等、 Ｎａｔｕｒｅ
２８５ 、４５６−４６１．１９８０）及びクロストリパイン（Ａ、 Ｄ。
Ｂｅｎｎｅｔｔ等、ＥＰＡ Ｃｚ３１３６３）Ｃ両酵素ともＬｙｓ−Ｘ と Ａ
ｒｇ −Ｘとの間の結合を開く）、ならびにＧｌｕ−Ｘの結合を切断するエンド
プロテイナーゼＧｌｕ −Ｃ（Ａ、 Ｄ、 Ｂｅｎｎｅｔｔ等、ＥＰＡＯ１３１
３６３）を使用する。同様に、リジンの後を特異的に分解するエンドプロテイナ
ーゼ Ｌｙｓ −Ｃ（Ｃｈｅｍ、 Ｈｏｐｐｅ −Ｓｅｙｌｅｒ３ ６ ７ ．
５ｕｐｐ１． Ａｕｇ、ｌ ９ ８ ６ 、Ｓ−１６２、Ａｂｓｔｒ。
＋９．０１．０３）も使用された。
正確に定義さＪ］た数個のアミノ酸の配列内部の特異的結合を切断する方法があ
るならば、はるかに特異的となり、ひいてはより広範囲に適用することができる
。そこでＰ、 Ｒ，５ｚｏｋａ等（ＤＮＡ５．ｌ １−２０．１９８６）は、ア
ントラニル酸シンテターゼ及びラン成長ホルモンからの部分配列がＡｓｐ −Ｐ
ｒｏ配列を介して相互に結合されている融合タンパク質を、 Ａｓｐ−Ｐｒｏ結
合が極めて酸不安定であるから酸を作用させて前記同成分に分解することに成功
した。しかしこの方法は、酸の作用時にまたその他のペプチド結合の切断も副反
応として考慮しなければならないという事実の他に、特に、結合配列から該ペプ
チドのＮ末端にプロリンが残っていて、これが多くの場合不利であるという欠点
を有している。融合タンパク質の配列Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ｔｙｒ内で２個のロイシン張基の間の結合を選択的に切断するために
使用したレニンとの反応の場合にも同様な限界を設けざるを得ない（Ｊ、 Ｓ。
Ｂｏｇｅｒ等、ＦＰＡＯ１６３５７３）、この場合には、しばしば不所望の余分
の３個のアミノ酸が残る。
λｃｌｌタンパク質の３１個のアミノ酸から成るＮ末端部分を有する融合タンパ
ク質からヒトβ−グロビンを遊離するために、Ｋ、 Ｎａｇａｉ及びＨ，Ｃ，Ｔ
ｈｇｅｒｓｅｎはＸａ因子、つまり通常、プロトロンビンからトロンビンへの変
換を作用する血漿グロテアーゼを使用した。
同様にしてＴ、 １ｍａｉ等は、９個の付加的Ｎ末端アミノ酸を有する融合タン
パク質を介してヒトプロレニンを製造するために、Ｉｖ記酵素を使用した。両者
の場合ともＮ及びＣ末端部分の間の移行部として、Ｘａ因子によって認識されか
つＡｒｇ−Ｘ（Ｘはヒトタンパク質の一番目のＮ＊端アミノ酸である）の結合に
おいて切断される配列＋ １ｅ−Ｇ １ｕ−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ−Ｘが存在した。
従ってＸａ因子は、融合タンパク質の分解のために使用スべき酵素に対する必須
の要件を満足させるようｌ；思われる。しかしまた、前記認識配列を有する融合
タンパク質の分解はＸａ因子によって不可能である２例も報告された（に、 Ａ
１１ｅｎ等、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）Ｉｏｐｐｅ −５ｅｙｌｅｒ３６７
、５ｕｐｐｌ 、Ａｕｇ、］ ９８６ 、５．１６２ 、 Ａｂｓｔｒ。
１９ 、０１−０３ ； Ｈ，ｈｌａｙｅｒ等、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 Ｈ
ｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ ３６７ 、５ｕｐｐ１． Ａｕｇ、１９８６ 、Ｓ
２８５、 Ａｂｓｉｒ、 ０５． ０１−５０） 。従ってＸａ因子を用いる方
法を一般的に適用することは不可能である。
また、（Ａｓｐ） ａ Ｌｙｓ −Ｘの配列においてＬｙｓとＸとの間の結合を
分解する酵素エンテロキナーゼの場合にも同様な制限を設けざるを得ない。Ｒ，
Ｍ、 Ｂｅｌａｇａｊｅ等（ＤＮＡユ、１２０．１９８４）は、確かに、前記配
列がＮ末端部分から遠く離れて存在する融合タンパク質から、エンテロキナーゼ
の天然基質であるトリプシノーゲンの場合と同様にこのエンテロキナーゼを用い
てヒト成長ホルモンを遊離した。しかしアルカリ性ホスファターゼき副腎皮質刺
戟ホルモンとが前記配列を介して結合された融合タンパク質をエンテロキナーゼ
で分解する実験は成功しなかった。
ＥＰ２０２９０には、相応の構造を有する融合タンパク質を分解するためにコラ
ゲナーゼの高い特異性を利用する方法が記載されている。コラゲナーゼは、Ｐｒ
ｏ−ＹＪ： １ｙ−Ｐｒｏの配列（Ｙは遺伝暗号の２０種のアミノ酸の任意のも
のであってよい）を認識し、ＹとＧａｙとの間の結合を分解する。前記配列を有
する融合タンパク質から、Ｎ末端部にざらにコラゲナーゼ配列から由来するアミ
ノ酸たるＧｌｙ及びＰｒｏを有するペプチドが遊離される。これらのアミノ酸は
、他の酵素、すなわちボストープロリンージペプチジルーアミノベプチダーゼ（
ＰＰＤＡ）を用いてジペプチドとして除去することができる。
ところで、Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ配列を有するペプチド及びタンパク質を
、クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃ１ｏｓ ｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏ
ｌｙｔｉｅｕｍ） （ＥＣ３，４，２４，３）からのコラゲナーゼであるクロス
トリジオペプチターゼＡで分解する実験によって、前記の反応順序を適用して融
合タンパク質を介してペプチドを製造することは極めて限定された程度でしか行
い得ないことが判明した。なるほど、Ｎ１丁ｏｅｐｅｒｔ等（第１４回ＦＥＢＳ
会議の報告、１９８１）は、比較的小さい、半合成的モデルペプチド、厳密言え
ば化合物：Ｃｂｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−インシュリンＡ
鎖（ウシ）が前記図式に従ってクロストリジオベプチターゼＡ及びＰＰＤＡと反
応し、期待された反応生成物が良好な収量で得られることを証明することができ
た。またＥ。
Ｗｕｅｎｓｃｈ等（Ｈｏｐｐａ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ。
３６２．１２８５−１２８７．１９８１）も、他のモデルペプチドの反応の場合
に同様な結果を得た。しかるに、Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ配列を宵する４１
１の天然タンパク質に関しては、２種のみにューロフインン■及びランカタラー
ゼ）がクロストリジオペプチターゼＡで特異的に分解され、この分解はまｔ；シ
スティン側鎖がＳ−スルホネートに変換した後のみであった。しかも酵素の比較
的大きい過剰でも、定量的反応は達成され得なかった（ Ｍ、 Ｔｏｅｐｅｒｔ
等、第１４回ＦＥＢＳ会議報告、１９８１）。
西独国特許出願第Ｐ３７３１８７５．６号明細書には、Ｅ、 ｃｏｌｉのアルカ
リ性ホスファターゼから得られる融合タンパク質を介して、副腎皮質刺戟ホルモ
ンを製造するための方法が記載されている。この場合にも、細菌タンパク質配列
と目標ペプチドとの間にテトラペプチド配列Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ （Ｙ
は遺伝暗号の２０種のアミノ酸の任意のものを表わす）を有する融合タンパク質
が、なるほど所定の位置でクロストリジオペプチターゼＡで特異的に分解されう
るけれども、反応速度が極めて低いことが判った。
Ｊ、 Ｇｅｒｍｉｎｏ及びり、 Ｂａ５ｔｉａ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８１．４６９２〜４６９６．．１９８４）は、Ｎ及びＣ末端部
の間の結合部分としてＰｒｏａ −２−コラーゲンからの約６０個のアミノ酸か
ら成る配列を有する融合タンパク質を製造した。このタンパク質は、コラゲナー
ゼによって相応のコラーゲン自体と同様ｊ二良好に分解された。しかし、該融合
タンパク質は約６０個のアミノ酸の配列内のどの位置で正確に分解されるのか判
らない。また、この配列の程度の差こそあれ大きい残分が、Ｃ末端分解生成物の
Ｎ末端部になお存在していることも判明した。従ってこの変法は、正確に規定さ
れｆ−Ｎ末端部を有するポリペプチドを製造するためには不適である。
発明の開示
本発明の本質は、式Ｉ：
Ｈ，Ｎ−Ｚ、−χ−（Ｐｒｏ−Ｙ−（、Ｉｙ）、−Ｐｒｏ−Ｚ、−ＣｏｏＨ（Ｉ
）［式中、ｎ ＞ ２であり、Ｘ及びＹは遺伝暗号によって決定される２０種
のアミノ酸の任意のものを表わし、２、は細菌のアミノ酸配列を表わし、２．は
遺伝暗号による任意のアミノ酸から成る目探ペプチドを表すすｊで示される融合
タンパク質から、アミノ酸配列−Ｘ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｓ−Ｐｒｏ−（こ
こでＸ及びＹは遺伝的にフード可能の７ｉ）酸の任意のものを表わし、ｎ〉２で
ある）の後に絖〈Ｃ末端タンパク質配列を、コラゲナーゼ及びポストプロリンジ
ベチジルアミノペグチダーゼ（ＰＰＤＡ）で酵素的に分離することを特徴とする
、目標ペプチドの製造方法にある。
まに本発明は、請求の範囲第１項から第６項までに記載の式■で示される融合タ
ンパク質及びその製造方法、式１で示される融合タンパク質をコードする遺伝子
構造、反復コラゲナーゼ切断位置のコドンを有し、従って式Ｉの融合タンパク質
の製造のために適当なプラスミド又は比較可能なベクター（例えばフフージベク
ター）に関する
細菌のアミノ酸配列２．としては、アルカリ性ホスファターゼ、アントラニル厳
シンテターゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコー
ル−アセチルトランスフェラーゼ等が該当する。
次の反応図式は、コラゲナーゼ及びポストプロリンージペプチジルーアミノベブ
チダーゼ（ＰＰＤＡ）による融合タンパク質の加水分解を説明する：細菌 ペプ
チド
ＮＨｘ−−−−−−−−−−−−−−Ｘ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）、−Ｐｒｏ
−−−−Ｃ００ＨＮＨ３−−−＝−−−−−−−−−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｙ＋（Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−Ｙ）ａ−＋タンパク質配列
ペプチド
＋ に１ｙ−Ｐｒｏ−−−−−−−−−−ＣＯＯＨＸ及びＹは遺伝暗号で決定さ
れる２０種のアミノ酸の任意のものを表わし、ｎは好ましくは２〜１０である。
融合タンパク質の新規分解方法の利点は、ヨーロッパ特許第２０２９０号記載の
方法と比べて、例えばクロストリジオペグチダーゼＡによる反応速度が数オーダ
ーも増大されうる点にある。コラゲナーゼの認識配列を反復形で含有する融合タ
ンパク質は、コラゲナーゼの単一の分解位置を有する相応の融合タンパク質より
もはるかに良好に分解されうる。
本発明による方法を説明するために、例１〜３で、コラゲナーゼによって分解可
能の配列を有する３種のモデルタンパク質の製造及び酵素的分解を記載する。
これらのタンパク質のアミノ酸配列を表１に総括しである。これらのタンパク質
は、大腸菌に１２株（Ｅ。
ｃｏｌｉ Ｋ ］ ２）からのプレホスファターゼ、つまり４７１個のアミノ酸
から成るアルカリ性ホスファターゼの生合成の中間生成物から誘導される。この
プレホスファターゼは、アミノ１１２２個のＮ末端のシグナル配列の分離によっ
て活性酵素・に変えられる。これに対して修飾されたホスファターゼの場合には
アミノ酸２２個のシグナル配列は注目すべき程度には分離されないアルカ５り性
ホスファターゼのアミノ酸配列（Ｒ，Ａ。
Ｂｒａｓｈａｖ 等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ Ｓ Ａ ８
１ ＊４６９２−４６９６．１９８１）及びＥ、 Ｃｏ１１ Ｋ １２からの
相応の遺伝子（ｐｈｏＡ）のヌクレオチド配列は公知である（Ｍ、 Ｓｉｍｏｎ
ｉｓ、 Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、 ＦｒｅｉｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ
Ｂｅｒｌｉｎ、 ｌ ９８３ ； Ｃ，Ｎ、 Ｃｈａｕｌ等。
Ｇｅｎｅ ４４．１２１〜１２５．１９８６）、まｔ： ７ ルカリ性ホフ７ア
ターゼをベースとする融合タンパク質の構成のために使用されうるベクターも記
載されている（ Ｗ、 Ｂｏｉｄｏ１等＋ Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 にｅｎｅｔ、
１８５ ＋ ５１０−５１２． ｌ ９３２； Ｗ、 Ｂｏｉｄｏｌ、 Ｄｉ
ｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ。
Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｂｅｒｌｉｎ、１９８４
） ａ ｐＳＢ９４の名称を有する、これらのプラスミドの１種から出発して、
試験管内の新しい結合及びＤＮＡクローニングの自体公知の方法（Ｔ、 Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ等、 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ、 Ｎ、 Ｙ、 、 ＵＳＡ、１９８２）を用いて、Ｅ、 ｃｏｌｉ宿主細
胞への導入後表１に記載したタンパク質の生合成をもたらす修飾ベクターを製造
した。このたメニｐＳＢ ４９上のｐｈｏ Ａ遺伝子の２つの位置に、つまりＮ
ｅｏ Ｉ−及びＳｐｈ Ｉ配列に、條飾遺伝子でコラゲナーゼによって認識され
うるアミノ酸配列のコドンを形成するオリゴヌクレオチドを導入した。第１図乃
至第４図には、ｐＳＢ９４及び同プラスミドから誘導されたプラスミドｐＳＡ３
０２、ｐＳＡｓ ０６及びｐＨ５４１３３の制限酵素切断地図を図示しである。
３種のモデルタンパク質とクロストリジオペブチダーゼＡとの反応の結果は、第
３８頁及び第３９頁ならびに表２に示しである。
第３８頁は、所期の分子量を有する分解生成物の形成、従って所定の位置におけ
る特異的分解を裏付けるゲル電気泳動分離を示す。
第３９頁には、生成物形成のインキュベーション時間及び使用酵素量に対する依
存関係を示しである。これらの曲線から得られた生成物形成速度（表２に総括さ
れている）は、二重切断位置（Ｈ５４１３３／ｌ）及び二重切断位置（Ｓ Ａ
５０６ ／ １ ）がコラゲナーゼＩ：対する反応能力を単一の切断位置（ＳＡ
３０２／１）と比べてどの程度高めるかを明らかにしている。
副腎皮質刺戟ホルモン及びそれから誘導されたペプチドの製造方法を対象とする
西独国特許出願第Ｐ３７３１８７５．６号明細書には、ホルモン配列が単−及び
反復コラゲナーゼ切断位置を介してＥ、 ｃｏｌｉからのアルカリ性ホス７７タ
ーゼの部分配列に結合された融合タンパク質が記載されている。この融合タンパ
ク質とクロストリジオペブチダーゼＡとを反応させる１；めの、同明細書に記載
された実験は、本発明で記載された結果を十分に保証している。表２には極めて
重要なＡＣＴＨ融合タンパク質の生成物形成速度も所載されている。単一コラゲ
ナーゼ切断位置をタンパク質（ＳＡ１８６／］）からは、ペプチドホルモンは不
完全にして、しかも実際の裂取的適用には不適当な条件下でしか遊離され得なか
ったのに、二重切断位置を有する相応のタンパク質（ＳＡ３４３／］）は、すで
に少な切断位置（ＳＡ３４１／１及び５Ａ３６０／１）ｔ−使用することによっ
て反応速度はさらに増大された。
ＡＣ丁Ｈ融合タンパク質５Ａ３４１／ｌの配列は表１に示しである。第３８頁の
ゲル電気泳動による分離は、５Ａ３４］／１とクロストリジオペブチダーゼＡと
の反応の生成物３種をバンドで示しである。
上記図式に相応するＰＰＤＡによる反応は、反復クラゲナーゼ切断位置を使用す
る場合には、反復切断位置内で、該ペプチドのＮ末端に最も近いＹ−Ｇｌｙ結合
も切断される場合のみ、Ｎ末端に正確なアミノ酸配列を有する標準ペプチドを形
成しうる。ゲル電気泳動法及びＨＰＬＣによる分析テストによって、反復フラゲ
ナーゼ切断位置を有する融合タンパク質からの分解生成物の異質性は認識されな
い。これは、クロストリジオペブチダーゼＡによる反応の際に反復配列のすべて
のｙ−ｃ＋ｙ結合が切断されることを示す。これは、西独国特許出！ｌＩ第Ｐ３
７３１８７５．６号明細書に記載されているように、５Ａ３４１／１からの相応
の分解生成物の例では、Ｎ末端の部分配列の決定によって証明された：エドマン
分解法はＧｌｙ −Ｐｒｏ −ＡＣＴＨの初めの７個のアミノ酸に関して予想さ
れＩ；配列を明らかにした。一つの反復配列内で初めの結合を切断することによ
って、他の切断位置が、露出及びより良好になる作用容易性によって、初めの切
断位置よりもはるかに迅速に反応するように活性化されることは明らかであり、
その結果不完全な切断による中間生成物は検出され得ない。
該方法の特異性は、反復コラゲナーゼ切断位置を使用することによって明らかに
高められ、偶然Ｐｒｏ −Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ配列を有するペプチドすら、この
配列の反応性が小さいためにここで使用される条件下で製造することができた。
従って該製造方法は、事際に任意のすべてのペプチドにとって適しており、ま！
；宿主系／ベクター系の選択に関しても及びは様な特異性を有する他のコラゲナ
ーゼ及びアミノペプチジル−ジペプチダーゼを使用する場合にも制限は存在しな
い。
本発明による方法はもちろんまた１段階でも、つまりコラゲナーゼ及びＰＰＤＡ
との同時反応の場合にも実施することができる。
プラスミドｐＢＲ３２２： ＵＳＡの Ｒｏｃｋｅｖｉｌｌｅ、 Ｍｄ。
在 Ａｍｅｒｉｃａｎ 丁ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ （
ＡＴＣＣ）で１９７９年７月１６日に寄託（ＡＴＣＣ４００１５）。
大腸ＷＳＢ４４：ゲッチンゲン在ＤｓＭ、ｒ１９７９年７月１６日に寄託１５Ｍ
１．６０６）。
大腸菌に１２野生型・ＤＳＭで１９７３年１１月２６日以来寄託（ＤＳＭ４９８
．）。
発明を実施するために最良の形態
例：
１、 ホス７アターゼタンパク質ＳＡ、３０２／１．ＳＡ５０６／Ｉ及びＨ５４
１３３／１の遺伝子を有する新組換えプラスミドの製造
前記３種のタンパク質の生合成を、適宜形質転換された細菌細胞において新組換
えプラスミドｐＳＡ ３０２、 ｐｓＡ ５０６及びｐＨ３４１３３によって決
定する。これらのプラスミドはベクタープラスミドｐＳＢ ９４から形成された
。ｐＳＢ ９４はプラスミドｐＳＢ ５３ （寄託番号ＡＴＣＣ４００２０で１
９７９年７月１６日に寄託）から公知方法（Ｌ Ｂｏｉｄｏｌ、 Ｄｉｓｓｅｒ
ｔａｔｉｏｎ。
Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｂｅｒｌｉｎ、１９８４
；また米国特許第４．３７５．５１４号明細書）により誘導したプラスミドｐＳ
Ｂ ９４の製造［Ｗ、 Ｂｏｉｄｏｌ、 Ｄｉｓｓｅｒ−ｔａｔｉｏｎ、 ＴＵ
−Ｂｅｒｌｉｎ Ｄ８３／、Ｆ Ｂ Ｉ ３． Ｎｒ、１５８（１９８４）］ニ
グラスミドｐＳＢ５３［ヨーロッパ特許第２３８８２号、ＡＴＣＣ４００２０（
１９７９年７月１６日）］から出発して、プラスミドｐＳＢ９４を次のように製
造したｐＳＢ５３ （２０５，ｃ＋９／ｍＭ）６０μｆｆ、反応緩衝液６０ｉｉ
Ｑ ＣトリスＨＣＩ ２０ ｍＮ、 ＭｇＣ１＊ ２０ ｍＷ、 ＮａＣ＋１５
０ｍＭ、 メルカプト玉タノール２０ｍＭ、 ｐＨ７−５）、ウシ血清アルブミ
ン（ｌ ｔａｇ／ｌｎＱ’） １８ ｉｔ Ｑ 、 ５ａＩ５μｇ％Ｘｈｏ１５
μｇ及び）１，０１２μ０かも成る反応混合物中でｐＳＢ５３−ＤＮＡを３７℃
で３時間インキュベートとした。制限エンドヌクレアーゼ５ａｌＩ 及［ｘｈＯ
ＩはＢｉｏｌａｂｓ社（Ｕ Ｓ Ａ）から取得しｔ；。
ｐＳＢ５３ （ゲル電気泳動により分子量を測定）を２２５５ｂｐ及び６４５４
ｂｐ（配列分析により分子量を測定）の断片に定量的に分解する反応条件を予備
試験で確定した・
両断片の分離は寒天ゲル電気泳動によって行なった６ ４５４ ｂｐ断片は、０
．７％寒天ゲルから電気溶離１：ヨッて単離し［丁、Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｅ、
Ｆｒ１ｔｓｅｈ、 ｊ。
Ｓ！＋ｏｂｒｏｃｋ； Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、１ ６４ １
６５ ＋Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ）ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂ−Ｎｅｗ Ｗｏｒｋ
（１９８２）］ 、リガーゼ溶液中で一本鎖の相補的５′−突出端を介して結
合して環状分子を形成した。Ｔ、リガーゼ（ＬＴＳＡ Ｂｉｏｌｐｂｓ製）との
りガーゼ反応は、トリスＨＣ１５０ｍＭ、 ｌＬｇｃＩ２１０ ｍＭ、ジチオト
レイトール２Ｃ１ｍＬ ウシ血清アルブミン５０μｇ／ｒｎＱ％ＡＴＰ １＋ｎ
Ａ （ｐＨ７，８）を含有する緩衝反応液中で行なった。リガーゼ溶液（容量１
００μＱ）を１３℃で１６時間インキュベートしｔ二。
反応をフェノール抽出によって停止し、エタノ−１ヲ用いる３回のエーテル抽出
によりＤＮＡを水相から沈殿させた。遠心分離後にＤＮＡａｍ殿物をＤＮＡ緩衝
液 ［ト リ ス ）ＩＣ＋ ４ ５＋ｏＭ％ ＥＤＴＡ Ｏ−１ｗＭ ％ ｐ
Ｈ７−９］５０μｇ中に溶かし、大腸ＷＳＢ４４株の適格細胞の形質転換のため
に使用した（適格細胞２００μｇ＋リガーゼ溶液からのＤＮＡ２５μＱ）。
適格細胞の製造及び形質転換条件はヨーロッパ特許第２３８８２号に記載された
方法及び条件と同様である。
得られた形質転換細胞（アンピシリン耐性細胞）からプラスミドＤＮＡを単離し
、側照分析によってプラスミドの構造を確認しｔ；。
第１図にはグラスミドｐｓＢ９４の制限酵素切断地図を図示しである（個々の制
限酵素配列の間の間隔には塩基対（Ｂｐ）が記載してあり、全塩基対は６４５４
個である）。該プラスミドはｐＢＲ３２２からのβ−ラクタマーゼの遺伝子（ア
ンピシリン耐性）及びＥ、 ｃｏｌｉＫ１２からのアルカリ性ホスファターゼの
遺伝子を有する。 ｐＳＡ３０２及びｐＳ＾５０６の製造のためには、相応のオ
リゴヌクレオチドを、ｐｈｏＡ遺伝子内に存在するｆｌｌ限エンドヌクレアーゼ
Ｎｅｏ １及びＳｐｌの認識配列中に導入した。次にｐｓＡ５０６から２７塩基
対のＰｓＬＩ断片を除去することによってｐＨ５４１３３を製造した、第２図乃
至第４図には３種の新組換えプラスミドの制限酵素切断地図を図示しである：
第２図について二アミノ酸部分配列上の２９７及び２９８アミノ酸はプレホスフ
ァターゼのアミノ酸の特性を示しており、タンパク質５Ａ３０２／ｌにおいては
これら２個のアミノ酸の間にさらに６個のアミノ酸が導入されている。
第３図について二アミノ酸部分配列上の４４７及び４４８アミノ酸はプレホスフ
ァターゼのアミノ酸の特性を示しており、タンパク質５Ａ５０６／ｌにおいては
、これらの２個のアミノ酸の間にさらに１５個のアミノ酸が導入されている。
第４図について二アミノ酸部分配列上の４４７及び４４８アミノ酸はプレホスフ
ァターゼのアミノ酸の特性を示しており、タンパク質）！５４１３３／１ではこ
れら２１′ｉ！１のアミノ酸の間にさらに６個のアミノ−が導入されている。
新組換えプラスミドの製造の場合には、ＤＮＡクローニングの文献公知の方法を
適用しｊ；。これらの方法は、Ｔ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ等によって（Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ。
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｒｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、 Ｎ、 Ｙ、 、 ＵＳＡ ［１９８２］ ）詳細
かつ総括的に記載された。宿主細胞としてはＥ、ｃｏｌｉ ５Ｂ４４株を使用す
る（ Ｗ、 Ｂｏｉｄｏｌ、 Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ。
Ｔｅｃｈｎｉｓｃｂｅ １Ｊｎｉｙｅｒｓｉｔａｅｔ Ｂｅｒｌｉｎ ｆ １９
８４ ］ ； Ｇ−５ｉｅＷｅｒｔ等、米国特許第４，３７５．５１４号［１９
８３］）。これは、広く普及されたクローリング株Ｅ。
ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ （ＤＳＭ１６０７の番号で１９７９年７月１６５に寄託
）のホスファターゼ員突然変異体（ｐｈｏＡ）である。
オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置 Specifically degrades genetically engineered fusion proteins using collagenase.
Background Art Genetic engineering has developed new methods for producing peptides and proteins that are far superior to traditional chemical synthesis methods, especially for relatively long amino acid sequences.
It was. For the first time, substances that were previously difficult to obtain, such as growth hormone, interferon and a number of peptide hormones, can be made available in sufficient quantities [E, A, O, Marston, Bioche+n, J, 240.1-12 (1986 )]. Genetic engineering methods for producing polypeptides include codons with the amino acid sequence to be produced.
It is based on the transfer of suitable deoxyribonucleic acid (DNA) into suitable host cells in a form that allows the replication and expression of the newly introduced genetic information. As host cells, small to medium sized peptides (less than about 100 amino acids) are
In this case, preferably bacteria such as Escherichia coli are used. By the way, polypeptides with sizes in the above range are protected by significant tertiary structure.
It has been found that the cells are extremely easily attacked by intracellular bacterial proteases. This fact makes it clear that the polypeptide to be produced is directly formed in the final form or optionally with an additional N-terminal methionine group (the so-called direct methionine group).
If controlled in such a way that it can lead to significant yield reductions or large losses of frozen soil synthesis products. In contrast, the desired amino acid sequence is first obtained from a much larger precursor molecule, the so-called fusion
When synthesized as a synthetic protein, it can be produced in good yields. Therefore, in order to produce small and medium-sized peptides, it is necessary to use bacterial genes that can be expressed well and are also as regulatable as possible and the DNA sequence of the peptides to be produced.
Hybrid genes are transferred from column 7 onto the plasmid vector by new ligation in vitro.
A variant consisting of forming genes becomes advantageous. The hybrid gene is
Bacterial regulatory elements (promoter, liposome binding site and terminator)
and the largest possible portion of the N-terminal amino acid codon of the bacterial gene product, followed by the new peptide codon and the termination codon. plasmid vector
After transfer of the protein into a suitable bacterial host cell, the hybrid gene is transformed into a fusion protein having an N-terminal part derived from the corresponding bacterial protein and a C-terminal part consisting of the amino acid sequence of the peptide to be produced. control the biosynthesis of
This fusion protein can be easily produced in large amounts and isolated by fermentation of transformed cells. A variety of bacterial genes may be used to form the hybrid gene, but preferably the enzymes are β-galactosidase, β-lactamase, anthranilate cycythetase, alkaline phosphatase, and enzymes.
The gene for loramphenicol-acetyltransferase was used. The final step in producing peptides by the method described above is the precise degradation of the fusion protein. To enable such degradation, the hybrid gene must be
The small and medium-sized peptides that need to be made such that there is an easily and selectively cleavable peptide bond between the bacterial portion of the initial fusion protein and the new peptide sequence to be produced. For engineering manufacturing, fusion
The development of specific methods for degrading proteins that are as widely applicable as possible has hitherto been a major problem that has not been solved satisfactorily. The object of the present invention is to obtain the desired peptide without leaving undesired extra amino acids at the N-terminus.
It is a universally applicable and specific method for degrading fusion proteins that provides the exact amino acid sequence of the compound. The first peptides produced by genetic engineering, e.g. 110.1979), the bromocyanine component was extracted from the corresponding fusion protein derived from β-galactosidase.
liberated by solution. Bromcyan consists of methionine and the atom at the next carboxyl position.
Minol [Net-X, in this case, X is fixed by the genetic code and consists of 7220 numbers.
selectively breaks down bonds between amino acids]. This method is of course only applicable to peptides that do not even have methionine. This is before
This also applies to the three types of peptides listed above. Similar limitations apply to all fusion protein components based on recognition of individual amino acids.
The solution method is recognized. Now, a fusion protein containing lysine, arginine or glutamic acid as the linkage between the N-terminal and C-terminal parts is produced. For this degradation, the enzymes trypsin (J, 5hine et al., Nature 285, 456-461.1980) and clostripain (A, D. Bennett et al., EPA Cz31363), both of which contain Lys-X and Arg- The endoproteinase Glu-C (A, D, Bennett et al., EPAO 131 363), which opens the bond between Glu- Similarly, endoproteins that specifically degrade after lysine
Lys-C (Chem, Hoppe-Seyler367.5upp1.Aug, l986, S-162, Abstr. +9.01.03) was also used. There is a way to cleave specific bonds within a precisely defined sequence of several amino acids.
If it were, it would be much more specific and therefore more broadly applicable. Therefore, P, R, 5zoka et al. (DNA5.l 1-20.1986)
A fusion protein in which subsequences from trannylate synthetase and orchid growth hormone are linked to each other via the Asp-Pro sequence is produced by Asp-Pro conjugation.
Since this compound is extremely acid-labile, we were able to successfully decompose it into the same components by applying acid. However, this method also prevents cleavage of other peptide bonds during the action of the acid as a side reaction.
In addition to the fact that the peptide must be taken into account as a
It has the disadvantage that it retains a proline at the N-terminus, which is often a disadvantage. A similar limit was found in the case of the reaction with renin, which was used to selectively cleave the bond between two leucine tethers within the sequence Pro-Phe-His-Leu-Leu -Val-Tyr of the fusion protein. (J, S. Boger et al., FPAO 163573), in which case an undesired extra three amino acids often remain. A fusion protein having an N-terminal portion consisting of 31 amino acids of the λcll protein.
To release human β-globin from protein, K, Nagai and H, C, Thgersen used factor
A plasma grotease that acts as a catalytic converter was used. Similarly, T, 1mai, etc. are fusion proteins with 9 additional N-terminal amino acids.
Enzyme IV was used to produce human prorenin via protein. In both cases, the transition between the N- and C-terminal portions is recognized by factor Xa.
For the bond of Arg-X (X is the first N*-terminal amino acid of the human protein)
There was a sequence + 1e-G 1u-G ly-Arg-X that was cleaved at. Factor Xa therefore appears to fulfill the essential requirements for an enzyme to be used for the degradation of the fusion protein. However, two cases have also been reported in which fusion proteins having the above recognition sequence cannot be degraded by factor .162, Abstr. 19, 01-03; H, Hlayer et al., Biol, Chem, H oppe-5eyler 367, 5upp1. Aug, 1986, S 285, Absir, 05.01-50). Therefore, it is better to use factor Xa.
It is impossible to apply the law generally. Furthermore, similar restrictions must be placed in the case of enterokinase, an enzyme that breaks down the bond between Lys and X in the (Asp)aLys-X sequence. R. M. Belagaje et al. (DNA U, 120.1984) certainly
Enterokinase was used to release human growth hormone from a fusion protein in which the sequence was located far from the N-terminal portion, as well as trypsinogen, the natural substrate of enterokinase. However, alkaline phosphatase
Experiments using enterokinase to degrade a fusion protein in which the terrestrial hormone was bound via the above sequence were not successful. EP 20290 includes a framework for disassembling fusion proteins with corresponding structures.
Methods have been described that take advantage of the high specificity of genease. Collagenase has the sequence Pro-YJ: 1y-Pro (Y can be any of the 20 amino acids in the genetic code).
) and decomposes the bond between Y and Gay. having the above array
The fusion protein contains an amino acid derived from the collagenase sequence at the N-terminus.
A peptide with the amino acids Gly and Pro is released. These amino acids can be removed as dipeptides using another enzyme, namely Vostoproline dipeptidyl aminobeptidase (PPDA). By the way, an experiment was conducted in which peptides and proteins having the Pro-Y-Gly-Pro sequence were degraded with clostridiopeptidase A, a collagenase from Clostridium histolytium (EC3, 4, 24, 3). By applying the reaction sequence described above, the melting
The production of peptides via conjugation is only possible to a very limited extent.
It turned out to be impossible. Indeed, N1choepert et al. (Report of the 14th FEBS Conference, 1981) proposed a relatively small, semi-synthetic model peptide, strictly speaking, a compound: Cbo-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Insulin A chain ( bovine) reacts with clostridiobeptidase A and PPDA according to the above scheme.
Accordingly, we were able to prove that the expected reaction product could be obtained in good yield. E again. Wuensch et al. (Hoppa-Seyler's Z, Physiol, Chem. 362.1285-1287.1981) also obtained similar results in the case of reactions with other model peptides. However, regarding the 411 natural proteins that contain the Pro-Y-Gly-Pro sequence, only two species include eurofine and lankathalar.
is specifically degraded by clostridiopeptidase A, and this degradation is also
Only after the Stain side chain was converted to S-sulfonate. Moreover, even with relatively large excesses of enzyme, quantitative reactions could not be achieved (M. Toepert et al., 14th FEBS Conference Report, 1981). West German Patent Application No. P3731875.6 discloses that E. coli alkaline
adrenocortical stimulant hormone via a fusion protein derived from phosphatase
A method is described for producing a ton. In this case as well, a fusion protein having the tetrapeptide sequence Pro-Y-Gly-Pro (Y represents any one of the 20 amino acids of the genetic code) between the bacterial protein sequence and the target peptide is clearly a predetermined protein. Can be specifically degraded by clostridiopeptidase A at the position
However, the reaction rate was found to be extremely low. J. Germino et al., Ba5tia (Proc, Natl., Acad. Sci, USA 81.4692-4696..1984) uses approximately 60 molecules from Proa-2-collagen as the linking moiety between the N- and C-termini. Amino acids of
A fusion protein having a sequence consisting of the following was produced. This protein is collagener
Like the corresponding collagen itself, it was successfully degraded by the enzymes. However, it is unclear exactly where within the approximately 60 amino acid sequence this fusion protein is degraded.
No. It was also found that more or less large residues of this sequence still exist at the N-terminus of the C-terminal degradation product. This variant is therefore precisely defined.
It is unsuitable for producing polypeptides having an f-N terminus. DISCLOSURE OF THE INVENTION The essence of the invention resides in the formula I: , X and Y represent any of the 20 amino acids determined by the genetic code, 2 represents the bacterial amino acid sequence, and 2. The amino acid sequence -X-(Pro-Y-Gly)s-Pro-(this
where X and Y represent any of the genetically foodable 7i) acids, n>2) followed by the C-terminal protein sequence, collagenase and post-proline di-vetidylaminopegtidase ( A method for producing a target peptide, characterized by enzymatic separation using PPDA). The present invention also provides a fusion tag represented by the formulas recited in claims 1 to 6.
Proteins and methods for their production, the gene structure encoding the fusion protein of formula 1, a plasmid or a comparable vector ( For example, Huhuzibek
2. Bacterial amino acid sequences related to These include alkaline phosphatase, anthranyl synthetase, β-lactamase, β-galactosidase, and chloramphenicol.
This includes acetyltransferase and the like. The following reaction scheme shows collagenase and post-proline di-peptidyl-aminobeb.
Describe the hydrolysis of fusion proteins by titase (PPDA): Bacterial PEP
Tido NHx------------X-(Pro-Y-Gly), -Pro----C00HNH3---=----- Y+ (Gly -Pro-Y)a-+ Protein sequence Peptide + to 1y-Pro--COOHX and Y are determined by genetic code.
represents any one of the 20 types of amino acids, and n is preferably 2 to 10. The advantage of the new method for degrading fusion proteins is that, compared to the method described in European Patent No. 20290, the reaction rate with clostridiopegtidase A is several orders of magnitude faster.
- is also at the point where it can be increased. A fusion tag containing the recognition sequence of collagenase in repeated form.
Proteins can be degraded much better than corresponding fusion proteins with a single degradation site of collagenase. In order to illustrate the method according to the invention, in Examples 1 to 3,
The production and enzymatic degradation of three model proteins with functional sequences are described. The amino acid sequences of these proteins are summarized in Table 1. These proteins are derived from the biosynthetic intermediate of prephosphatase, an alkaline phosphatase consisting of 471 amino acids, from E. coli K]2. This prephosphatase is produced by the separation of an N-terminal signal sequence of 1122 amino acids.
can be converted into active enzymes. In contrast, in the case of modified phosphatases, the 22-amino acid signal sequence is not separated to a remarkable degree. , USA 81 *4692-4696.1981) and the nucleotide sequence of the corresponding gene (phoA) from E. Co11 K12 is known (M. Simonis, Dissertation, Freie Universitat Berlin, 1981). 3; C, N., Chaul et al. Gene 44.121-125.1986), 7.
Vectors that can be used for the construction of fusion proteins based on
(W, Boido1 et al. These plasmids, bearing the name SB94, Starting from one species, new conjugations in vitro and methods known per se for DNA cloning (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., US A, 1982) and E. coli host cells.
Modified vectors were produced that, after introduction into cells, led to the biosynthesis of the proteins listed in Table 1. In addition, oligonucleotides forming codons for amino acid sequences that can be recognized by collagenase in the conditioning genes were introduced into two positions of the pho A gene on pSB49, ie, at the Neo I- and Sph I sequences. Figure 1
FIG. 4 shows restriction enzyme cleavage maps of pSB94 and plasmids pSA302, pSAs06 and pH54133 derived from the same plasmid. The results of the reaction between three model proteins and clostridiopebutidase A are shown on pages 38 and 39 and in Table 2. Page 38 describes the formation of a decomposition product with a desired molecular weight and thus in a given position.
Figure 2 shows gel electrophoretic separation confirming specific degradation. Page 39 describes the dependence of product formation on incubation time and amount of enzyme used.
It shows the existing relationship. The product formation rates obtained from these curves (summarized in Table 2)
compared to the single cleavage position (SA 302/1), It is clear whether the level will be increased. West German Patent Application No. P3731875.6, which is directed to a process for the production of adrenocorticotropic hormone and peptides derived therefrom, discloses that the hormone sequence is an alkaline compound from E. coli via single and repeated collagenase cleavage sites. Hoss 77ta
Fusion proteins linked to subsequences of the enzyme have been described. This fusion Tampa
The experiments described in the same specification for reacting clostridiopebutidase A with clostridiopebutidase A fully guarantee the results described in the present invention. Table 2 also lists the critical ACTH fusion protein product formation rates. single collage
If the enzyme cleavage site is from the protein (SA186/), the peptide hormone will be incomplete and can only be released under conditions unsuitable for actual cleaving applications.
However, the corresponding protein with a double cleavage site (SA343/) has already been
By using fewer cutting positions (SA341/1 and 5A360/1)
The reaction rate was further increased. The sequence of AC Ding H fusion protein 5A341/l is shown in Table 1. The separation by gel electrophoresis on page 38 shows three bands of products of the reaction between 5A34]/1 and clostridiopebutidase A. A reaction with PPDA corresponding to the above scheme uses repeated clagenase cleavage sites.
If the Y-Gly bond closest to the N-terminus of the peptide is also cleaved within the repeated cleavage position, a standard peptide with the correct amino acid sequence at the N-terminus is formed.
It can be done. Repeated flagging was performed by gel electrophoresis and HPLC analytical testing.
The heterogeneity of degradation products from fusion proteins with enzyme cleavage sites is not recognized.
stomach. This indicates that upon reaction with clostridiopebutidase A, all y-c+y bonds of the repeat sequence are cleaved. This is a West German patent! In the example of the corresponding degradation products from 5A341/1, as described in II No. P3 731875.6, the Edman degradation method was demonstrated by determination of the N-terminal partial sequence. - predicted for the first 7 amino acids of ACTH
I: The sequence was revealed. by breaking the first bond within a repeat sequence.
Therefore, the other cutting positions can be compared to the first one with better exposure and ease of operation.
It is clear that the cleavage position is activated to react much more rapidly than the cleavage position, so that intermediate products due to incomplete cleavage cannot be detected. The specificity of the method is clearly enhanced by the use of repeated collagenase cleavage sites, and even peptides that happen to have a Pro-X-Gly-Pro sequence can be easily detected under the conditions used here due to the low reactivity of this sequence. could be manufactured below. The production method is therefore suitable for virtually any peptide, and! ; other collagens with different specificities also regarding the choice of host system/vector system.
There are also no restrictions when using aminopeptidyl-dipeptidases and aminopeptidyl-dipeptidases.
stomach. The method according to the invention can of course also be carried out in one step, ie in the case of simultaneous reaction with collagenase and PPDA. Plasmid pBR322: Rockeville, Md. USA. Deposited with the American Culture Collection (ATCC) on July 16, 1979 (ATCC 40015). Colon WSB44: DsM, Göttingen, r15M 1.606, deposited on July 16, 1979). Deposited since November 26, 1973 in E. coli with 12 wild type DSM (DSM498.). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Examples: 1. Phos-7 atase protein SA, 302/1. Production of a new recombinant plasmid carrying the genes of SA506/I and H54 133/1 The biosynthesis of the above three proteins was carried out by the new recombinant plasmid in appropriately transformed bacterial cells.
plasmids pSA 302, psA 506 and pH34133.
Set. These plasmids were formed from vector plasmid pSB94. pSB 94 is plasmid pSB 53 (deposit number ATCC 40020).
Production of plasmid pS B 94 [W, deposited on July 16, 1979] by known methods (L Boidol, Dissertation. Technische Universitaet Berlin, 1984; also U.S. Pat. No. 4,375,514). Boidol, Disser-tation, TU-Berlin D83/, F B I 3. Nr, 158 (1984)]
Starting from Grasmid pSB53 [European Patent No. 23882, ATCC 40020 (July 16, 1979)], plasmid pSB94 was constructed as follows.
pSB53 (205, c+9/mM) 60μff, reaction buffer 60ii QC Tris HCI 20 mN, MgCl* 20 mW, NaC+15 0mM, mercaptotanol 20mM, pH 7-5), bovine serum albumin.
pSB53-DNA was incubated at 37°C for 3 hours in a reaction mixture consisting of 18 it Q, 5aI 5μg% Restriction endonucleases 5alI and [xhOI were obtained from Biolabs (USA); The reaction conditions for quantitatively decomposing pSB53 (molecular weight measured by gel electrophoresis) into fragments of 2255 bp and 6454 bp (molecular weight measured by sequence analysis) were established through preliminary tests.・Separation of both fragments was performed by agar gel electrophoresis. The 6454 bp fragment obtained was 0. Electroelution 1: Isolation from 7% agar gel [Ding, Maniatis, E, Frltseh, J. S! +obrock; Molecular Cloning, 164 165 +Colid Spring) Labor Lab-New Work (1982)], ligation via the complementary 5'-overhang of the single strand in ligase solution.
together to form a cyclic molecule. T, with ligase (manufactured by LTSA Biolpbs)
The ligase reaction was carried out using 150 mM Tris HC, 210 mM HLgcI, and dithiotide.
The reaction was carried out in a buffer reaction solution containing 1 mL of Reitol 2C and 50 μg of bovine serum albumin/rnQ% ATP 1+n A (pH 7, 8). The ligase solution (volume 100 μQ) was incubated at 13°C for 16 hours. The reaction was stopped by phenol extraction and the DNA was precipitated from the aqueous phase by three ether extractions using ethanol-1. After centrifugation, the DNAam precipitate was dissolved in 50 μg of DNA buffer [Tris) IC+45+oM% EDTA O-1wM% pH7-9] and used for transformation of competent cells of colon WSB44 strain ( 200 μg cells + 25 μQ DNA from ligase solution). The production of qualified cells and transformation conditions are similar to the methods and conditions described in European Patent No. 23882. Plasmid DNA was isolated from the obtained transformed cells (ampicillin-resistant cells), and the structure of the plasmid was confirmed by side-light analysis. Figure 1 shows the restriction enzyme cleavage map of Grasmid psB94 (individual restriction
Base pairs (Bp) are written in the spaces between the restriction enzyme sequences, and the total base pairs are 6454). The plasmid contains the β-lactamase gene (A) from pBR322.
ampicillin resistance) and the gene for alkaline phosphatase from E. coli K12. For the production of pSA302 and pS^506, corresponding optics are required.
Ligonucleotides were introduced into the recognition sequences of the fll restriction endonucleases Neo 1 and Spl, which are present within the phoA gene. pH54133 was then produced by removing the 27 base pair PsLI fragment from psA506, Figure 2.
Figure 4 shows the restriction enzyme cleavage maps of the three new recombinant plasmids: Regarding Figure 2, amino acids 297 and 298 on the two amino acid partial sequences are prephosph.
In protein 5A302/l, six additional amino acids are introduced between these two amino acids. Regarding Figure 3, amino acids 447 and 448 on the two amino acid partial sequences are prephosph
In protein 5A506/1, 15 additional amino acids are introduced between these two amino acids. Regarding Figure 4, amino acids 447 and 448 on the two amino acid partial sequences are prephosph
Shows the amino acid properties of atase, protein )! In 54133/1 this
21'i! Six additional amino acids have been introduced between one amino acid. For the production of new recombinant plasmids, methods known in the literature for DNA cloning are applied. These methods have been described in detail and comprehensively by T. Maniatis et al. (Molecular Cloning. Colorado Spring Harbor Laboratory, Colorado Spring Harbor, N.Y., USA [1982]). E. coli strain 5B44 was used as the host cell.
(W, Boidol, Dissertation. Techniscbe 1Jniyersitaet Berlin f 1984]; G-5ieWert et al., U.S. Pat. No. 4,375.514 [1983]). This is the widely popular crawling strain E. The phosphatase member mutant (phoA) of E. coli HBIOI (deposited July 165, 1979 under number DSM 1607). Oligonucleotides are an automatic DNA synthesizer
【Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍ社（８５０ＬｉｎｃｏＩｎ ＣｅｎｔｅｒＤｒｉｖｅ、 Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ
１ｔｙ、 Ｃａ１ｉｆ、 ９４４０４ 、 Ｕ Ｓ Ａ ）製３８１Ａ型］によ
って装置メーカーの指示に従って合成し、ゲル電気泳動によって精製した。
ＤＮＡの配列決定は、−木調ファージベクターＭ１３＋＋＋ｐ１８及びＭ １３
ｍｐｌ ９ （Ｃ，Ｙａｎｉｓｅｈ −Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅｎｅ３３．１０
３−１１９ Ｎ９８５］）を使用してジデソキシ法（Ｆ、 Ｓａｎｇｅｒ等、
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ｔＪｓＡ ７４．５４６３−５４６７ ［１９７７］）によ
り行なった。前記ファージベクターは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ （Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ ）、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ −Ｌ Ｋ Ｂ Ｇｍｂ）ｌ及び他の多くの提
供者から入手できる。
放射性標識のためには、デソキシアデノンン−５−［ａ −３＆ ｓ ］ チオ
トリホスフェートを使用した（ ｌｉｌ、Ｄ。
ＢｉｇＨｉｎ等、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａ４． Ｓｃｉ、 Ｕ Ｓ
Ａ −８０＋３９６３−３９６５ ［９８３］ ）。
制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ 、 ＰｓｔＩ 、 ５ｐｈｌ及びＨａｅ
ｍならびにＤＮＡリガーゼ（７４）ｉ：ｔ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ （Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）社から入手した。ＮｃｏＩはＮｅｖｉ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ Ｇｍｂ）ｌ （６２３１５ｃｈｖａｌｂａｃｈ ）から、ポリヌクレオチ
ド−キナーゼ（Ｔ４）はＰｈａｒｍａｃｉａ／Ｐ−Ｌ （７８００Ｆｒｅｉｂｕ
ｒｇ ｉ、 Ｂｒ、）から入手した。
１．１ ｐＳＡ３０２の製造
プラスミドｐＳＢ９４を制限エンドヌクレアーゼＮｅｏ Ｔで線状化した。その
ために、プラスミドＤＮＡ１４μ９及び反応緩衝液（トリスＨＣＩ ５０ ｍＭ
、 ＭｇＣｌ２１０ ｍＭ、 ＮａＣｌ２１００ ｍＭ、ジチオトレイトール１
ｍＭ、 ｐＨ７，５） ５０ ｐ （ｌ中のＮｃｏｌ １７単位を含有する反応
混合物を３７℃で７時間インキュベートした。反応混合物を）二ノールで抽出し
た後エタノールでＤＮＡを沈殿し、乾燥し、ＴＥ緩衝液（トリスＨＣｌ４５ ｍ
＆ｉ、 ＥＤＴＡＩ ｉＭ、 ｐＨ７，５）中で溶かした。
５’ −ＯＨ基で加リン酸分解さねなかった２種の１８ｆｆｌｅｒ合成オリゴヌ
クレオチド：５ ’ −ＣＡＴ ＧＧＣＣＣＴ にＣＡ ＧにＡ ＣＣＣ−３’
５ ’ −ＣＡＴＧ ＧＧＧ 丁ＣＣＴＧＣＡＧＧ にＣ−３’各１μｇを水性
溶液中で混合し、３７℃で１５分前保温した。次に両オリゴヌクレオチドを、線
状化されたｐＳＢ９４ ３−５μ９及びリガーゼ反応緩衝液（トリスＨＣＩ ２
０ ＋ｎＭ、 ＭｇＣＬ １０ ｍ１ｌＩ、ジチオユリトリット１０＋ｎｌＪ、
ＡＴＰ’０．６ｍＭ、ｐＨ７，６） ５０ｐＯ中（’）ＤＮＡリガーゼ４単位と
２０℃で２．５時間反応させた。ＤＮＡを前記のようにフェノール抽出及びエタ
ノール沈殿ｔ：よって後処理し、Ｅ、 ｃｏｌｉ ＳＢ４４株の形質転換のため
に使用した。適格細胞の製造及び形質転換を賢。
Ｄａｇｅｒｔ及びＳ、 Ｄ、 Ｅｈｒｌｉｃｈの方法（Ｇｅｎｅ ６．２３−２
８Ｎ９７９］）により行なった。
形質転換細胞を塗布して単一コロニーを形成させた。前記オリゴヌクレオチド配
列を有するプラスミドＤＮＡを含むコロニーをコロニーハイブリッド形成によっ
て同定した。コロニーハイブリッド形成は、Ｔ。
Ｍａｎｉａ【ｉｓ等（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇｌ（ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ’、 Ｎ 、Ｙ 、 。
ＵＳＡ ［９８２］ ）によって記載された基礎記録に従ってＪ、 Ｐ、 ’Ｇ
ｅｒｇｅｎ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ヱ ２１１５’
−２１３６［１９７９］）によって記載された変法で実施した。放射性ハイブリ
ッド形成試薬としては、γＰ ”−Ａ Ｔ Ｐ及びポリヌクレオチドキナーゼ（
Ｔ、）との反応によって予め５′＝ｐ＄２−ホスフェートで標識された前記オリ
ゴヌクレオチドを使用した。
正のクローンの新組換えプラスミドにおいて、１８塩基対の合成Ｎｃｏｌ断片の
定位を制限分析によって確認した。このためにプラスミドＤＮＡを標準方法によ
り単離し、制限エンドヌクレアーゼＨａｅＤＴと反応させた。生成された断片混
合物をゲル電気泳動によって分析した（８％ポリアクリルアミドゲル中のＨａｅ
ｍ切断ＰＢＲ３２２との比較によって分子量を測定）。
１８塩基対の合成断片の組込みのために使用したＮｃｏ Ｉ切断位置は、ｐＳＢ
９４の３８５塩基対のＨａｅ ｍ断片上に局在している。この断片は新組換えプ
ラスミドにおいては欠けていて、２側の新しい断片と交換されていなければなら
ない。それというのも１８塩基対断片はＨａｅ ｍ配列さえ有しているからであ
る。２個の新しい断片の大きさは、１８塩基対の断片の定位に依存している：第
２図に図示した所望の定位の場合Ｉ：は３４２塩基対及び６１塩基対の断片が期
待されるし、他方逆の定位は３３０塩基対及び７３塩基対の断片を与える。両定
位を有する数個のプラスミドが見出された。第２図に図示したｐＳＡ３０２は所
望の定位を有するプラスミドの１つである。
クロニーングによって導入された合成りＮＡを含む、’ ｐＳＡ３０２からの塩
基対３４９のＥｃｏＲＩ断片を、配列決定ベクターＭ１３ｍｐ１９にクローニン
グシ、前記のように配列決定しＩ；。第２図に図示した、両ＥｃｏＲ１切断位置
の間のｐＳＡ３０２の部分配列は完全に立証された。
１．２ ｐＳＡ５０６の製造
この製造もｐＳＡ３０２の製造と同様に行なった。 ｐＳＢ９４を’＃Ｉ＠エン
ドヌクレアーゼｓｐｈ Ｉで線状化した。
反応条件及び後処理はｐＳＡ３０２に関して記載したとおりである。
２個の４５ｍａｒオリゴヌオリゴヌクレオチド配列ＴＣＣＴＧＣＡＧ（、ＣＣＣ
ＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣ丁ＧＣＡＧＧＴＣＣＧＣＡＴＧ−３′
及び
５ ’ −ＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡ ＣＣＣＧＣＣＧＧ
ＧＣＣＴ ＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧ−３′
を、ｐＳＡ３０２の場合に記載したのと同一の条件下でＳｐｈ Ｉ線状化ｐＳＢ
９４及びＤＮＡリガーゼと反応させて後処理したａ Ｅ、 ｃｏｌｉ ＳＢ４４
の形質変転後に正のコロニーを、Ｐ３″末端標識４５ｍｅｒオリゴヌクレオチド
によるコロニーハイブリッド形成によって同定しｔ；。
このようにして得られた新組換えプラスミドは、２個の４５ｍｅｒオリゴヌクレ
オチドから形成されｆ；Ｄ Ｎへ部分の片側にのみ完全なＳｐｈ Ｉ配列を有す
る。これは請求められたプラスミドにおいて次に位置するＥｃｏＲＩ配列（第３
図参照）から２５７塩基対の距離を有し、他方この距離は逆定位のプラスミドに
おいてはｐＳＢ９４の場合と全く同じように僅かに２１２塩基を有する。
新組換えプラスミドと制限配列ＥｃｏＲＩ及びｓｐｈ Ｉとの反応によって得ら
れたＤＮＡ断片の、ゲル電気泳動による大きさ決定によって、ｐｓＡｓ ０６が
合成りＮＡ断片の所望の定位を有するプラスミドの１つであることが判った。第
３図で示した配列を立証するために、２５７塩基対のＥｃｏＲＩ ／ Ｓｐｈ
Ｉ断片を配列決定ベクターにクローリングし、配拘決定した。
１．３ ｐＨ５４１３３の製造
プラスミドｐＳＡ５０６のＤＮＡ３μ９と反応緩衝液（１，１と同様）５０μａ
中の制＠酵素Ｐｓｔｌの５単位とから成る反応混合物を、３７℃で２時間インキ
ュベートし、例１．１で記載したように後処理した。これによって１％寒天ゲル
における電気泳動によって相互に分離された３個のＤＮＡ断片（２７塩基対、２
４２０塩基対及び４００７塩基対）が生じた。２（１の大きい方の断片を電気溶
離によってゲルから単離し、精製し、例１．１と同様の反応条件下でＤＮＡリガ
ーゼ（Ｔ４）と反応させ、後処理し、Ｅ、ｃｏｌｉＳＢ４４の形質転換のため１
：使用した。若干のアンピシリン耐性クローンからプラスミドＤＮＡを単離した
。その中の１つがｐＨ５４１３３であって、その制限酵素切断地図は第４図に示
しである。ｐＨ５４１３３は、ｐＳＡ５０６から、２５７塩基対のＥｃｏＲＩ
／ Ｓｐｈ Ｉ断片の２３０塩基対への太きさの低減をもたらす欠失によって誘
導される。この断片を例１．２と同様にＭ１３ｍｐ１ｇにクローニンクシ、配列
決定した。これによって第４図で示したヌクレオチド配列が立証された。
２、 タンパク質５Ａ３０２／１．５Ａ５０６／ｌ及びＨ３４１３３／ｌの製造
前記３種のタンパク質は例１で記載した株：Ｅ、 ｃｏｌｉ Ｓ Ｂ ４４ （
ｐＳＡ３０２）、Ｅ、 ｃｏｌｉ ＳＢ４４ （ｐＳＡ５０６） 及びＥ、 ｃ
ｏ目 ＳＢ４４ （ｐＨＳ４１３３）の発酵によって得られた。それらの生合成
は、アルカリ性ホスファターゼの生合成と同様にして調節する。
該生合成は無機ホスフェートによって再開始され、逆にホス７工−ト不足の培地
では誘導される（ Ａ。
Ｔｏｒｒｉａｎｉ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ ３８ ｅ
４６０− ’４６９ ［１９６０］ ）。
ホス７７ターゼ誘導体の同定のためｌこは、就中Ｈ８Ｔｏｗｂｉｎ等による抗原
プロット検出法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７６、４３５０ ４３５４ ［１９７９］）を
適用した。このために必要な抗血清は、標準条件（Ｄ、 Ｌ Ｗｅｉｒ、 Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 Ｖｏ
ｌ、 ｎｉ 、 Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌ。
０ｘｆｏｒｄ １９７８ ）下で精製されたＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２度アルカ
リ性ホスフェートでウサギを免疫することによって製造しｔ：。免疫のために使
用したホスフェートは１公知法（Ａ、丁ｏｒｒｉａｎｉ ： ’ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ７’ 、Ｖｏｌ、ｎｌＢ、２ １ ２ ２ １ ８
． Ｌ。
Ｇｒｏｓｓｍａｎ、Ｋ、Ｍｏ１ｄａｖｅ （Ｅｄｓ、）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ
ｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ ［１９６８］ ）により単離した。第二抗体としては
、指標酵素としてアルカリ性ホスファターゼが結合されたウサギＩｇＧに対する
ヤギの抗血清を用いた（Ｃｏｏｐｅｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｅａｌ Ｉｎｃ、、 Ｍ
ａｌｖｅｒｎ、 Ｕ Ｓ Ａ ） ｅ呈色試薬としては５−ブロム−４−クロル
−３−１ン）’！Ｊルホスフェートを使用した。
３種のタンパク質及びこれらのタンパク質が生産される前記３種の菌株は、すべ
での同じ発酵法及び単離法に関して適用されうるように相互を二類似している。
２．１ 発酵
付加的にインピシリン１００μｇ／＋ａＱを含有するし一培地（、Ｅ、 Ｓ、
Ｌｅｎａｏｘ 、 Ｖｉｒｏｉｏｇｙ上、１９０−２０６ Ｅｌ ９５５］ ）
２ｏｍｕ：、単一””二−ヲ接種Ｌ、３７℃で２４時間振盪し、次１：同−培
地８００＋ｍＱ中に移し、これをさらに３７℃で１６時間振盪した。この予備培
地を、低ホスフエート培地（Ｋ、Ｋｒｅｕｚｅｒ等によるＬＰ培地： Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ １３ユ、、４５９−４６８［１９７５］ ）９．２Ｑがその中に存在
する２０１２ガラス発酵檀に移した。発酵槽を３７℃で、１０ｆｆ／ｗｉｎの通
気（２２０＋ｎ１ｎ）下で６時間撹拌した。次に流動遠心分離機で細胞を得た。
約３０ｇの湿潤細胞物質が得られた。
２．２ 増量されたタンパク質抽出物の単離２．１からの湿潤細胞３０ｇを分解
緩衝液（トリスＨＣｌ５０ｍＭ、 ＮａＣ１ｌ ６０ｍＭ、 ｐＨ８−０） ４
００ｙａＱ中で懸濁した。フェニルメチルスルホニルフルオリド（最終濃度１０
ｍＭ）及びＤＮＡ５ｅ（ウシ膵臓からのＤ Ｎ Ａ ｓｅｌ 、 Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ／ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、純度１：１０ｐｙ／９湿潤細胞）を加えた後
、該懸濁液を低温室（４℃）において細胞ホモジナイザー（Ｍａｎｔｏｎ −Ｇ
ａｕｌｉｎ）で圧力６５０〜７００ｋｙ／ｃｔｎ”（１００００Ｐｓｉ）で分解
した。分解を２回反復し、各通過後に懸濁液を水中で冷却した。不溶細胞成分を
遠心分離によって分離しく１１００００ｘ及び４℃で２０分）、分解緩衝液で２
回洗浄し、トリスＨＣ１５０ｍＭ（ｐＨ８，０） ／尿素８Ｍ（６０ｗＱ）中に
溶かした。この溶液から遠心分離によって不溶成分を除去し、勾配クロマトグラ
フィーによるさらなる精製まで水中に保管した。
２．３ ホスファターゼ誘導体の同定
２．２で得られｔ：タンパク質抽出物の尿素緩衝液中の主要タンパク質成分（約
５０〜７０％）がその都度ホスファターゼ誘導体である。タンパク質混合物を、
標準条件（Ｌｌ、 Ｋ、 Ｌａａｎ＋ｍｌｉ 、 Ｎａｔｕｒｅ ２２７ 、６
８０−６８５ ［９７０］ ）下？５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動
することによって分離した後、相応のタンパク質バンドを次の基準により同定し
た：ａ）タンパク質混合物の最も太いバンドは表１で記載したアミノ酸配列に相
応する分子量を有する。
ｂ） このタンパク質はホスフェートによって再開始可能である、つまり細胞を
２．１で記載したように、しかし１０倍のホスフェート濃度で発酵した場合には
該バンドは現われない。
Ｃ）該バンドはプラスミド特異的であって、２．１と同じ条件下で製造されＩ；
、プラスミドを含まないＥ。
ｃｏｌｉｓ８４４株の細胞では現われない。
ｄ）該バンドは、抗原プロット検出法では特異的にＥ、 ｃｏｌｉ Ｋ １２産
精製アルカリ性ホスフアターゼに対する抗血清と反応する。
探準タンパク質混合物（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製低分子量タンパク質）を用いる
ゲル電気泳動分子量測定から、ホスファターゼ誘導体が所謂前駆形で存在する、
つまりさらにアルカリ性ホスファターゼのシグナル配列も有することが認められ
る。該タンパク質は希薄緩衝液中では比較的難溶である。従って細胞分解及び遠
心分離後に得られる上澄みでは僅少量しか検出することができない。
２．４ ホスファターゼ誘導体の精製
２．２で得られたタンパク質抽出物を分離して、中圧クロマトグラフィー装置（
ＦＰＬＣ） （スウェーデン国つプサラ在Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いる勾配
クロマトグラフィーによって修飾ホスファターゼをさらに精製する。
前記メイ力−のアニオン交換カラム（Ｍｏｎｏ Ｑ −ＨＲ５１５型）を、緩衝
液Ａ（１−リスＨＣＩ ５０ ＋ｎＭ、尿素８Ｍ、Ｉ））１８．０）で平衡化し
、２．１からのタンパク（質溶液を負荷し、最後に緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（）リス
ＭＣｌ５０ ｍＭ、 ＮａＣ１ｌ Ｍ 、尿素８Ｍ、ｐＨ８，０）から形成され
る、ＮａＣｌ Ｏ−２００ｍ１Ｊの勾配を用いて、ｌ−０，ｆｌ／ｍｉｎの流量
で溶出を行なった。全勾配容量は２０ｒｎＱであり、１ｒｎＱのフラクションづ
つ集めｔ；。
溶出液の２８０ｎｌｌｌでの吸光を流量プロットメーターで記録した。＠々のフ
ラクションのタンパク質組成は５ＤＳ−ポリアクリルアミドーゲ・ルミ気泳動に
よって分析した。ホスファターゼ誘導体は５０〜７０ｍＭのＮａＣｌで溶出され
た。相応のフラクションを精製し、４００倍の容積の緩衝液（トリスＨＣ１５０
ｍＭ、 ＮａＣ１１５０ｍＭ、 ｐＨ８，０）に対して透析した。この条件下で
該タンパク質は溶解しており、この形で次のコラゲナーゼ分解のｔ：めに使用し
た。ホスファターゼ製剤の純度を５ＤＳ−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動に
よってコントロールした（第３８頁、バンド４，６及８参照）。同純度は９０％
よりも高かった。タンパク質分はＷ、 Ｓｃｈａｆｆｍｅｒ等（Ａｒ＋ａ１．
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ５６ 、５０２−５１４ ［１９７３］）によりアミドシュ
ワルツ１０Ｂを用いて測定し、濃度は０．６〜０．７πｇ／１ｌ１１２であった
。１０１２の発酵から約１６０ｍ５のタンパク質が得られた。
３、修飾ホスファターゼタンパク質のコラゲナーゼＬ：よる特異的分解
３．１． コラゲナーゼの精製
クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｈｉｓｔｏｌｙｔ
ｉｃｕｍ） （ＥＣ３，４−２４，３）産クロストリジオペブチダーゼＡを、Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ社（Ｄ −８０２４Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ
、 Ｇｒｕｅｎｗａｌｄａｒ Ｗｅｇ ３０ ）から入手した（ Ｔｙｐ■、
Ｂｅ５ｔ、−Ｎｒ、 ＣＯ７７３）。
この酵素を、ＦＰＬＣ装置及び例２．４．記載のものと同じアニオン交換カラム
の使用下に勾配クロマトグラフィーによってさらに精製した。コラゲナーゼ２ｔ
ａｇを使用し、緩衝液Ａ（トリスＨＣＩ Ｉ ＯｍＭ、 ＣａＣ１ｚ ５ｍＭ、
ｐＨ８。
０）と緩衝液Ｂ（）リスＨＣＩ ］ Ｏ０＋ｎＭ、 ＣａＣ１＝ ５ ｍＭ。
ＮａＣ１ｌ ｍＭ、 ｐＨ８−０）とから成る、ＮａＣ１０−２００ｍＭの勾配
を用いて流出速度０ 、５ ｍ１２／ｍｉｎで流出させた。勾配の全容量は２０
凋Ωであっｔ；。フラゲナーゼ活性はＥ＋Ｗｕｅｎｓｃｈ等（Ｆｌｏｐｐｅ−５
ｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、３３３，１４９ １５１ ［１９６３］）によって記載されたテスト
によって測定した。極めて活性のある７ラクシ謬ンは０．８１１ｇ／ｒｎＱのタ
ンパク質分及び２５００単位／ｖｎｙの特異活性を有していた。次に記載する分
解実験は、−２０℃で保管し！：前記フラクシｎンを用いて実施した。
１２ ＨＳ４１３３／１の分解
一木調タンパク質は４７７個のアミノ酸（分子量４９９１９）の長さを有してい
る。該タンパク質は、コラゲナーゼによって切断可能の配列ニ
ー〇ｌｙ −（Ｐｒｏ −Ｙ −Ｇｌｙ ）！ −Ｐｒｏ −［前記配列中Ｙは
１回は旧ｓ、１回はＡｈａを表わす（表１参照）］を有している。２つのＹ −
Ｇｌｙ結合を切断することによって、４４７アミノ酸（分子量４６８８０）及び
２７アミノ酸（分子量２８３２）を有する２種のタンパク質ならびにトリペプチ
ドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａが形成される。種々のホスファターゼ誘導体のコラゲ
ナーゼに対する反応性を相互に比較するために、最大分解生成物の形成を反応時
間及び酵素量に依存して測定し１；。
反応緩衝液（トリスＨＣＩ ９０ ｍＭ、 ＣａＣｌ２５ ｍＭ、 ＮａＣ１１
２０！ＩＩＭ、 ｐｌ（８，０）中にＨ３４１３３／１ ５３ μ９及びクロス
トリジオペブチダーゼＡ０．１単位を含有する反応混合物を、３７℃で２．５時
間インキュベートした。１５〜３０分の時間間隔で各１０μＱの試料を取り出し
、試料緩衝液（１０％サッカロース、１０％ナトリウムドデシルスルフェート、
ジチオトレイトール１ｍＭ、 ＥＤＴＡ ２ｍＭ） ３μＱを加え、９５℃に５
分加熱することによって直ちに停止しｔ：。
試料を５ＤＳ−ポリアクリルアミド−勾配ゲル（定数０．３３％ビスアクリルア
ミドを有する１２．５〜２５％アクリルアミドの勾配）で電気泳動することによ
って分離した。同ゲルをクーマシーブリリアントブルーＧで染色しｌ：後、タン
パク質バンドに従って細片状１：切断し一ゲルスキャナー（ＩＳＣＯ社製、光学
装置６型、吸収モニターＵ Ａ −、５）を用いて２８０ｎｍで定量的に評価し
た。精製されたホスファターゼタンパク質を用いて得られた相応の校正曲線によ
ってピークの高さから、最大分解生成物のバンドのタンパク質含分を確定した。
この結果は第３８頁に総括しである。これらのデータからＨ５４１３３／ｌの生
成物形成速度２１ 、０ ｐＭｏｌ／功ｉｎ／酵素単位が得られる。
第３８頁の分離は、バンド７でクロストリジオペブチダーゼＡとの完全な反応後
のＨＡ４１３３／１の試料からの最大分解生成物の電気泳動分離を示す。
３．３ ５Ａ５０６／１の分解
該−木調タンパク質は、４８６個のアミノＭ（分子量５０５９６）の長さを有し
、；ラゲナーゼによって切断可能の配列ニ
ー Ｇｌｙ −（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｓ −Ｐｒ。
］前記配列中Ｙは１回は旧ｓ、 ４回はＡｌａを表わす（表１参照）〕を含む。
すべてのＹ −ｃｒｙ結合を切断すると、Ｈ５４１３３／１から生じるタンパク
質（，３，２゜参照）と同じタンパク質及び基質１Ｍ０１当り４ＭＯ】のＧｌｙ
−Ｐｒｏ−Ａｌａが形成される。クロストリジオペブチダーゼＡに対する５Ａ５
０６／１の反応性の測定は、Ｈ５４１３３／ｌの場合と同様に行なった。
反応溶液はＩＱＱ、ｕｆｆ中５３μｙの５Ａ５０６／１を含有しており、Ｈ５４
１３３／１の反応溶液と同じ酵素濃度及び緩衝液濃度を有してぃｔ；。３７℃で
８０分間インキニペートした。１０〜１５分の間隔で１０μＱの試料を取出し、
３．２．で記載したように停止し、ゲル電気泳動後にゲルスキャナーで分析した
。結果は第３８頁に区示しである。生成物形成速度は６０ｐＭｏｌ／ｍ１１１／
＃素単位であった。
第３８頁の分離は、クロストリジオペブチダーゼＡとの定量的反応後の５Ａ５０
６／１からの最大反応生成物をバンド５で示す。
３．４． ５Ａ３０２／ｌの分解
該−木調タンパク質は４７７個のアミノ酸の長さを有し、コラゲナーゼによって
切断できる配列ニー Ｇａｙ −Ｐｒｏ −Ａｌａ −Ｇｌｙ −Ｐｒｏ −（
表１参照）を含む。３０１アミノ酸（分子量３１２６９）及び１７６アミノ酸（
分子量１８６６８）の長さを有する２種の分解生成物が形成される。５Ａ３０２
／１の反応性は小さいためｔ：、生成物形成速度のおおよその値しか得られなか
った。
反応緩衝液１５μＱ （３，２の場合と同様）中に５Ａ３０２／１μり及びクロ
ストリジオペブチダーゼＡ１．０単位を含有する反応混合物を３７℃で１５時間
インキュベートとし、次に３．２で記載したように試料緩衝液を加えかつ加熱し
て停止し、ゲル電気泳動及びゲルスキャナーでの評価によって分析した。大きい
反応生成物約０ 、０２ ｐＭｏｌ／ ｍｉｎ／酵素単位が形成された。第３８
頁にはバンド９で相、応のゲル電気泳動分離を示しである。
表 ２： 修飾プレホスファターゼ（表１）及びプレホスファターゼ／ＡＴＣＨ
融合タンパク質（西独国特許出願第Ｐ・３７３１８７５．６号）とクロストリジ
オペブチダーゼＡとの反応の性成物形成速度
ｕｓ４ｔ３３／’ｌ ２ ２１．０
ｓＡ５０６Ａ ５ ５９．８
ＳＡ１８６／１ １ ＜ Ｄ−０１
ＳＡ３４３／１ ２ ４０
ＳＡ３４１／１ ５ ３５０
ＳＡ３６０ダ ８５４０
応生成物のグル電気泳動分離
５Ａ３４Ｔ／１ ５Ａ５０６／Ｉ Ｈ５４Ｔ３３／Ｉ ５Ａ３０２／１第３．
５． ７及び９列：クロスト１，１ジオペプチダーゼＡで分解した後の生成物第
２及び３列で使用した融合タンパク質は勾配クロマトグラフィーによって精製さ
れなかった。
第３列の最低分子量を有するバンドはａｌｙ−ｐｒｏ−ｈｃＴＨｃ １−３９）
である。
第５及び７列には高分子分解生成物のみが認められ、低分子生成物はデルを完全
に通過する。
タンパク質５Ａ３０２／１、ｎ５４１３３／１及び５Ａ５０６／１ とクロスト
リジオペブチダーゼＡとの反応の時間従属関係単試料半シ
の生成物
反応条件は例３．２〜３．４に記載されている。
５Ａ５０６／１及びＨ９４１３３／１の値はそれぞれクロスト１．１ジオペプチ
ダーゼＡ Ｏ，０１単位を用いて得られ、５Ａ３０２／１の値はクロストリジオ
ペプチダ−Ａｏ、１単位で得られた。
Ａｂｂ、ｉ： プ７ スミ） ｐｓＢ９４ （６４５４塩基対）ノ制限ｐ素ａ断
地図１５す
Ａｂｂ・ ２ ： ｒ５ヌミドｐｓＡ３，０２の制限酵素切断地図Ａｂｂ、３
： プラスミドｐＳＡ ５０．６の制限酵素切断地図１５！３
Ａｂｂ、４ ： プラスミドｐｐｓ４１３３の制限酵素切断地図国際調査報告
−１−−１−ｍ−１龜 ＰＣＴ／ＤＥ ８ε１００５３５国際調査報告 [Model 381A manufactured by Applied Biosystems (850 LincoIn CenterDrive, Foster C1ty, Calif, 94404, USA)]
It was synthesized according to the equipment manufacturer's instructions and purified by gel electrophoresis. DNA sequencing was performed using the didesoxy method (F, Sanger et al., Proc, Natl. Aead, Sci, tJsA 74.5463-5467 [1977]).
I did it. The phage vectors are commercially available from Boehringer (Mannheim), Pharmacia-LKB Gmb) and many others.
Available from the donor. For radiolabeling, desoxyadenon-5-[a-3&s]thio triphosphate was used (Lil, D. BigHin et al., Proc, Natl. Aca4. Sci, USA-80+3963-3965 [ 983] ). Restriction endonucleases EcoRI, PstI, 5phl and Haem and DNA ligase (74)i:t were obtained from Boehringer (Mannheim). NcoI was a polynucleotide obtained from Nevi England Biola bs Gmb)l (62315chvalbach).
Kinase (T4) was obtained from Pharmacia/P-L (7800 Freiburg, Br.). 1.1 Production of pSA302 Plasmid pSB94 was linearized with restriction endonuclease Neo T. the
The reaction mixture containing 14 μ9 of plasmid DNA and reaction buffer (Tris-HCI 50 mM, MgCl2 10 mM, NaCl2 100 mM, dithiothreitol 1 mM, pH 7,5) containing 50 p (Ncol 17 units in l) was incubated at 37 °C for 7 hours. The reaction mixture was extracted with dinol (incubated for an hour).
The DNA was then precipitated with ethanol, dried and dissolved in TE buffer (Tris HCl45 m&i, EDTAI iM, pH 7,5). Two 18ffler synthetic oligonucleotides that did not undergo phosphorolysis at the 5'-OH group.
Creotides: 1 μg each of 5'-CAT GGCCCT, CAG, ACCC-3', 5'-CATG GGG, and C-3' were mixed in an aqueous solution and incubated at 37°C for 15 minutes. Both oligonucleotides were then incubated with linearized pSB94 3-5μ9 and ligase reaction buffer (Tris HCI 20 +nM, MgCL 10mlI, dithioeurytrit 10+nlJ, ATP'0.6mM, pH 7,6) at 50pO ( ') Reacted with 4 units of DNA ligase at 20°C for 2.5 hours. The DNA was phenol extracted and evaporated as described above.
Nord precipitation: thus post-treated and used for transformation of E. coli strain SB44. For the production and transformation of qualified cells. It was performed according to the method of Dagert and S. D. Ehrlich (Gene 6.23-2 8N979). Transformed cells were plated to form single colonies. The oligonucleotide sequence
Colonies containing plasmid DNA with sequences are isolated by colony hybridization.
Identified it. Colony hybridization was performed by T. J. P. 'Gergen' according to the basic record described by Mania [is et al. etc. (Nucleic Ac1dsResearch 2115 '-2136 [1979]).
As a compound-forming reagent, the oligonucleotide previously labeled with 5'=p$2-phosphate by reaction with γP''-ATP and polynucleotide kinase (T, ) is used.
nucleotides were used. The localization of the 18 base pair synthetic Ncol fragment in the new recombinant plasmid of the positive clone was confirmed by restriction analysis. For this purpose, plasmid DNA was prepared using standard methods.
and reacted with the restriction endonuclease HaeDT. The generated fragments
Compounds were analyzed by gel electrophoresis (molecular weight determined by comparison with Haem cleaved PBR322 in an 8% polyacrylamide gel). The Nco I cleavage site used for incorporation of the 18 base pair synthetic fragment is located on the 385 base pair Haem fragment of pSB94. This fragment is a new recombinant protein.
In the rasmid it is missing and must be replaced with a new fragment on the 2nd side.
do not have. This is because the 18 base pair fragment even has the Haem sequence.
Ru. The sizes of the two new fragments depend on the orientation of the 18 base pair fragment: In the desired orientation case I, illustrated in Figure 2, the 342 base pair and 61 base pair fragments are expected.
while the reverse orientation gives fragments of 330 base pairs and 73 base pairs. Ryoden
Several plasmids were found that had the same position. The pSA302 shown in Figure 2 is
This is one of the plasmids with the desired orientation. 'salt from pSA302, containing synthetic NA introduced by cloning.
The EcoRI fragment of base pair 349 was cloned into the sequencing vector M13mp19.
Gusi, sequenced as described above. The partial sequence of pSA302 between both EcoR1 cleavage sites, illustrated in FIG. 2, has been completely verified. 1.2 Production of pSA506 This production was carried out in the same manner as the production of pSA302. pSB94’#I@en
Linearized with donuclease sph I. Reaction conditions and work-up were as described for pSA302. Two 45mar oligonucleotide sequences TCCTGCAG (, CCC GGCGGGTCCAGCAGGCCC-3' and 5'-CGGACCTGCAGGGCCTGCTGGA CCCGCCGG GCCT GCAGGACCATG-3' was Sph I linearized under the same conditions as described for pSA302. After transformation of E. coli SB44 post-treated by reaction with pSB94 and DNA ligase, positive colonies were identified by colony hybridization with P3'' end-labeled 45mer oligonucleotides obtained in this way. The new recombinant plasmid contains two 45mer oligonucleotides.
Formed from the otid f;DN with a complete Sph I sequence on only one side of the part
Ru. This has a distance of 257 base pairs from the next located EcoRI sequence in the claimed plasmid (see Figure 3), whereas this distance
It has only 212 bases, just like pSB94. obtained by reaction of the new recombinant plasmid with the restriction sequences EcoRI and sphI.
Size determination of the synthesized DNA fragments by gel electrophoresis revealed that psAs06 was one of the plasmids with the desired orientation of the synthesized DNA fragments. To verify the sequence shown in Figure 3, a 257 base pair EcoRI/Sph I fragment was crawled into a sequencing vector and bound. 1.3 Production of pH54133 A reaction mixture consisting of 3μ9 DNA of plasmid pSA506 and 5 units of the inhibitor enzyme Pstl in 50μa of reaction buffer (same as in 1, 1) was incubated at 37°C for 2 hours.
The mixture was incubated and worked up as described in Example 1.1. This resulted in three DNA fragments (27 base pairs, 2
420 base pairs and 4007 base pairs). 2 (electrolyze the larger piece of 1)
The DNA ligature was isolated from the gel by separation and purified under reaction conditions similar to Example 1.1.
(T4), post-treated, and used for transformation of E. coli SB44. Plasmid DNA was isolated from some ampicillin resistant clones. One of them is pH54133, and its restriction enzyme cleavage map is shown in Figure 4.
It is. pH54133 was induced from pSA506 by a deletion resulting in a reduction in the size of the 257 base pair EcoRI/Sph I fragment to 230 base pairs.
be guided. This fragment was cloned into M13mp1g and sequenced as in Example 1.2. This verified the nucleotide sequence shown in FIG. 2. Production of proteins 5A302/1.5A506/l and H34133/l The three proteins were obtained from the strains described in Example 1: E. coli SB 44 (pSA302), E. coli SB44 (pSA506) and E. c. Obtained by fermentation of order o SB44 (pHS4133). Their biosynthesis is regulated in a manner similar to that of alkaline phosphatase. The biosynthesis is reinitiated by inorganic phosphate and conversely induced in phosphate-deficient media (A. Torriani, Biochem Biophys, Acta 38 e 460-'469 [1960]). For the identification of phos-77tase derivatives, the antigen plot detection method by H8Towbin et al. (Proc, Natl. Acad, Sci, USA 76, 4350 4354 [1979]) was applied, among others. The antiserum required for this was obtained from E. coli purified under standard conditions (D. L. Weir, Handbook of Experimental Immunology, Vol. 2, Blackwell 5 Scientific Publ. Oxford 1978). K 12 degree Arca
produced by immunizing rabbits with phosphoric phosphate. used for immunity
The phosphates used were prepared according to a known method (A., D., 'Methods in Enzymolog 7', Vol. nlB, 2122218.L. Grossman, K., Moldave (Eds,) Academic Press, New York). [1968]) isolated by. As the second antibody, a goat antiserum against rabbit IgG conjugated with alkaline phosphatase was used as the indicator enzyme (Cooper Biomedial Inc., Malvern, USA).As the color reagent, 5-bromo-4- Kroll -3-1n)'! J ruphosphate was used. The three proteins and the three strains from which these proteins are produced are similar to each other so that the same fermentation and isolation methods can be applied in all cases. 2.1 Fermentation 2 omu: single inoculum L, 37 °C Shake for 24 hours, then incubate the same medium.
The mixture was transferred to 800+ mQ soil and further shaken at 37° C. for 16 hours. This preliminary culture
The culture was transferred to a 2012 glass fermentation vessel in which low phosphate medium (LP medium by K. Kreuzer et al.: Genetics 13, 459-468 [1975]) 9.2Q was present. The fermenter was heated to 37°C with a flow rate of 10ff/win.
The mixture was stirred for 6 hours under air (220+n1n). Cells were then obtained using a flow centrifuge. Approximately 30 g of wet cellular material was obtained. 2.2 Isolation of expanded protein extract 30 g of wet cells from 2.1 were suspended in 400 yaQ of lysis buffer (Tris HCl 50 mM, NaCl 60 mM, pH 8-0). After adding phenylmethylsulfonyl fluoride (final concentration 10 mM) and DNA5e (DNA sel from bovine pancreas, Boehringer/Mannheim, purity 1:10 py/9 wet cells), the suspension was kept in a cold room. Cells were digested with a cell homogenizer (Manton-Gaulin) at a pressure of 650-700 ky/ctn" (10,000 Psi) at (4°C). Digestion was repeated twice, and the suspension was cooled in water after each pass. was separated by centrifugation (20 min at 110,000x and 4°C), washed twice with digestion buffer, and dissolved in Tris HC 150mM (pH 8,0)/Urea 8M (60wQ).Insoluble components were removed from this solution by centrifugation. and gradient chromatograph
It was kept in water until further purification by filtration. 2.3 Identification of phosphatase derivatives The major protein component (approximately 50-70%) in the urea buffer of the protein extract obtained in 2.2 is in each case a phosphatase derivative. The protein mixture was prepared under standard conditions (Ll, K, Laan+mli, Nature 227, 680-685 [970]). After separation by electrophoresis on a 5DS-polyacrylamide gel, the corresponding protein bands were identified according to the following criteria:
a) The thickest band of the protein mixture corresponds to the amino acid sequence listed in Table 1.
has a corresponding molecular weight. b) This protein can be reinitiated by phosphate, ie the band does not appear when the cells are fermented as described in 2.1 but at 10 times the phosphate concentration. C) The band is plasmid specific and was produced under the same conditions as in 2.1.I; plasmid-free E. It does not appear in cells of the coli 844 strain. d) The band specifically reacts with antiserum against purified alkaline phosphatase produced by E. coli K12 in the antigen plot detection method. Gel electrophoresis molecular weight measurements using a probe protein mixture (low molecular weight proteins manufactured by Pharmacia) revealed that the phosphatase derivative exists in a so-called precursor form, that is, it also has the signal sequence of alkaline phosphatase.
Ru. The protein is relatively poorly soluble in dilute buffers. Therefore, cell degradation and
Only a small amount can be detected in the supernatant obtained after heart separation. 2.4 Purification of phosphatase derivatives The protein extract obtained in 2.2 was separated and the modified phosphatase was further purified by gradient chromatography using a medium pressure chromatography device (FPLC) (Pharmacia, Psala, Sweden). do. The aforementioned Mayriki anion exchange column (Mono Q-HR515 type) was equilibrated with buffer A (1-lith HCI 50 + nM, urea 8 M, I)), and the protein from 2.1 The solution was loaded and finally 1-0, fl using a gradient of 200 ml of NaCl O, formed from buffer A and buffer B (50 mM NaCl, 11 M NaCl, 8 M urea, pH 8,0). Elution was performed at a flow rate of /min. The total gradient capacity is 20rnQ, and each fraction of 1rnQ
Collect them. The absorbance of the eluate at 280 nllll was recorded with a flow plot meter. ＠のふ
The protein composition of the lactation was determined by 5DS-polyacrylamide Ge-Lumi pneumophoresis.
Therefore, I analyzed it. Phosphatase derivatives were eluted at 50-70mM NaCl. The corresponding fractions were purified and dialyzed against 400 volumes of buffer (Tris HC 150 mM, NaCl 1150 mM, pH 8.0). Under these conditions, the protein is dissolved and used in this form for the next step of collagenase digestion.
Ta. Purity of phosphatase preparations determined by 5DS-polyacrylamide gel electrophoresis
Therefore, it was controlled (see page 38, bands 4, 6 and 8). The purity was higher than 90%. The protein content was analyzed by W. Schaffmer et al.
The concentration was measured using Waltz 10B and was 0.6 to 0.7 πg/1l112. Approximately 160 m5 of protein was obtained from 1012 fermentations. 3. Specific degradation of modified phosphatase proteins by collagenase L 3.1. Purification of Collagenase Clostridiopebutidase A from Clostridium histolyticum (EC3,4-24,3) was purchased from Sigma Chemie GmbH (D-8024 Deisenhofen, Gruenwaldar We). (Typ, Be5t, obtained from g30) -Nr, CO773). This enzyme was analyzed using an FPLC apparatus and Example 2.4. Further purification was performed by gradient chromatography using the same anion exchange column as described. Using collagenase 2t ag, buffer A (Tris HCI I OmM, CaC1z 5 mM, pH 8.0) and buffer B (Tris HCI] O0 + nM, CaC1 = 5 mM. A gradient of 10-200mM NaCl (11mM NaCl, pH 8-0) was used at a flow rate of 0 and 5 ml/min. The total capacitance of the gradient is 20Ω. Flagenase activity was determined by the test described by E+ Wuensch et al. (Floppe-5 eyler's Z, Physiol. Chem, 333, 149 151 [1963]). The highly active 7 lacs has a tar of 0.811g/rnQ.
It had a protein content and a specific activity of 2500 units/vny. The amount described next
Store the solution experiment at -20℃! : It was carried out using the above-mentioned fraxin. 12 Degradation of HS4133/1 Ichikicho protein has a length of 477 amino acids (molecular weight 49919).
Ru. The protein contains a sequence sequence cleavable by collagenase.
-〇ly-(Pro-Y-Gly)! -Pro-[Y in the above sequence represents old s once and once represents Aha (see Table 1)]. By cleaving two Y-Gly bonds, two proteins with 447 amino acids (molecular weight 46,880) and 27 amino acids (molecular weight 2832) and tripeptidyl
Gly-Pro-Ala is formed. Collagen of various phosphatase derivatives
In order to compare the reactivity towards enzymes with each other, the formation of maximum degradation products was determined during the reaction.
1; depending on the time and enzyme amount. The reaction mixture containing 53 μ9 of H34133/1 and 0.1 unit of cross-tridiopebutidase A in reaction buffer (90 mM Tris-HCI, 25 mM CaCl, 20!IIM, pl(8,0)) was incubated at 37°C. 2.5 o'clock
Incubated for a while. Remove 10 μQ of each sample at time intervals of 15 to 30 minutes, add 3 μQ of sample buffer (10% sucrose, 10% sodium dodecyl sulfate, 1 mM dithiothreitol, 2 mM EDTA), and heat to 95°C for 5 minutes. Stop immediately by t:. Samples were run on a 5DS-polyacrylamide gradient gel (constant 0.33% bis-acrylamide).
by electrophoresis in a gradient of 12.5-25% acrylamide with
It was separated. The same gel was stained with Coomassie brilliant blue G, and then stained.
Cut into strips according to protein bands and quantitatively evaluated at 280 nm using a gel scanner (manufactured by ISCO, optical device type 6, absorption monitor UA-5).
Ta. A corresponding calibration curve obtained using purified phosphatase protein
The protein content of the maximum degradation product band was determined from the height of the peak. The results are summarized on page 38. From these data, the production of H54133/l
Product formation rate 21, 0 pMol/in/enzyme unit is obtained. The separation on page 38 shows the electrophoretic separation of the largest degradation products from a sample of HA4133/1 after complete reaction with clostridiopebutidase A in band 7. 3.3 Degradation of 5A506/1 The wood-like protein has a length of 486 amino acids M (molecular weight 50,596);
-Gly-(Pro-Y-Gly)s-Pr. ] In the above arrangement, Y represents old s once and represents Ala four times (see Table 1)]. When all Y-cry bonds are cleaved, the protein generated from H54133/1
4 MO] of Gly-Pro-Ala is formed per 1 MO of the same protein and substrate as the protein and substrate (see , 3, 2). The reactivity of 5A506/1 with clostridiopebutidase A was measured in the same manner as for H54133/1. The reaction solution contained 53 μy of 5A506/1 in IQQ, uff, and had the same enzyme and buffer concentrations as the reaction solution for H54 133/1. Incubate for 80 minutes at 37°C. Remove 10 μQ samples at 10-15 minute intervals. 3.2. were stopped and analyzed on a gel scanner after gel electrophoresis as described in . The results are shown on page 38. The product formation rate was 60 pMol/ml/# unit. The separation on page 38 shows the maximum reaction product from 5A50 6/1 in band 5 after quantitative reaction with clostridiopebutidase A. 3.4. Degradation of 5A302/l The woody protein has a length of 477 amino acids and contains the sequence Gay-Pro-Ala-Gly-Pro- (see Table 1) which can be cleaved by collagenase. Two degradation products are formed with lengths of 301 amino acids (molecular weight 31,269) and 176 amino acids (molecular weight 18,668). Since the reactivity of 5A302/1 is small, only an approximate value of the product formation rate can be obtained.
It was. 5A302/1μ in 15μQ of reaction buffer (same as in 3 and 2) and chlorine.
The reaction mixture containing 1.0 units of stridiopeptidase A was incubated for 15 hours at 37°C, then stopped by adding sample buffer and heating as described in 3.2, and subjected to gel electrophoresis and gel analysis. Analyzed by scanner evaluation. A large reaction product of approximately 0.02 pMol/min/enzyme unit was formed. On page 38, band 9 shows the gel electrophoretic separation of the phase. Table 2: Rate of product formation for the reaction of the modified prephosphatase (Table 1) and the prephosphatase/ATCH fusion protein (West German Patent Application No. P. 3731875.6) with clostridiopebutidase A us4t33/'l 2 21. 0 sA506A 5 59.8 SA186/1 1 < D-01 SA343/1 2 40 SA341/1 5 350 SA360 da 8540 Glue electrophoretic separation of reaction product 5A34T/1 5A506/I H54T33/I 5A302/1 3rd. 5.7 and 9 rows: Products after digestion with clost 1,1 diopeptidase A. The fusion proteins used in rows 2 and 3 were purified by gradient chromatography.
I couldn't. The band with the lowest molecular weight in the third column is aly-pro-hcTHc 1-39). Only high-molecular decomposition products are observed in columns 5 and 7, and low-molecular products completely pass through the del. Clost with proteins 5A302/1, n54133/1 and 5A506/1
Time Dependency of the Reaction with Lysiopeptidase A Single Sample Product Reaction conditions are described in Examples 3.2 to 3.4. The values for 5A506/1 and H94133/1 are Clost 1.1 diopepti, respectively.
The value of 5A302/1 was obtained using Clostrigiopeptida-Ao, 1 unit. Abb, i: psB94 (6454 base pairs) restriction p fragment map 15 Abb.2: Restriction enzyme cleavage map of r5 numid psA3,02 Abb, 3: Restriction enzyme cleavage map of plasmid pSA 50.6 Map 15!3 Abb, 4: International research report on restriction enzyme cleavage map of plasmid pps4133 -1--1-m-1 龜 PCT/DE 8ε100535 International research report