JPH0424659B2

JPH0424659B2 -

Info

Publication number: JPH0424659B2
Application number: JP60198334A
Authority: JP
Inventors: Mikio Tsuboi; Masashi Iwata; Takaharu Yamamura
Original assignee: YAMAMURA KAGAKU KENKYUSHO KK
Current assignee: YAMAMURA KAGAKU KENKYUSHO KK
Priority date: 1985-09-07
Filing date: 1985-09-07
Publication date: 1992-04-27
Also published as: JPS6258164A

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は、主として高速液体クロマトグラフイ
ー用の充填剤として用い、溶液中のタンパク質や
アミノ酸などを高精度で分離するクロマトグラフ
イー用担体に関する。（従来の技術）液体クロマトグラフイーにおいて、シリカゲル
そのものを充填剤として用いると、該クロマトグ
ラフイーの適用範囲が限定され、さらにカラムを
安定に保ち、再現性のあるクロマトグラムを得る
のが難しい。一方、高速液体クロマトグラフイー
用の充填剤として有機質ゲルを用いると、高圧・
高流速時に機械的強度に欠け、かつ粒子径や細孔
容積などの物理的形状が変化しやすく、剛構造の
担体としては無機質粒子よりも劣つている。この
ため、クロマトグラフイー用担体としてシリカゲ
ルなどの無機質粒子を用い、この表面を有機シラ
ン化合物で有機官能基を導入すると、有機溶媒か
ら水溶液まで広い範囲の溶媒を溶離液の成分とし
て使え、揮発性の乏しい生体成分の分離分析も容
易である。ただしシリカゲルなどの無機質粒子を化学的に
表面処理しても、表面シラノール基が100％反応
したわけでなく、未反応シラノール基がかなり残
存しているので、溶離液の使用PH範囲が限定さ
れ、特に生体試料を用いる場合にはカラムの寿命
が短い。さらに無機質粒子の表面において、未反
応シラノール基が遊離していると、ある種の溶質
は強く吸着されてカラム外へ出てこず、分離性能
自体も十分でない。こうした問題を改善するため
に、たとえば特開昭55−5941号では、多孔性無機
質粒子の表面にエポキシ基を末端に有する有機シ
ラン化合物を化学結合し、前記エポキシ基にさら
にエポキシ基含有有機物を付加して、表面を親水
性高分子で覆つて吸着性を低下させている。また
特開昭56−93043号では、粒子表面にエポキシ基
を末端に有する有機シラン化合物を反応させ、該
化合物を介して単糖類または多糖類を化学結合す
ることにより、無機質担体にタンパク質を吸着す
ることを防止している。特開昭58−223062号で
は、化学的に表面処理したシリカゲルを用いる際
に、あらかじめタンパク質を飽和吸着させること
により、除タンパク質処理することなく、低分子
量の生理活性物質，薬剤を迅速に分離している。
特開昭59−112260号では、シリカゲルなどの基体
表面にアミノ官能基を化学結合し、さらにスクシ
ンイミド単位を有するポリマーと反応させて、ポ
リアスパラギン酸の被覆を形成している。（発明が解決しようとする問題点）多孔性無機質担体の表面改質は、単なる有機シ
リル化剤による処理のほかに、残存シラノール基
の影響を極力避けるために前記のように種々存在
し、さらにカーボワツクス，トリメチルアンモニ
ウムなどによる処理も知られている。しかし従来
の担体では、特に水溶性タンパク質を溶質とする
際に分離性能が未だ十分でなく、溶質の回収率か
ら考慮して若干の吸着が認められ、かつこれらの
担体を用いたクロマトグラフは比較的ブロードと
なり、分離にかなりの時間を要することになる。
また特開昭58−223062号では、シラン処理シリカ
ゲルをさらにタンパク質で処理するといつても、
このタンパク質は検体の除タンパク質処理を省く
ためにシリカゲルに吸着させるにすぎず、この充
填剤で分離できるのは低分子量の生理活性物質，
薬剤などだけである。特開昭59−112260号では、
シリカゲル表面にポリアスパラギン酸の被覆を形
成するけれども、それはポリスクシンイミド−シ
リカを介して固定されるにすぎず、目的物の生成
に要する時間が長いうえに、完全にポリアスパラ
ギン酸被覆になつたか否かを確認することが相当
に困難である。（問題点を解決するための手段）本発明者らは、従来の高速液体クロマトグラフ
イー用の充填剤に関する問題を種々検討した結
果、水系ゲル浸透クロマトグラフイー用担体とし
てはまず表面が親水基で被覆または化学結合され
ているうえに、遊離または残存シラノール基を十
分にマスクすることを要するために、表面改善に
際して、親水性基を持ちかつ吸着傾向の少ない−
NHCO−（ペプチド鎖）を有するタンパク質を用
いることにより、大量のクロマトグラフイー分離
または分取に適応する高圧・高流速処理が可能で
あることを見出した。本発明に係るクロマトグラフイー用担体では、
可溶性タンパク質またはポリペプチド類を架橋結
合し、この架橋高分子化合物で多孔性無機質粒子
の表面を被覆する。この無機質粒子は、あらかじ
めその表面に有機シラン化合物を化学結合してお
いてもよく、この際には架橋高分子化合物は粒子
表面の残存シラノール基を被覆する。本発明で用いる多孔性無機質粒子は、たとえば
シリカ，アルミナ，シリカ・アルミナ，チタニ
ア，ケイソウ土，ケイ酸ガラス，アルミノケイ酸
塩，クレーカオリン，タルク，ゼオライトなどが
あり、ガラスビーズ表面にシリカゲル微粒子など
をまぶしてもよく、その形状は球状または破砕状
であつて、天然産または人造物のいずれであつて
もよい。この無機質粒子は、１〜500μm，表面積
１〜800m²／ｇ，平均細孔径30〜4000Åの微粒で
あると好ましい。代表的な無機質粒子はシリカま
たはアルミナであつて、化学的純度には特別の制
限を設ける必要はない。また無機質粒子は、使用
に先だつてあらかじめ鉱酸処理をし、その後に
100〜200℃で数時間乾燥すると好ましい。所望に応じて行うシラン処理で用いる有機シラ
ン化合物は、たとえばγ−グリシドキシプロピル
トリメトキシシラン，γ−グリシドキシプロピル
トリエトキシシラン，３−アミノプロピルトリメ
トキシシラン，３−アミノプロピルトリエトキシ
シラン，３−グリシドキシプロピルジメチルクロ
シラン，Ｎ−２（アミノエチル）−３−アミノプロ
ピルトリメトキシシラン，Ｎ−２（アミノエチル）
−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン，
３−シアノプロピルトリクロルシラン，３−アセ
トキシプロピルジメチルクロルシラン，３−アセ
トキシプロピルメチルジクロルシラン，イソシア
ネートプロピルジメチルクロルシラン，イソシア
ネートプロピルトリエトキシシラン，３−メルカ
プトプロピルトリエトキシシランなどであり、エ
ポキシ基，アミノ基，シアノ基，イソシアナート
基，メルカプト基などの親水性官能基またはトリ
メチルクロルシランのように短い官能基を有する
シラン化合物が好ましい。また前記のシラン化合
物以外でも、カルボキシル基などの親水性官能基
または低級炭素鎖を有する官能基を持つシラン化
合物については適用可能である。無機質粒子と有
機シラン化合物との結合反応は、公知のように該
シラン化合物の分解を避ける条件を選択するのが
好ましく、かつ無機質粒子の表面に存在するシラ
ノール基と可能な限り多く化学結合させると好ま
しい。本発明で用いるタンパク質は、可溶性であれば
そのまま出発材料として使用することが可能であ
り、ゼラチン，メタプロテイン，プロテオース，
ペプトン，ペプチドなどの誘導タンパク質、カゼ
インなどのリンタンパク質、ムコタンパク質など
の糖タンパク質、アルブミン，グロブリン，グル
テリン，ヒストン，プロタミンなどの単純タンパ
ク質が例示できる。またケラチンのような硬タン
パク質は、可溶性でないけれども、水との煮沸ま
たは酵素，酸，アルカリなどで変性して可溶性に
すればよく、出発材料としてはタンパク質そのま
まを使用しても、酵素，酸，アルカリなどで適度
に加水分解したものを使用してもよい。またタン
パク質の代りに、天然または合成のポリペプチド
類も使用可能であり、１種または２種以上のα−
アミノ酸類を縮重合したホモポリマーまたはコポ
リマーであるポリアミノ酸もポリペプチド類とし
て包含する。タンパク質またはポリペプチド類の
分子量は、約5000以上好ましくは約10000以上で
あれば、カルボニル化合物による架橋結合によつ
て十分な被覆強度を得るものと推定でき、この分
子量が大きくなればなるほど、一般にカルボニル
化合物の添加量を少なくすると好ましい。代表的
なタンパク質は、分子量約5000〜200000のゼラチ
ンであり、ゼラチンは分子量の制御が比較的容易
でありかつ比較的安価である点でも好ましい。タンパク質またはポリペプチド類自体に架橋結
合を生じさせるカルボニル化合物は、グリオキサ
ール，マロンアルデヒド（プロパンジアール），
コハク酸ジアルデヒド（ブタンジアール），グル
タルアルデヒド（ペンタンジアール），アジプア
ルデヒド（ヘキサンジアール），ピメリンジアル
デヒド，スベリンジアルデヒド，マレインジアル
デヒド，２−ペンテン−１，５−ジアルデヒド，
アセチレンジアルデヒド，メソオキサールジアル
デヒドのようなジアルデヒド類、ホルマリン，ア
セトアルデヒドのようなアルデヒド類またはパラ
ホルムアルデヒドのようなアルデヒド系線状高分
子などであり、それ自体でも容易に重合しやすく
かつタンパク質またはポリペプチド類と架橋結合
しやすいジアルデヒド類を用いると好ましい。ア
ルデヒドやケトンであるカルボニル化合物は、
水，アルコールなどの適当な溶媒中で、タンパク
質またはポリペプチド類の基質であるアミノ基と
反応して、下記のようにして縮合した結果、脱水
が起るものと推定できる。Ｃ＝Ｏ＋H₂Ｎ→Ｃ＝Ｎ− したがつてジアルデヒド類は、２個のアミノ基
と架橋反応して次のように化学結合するはずであ
る。 −Ｎ＝CH−（CH₂）_o−CH＝Ｎ− またホルマリンまたはアセトアルデヒドの結合
は次の通りである。

【式】

【式】たとえば市販のゼラチンに関して、その分子量
5000〜200000に対応する25％グルタルアルデヒド
の添加量は、シリカ5gに対して0.05〜20mlであ
ると、第２図から第４図に示すようにほぼ近似し
た液体クロマトグラフを得ることができる。25％
グルタルアルデヒドの添加量は、ゼラチンの分子
量が大きくなれば前記に範囲内で少なくする。（作用）多孔性無機質粒子は、直接または適当な有機シ
ラン処理の後に、可溶性タンパク質またはポリペ
プチド類で架橋結合した高分子化合物で表面被覆
する。有機シラン処理をあらかじめ行つた場合に
は、前記高分子化合物で残存シラノール基を表面
被覆することになる。タンパク質またはポリペプ
チド類は、カルボニル化合物によつてアミノ基を
介して架橋結合し、粒子表面において網目状に架
橋しているものと推定でき、反応条件によつては
粒子表面のシラノール基と局部的に化学結合する
かもしれない。多孔性無機質粒子の表面は、水，
アルコールなどの溶媒中でタンパク質またはポリ
ペプチド類で被覆され、タンパク質またはポリペ
プチド類をさらにカルボニル化合物で網目状に架
橋させるから、粒子表面から溶出することが無
く、約40℃以下の温度ではカラムの劣化はほとん
ど生じない。被覆処理した担体は、タンパク質ま
たはポリペプチド類に基づく遊離カルボキシル基
を有する親水性基で被われており、これらの基を
他の化合物と結合させてさらに改質することも可
能である。被覆処理した担体は、粒子表面が親水性基で被
われているので、溶質と担体表面との疎水性相互
作用がきわめて小さく、水系移動相では分子ふる
い効果によつて、アミノ酸，タンパク質などを高
精度で分離することができる。この担体は、粒子
表面の遊離カルボキシル基を利用して、極性溶媒
移動相においてイオン交換クロマトグラフイーと
してアミノ酸やタンパク質などを分離してもよ
く、このカラムはいくつかの酵素によつてほぼ定
量的に回復させることができる。（実施例）実施例１分子量100000のゼラチン20g蒸留水200mlに溶
解し、水浴上で50〜60℃に定め、直径２〜40μm
で細孔径300Åの多孔性シリカゲル（商品名YMC
−GEL，SIL，山村化学研究所製）50gを添加す
る。この溶液を均一に攪拌後、25％グルタルアル
デヒド水溶液10mlを滴下し、攪拌しながら３時間
反応させる。反応後直ちに、シリカゲル担体を蒸
留水１リツトル，メチルアルコール１リツトルで
濾過洗浄を行い、さらにテトラヒドロフラン１リ
ツトル，メチルアルコール２リツトル，蒸留水３
リツトルで洗浄し、減圧乾燥器で乾燥する。得た
シリカゲル担体の重量増加は、シリカゲルに対し
て８％である。タンパク質の結合確認のために、得たシリカゲ
ル担体1gにNaOH3gを添加し、蒸留水で全量を
10mlとしてから１時間煮沸する。この水溶液を
HCIで中和し、ニンヒドリン0.1gを蒸留水30mlに
溶かした反応試薬を数滴加え、さらに煮沸，冷却
すると、ニンヒドリン反応によつて青紫色を呈す
る。この確認試験において、前処理として
NaOH分解を行うのは、タンパク質とカルボニ
ル化合物による架橋結合はアミノ基のＣ＝Ｎ−
結合に由来するものであるため、遊離アミノ基の
存在しないことで直接ニンヒドリンを加えても呈
色せず、まずNaOH分解によつて遊離アミノ基
を形成させることを要する。また前記の洗浄の際
に、洗液にニンヒドリン反応およびビウレツト反
応を行つても呈色せず、このためにシリカゲル担
体をカラムクロマトグラフイーとして用いる時に
移動相を流しても、該担体からタンパク質の脱離
しないことが確認できる。得たシリカゲル担体を、内径６mm，長さ300mm
のステンレスカラムに乾式充填し、さらにメチル
アルコールで加圧して充填する。このカラムを用
い、下記の条件下で水溶媒系のゲル浸透クロマト
グラフイー用充填剤としての性能を調べる。（測定条件）移動相 0.3MNaCl＋0.1Mリン酸塩緩衝液
（pH7.0）流速 0.5ml／分温度室温検出器紫外線吸光光度計220nm（0.64aufs）試料タンパク質混合物１牛血清フイブリノーゲン（分子量380000）２牛血清アルブミン（分子量67000）３ β−ラクトグロブリン（分子量41000）４リボヌクレアーゼＡ（分子量13000）５トレース６Ｌ−バリン（分子量177.15）得たクロマトグラフは、第１図に示すようにピー
クが鋭く、各成分の分離状態はきわめて良好であ
る。また同一の測定条件下において、次のタンパク
質混合物のクロマトグラフを第３図に示す。試料１牛血清フイブリノーゲン２牛血清アルブミン３ β−ラクトグロブリン４ミオグロビン（分子量17500）５チトクロームＣ（分子量16000）６Ｌ−バリンこの分離状態も図示のようにきわめて良好であ
る。実施例２分子量約10000のゼラチンを用いる以外は実施
例と同様に製造し、この際の25％グルタルアルデ
ヒド水溶液の滴下量は15mlである。実施例１と同様の処理および条件下で、水溶媒
系のゲル浸透クロマトグラフイー用充填剤として
の性能を調べる。第３図の場合と同じ試料によつ
て得たクロマトグラフは、第２図に示すようにピ
ークが鋭く、各成分の分離状態はきわめて良好で
ある。実施例３分子量約200000のゼラチンを用いる以外は実施
例１と同様に製造し、この際の25％グルタルアル
デヒド水溶液の滴下量は5mlである。実施例１と同様の処理および条件下で、水溶媒
系のゲル浸透クロマトグラフイー用充填剤として
の性能を調べる。第３図の場合と同じ試料によつ
て得たクロマトグラフは、第４図に示すようにピ
ークが鋭く、各成分の分離状態はきわめて良好で
ある。実施例４直径３〜50μmで細孔径30〜2000Åの多孔性シ
リカゲル（商品名YMC−GEL SIL）5gを蒸留水
100ml中に入れ、さらにγ−グリシドキシプルピ
ルトリメトキシシラン5gを添加し、HCIでpHを
４〜５に調整してから、80℃に加熱して約２時間
還流する。加熱後濾過し、蒸留水１リツトルで洗
浄してから60℃で減圧乾燥する。乾燥したシラン
処理シリカゲルに分子量約5000のゼラチン5gを
加え、さらに25％グルタルアルデヒド水溶液2ml
を添加して、蒸留水で全量を200mlとする。この
溶液を均一に攪拌後、さらに攪拌しながら50〜60
℃で３時間反応させる。反応完了後、シリカゲル
担体を蒸留水１リツトル，メチルアルコール１リ
ツトルで洗浄し、30℃で減圧乾燥する。得たシラン処理シリカゲル担体を、内径６mm，
長さ150mmのステンレスカラムに充填する。この
カラムを実施例１と同様の測定条件下でクロマト
グラフを作成するが、試料のタンパク質混合物は
下記の通りである。試料１人血清γ−グロブリン（分子量160000）２牛血清アルブミン３チトクロームＣ４Ｌ−バリン得たクロマトグラフは、第５図に示すようにピ
ークが鋭く、各成分の分離状態はきわめて良好で
ある。実施例５実施例４と同様のシリカゲル5gを蒸留水100ml
中に入れ、さらに３−アミノプロピルトリエトキ
シシラン2.5gを添加し、HCIでpHを６〜７に調
整してから、80℃に加熱して約２時間還流する。
この後は実施例４と同様に処理して、シラン処理
シリカゲル担体を得、これを実施例４と同様の条
件下でクロマトグラフを作成する。得たクロマトグラフは、第６図に示すようにピ
ークが鋭く、各成分の分離状態はきわめて良好で
ある。（発明の効果）本発明に係るクロマトグラフイー用担体は、そ
の粒子表面が架橋ポリペプチド鎖のような親水性
高分子で被覆されているため、溶質と粒子表面と
の疎水性相互作用が極めて小さく低吸着性であ
り、それ故に高速のゲル浸透クロマトグラフイー
用充填剤としてきわめてすぐれている。この担体
はシリカやアルミナなどの無機質粒子であるの
で、高圧・高流速時の機械的強度に富み、しかも
網目状の架橋ポリペプチド鎖で表面被覆すること
により、架橋高分子化合物が表面から溶出した
り、常温の使用でカラムの劣化が生じることはほ
とんど無い。したがつて本発明の担体は、たとえ
ばタンパク質，ポリペプチド，酵素，ホルモン類
などを水系溶媒で分子ふるい効果で分離すること
はもとより、他の極性溶媒によるクロマトグラフ
イー測定などに使用できる。特に本発明の担体
は、水溶性タンパク質やアミノ酸の分離性能がす
ぐれているから、その分析や分取によつて食品工
業，医薬品工業，医療分野に寄与することができ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図から第６図はそれぞれ本発明に係る担体
を用いて作成したクロマトグラフの例を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１可溶性タンパク質またはポリペプチド類をカ
ルボニル化合物によつて架橋結合し、この架橋高
分子化合物で多孔性無機質粒子の表面を被覆して
いることを特徴とするクロマトグラフイー用担
体。２多孔性無機質粒子が、直径１〜500μm，表面
積１〜800m²／ｇ，平均細孔径30〜4000Åの微粒
である特許請求の範囲第１項に記載の担体。３多孔性無機質粒子がシリカゲルである特許請
求の範囲第２項に記載の担体。４可溶性タンパク質が、分子量約5000〜200000
のゼラチンである特許請求の範囲第１項に記載の
担体。５カルボニル化合物として、ジアルデヒド類を
用いる特許請求の範囲第１項に記載の担体。６多孔性無機質粒子の表面に有機シラン化合物
を化学結合し、ついで可溶性タンパク質またはポ
リペプチド類をカルボニル化合物によつて架橋結
合し、この架橋高分子化合物で粒子表面の残存シ
ラノール基を被覆していることを特徴とするクロ
マトグラフイー用担体。