JPH03500604A - 鶏痘ウイルスプロモータ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

技術分野 本発明は、組換えＤＮＡ法の分野に属し、鶏痘ウィルスベクターに挿入される外 来ＤＮＡの発現に有用なプロモータに関する。 従来の技術 ポックスウィルスは、二重直鎖ＤＮＡゲノムを含む複雑な形態を有する大型ウィ ルスである。それらは、細胞の細胞質内で複製するＤＮＡウィルスの少数群の１ つである。それらは６属：即ちオルソポックスウィルスｏｐｊｈｏｐｏｘｖｉｒ ｕｓｅｓ、アヴイボックスウイルスａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ、カプリポック スウィルスｃａｐｒｉｐ。 ｘｖｉｒｕｓｅｓ、レポリボックスウィルスＩ！ｐｏ＋１ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ 、パラポックスウィルスｐａｒａｐｏｘｖｉ＋ｕｓ、及び昆虫ポックスウィルス ｅｎｔ。 ｍｏｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓに分類される。オルソポックスウィルスであるワクシ ニアウィルスは、ポックスウィルスの中で最も広範に研究されており、また米国 特許第４．６０３．１１２号（Ｐａｏｌｅｊｔｉ等）の対象である。鶏痘ウィル スはアヴイボックスウイルス又は鳥類ポックスウィルスである。 組換えＤＮＡ法における最近の進歩により、ワクシニアウィルスは、外来遺伝子 を運搬し、発現するためのベクターとして用いることができるようになった。 この点ニラいては、Ｍ、Ｍａｃｋｅｆｌ　＆　Ｇ、Ｌ、Ｓｍ１ｔｈ　（Ｊｏｕｒ ｎａｌ　０１Ｇｅｎｅｒａｌ　ＶｉｒｏｌｏＢ　６７、　２０６７〜２０８２（ １９８６））を参照されたい。 ワクシニアウィルスのある種の特性により、それは本目的に適するようになる。 先ず、それは、少なくとも２５，０００塩基対までの、そのゲノム中の大量の外 部ＤＮＡを認容する。第二に、それは、特異的にメツセンジャーＲＮＡの転写を ＤＮＡゲノム上のウィルスプロモータ配列から開始するそれ自身のＲＮＡポリメ ラーゼをコードする。宿主細胞ＲＮＡポリメラーゼ■はこれらのウィルスプロモ ータを認識しないか、あるいはワクシニアＲＮＡポリメラーゼは、宿主ＲＮＡポ リメラーゼによって認識されるプロモータから転写しない。これら２つの特性に より、外来遺伝子は、ワクシニアウィルスプロモータの制御下でワクシニアウィ ルスゲノムに挿入可能となる。ワクシニアウィルスゲノムが非常に大きいこと（ １８６，０００塩基対）と、ＤＮＡ単独では感染性でないという事実のために、 制限酵素開裂及びＤＮＡ断片のゲノムとの結紮（連結）という従来の組換えＤＮ Ａ法は、技術的に実行可能でない。したがって、相同組換え操作によりＤＮＡを ゲノム中に導入する。相同組換えは、事実上、（１）ワクシニアウィルス（Ｖ　 Ｖ）の複製及び正常機能を減損しないいくつかの領域における本ウィルスの長さ を予め選択しく以下、「非必須領域」と称する）、（２）非必須領域のコピー中 にある長さの外来ＤＮＡの構築物を作成し、したがってＶＶ　ＤＮＡの非必須領 域の延長配列によって外来ＤＮＡが連結されており、（３）適当な組織培養細胞 を■■で、並びにその構築物で共感染し、（４）構築物ＤＮＡによりゲノム中に それが複製されるよう、ｉｎ　ｖｉｖｏで予め選択された長さが取り換えられた （ｒ組換えられたＪ）ＶＶを含有する細胞を選択することを包含する。 外来遺伝子を構築物中に挿入するためには、構築物はそれ自体ベクター中、例え ばプラスミドに含まれる必要がある。それはまた、ウィルス内の外来ＤＮＡの発 現を調節するためのプロモータを包含する必要もある。その手順は、上記Ｍａｃ ｋｅＨ及びＳｍ１ｔｈの再検討に十分に記載されている。ワクシニアウィルスベ クターは、いくつかのウィルス蛋白質に対するＤＮＡの発現に関して実験的にこ の方法で用いられてきた。例えば、狂犬病ウィルス糖蛋白質の発現に関しては、 Ｍ、Ｋｉｃｎ７等（Ｎａｔｕｒｅ　３１２゜１６３〜＋６６　（＋９８４））を 参照されたい。ワクシニアウィルスベクターは、ベクターとしてのその用途を減 損することなく、弱毒化、即ちそれを低毒性となるよう変えることができるため 、予防接種に使用し得る可能性は十分にある。 原則的に、同様の技法を鶏痘ウィルス（ＦＰＶ）に適用できることがここ数年認 識されており（例えば、Ｍ、　Ｍ、　Ｂ１ｎｎ５等、ｌ５ｒａｅｌ　Ｊｏｕｒｎ ａｌ　ｏｆ　Ｖｅ＋ｅｒｉｎａＢ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４２．１２４〜１２７（１ ９８６）を参照されたい）、それにより、食用飼鳥類の予防接種に用いるための ベクターが提供される。ＶＶと同様にＦＰＶは、非常に大きなゲノムを有する（ ｖ■よりも大きくさえある：概算値２４０〜３６０キロベース）が、それがどの 程度までワクシニアウィルスと似ているかは公知でない。 ＦＰＶベクターにおける外来ＤＮＡの発現に不可欠な要件の１つは強力なプロモ ーターであり、これはＦＰＶ　ＲＮＡポリメラーゼによって認識される。■■に おいてはいくつかのプロモータが確認されているが、しかしそれらの相対的強度 は十分に調査されてはいない。その主なものを以下に示す：１、　ｐ７．５．　 １．５Ｋｄポリペプチドプロモータ。これは初期及び後期活性を有し、ワクシニ アに挿入される遺伝子を発現するた２、　ｐＨ，ワクシニアＨｉｎｄｕ断片Ｆ／ Ｅの接合部にマツピングされ、ＩＩＫｄの大型構造ポリペプチドに対する遺伝子 は、広範に用いられてきた後期プロモータを有する。Ｃ，Ｂｅ＋１ｈｏｌｅ１等 、Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２．　２０９６〜２１０ ０（１９８５）。 ３、　ｐＴＫ、チミジンキナーゼをプロモートする。この遺伝子はワクシニアＨ ｉｎｄＩ［［断片にマツピングされる。Ｊ、Ｐ、Ｗｅｉ＋等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 　１５８．　２０６〜２１０　（１９８７）。このプロモータは大いに用いられ てきたというわけではなく、強力ではないと尤えられる。 ４、ｐＦ、未知の、初期非必須遺伝子をプロモートする。 これはワクシニアＨｉｎｄｕ断片Ｆでマツピングされる。Ｄ。 Ｐａｎ１ｃａｌｉ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａ目、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８０．　５ ３６４〜５３６８（１９８３）を参照されたい。最近、「相対的に有効でない」 、即ちＴＫプロモータの１０分の１の効力しかないことが明らかにされた。Ｂ。 Ｅ、　Ｈ１Ｃｏｕｐ２＋等、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｔａｌ、８８．２２９９〜２３０ ９（１９ｇ？）。 ５、　ｐ４ｂ、４ｂ遺伝子は６２Ｋｄのコア蛋白質をコードする。それは、ワク シニアＨｉｎｄＩＩＩ断片Ａにマツピングされる後期ブロモ参照。４ｂ蛋白質は ワクシニアにおけるウィルス蛋白質の約１０％を占める。 ６、及び７．　ｐＭ、及びｐｌ、　これらは、それぞれワクシニアＨｉｎｄＩＩ ［％片Ｍ及びＩ断片からの２つの特徴のない初期ワクシニアプロモータであって 、多価ワクシニアワクチン作成に用いられる。Ｍ、　Ｅ、　Ｐｅ＋ｋｕｓ等、５ ｃｉｅｎｃｅ　２２９．　９８１〜９８４　（１９８５）。 ８、　ｐ２ｇＫ、　後期２８Ｋｄコア蛋白質をコードする遺伝子をプロモートす る。Ｊ、Ｐ、Ｗｅｉｒ等、Ｊ、　Ｖｉｔａｌ、　６１．　７５〜８０　（１９ｇ ？）。これは大して用いられてはいない。 ＦＰＶのゲノムＤＮＡ配列についての情報不足のため（そして事実、ｖｖは、Ｖ ｖのゲノムＤＮＡ配列の約３分の１に関してしか発表されていないために）、ｖ ｖにおいて公知の特定プロモータと同様のものがＦＰＶにもあるのか否かは予測 できなかったし、あるいはプロモータとしてのその効能を予測することはできな かった。 ＦＰＶのゲノムのＤＮＡ配列に関しては、非常に限られたデータだけが発表され ているにすぎない。したがって、Ｂｏｙｌｅ等（Ｖｉ＋ｏｌｏｇｒ　１５６．　 ３５５〜３６５　（１９８７））は、チミジンキナーゼ（Ｔ　Ｋ）遺伝子の配列 を発表し、合計１０６１塩基対の配列を配置した。これらの著者達は、ＦＰＶプ ロモータ領域を探求し、それが、１１の■ｖプロモータに共通のいわゆるコンセ ンサス配列を含むことを認めた［Ａ、　Ｐｌｕｃｉｅｎｎｉｃｘａｋ等、Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　１３．　９８５〜９９８　（１９８５ ）］　、この「コンセンサス配列」はＴＡＴＡ・・・・・・（２０〜２４ｂｐ） ・・・・・・ＡＡＴＡＡを基礎としていると考えられるが、しかし、それからの 多数の逸脱が認められたし、また全領域は非常にＡＴ−リッチであるため「コン センサス配列」という概念は批判的検討に耐え得ない。さらに、これらのコンセ ンサス配列とＴＫｍＲＮＡＳの５′末端との間の距離は、ＦＰＶとｖｖとの間で 隔たっている。ＦＰＶ　ＫＴ遺伝子はワクシニアウィルスベクターにおいて発現 され、したがって■ＶＲＮＡポリメラーゼに認識されることが判明したため、こ れら２つのプロモータ間のある程度の類似性が推定される。もちろん、全てのｖ ｖプロモータが全てのＦＰＶプロモータと非常に相同性が高いということにはな らず、事実、本発明者の未発表データは、これが真相でないことを示唆している 。 さらに従来技術は、「発明の要約」の項の後で言及するつもりであり、その内容 も明らかにされる。 発明の要約 本発明の多くは、いくつかのＦＰＶ遺伝子の位置を定め、プロモータ性強度に関 してそれらに関連した５′非コード領域を試験し、それによっである強力なプロ モータを選択することによって生じた。 ＦＰＶゲノムのいくつかの領域は、本発明に至る研究で調べられてきた。それら のいくつかはＤＮＡを酵素ＢａｍＨＩで切断し、それによって生成されるプラス ミドの範囲内から約１１，２キロベースの挿入体を有するものを選択し、そのＤ ＮＡ長を調べることによって生じる。別のものは、ＦＰｖゲノムを無作為（ラン ダム）クローニングし、これらの配列を上記ワクシニア４ｂ遺伝子のＤＮＡの配 列と比較することによって生じた。 強力なプロモータを確認する別の方法には、ＦＰＶ　ＤＮＡからのＲＮＡ転写を シミュレートすることが含まれる。 その結果、５つの強力なプロモータが判明したので、本発明はそれらを含む種々 のＤＮＡ分子を提供する。ポックスウィルスＤＮＡのプロモータについては、現 在、科学的には十分には分かっていない。遺伝子の５′又は「上流」末端までの 一定の領域は、転写に関与するＲＮＡポリメラーゼを結合することによりメツセ ンジャーＲＮＡにゲノムＤＮＡを転写するのに役立つので、その遺伝子の開始コ ドンを含むＲＮＡの転写が可能となるということは公知である。このような上流 領域が「プロモータ」と呼ばれる。上流配列のヌクレオチドのどれがプロモーシ ョンに不可欠で、どれが不可欠でないか、あるいは公知のプロモータの正確には どれが最小でどれが最大の長さなのかをはっきりということはできない。プロモ ータがどのあたりで、どの位の長さであるか正確に分からないのは一見、かなり 不満足であるようであるが、ＤＮＡの転写に役立つ領域外の別のＤＮＡを含入す ることについては通常何の害もないため、実際には問題でない。さらに、後述す る通り、それは、この領域をさらに精確に測定するための冗長な実験によって可 能となる。これらの全情況においては、したがって、プロモータの配列に言及す るよりむしろ、それが先行する遺伝子に言及することによってプロモータを定義 する方がより妥当である。問題の遺伝子のうち４つは、ＢａｍＨＩ断片のオープ ン読み枠０ＲＦ８．０ＲＦ５及びＯＲＦ　１０のものであり、大半がほとんどワ クシニア４ｂ遺伝子に対応する（最高度の相同性を示す）ＦＰＶの遺伝子であ、 る。最後に記載したＦＰＶ遺伝子は、便宜上ＦＰ４ｂと呼ばれる。これらの遺伝 子は、以下の実施例１で十分に確認される。 ５番目の強力にプロモートされる遺伝子は、ウィルスＤＮＡが転写される場合に 生成されると考えられるｍＲＮＡの量を調べることにより確認した。強力なプロ モータは、弱いプロモータよりも大量のＲＮＡの転写を指示する、というのがそ の理論である。Ｉｎ　ｖｉｖｏの実験で生じる問題を回避するために、ＲＮＡは 、ｉｎ　ｙｉｖｏ　＆写に匹敵すると思われる方法でｉｎマ１１ｒＯで調製した 。このようにして調製したＲＮＡを、ＦＰＶ　ＤＮＡのＢ１［１１ＨＩ及びＥｃ ｏＲＩ制限断片と交雑（ハイブリダイズ）した。 いくつかの断片との強力なハイブリダイゼーションによって強力にプロモートさ れた遺伝子が示されるようになり、この方法によって、少なくとも一部、０．７ ９　ｋｂ　Ｅ　ＣＯＲＩ断片内に整列するこのような遺伝子が確認されて、その 断片が部分的に配列された：実施例２参照。 これら５つの遺伝子は種々の方法で定義することができるが、もちろん、１つの 鎖の間、あるいはＦＰＶの種類の間で、それらの配列の差異は疑いなく小さいと いうことは常に共通している。それらを定義する便利な、且つ任意の方法の１つ は、それらがコードする適当な長さのアミノ酸配列に言及することである。最初 の１０個、さらに好ましくは最初の２０個のアミノ酸といったところが、ＦＰＶ におる独特の配列を形成ｒると考えるのが理にかなっている。したがって、４つ の遺伝子のある慣用的定義は、以下に示すと同様の最初の２０個のアミノ酸に基 づくものである： （＋）ＦＰ４ｂ遺伝子。これは以下の開始配列を有する、約６５７個のアミノ酸 の蛋白質をコードする。 Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｔ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　 ＧｌｕＧｌｕ　Ｖａｌ　ＬＦＳ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｕ（２）ＢａｍＨＩ断片０ＲＦ８遺伝子。以下の開始配列を有する、 約１１６個のアミノ酸の蛋白質をコードする。 Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐ＋ｏ　ＡｒｇＡｒｇＳｅｒ　５ｅ ｒＡｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔ＋ｐλｔｅｌ　Ｌｅｕ　ｌ１ｅＰｒｏ　Ｇａｓ　 Ｇｌｙ（３）ＢａｍＨＩ断片０ＲＦ５遺伝子。以下の開始配列を有する、約１０ ５個のアミノ酸の蛋白質をコードする。 Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｙｙｓ　Ａｌａ 　ＬｅｕＧｌｙ　Ｓｅｔ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｓｅｔ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　 １４６　Ｔｈｒ（４）Ｂ２ｍＨＩ断片ＯＲＦ　１０遺伝子。以下の開始配列を有 する、約２８０個のアミノ酸の蛋白質をコードする。 Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｃ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ＡｒｇＡ＋ｎ　Ｔｈｒ　ｌ １ｅＬｙｓ　Ｌｙｓ　ｈｉｅｌ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　ｌ１ｅＬｙ ｓ　ｌ１ｅ−遺伝子（５）は、少なくとも一部は？９０ｂｐ　（０，７９ｋｂ） 　Ｄ　Ｎ　Ａ配列内に位置し、その５′末端付近に配列：（５’）　ＴＧＴＣＡ ＴＣＡＴＡ　丁ＣＣＡＣＣＴＡＴＡ　ＡＡＴＧＴＡＡＴＡＴを、またその３′末 端付近に以下の配列： ＡＡＧＡＡＴＡＧＴＣＴＡＡＡＴＴＡＣＣＴ　ＡＡＣＡＴＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴ 　（３’）を含む、と定義することができる。 遺伝子（１）〜（４）に関しては、２０個のアミノ酸における変動は異なるＦＰ Ｖ株間で生じるであろうことは、もちろん理解できる。おそらく、全遺伝子に関 して少なくとも９０％の相同性が認められるが、しかし、最初の２０個のアミノ 酸に関しては相同性が低くてもよく、おそらくは３〜４つまでの差異が認められ る。しかしながら、最初の１０〜２０個のアミノ酸配列における異所性の正確な 度合いは何であれ、どの遺伝子が意図するものに関して当業者はいかなる疑いも ないことは確かである。 同様に、遺伝子（５）に関しては、引用したＤＮＡ配列は検出されたＥＣ０ＲＩ 断片のものであり、ＦＰＶのいくつかの株においては、一方又は両方のＥｃｏＲ Ｉ制限部位を欠く可能性があり、その結果、ＤＮＡ配列を引用することが限定的 である。７９０ｂｐ断片に関して本明細書に示された配列情報の助けをかりれば 、７９０ｂｐ　ＤＮＡのシーケンシングを容易に完了し、次いて、遺伝子（５） に対する開放読み枠（ＯＲＦ）を見出すことができる。 この遺伝子は、必ずしも？９０ｂＵ断片内に全部が配置するとは限らない。した がって、７９０ｂｐ　ＤＮＡを標識し、それを用いて、異なる酵素による制限に よって作製されるＦＰＶゲノムＤＮＡのライブラリーをプローブすることによっ て、７９０ｂｐ領域の両側のゲノムの配列を決定する必要があり得る。ＯＲＦの 開始が突きとめられた場合は、５′非コ一ド配列をプロモータＤＮＡとして用い ることができる。この断片内に配置する２つの遺伝子が偶然に存在する場合は、 どちらかが、ＲＮＡとより強力に交雑しようとする。ＦＰＶ株間に何らかのヌク レオチド変動を存在する可能性はあるけれども、ＤＮＡレベルではおそらくは、 少なくとも８０％の相同性が認められるものと思われる。しかしながら、当業者 は、どの遺伝子が意図されていることに関して何の疑念もないと確信する。まも なく、ＦＰＶゲノムの部分的地図を作製できると予測される。その他のポックス ウィルス同様、ＦＰＶは、その両端間に類似性を有する直鎖ゲノムを有する。そ の末端配列は逆に反復される。これらの末端逆転反復（ＴＩＲｓ）内では、直列 的反復配列が存在する。指示されたＢａｍＨＩ消化によりこれらの末端逆転反復 （Ｔ　Ｉ　Ｒ）配列を含有するクローンが生じ、検査したＦＰＶ株のＴＩＲ内に は、約１１、２ｋｂ断片の一端（本明細書で後述する配列の左手）で約３．７〜 ４．Ｏｋｂの長さが存在することが確定されている。ＦＰ４ｂ遺伝子は、そのゲ ノムの中心領域にあることは確かである。０．７９ｋｂ配列のどのあたりである かは、目下不明である。 本発明は、実質的に、上で確認された遺伝子の各々の５′末端側に位置する非コ ードＤＮＡから成り、そのプロモータを包含するＤＮＡ分子を含む。「非コード 」とは、その遺伝子をコードしないことを意味する：それは別の遺伝子をコード し得るし、またプロモータとして働き得る。任意の合理的長さのこのようなりＮ Ａ、一般的には１５０ヌクレオチド（又はｄｓＤＮＡの場合は塩基対）まで、通 常１００ヌクレオチドまで、特に８０ヌクレオチドまでの５′末端（それがゲノ ムに沿った次の遺伝子内のＤＮＡをコードする場合でも）を、本明細書では「プ ロモータＤＮＡＪと称する。 本発明はまた、ＦＰＶの非必須領域（ＮＥＲ）配列を含有するクローンベクター 内 記ＮＥＲは該プロモータにより転写される（ｂ）外来遺伝子（即ちＦＰＶベクタ ー中に挿入されるのが望ましい遺伝子）がその本発明はまた、順次： （１）鶏痘ウィルス（Ｆ　Ｐ　Ｖ）ゲノムの第１相同組換え可能な配列、 （２）ＦＰＶゲノムの非必須領域（Ｎ　Ｅ　Ｒ）の第１部分内の配列、（３）本 発明（７）ＦＰＶプｏモータＤＮＡ。 す （４）プロモータによる転写可能終下流の外来遺伝子（それによって、鶏痘ウィ ルスＲＮＡポリメラーゼがプロモータと結合した場合、外来遺伝子をｍＲＮＡに 転写する）、（５）ＦＰＶゲノムの同−ＮＥＲの第２部分内の配列。第−配列及 び第二配列は、好ましくは、ＦＰｖゲノム内のＮＥＲの第１及び第２部分の場合 と同じ相対配向（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）である。 （６）ＦＰＶゲノムの第２相同組換え可能配列、から成る組換えベクターを含む が、この場合、上記配列　（１）及び（６）はＦＰＶゲノムのＮＥＲの側面に配 置し、組換えベクター内において、ＦＰＶゲノム内に存在する場合と同じ相対的 配向である。 さらに本発明は、転写可能な様式で外来遺伝子と結合する本発明のプロモータを 包含するＤＮＡ構築物を含む。このような構築物又は「カセット」はクローンベ クター内に挿入でき、次いで本発明の組換えベクターを調製するに際して有用な 組換えベクターとして用いることができる。 本発明はさらに、本発明の組換え及び組換えベクターを有する宿主、特にプラス ミドベクターを有する細菌宿主を含む。 本発明はさらに、外来遺伝子を含有する本発明の組換えベクターによるＦＰＶの 相同組換えの生成物である組換えＦＰＶ。 相同組換え操作法；このような組換えＦＰＶに感染される動物細胞；及び反応性 動物、特にニワトリをワクチン接種する方法（これは本発明の組換えベクターを 用いて接種することから成る）を意図する。 従来技術の追加説明 １９８６年９月２４〜２８日に一ニーヨークのＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒで開催された国際ポックスウィルス研究会会議ｔｈｅ　１ｎｊｅ＋ｎａｊ ｉｏｎａＩ　Ｐｏｘｖｉｒｕｓ　Ｉｌ’ｏ山ｈｏｐ　ｍｅｅｔｉｎｇで、Ｆ、３ ．　Ｔｏｍｌｅｙは、「鶏痘ウィルスの１１．３ｋｂ断片の分子構造及び構築Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　５ｆｒｕｃｌ＋＋ｒｅａｎｄ　ｏｒｇａｎｉｘａ＋ｉｏｎ　 ｏｆ　２ｎ　１１．３ｋｂ　ｆｒ２ｇｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｉｏｗｌｐｏｘｖｉ＋ｕ ｓＪという演題で、スライドを用いて講演した。この講演は、１１．２ｋｂ　Ｂ ａｍ旧断片（当時はＩｌ、　２ｋｂというよりむしろ１１．３ｋｂの長さである と考えられていた）のシーケンシングの予備的結果についての概略を示すもので あった。本講演は、断片の富ＡＴ性を取扱い、２０の開放読み枠を示すスライド を含み、ＦＰＶにおける使用コドンを考察し、ＦＰＶ４８ｋｄ予測ポリペプチド （本明細書ではｒＯＲＦＩＪ）と■ｖにおける４２ｋｄ初期蛋白とを比較し、そ の他の予測ポリペプチドを肝臓レクチン及び抗アルファトリプシノーゲンと比較 した。０ＲＦｓの機能性について、あるいは遺伝子発現の強度については言及さ れなかったし、任意の長さのＤＮＡ配列も示されながった。同一の講演が、１９ ８７年４月、スコツトランドの３１．Ａｎｄｒｅｖｓで開催されたｔｈｅ　Ｈｅ ｒｐｅｓ／　Ｐｏｘｖ１ｒｕｓ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅ ｔｙ　ｊａｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＯｇ−ｙで行われた。 １９８７年９月の会議では、］、　１．人、　Ｃａｍｂｅ　ｌ　１等が、Ｉｌ、 　２ｋｂ　Ｂ２ｍＨＩ断３片とそのゲノムの末端との間に存在するＦＰＶの末端 Ｂ　２ｍＨＩ断片に関連するポスターを展示した。ＤＮＡ配列は示されて（１９ ８８））は、ＢａｍＨＩ断片の全配列を、予測ポリペプチドと他の蛋白質との関 係についての詳細とともに示した。１２の主要０ＲＦｓの上流の配列の機能的プ ロモータ活性についての研究は、未発表データとして言及されている。このデー タが最初に開示されたのは、１９８８年８月２２〜２６日ハイデルベルグで開催 された第７回国際ポックスウィシス／イリドウィルス会議ｔｈｅ■ｌｈ　Ｉｎｔ ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｏｘｖｉｒｕｓ／Ｉｒ１ｄｏｖｉｒｕｓ　Ｍｅｅｔｉ ｎｇでＭ、Ｅ、　Ｇ。 Ｂｏ＋＋＋５ｎｅｌ１等が展示したポスターにおいてであった。 ４、

【図面の簡単な説明】

第１図は、鶏痘ウィルスに適用する場合の相同組換え操作の全体図を示し； 第２図及び第３図は、相同組換えに有用な本発明の組換えベクターの由来を模式 的に示すプラスミドマツプであり；第４図はトランジット・アッセイにおいて本 発明のＦＰＶプロモータを試験するための構築物の由来を示すプラスミドマツプ ロモーションに必要なりＮＡの正確な長さは公知でないが、一般的にはＲＮＡ開 始部位から１００塩基対までであるとみなされる。しかしこれは遺伝子開始部位 （ＡＴＧコドン）から５０塩基対の距離であるとすることもできる。したがって 、遺伝子の５′末端（開始コドンの直前）に対して１５０塩基対、好ましくは１ ００塩基対未満もしくは８０塩基対未満以内に含まれるＤＮＡ配列が、本発明の 目的には特に有益である。遺伝子（１）〜（４）に関するこれらの１５０塩基対 のＤＮＡ配列を以下に示す（読み易いよう任意に１０個ずつのブロックに分けた ）。 ＦＰ４ｂ　（５’）　ＴＡＴＴＡＣＧＴＧＧ　ＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴ　ＡＴＣＴ ＴＣＡＧＧＡ　ＡＡＡＧＧＧＴＡＴＴ　、〜ＴＧＴＴＡＣＣ`Ｇ ＾ＴＧＡＴＡＴＡＡＧ　ＡＧＡＡＣＴＣＡＧＡ　ＧＡＴＧＣＴＡＴＴＡ　ＴＴＣ ＣＴＴＡＡＣＴ　ＡＧＴＴＡＣＧＴＣＴＣＴＴＴＡＧＧＴＡＣＴＴＡＴＴＴＴＧ ＡＴ　ＡＣＧＴＴＡＣＡＡＧ　ＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡ　ＴＣＡＡＡＴＡＴＡＡ（ ３′） ＯＲＦ８　（５’）　ＡＧＡＡＴＡＧＣＡＴ　ＴＧＣＡＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣ ＧＡＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＡＡＴ　ＡＴＡＧＧＴＧＴＴＣ＾ＡＣＡＣＣＴＣＴＣ ＧＡＴＡＴＡＴＣＡＴ　ＴＡＴＴＴＧＴＴＴＴ　ＴＴＣＡＡＴＴＴＴＡ　ＴＴＡ ＴＡＡＧＴＡＧＴＴＴＧＡＡＴＧＣＡ　ＴＴＴＴＴＡＡＧＴＴ　ＴＡＡＴＡＡＡ ＴＣＴ　ＴＧＡＴ＾＾＾ＧＴＡ　ＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡ（３′） ＯＲＦ５　（５’）　ＴＡＡＡＣＣＡＡＡＴ　ＡＴＡＣＴＡＡＡＡＴ　ＡＴＡＡ ＡＡＴＴＡＴ　ＧＣＣＧＣＧＧＧＡＴ　ＧＡＴＡＡＧＡＴＡb ＴＴＣＡＧＡＴＧＡＴ　ＣＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＡＴＡＴＴＴＡＴＴ　ＡＡＴＴ ＧＧＣＡＡＴ　ＡＣＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧｍＡＴＡ　ＡＣＡＴＡＴＧＴＡＡ 　ＡＴＡＴＡＡＴＡＡＡ　ＣＡＡＴＡＡＴＴＴＡ　ＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡ（３′ ） ＯＲＦＩＯ（５’）　ＡＣＴＡＧＡＴＴＧＴ　ＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡ　ＡＴＡＴ ＧＴＧＴＡＡ　ＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴ　ＡＧＴＡＡＴＡＴＡf ＴＡＧＧＡＴＧＴＧＡ　ＴＡＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＡＧＡＡＡＡＡＴ　ＴＴＴＡ ＴＡＴＴＴＧ　ＴＡＴＡＡＡＡＣＣＧＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡ　ＴＡＡＡＣＨＡＴ Ｔ　ＴＡＧＴＴＡＣＴＴＴ　ＧＴＡＧＡＧＴＡＴＡ　ＣＴＡＡＡＴＡＡＴ＾（３ ′） 上記配列において、ＡＴＧ開始コドンは右手又は３′末端に続く。 有効なプロモーションに必要とされる５′非コ一ド配列がどの位の量であるのか は、正確には分からない。しかしながら、この疑問に応えるために実験を行うこ とができるし、実際、ｖｖに関してい（っかの実験がなされている。その結果、 ＦＰＶに必要な配列を調べるために同様の実験が可能であると考えられた。この ような方法の１つとして、欠失マツピングがある：これは、簡単な方法で試験中 の配列の一部を除去し、その後のプロモーション効能を検定すると、プロモータ 活動に十分な配列を確認することができるというものである。したがって、ワク シニアにおいては、１１キロダルトン（１１Ｋｄ）の遺伝子の上流の配列の１０ ０塩基対（ｂｐ）がプロモータとして作用するに十分であって、一時的に後期転 写を調節することが判明した（Ｃ。 Ｂｅ＋４ｂｏｌｒ１等、Ｐｒｏｃ、Ｎ［１，Ａｃｘｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ］　８ ２．’　２０９６〜２１００（＋９８５））。ｍＲＮＡ転写が開始すると推定さ れる部位の５′側で約＋５ｂｐを残した欠失は、依然として高レベルの発現を生 じた（１９Ｈ））は、新しい位置に移した場合、同一断片は低レベルで機能する ことを見出した。この新しい場所では、ＡＴＧ開始コドンの５′側の３２ｂｐ残 した欠失は、プロモータ強度に何の影響も及ぼさなかった。Ｍ、　Ａ、　Ｃｏｃ ｈｒａｎ等（Ｐｒｏｅ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。 （ＵＳＡ）　８２．　１９〜２３（１９８５））は、？、５ＫｄＶＶプロモータ ノ活性カ約３０活性上約３０ｂｐセグメントとを示した。Ｊ、Ｐ、ＷｅｉｒとＢ 、Ｍｏ５ｓ上流３２ｂｐがｖｖにおけるチミジンキナーゼ（Ｔ　Ｋ）のプロモー ションを正しく調節するのに十分であることを見出した。 ２８Ｋｄ後期遺伝子の前方２２８ｂｐのＤＮＡ配列（ＲＮＡ開始部位に対して一 ２１８位置から＋１０位置まで）は、クロラムフェニコールアセチルトランスフ ェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の前面に位置し、プロモータとして作用することが判 明した（Ｊ、Ｐ、Ｗｓｉｒ及びＢ、Ｍｏ５ｓ、Ｊ、Ｓ’ｉ＋ｏｌｏｇｙ　６１． 　７５〜８０（１９８７））　、　ＲＮＡ開始部位に向って伸びる一連の５′欠 失が作製された。ＣＡＴ発現の漸減は、欠失が−６１から−１８までに及んだ場 合に起きた。ＲＮＡ開始部位の１８ｂｐ前及びｌ０ｂｐ後を保持する突然変異体 は、依然として、亜最大レベルではあるが、後期遺伝子としてＣＡＴ遺伝子を発 現した。 欠失マツピングはプロモーション活動に十分なそれらの配列を限定し得るが、限 定配列内での活動に必要とされる正確な塩基を正確に定めることはできない。様 々な研究者が、特異的オリゴヌクレオチドを合成することにより（Ｍ、Ｈａｎｇ ｇｉ等、ｌｏｃ。 ｃｉｆ）、又は部位特異的突然変異誘発（Ｊ、　Ｐ、　Ｗｅｉｒ及びＢ、Ｎｏ＝ ｓ、Ｊ。 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６１．　７５〜８０（１９Ｂ？））によって、推定プロモー タ配列内の塩基を変更した。どちらの場合も、ご（少数の塩基、あるいは単一の 塩基であっても、その変更は、プロモーションの効能に著しい作用を及ぼし、そ れによって重要性を有する個々の塩基が確認された。しかしながら、配列におけ るいくつかの変化は、プロモーション効力の損失を伴うことなく許容されるたカ バーすべきものであることが必要であるのは当然のことであると思われる。 上記実験は、プロモータの効能に対する試験を必要とする。 このために、ＦＰＶにプロモータ遺伝子構築物を導入し、その遺伝子生成物の発 現を監視する必要はない。暫定的検定（トランジットアッセイ）として公知の短 期方法は、ｖｖに関して用いることが知られている（Ｍ１人、　Ｃｏｃｈ＋ａｎ 等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　８２．　１９〜２３　（１９８５））。暫定的検定では 、プロモータは、容易に検定可能な生成物を伴う遺伝子と結合される。次いで、 この構築物を含有するプラスミドを、ウィルス感染細胞に導入する。ウィルスＲ ＮＡポリメラーゼは、プロモータがウィルスゲノムに組み込まれていない場合で さえ、プロモータがら転写できる。ウィルスＤＮＡとプラスミドＤＮＡがともに 細胞中に存在する間だけ発現するため、この型の発現は「一過性」として知られ ている。２つの異なるマーカー遺伝子がワクシニアウィルス暫定検定系で用いら れてきた。この２つとは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ ＣＡ　Ｔ）遺伝子（Ｍ、　Ａ、Ｃｏｃｈｒ８ｎ等、上記）と、ベーターガラクト シダーゼｒ　ＩａｃＺＪ遺伝子（Ｄ、Ｐａｎ１ｃａｉｉ等、Ｇｅｎｅ　４７．１ ９３〜１９９　（１９Ｈ））である。ＣＡＴ遺伝子を用いた場合、試験中のプロ モータ配列は、それ自体のＡＴＧ開始コドンを含む全ＣＡＴ遺伝の前面でクロー ニングされた。したがって、これは「転写的融合」配列であり、即ちその配列は 非コード領域で融合される。ベータ〜ガラクトシダーゼＩａｃＺ遺伝子の場合に は、転写的融合ベクターと翻訳的融合ベクターの両方が、組換え体における暫定 検定及び試験に関して記載されている。翻訳的融合ベクターは、それ自体の開始 コドンを欠くベーターガラクトシダーゼ遺伝子を含有するので、したがって、融 合はコード領域内で起こる。ＡＴＧ開始コドンは、試験中に、ｖｖプロモータに よって提供された。したがって、ベーターガラクトシダーゼｒ　ＩａｃＺＪ遺伝 子は、Ｖｖ遺伝子開始コドンを有する枠内にあるようにクローニングされ、その ｖＶ遺伝子はそのコドン９の前でＩｘｃＺ遺伝子と融合した。このようにして、 プロモータは、その本来の位置におけると同様に、融合ベクター中で用いる開始 コドンに対して正確に同じ関係で存在した。 本発明においては、ＩａｃＺ遺伝子は、プロモータ強度を測定するための暫定的 検定に対してのみ用いてきた。しがしながら、本発明の実施に際し、食肉用飼鳥 の条件を改良するのに適した外来遺伝子を鶏痘ウィルス中に挿入することは妥当 であると思われる。好ましくは、その遺伝子はｉｎ　ｖｉｖｏサブユニットワク チンに適したもの、例えば伝染性気管支炎ウィルスＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓＢ＋ｏ ｎｃｂｉｌｉｓ　Ｖｉｒｕｓ　（Ｉ　ＢＶ）　、伝染性包嚢病１ｎｆｅｃｌｉｏ ｎｓＢｕｒｓａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｍｉｎｕｓ、　ニューカッスル病ウィルス ＮｅｗｃａｓｌｌｅＤｉｓｅａｓｅ　Ｖｉ＋ｕ＋　（Ｎ　Ｄ　Ｖ）　、７シック 病ウィルスＭａｒｅｋ’　５Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕａ　、伝染性喉頭気管支 炎ウィルスＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓＬａｒｙＢｏｌｒｘｃｈｅｉｌｉｓ　Ｖｉｒｕ ｓから選択される１つ又はそれ以上の遺伝子、並びにアイメリア属Ｅｉｍｅ山の 抗原蛋白質をコードする遺伝子である。特に有益な遺伝子は、ＰＣＴ国際特許出 願公開第１１６−０５８０６号及び欧州特許公開第２２７４１４Ａ号（ともにＮ ａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐｏｒａ ｔｉｏｎ）に記載されていると同様のＩＢＶのスパイク遺伝子並びにＮＤＶのＨ Ｎ及びＦ遺伝子である。外来遺伝子がｉｎ　ｖｉマ０で正確に翻訳されるために は、外来遺伝子がプロモータ直後の領域に挿入されるそれ自身のＡＴＧ開始コド ンを有する必要がある。 本発明のプロモータ及び所望の外来遺伝子を挿入するために、ＦＰＶの非必須領 域をつきとめる必要がある。原則として、ウィルスの基本的機能に害を及ぼさな いか、あるいはＦＰＶプロモータ又は外来遺伝子の作用を妨害しないと思われる ＦＰＶゲノムの任意の場所にそれらを挿入することができる。それはコード領域 にでも非コード領域でもあり得る。ＶＶにおいては、チミジンキナーゼ（Ｔ　Ｋ ）遺伝子はしばしばこのために用いられてきた。例えば、７．５にワクシニアプ ロモータ及びＴＫ非必須領域を用いてＶＶにおけるＩＢＶスパイク遺伝子の発現 を記載する上記国際特許出願第８６１０５８０６号明細書の実施例４を参照され たい。 外来遺伝子挿入の検出は、任意の非必須遺伝子、例えばＴＫを産生じないウィル ス感染細胞の検出に依存すると理解される。 このような細胞はｒＴＫマイナス」と記載される。それに代わる方法として、Ｔ Ｋ遺伝子、あるいは無マーカーコード又は非コード傾城を用いて、外来遺伝子配 列を補足する標識ヌクレオチド配列を用いるハイブリダイゼーション検定による 外来遺伝子の挿入を検定することができる。 １９８８年３月２４日に公開されたＰＣＴ出願Ｉｔ’０８８１０２０２２　（Ｃ ３ＩＲＯ）には、優性選択性マーカー遺伝子（ｒＥｃＢｐｌＪ　）及び■■プロ モータの助けによりＦＰＶのＴＫ遺伝子内に外来遺伝子をしっかりと挿入する方 法が記載されている。この特許出願の開示は、特表千３−５００６０４　（９） ｖ■プロモータを本発明のＦＰＶプロモータに置き換えて、本発明において用い ることができる。ＦＰＶプロモータの使用は、獣医薬許可当局に受け入れられる と思われ、好適である。 本発明のプロモータ及び外来遺伝子を、次いでＦＰＶゲノムの非必須領域（Ｎ　 Ｅ　Ｒ）に挿入しなければならない。図面の簡単な説明されている相同組換えの 操作は、挿入する方法を提供する。ＮＥＲを含むゲノムＤＮＡの断片は、クロー ニングベクター中でサブクローニングする。所望により、それの側面に配置する 配列のほとんどを除去するために短縮し得る。次いで、クローニングベクター内 にＮＥＲの一部（その一端で開始）を、その後本発明のＦＰＶプロモータ（ｒＰ Ｊ　）を、次いで外来遺伝子を、その後事実上ＮＥＲの残り（その他端で停止） を包含する構築物を作製する。この構築物は、適当なベクター内で、例えばリン 酸カルシウム法により、ＦＰＶに感染された細胞をトランスフェクトするのに用 いられる組換えベクターを形成し、それにより、ベクター内のＮＥＲ配列とＦＰ ＶのＮＥＲ配列との間に組換えを生じる。次いで、ＦＰＶは自動的にこの変更ゲ ノムを再パッケージする。したがって、変更ＦＰＶ（組換えＦｐｖ）は本発明の 一部である。 図面の第２図及び第３図は、上記組換えベクターを作製する代わりの方法を説明 する。先ず第２図に関しては、２つの制限部位ＡＳＢを有する非必須領域は適当 なベクター内に挿入されるが、これは説明としてプラスミドと記載する。同一（ 又は結紮できるよう適合する）制限部位Ａ、Ｂを有する別のプラスミドにおいて は、構築物は本発明のＦＰＶプロモータ配列及びそれに続く外来遺伝子配列によ り作製する。この構築物が作製され、それにより外来遺伝子開始コドンで又はそ の前でｍＲＮＡ転写が始まることがもちろん不可欠である。ｍＲＮＡ転写開始が 任意の特定のプロモータによって生じる場所を正確に決定するのは時間がかかる ため、通常はそのプロモータを良好に作動させるようプロモートするＦＰＶ遺伝 子の直前の例えば１００あるいはさらに好ましくは１５０塩基対のプロモータＤ ＮＡを、単に挿入するのが便利である。しかしながら、予め指示された実験を行 うための時間があれば、プロモータＤＮＡの一部はそれを短くするための制限酵 素処理により「かみ砕（（ｃｈｅｗｅ＋Ｉ　ｏｆｆ）Ｊことができ、それによっ て任意の非必須配列を排除できる。このような適応は、本明細書に記載の本発明 の特定の実施例の非本質的な変化であると考えられる。同じく、例えば、その天 然ＦＰＶ遺伝子配列の２〜３塩基対を含入するために、その下流端でプロモータ 配列を延長することができる。これにより、外来遺伝子配列が天然ＦＰＶ遺伝子 を伴う枠内にあるよう配列される場合は、一般的に翻訳融合蛋白質のｉｎ　ｖｉ ｖｏ発現が起こる。 しかしながら、このような蛋白質は特に望ましくなく、事実、任意の短い配列の ヌクレオチドが、プロモータＤＮＡと外来遺伝子の開始コドンとの間に位置し得 る。 制限部位Ａ、Ｂは、ＦＰＶプロモータＤＮＡ及び外来遺伝子の側面に配置するプ ラスミドＤＮＡ内にある。もちろん、Ａは、それがそのプロモータの非機能部分 にあたる場合には、プロモータＤＮＡ内であり得る。Ａ及びＢは同一でもかまわ ない。それらは粘着性又は平滑末端部位であり得るし、さらに組換えＤＮＡ分野 で十分公知の方法で、ヌクレオチドをさらに充填し、及び／又は結紮（ライゲー ト）することにより人工的に調製することができる。２型の構築物におけるＡ及 びＢは同じ平滑末端部位（Ｃ１示されていない）に転換され、次いでＮＥＲ内の 単一平滑末端部位Ｃ（Ａ、Ｂに代わる）での組換えが可能になる。もちろん、他 の配列のＤＮＡの組換えが起るのを防ぐためには、ベクターＤＮＡ内の単一（ユ ニーク）の部位を選択するよう注意しなければならない。 ２つのプラスミドからのＤＮＡをｉｎ　ｖｉｌ＋ｏで一緒に結紮し、次いで適当 な制限酵素を用いて宿主内に形質転換して、１型最終構築物を産生ずる。２型の プロモーター外来遺伝子構築物は、もちろんプロモータを含むベクターと外来遺 伝子を含む別のベクターから同様の方法で作製する。 第３図は、本発明の組換えベクターの別の製造方法を示す。 この方法では、ＮＥＲの第１部分、次いで本発明のＦＰＶプロモータ、次に外来 遺伝子導入のための少なくとも１つのクロー調製する。もちろん、実際に、任意 の長さのＤＮＡは、ある方法で又は別の方法で、外来遺伝子の導入に適したクロ ーニング部位を提供する。好ましくは、これらの構築物は多クローニング部位、 即ち種々の異なる制限酵素、例えば少なくとも１０の部位を含む短いＤＮＡを含 有する。次いで、このような構築物は可転性を有する。というのも、その後、そ の各末端に近い部位でほとんどの任意の外来遺伝子を側面に配置するＤＮＡを制 限処理し、第３図に示す多クローニング部位に外来遺伝子を挿入するのが非常に 容易であるためである。簡単にするためにＸとＹＯ２つの部位のみを示しである が、これらは所望により充填され、延長され、ｃｈｅｗ　ｂａｃｋされて、同一 平滑末端部位（Ｚ。 Ｘ、Ｙに代えて）を生じる。最終構築物においては、プロモータＤＮＡは、多ク ローニング部位の一部により外来遺伝子から分離するが、しかしこれは、最終ウ ィルス内でのｍＲＮＡの転写に悪影響を及ぼさない。 いずれの構築方法においても、プロモータ及び外来遺伝子によりＮＥＲを分割す る。もちろん、中央領域で分割されることは不可欠ではない。ＮＥＲの第広部分 が全残余物又はＮＥＲの残りを構成することも不可欠ではない。ＮＥＲの各末端 が相同ＮＥＲが、組換えベクター調製に際して間のどこかで切り取られたり、あ るいは別の（無関係な）ＤＮＡを挿入されることは問題にならない。明らかに、 用いるＮＥＲが完全領域であるか、あるいは非必須であるとＦＰＶゲノムにおい て確認された遺伝子である必要はない。その任意の部分を用いる場合、ＮＥＲに 関連した「末端」という用語は選択された部分の末端を意味する。 本明細書におけるＦＰＶ　（又は■■）以外のベクターに対する言及は、適切な 宿主内での構築物の大量産生に適した任意の好都合な原核性又は真核性クローニ ングベクターを意味する。 原核性ベクターは、通常はプラスミド又はファージである。好適な原核宿主とし ては、細菌が挙げられる。カビ、酵母菌及び動物細胞のもののような真核ベクタ ー、例えばＳＶ４０は、その方が便利であると考えられる場合に用いる。 使用する組換えベクターは通常は二本鎖ＤＮＡを有するけれども、相同組換えに 対しては一本鎖ＤＮＡを用いることもできる。 次いで、ＮＥＲ，プロモータ及び外来遺伝子を含む本発明の組換えプラスミドは 、相同組換え操作においてはＦＰＶ　ＤＮＡに対して「取換え済み（ｓｗａｐｐ ｅｄ　ｏｖｅｒ）　Ｊでなければならない。このために、適当な食肉用飼鳥類細 胞をＦＰＶに感染させる。明白な理由のために、野生型ＦＰＶを用いないのが最 もよい。ＦＰＶは、任意の好都合な弱毒化方法により、容易に弱毒化することが できる（毒性を弱めるために突然変異を起こさせる）。 組換えウィルスを選択するためには多数の異なる方法が用いられるが、これは、 Ｍ、Ｍａｃｋｅｔｌ及びＧ、　Ｌ、　Ｓ＋ｎＨｈ　（上記）の総説論文に、■ｖ に関して記載されている。このような方法は、本発明において利用できる。ＮＥ ＲとしてＴＫ遺伝子を用いる方法は、所望の（組換え）ウィルスを含有するウィ ルス混合物をＢＵｄＲを含む成長媒質中で新鮮ＴＫＥ細胞に形質転換するもので ある。ＢＵｄＲはＴＫ陽性であった本来のウィルスを殺すので、本発明に従って 産生されるＴＫマイナス突然変異株を選択することができる。別の方法は、ＦＰ ｖｌ又は望ましくはないがＶ■プロモータを、好ましくはＥｃｏｇｐｔのように 選択性の、しかしベーターガラクトシダーゼのような非選択性の別のマーカー遺 伝子とともにＮＥＲ内に含むために組換えプラスミドを拡大し、次いで例えばミ ベーターガラクトシダーゼ（この場合、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ ル−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）基質が成長媒質中に存在する場合は 青プラークが生じる）のようなマーカー遺伝子の特性を用いて、組換え株を検出 する。 選択された、ＦＰＶ　（欠失ＴＫ遺伝子を有するがしかし外来遺伝子を有する） を含むＴＫマイナス細胞を、次に慣用組織培養法、主として組織のトリプシン化 、あるいは胚形成ニワトリ又はシチメンチョウ卵の漿尿膜（ＣＡＭ）から得られ たニワトリ胚繊維芽細胞、ニワ）　ＩＪ繊維芽細胞、ニヮ）　ＩＪ胚上皮細胞内 で生育させた。鳥に投与するためには、組換えウィルスは、噴霧により、飲水に 混ぜて、経口的に、筋肉注射により、あるいは羽弁への接種によって投与される 。スキムミルク又はグリセロールのような成分を用いてウィルスを安定化するこ ともできる。 本発明は主にニワトリの治療を意図するが、ＦＰＶに安全に感染され得る他の動 物に関しても有益である可能性がある。適切な試験を実施後、ＦＰＶをヒトに感 染させても安全であると考えられる可能性さえある。 以下の実施例で本発明を説明する。 鶏痘ウィルスＨＰ４３８株は、Ａ、Ｍａｙ＋及びＨ，Ｍａｈｎｅ１両教授（Ｌｕ ＋１ｗｉｇ−Ｍａｚｉｍｉｌｌｉｘｎｇ　Ｉ！ｎ１ｖｅｒｓｉｆｙ、　Ｍｕｎｉ ｃｂ）から頂いたものである。ＨＰ４３８株は、組織培養内のヒヨコ胚繊維芽細 胞（ＣＥＦｓ）において４３８回継代接種により病原性ＨＦ２株から得られた（ Ａ、Ｍ２Ｔ＋等、２ｅｎｔ＋ａｌｂｌａＮ　ｆｕｒＶｅｌｅ＋ｉｎａ　ｍｅｄｉ ｘｉｎ　ＢＩ３゜１〜＋３（＋９６６））。クローニング用のＤＮＡを形成する ために用いたＨＰ４４１株は、ＣＥＦ細胞でさらに４回継代接種して得らＣＥＦ 細胞を、ペニシリン（２００Ｕ／ｍｌ）　、ストレプトマイシン（２００〜／ｍ ｌ）　、フンギシン（２１１５／　ｍｌ）　、及び１０％ウシ新生仔血液（Ｃ３ ）を補充した１９９　（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）液中で生育させた。 ３、ウィルスの精製及びそこからのＤＮＡ抽出ＨＰ４４１鶏痘ウィルスを、１細 胞当たり約１プラーク形成単位（ｐｌｕ）の多発性感染で集密的単層ＣＥＦ細胞 上に接種した。 無血清液中で細胞を予備洗浄し、ウィルス接種物を７５．？ボトル当たり１ｍｌ の無血清液で細胞に加えた。３７℃で１０分間インキュヘート後、ウィルスを細 胞に吸着させ、２％ウシ血清（Ｃ８）を含む媒質ＪＯｍｌを加えた。５日後、顕 著な細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察され、その時点で上澄を採取した。細胞破片 を、５ｏｒｔａｌｌ　ＧＳＡ　Ｏ−ター中で１０分間、２５Ｈｒｐｔｎで遠心分 離して、上澄から除去した。次いでウィルスを、５ｏｒｖａｌｌ　５Ｓ３４０− ター中で３０分、１４（１００ｒｐｍで遠心分離して上澄からペレット化した。 ウィルスペレットを１０ｍＭ　）リスｐＨ９，０中に再懸濁し、さらに低速回転 させて残りの細胞物質をすべて除去した。 ウィルスからＤＮＡを抽出するために、等容積の溶解緩衝液（１００ｍＭ　）リ ス−塩酸、ｐＨ７，８，２ｍＭ　ＥＤＴＡ、　５４％ショ糖、２％ＳＤＳ、　２ ００ｍＭ　２−メルカプトエタノール）をウィルス懸濁液に加えた。次いで、プ ロテインナーゼＫを固体として加えて、５００μ３／ｍ１とした。これを、５０ ℃で２時間インキュベートし、４℃で１晩放置した。次いてその溶液を、フェノ ール／クロロホルム／イソアミルアルコール（５０：　４８　：　２　ｖ／ｖ／ ｖ　、　１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７，５、ＩＩＩＩＭ　ＥＤＴＡで飽和）を用 いて、その後エーテルを用いて、数時間、徐々に、静かに抽出した。２．５容積 の無水エタノールを加えてウィルスＤＮＡを沈殿させた。ウィルスＤＮＡを１０ ｍ１ｌリス−塩酸ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ＴＥ）中、又は脱イオン水 中に再懸濁した。 ４、ウィルスＤＮＡのプラスミドベクター内へのクローニング１ＮのＦＰＶ　Ｄ ＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ　（ＢＲＬ）で切断して、ＢａｍＨＩ−切断、ホスフ ァターゼ処理Ｐ　Ｕ　Ｃ１３プラスミド（Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ）に結紮した。標 準法（Ｄ、Ｈａｎａｈａｎ、１．Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。 挿入ＤＮＡ断片を有するプラスミドを含有するコロニーを、Ｘ−ｇａｌインジケ ータプレート上で白色により確認した。ニック（ｎｉｃｋ）・翻訳化（放射能標 識化）ＦＰＶ　ＤＮＡでコロニーをプローブし、ＦＰＶ　ＤＮＡ挿入物を含むプ ラスミドを、Ｄ、Ｓ。 ＨｏｌｍｅＳ等（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１４，１９３〜１９７　（１９ ８１））の方法、及びＣｓＣβグラジェント上でのＤＮＡの精製法により単離さ れるプラスミドＤＮＡの制限消化によって分析した。ＦＰＶ　ＤＮＡ挿入物を含 む一連の組換えプラスミドが得られたが、これらのうちの１つ、ｐＭＨ２３と呼 ばれる約１１．２キロベースのものを、シーケンシングのために選択した。ＦＰ Ｖ　ＤＮＡのＥｃｏＲＩクローンを同様の方法で調製したが、但し、コロニーは 、放射能標識化ウィルスＤＮＡでプローブしなかった。しかし「ライブラリ」と してグリセロール培養中に保存した。 ５、ｐＭＨ２３のシーケンシング ｐＭＨ２３のウィルス挿入物を配列決定するために、ｐＭＨ２３の音波破砕断片 をＳｍａＩ−切断、ホスファターゼ処理Ｍ１３ｍｐｌＯ（Ａｍｅｒｓｂ＋＋ｍ　 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＰＬＣ）中にクローニングすることにより、ｐＭ Ｈ２３の無作為サブクローンを生成した。ウィルス挿入物を含むクローンは、ｐ ＭＨ２３からの放射能標識化挿入物を用いたコロニーハイブリダイゼーションに より確認した。 ［”Ｓ］　ｄ、ＡＴＰを用いたジデオキシシーケンシングを用いて、ウィルス挿 入物の全配列を確定した。 ６、鶏痘ウィルスゲノムの無作為シーケンシング鶏痘ＤＮＡ挿入物を含む組換え プラスミドは、上記と同様の方法によって得られたが、しかしさらに３回継代接 種したウィルス（ＨＰ４４４）から開始した。ウィルスゲノムの無作為シーケン シングは、上記５項と同様に実施した。ウィルスＤＮＡの音波破砕断片をＭＩａ ｍｐｌＯ中でクローニングし、任意の確認段階を介さずに直接シーケンシングし た。 ７、推定プロモータ配列の確認 プロモータとして試験すべき配列を、２つの方法で確認した＝ａ）ｐＭ８２３配 列における開放読み枠上流（５′のすぐ上流）の配列は、ウィルスにおけるプロ モータとして作用し、同様に、暫定検定系における試験に適していると思われる 。 ｂ）ワクシニアウィルスの４ｂ遺伝子と非常に相同の遺伝子の上流配列を、ＦＰ Ｖ　ＤＮＡによりコードされるアミノ酸とＶＶ４ｂによりコードされるアミノ酸 とを比較することにより選択した。 ｐＭＨ２３における開放読み枠（ＯＲＦｓ）、及びＦＰ４ｂ遺伝子を、以下の様 に確認した： （２）開放読み枠 ｐＭＨ２３挿入物（ｒｌｌ、　２ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片」）ノ全配列カ確定すれ でいるが、その長さは１１，２２５ヌクレオチドである。この配列を以下に示す （Ｘ＝ＦＰＶの異なるＭ１３クローンからのシーケンシングの場合に異なること が判明したヌクレオチド；星印＝停止コドン）。その配列のコンピュータ分析か ら、いくつかのＯＲＦ　ｓの存在が明らかにされた。長さ１５０塩基以上の０Ｒ Ｆｓのみを考慮した場合、５８〜４１８アミノ酸のポリペプチドを予示する１９ 個の完全と思われる遺伝子が認められる。そのサイズ又はその使用コドンにより 、１〜１２番のＯＲＦが大きな（ｍａｊｏｒ）ＯＲＦｓであると考えられた。こ れらの０ＲＦｓの開始位置及び停止位置を以下の表１に示す。他の７つの０ＲＦ ｓは、他の遺伝子内に重複又は含有されているため、あるいはそれらの使用コド ンのために小さい（ｍｉｎｏｒ）ものと考えられた。 ｌ　ＧＧＡＴＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＴ丁ＴＡＴＡＣＣＣＧ ＡＣＴＣＴＴＧＴＴＣＴＡＣＴＧＧＡＣＧＡμ、ＣＧＣＧＧ６１　ＡＧＡＴＴＴ ＡＡＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＧＴＡＴＡＧＴＣＧＡＧＧＡＣＧＣＣＣ丁ＣＧ ＧＴＡＡＴＡＡＡＴＴＧＡＴＴＡＴＡＴ１２１　ＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡ ＡＡＴＴＡＡＴＴＴＡＴＡＴＧＴＡＣＴＣＡＡＴＡＴＣＣ丁丁ＡＴＡＴＡＧＡＡ ＴＴＡＴＴＴＴＡＴb ＋８１　ＴＣＴＴＣＴＧＡＴＡＴＡＣＧＴＴＡＧＧＴＡＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＡ ＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＡ丁ＧＡＣＧＴＴＴＴＴ` ２４１　ＴＧＣＧＣＧＴＧＴＴＡＣＧＴＴＡＴＴＡＴＡＡＴＡＧＡＴＡＡＴＡＧ ＡＡＡＴＡＡＡＣＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴ` ３０１　ＴＣＴＴＴＴＣＡＧＴ丁Ｇ丁ＴＡＡＡＴＡＴＡＴＴＣＴＡＧＴＴＴＴＡ ＴＡＡＧＣＧＴＴＡＴＴＣＡＴＡＴＡ丁ＡＡＡＡＡＡＴＡＴ` ３６１　ＡＡＡＡＣＴＡＡＡＴＣＧＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＣＴＡＣＧＧ ＣＧＧＴＣＡＴＴＴＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＣＧＣＧＡＴＧＧ` ４２１　ＧＴＴＣＧＧＴＴＧＴＡＣＧＧＧＡＡＣＴＡＡＴＡＡＣＣＡＧＴＴＧＧ ＣＣＧＴＴＣＡＣＡＧＡＴＴＴＡＣＡＧＡＡＡＣＧＣＧＴＴs ４８＋　ＴＡＣＡＴＣＴＴＶＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＴＴＴＡＧＴ丁ＡＡＴＴ ＴＡＧＧＡＡＴＡＡＧＴＧＡＣＴＴＡＡＡＴＧＡＴＡＴＡＡ` ５４１　ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＴＣＴＡＡＡＡＴＡＴＴＣＴＴＴＣ ＣＧＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＣＧＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＧＴＡs ６０１　ＴＡＡＡＧＡＴＣＧＴＡＡＡＴＣＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＴＴＴＴＣＧ ＡＡＡＡＣＴＣＣＣＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＣＴＴＧＣＴＴＡ` ６６１　ＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＧＣＣＴＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＡＡＴＴＡＡ ＧＴＡＣＧＧＴＡＧＴＡＧＡＴＴＣＣＧＴＴＡＣＣＧＴＡＧ` ７２１　ＧＡＡＴＡＣＣＧＴＴＡＣＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＴＡ丁ＧＡＡＡＡＡＧ ＧＡＧＡＴＴＡＣＴＴＴＧＣＣＡＧＧＣＡＴＡＧＡＧＡＴＴs ７８１　ＴＡＧＴＡＣＣＧＴＣＴＴＴＴＣＴＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＴＡＴＧＣＧ ＴＴＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＧＧＡＡＣＡＡＣb ８４１ＡＧＡＡＡＣＧＧＧＡＧＧＴＧＡＡＡＣＧＧＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＣＧＡ ＴＡＡＴＡＡＴＡＣＧＴＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＣ９０＋　ＡＧＡＴＣ ＡＴＣＴＡＴＴＴＧＡＴＡＡＡＡＣＴＡＴＡＧＡＡＣＡＴＧＡＡＡＧＴＡＴＴＡ ＣＣＧＴＴＧＡＡＡＧＣＧＧＴＡＧＡＡ` ９６１ＡＴＧＣＧＴＧＧＣＧＴＴＡＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＴＡＣ丁ＡＧＡＡＡＡ ＡＡＡＧＴＴＡＴＣＣＧＣＧＴＣＡＡＣＡＡＡＣＧＴＡＡＴ１０２１　ＡＧＧＴ ＡＧＣＡＴＡＧＡＡＴＡＣＴＴＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴ ＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＴＧＡＴＣＴＴbＡ １０８１　ＧＴＴＧＴＧＴＴＡＴＴＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＡＡＴＡＧＡＡＡＧＡ 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ＴＴＴＡＡＴＡ、ＡＧＣＣＡＣＴＡＴＴＣＧＴＡＴＴＴＡＴfＴ ９９０１　ＴＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＣＣＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＴＴＡＴＣＡＣＡ ＴＡＣＣＡＴＣＡＴＧＣＴＡＴＣＡＴＣＣＣＡＡＣＴＴＡＡiＴ １００２１　ＣＴＡＡＡＴＡＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＴＡＴＣＴＡＣＴＡ ＡＡＡＴＡＡＴＡＡＣ六ＡＡＴＡＡＣＡＡＴＡＴＡＧＴＧＡ`ＡＧ １００８１　ＣＴＡＴＣＣ，ＴＴＡＡＴＡＧＡＣＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＡＧＣＴ ＴＴＴＴＴＡＣＡＣＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＡＴＴＴＡsＡ丁Ｔ １０１４１　ＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＧ ＴＣＴＣＡＴＴＴＴＧＴＡＧＴＡＧＴＡＧＡＴＴＴＣＧＴＡ`ＧＡ １０２０１　ＴＣＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＡＴＴＴＴＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＴＣＣ ＡＴＣ丁ＡＡＴＴＴＣＴＡＴＧＧＧＴＡＡＡＧＴＡＴＡＣＣ`ＴＴ １０２６１　ＴＴＧＴＡＴＴＴＡＣＴＡＧＧＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＡＴＡＴ ＴＧＴＴＴＡ丁ＣＴＣＴＡＡＴＡＡＣＡＴＴＴＣＡ丁Ａ丁ＣsＴｒ １０３２１　ＴＴＧＴＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＡＴ丁Ａ ＴＡＣＧＡＡＡＡＣＡＧＴＴＧＧＧＡＡＡＴＡＴＴＧＴＴＴsＧＡ １０３８１　ＴＴＡＴＡＴＴＣＡＴＴＴｒＴＴＣＴＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＣＧＧ ＡＣＡＧ丁ＣＴＡＴＡＣＡＣＴＡＴＡＧＣＧＡＴＧＴＴＡＴbＴＴ １０４４１　ＣＧＴＴＡＧＡＴＡＡＴＡＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＴＴＡＡＡＴ ＣＴＴＧＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣＧＴＣＧＴＡＴＡＴＣＴsＧＡ Ｉ０５０１　ＡＣＧＴＴＴＴＣＡＴＡＣＧＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＡ ＴＡＡＴＡＴＴＴＡＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴ丁ＡＡＧＴＡＴＴbＡＣ １０５６１　ＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡ ＴＴＣＣＧＴＴＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＴＴＧＴＡＡＧ`ＴＡ １０６２１　ＡＧＴＡＡＴＡＣＡＡＴＧＡＴＡＣ丁ＡＴＡＴＡＧＴＴＡＧＣＡＡ ＧＡＡＴＡＡ丁μ．ＧＣＡＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＴＡＧＴＡsＧＴＡ ｛０６８＋　ＡＣＡＴＡＡＡＧＧＴＧＴＡＴＴＣＣＣＴＣＡＴＣＡＴＣＴＡＡＡ ＧＣＧＴＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＣＣＧＴＧＧＴＣＴＡＴＴＡ`ＴＡ １０７４１　ＣＣＡＡＴＡＴＡＴＴＡＣＴＡＡＡＡＴＣＡＴＴＡＴＡＴＣＧＴＴ Ｃ丁ＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＧＴＧＴＡＡＴＡＴＡＴ丁ＣＴＡbＣＣ １０８０１　Ａ丁丁ＣＴＴＣＣ丁丁ＴＡＴＡ丁丁丁八丁八丁ＴＡＧＣＴＣＣＴＣ ＴＡＧＡＴＡＴＧＡＴＧＴＡＡＴＣＴＡＡＴＡＧＧＴＣＧＴbＧＧ １０８６１　ＴＡＡＴＡＡＡＣＣＴＡＧＴＴＴＣＧＴＡＴＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧ ＴＡＴＴＡＧＴＴＡＡＡＡＣＧＣＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＡＡsＡＴ １０９２１　ＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＴＣＴＡＡＴＡＡＴＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡ ＴＴＴＴＴＡＡＴＣＴＡＡＡＣＧＧＡＴＣＧＴＡＴＡＣＴＴsＣＡ １０９８１　ＴＡＧＣＧＴＡＡＴＧＴＡＴＡＧＧＧＴＡＴＴＴＡＣＣＡＴＴＣＧ ＣＧＣＣＣＪＣＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＡＴＧＴＣＡＧＣＧＣbＧＴ １１０４１　ＡＴＴＣＴＡＴＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＡＣＴＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴ ＣＴＧＴＴＣＴＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＡＴＧＴＡＴＡＧfＴＴ １１１０１　ＴＣＡＡＡＣＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＴＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＡＧ ＣＴＣＣＧＴＡＴＴＣＴＡＡＴＡＧＣＧＡＴＣＴＡＧＣＴＡsＡＴ １１１６１　Ｃ丁ＡＣＡＣＡＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＧＣＣＴＴＡＴＧＴＡ ＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＡＡＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＡＴＧＴsＡＧ ＋１２２１　ＧＡＴＣＣ 表　１ １　４１６　１６７２　４１８　４８．２２　２１６６２６５９　１６７　１９ ．８３　４０５４　３６０８”１４８　１６．４４　４１７０　４５９２　１４ ０　１６．５５　５１３８　４８２ビ　１０５　＋２．５６　５９７４　５５１ ９゜１５１　１７．９７　７９０６　６６７４”４１０　４６．８８　８０２５ 　８３７４　１１６　１３．２９　８６３２８８３５　６７　７．９ １０　９６８６　８８４４゜　２Ｈ　３３．　０１１　１０１２０　９６８９” 　１４３　１６．６１２　１０７０５　１０＋３９゜１ｇ８　２２．４＊ＯＲＦ ｓ　３、５、６、７、１０，　１１及び１２は、上記のもノニ対する相補鎖上に 、即ち他のものと逆方向に転写されるっ１１の大きなＯＲＦｓの上流の配列は、 暫定検定系におけるプロモータ活性を測定するためにＩａｃＺ翻訳融合ベクター 内でクローニングされた。 （ｂ）ＦＰ４ｂ遺伝子 鶏痘ウイルスＤＮＡの無作為クローンを配列決定した。各クローンの配列は６つ と考えられる枠内にコンピュータで翻訳し、発表済みのワクシニア配列と比較し た。ワクシニア遺伝子とある程度の相同性を有するいくつかの鶏痘遺伝子を検出 した。この方法で検出したある遺伝子は、ワクシニア４ｂ遺伝子と相同の鶏痘遺 伝子であった（これは、本明細書ではＦｂ４ｂ遺伝子と呼ぶ）。これらの配列を 含むＭ１３クローンを用いて、鶏痘ウイルスクローンのＥｃｏ’ＲＩライブラリ をプローブし（上記参照）、２．７キロベースのＤＮＡを含有するクローンを検 出した。そのクローンをｐＭＨ２３に関して記載したと同様に配列した結果、推 定プロモータ配列上流のＦＰ４ｂ遺伝子の５′末端、及び別の開放読み枠の３′ 末端を含むことが判明した。 ８．プロモー夕の強度検定 （ａ）暫定融合ベクターは、プロモータ配列を試験遺伝子の開始コドンまで及び それを含めて、容易に検出可能な生産物に関連する遺伝子と融合させる。したが って、試験中のプロモータ配列は、本来の遺伝子におけると同様、ＯＲＦの開始 に対して全く同じ配列内容であり、遺伝子のコード配列のみが変化する。 こ、の場合に使用した暫定融合ベクターは、検定可能マーカーとしてベータ・ガ ラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を有し、ｐＮＭ４８０　、ｐＮＭ４８１及び ｐＮＭ４Ｂと呼ばれる。それらは、ｐＭ（１９８４））によって作製された。改 変ベクターは、３つの読み枠すべてに用いることができる唯一のクローニング部 位をさらに有する。 （ｂ）暫定融合ベクター内の鶏痘配列のクローニングシーケンシングのために形 成された無作為Ｍ１３サブクローンを用いて、　１ａｃＺ遺伝子の上流に試験配 列を配置した。ＡＴＧコドンのすぐ下流から開始し、上流方向に向かう（推定プ ロモータ中に）Ｍ１３クローンを選択した。Ｍ＋３ポリリンカーにおける制限酵 素部位を用いて、断片をクローンから切り取り、適当な制限酵素で切断したｐＮ Ｍベクター中にクローニングした。 融合蛋白質中に相対的に少量のＦＰＶ遺伝子ＯＲＦが存在するように適当なりロ ーンを選択し、ＦＰＶ　ＯＲＦによりコードされる少数のアミノ酸が１ａｃＺ遺 伝子を有する枠内に存在するように適当なベクターを選択した。そのため、ベク ターを１つ又は２つのヌクレオチドで異ならせ、ｐＮＭ４８０　、　４８１、及 び４８２と名づける。全１ａｃＺ遺伝子を生じた鶏痘配列を含有するプラスミド は、細菌プレート上の青色により、又は放射能標識化鶏痘ＤＮＡでプローブする ことにより、試験的に確認し、融合部位を経て、推定プロモータへのシーケンシ ングにより明確に確認した。第２図は、これらすべてのクローン（１番以外）を ｐＮＭベクター中にどのようにしてクローニングしたかを示す（ＯＲＦＩに適し たＭ　］　３クローンだけが異なる配位であったため、異なる制限酵素を用いな ければならなかった。標識されたＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ１１部位間のＢａｌ ｌ１ＨＩを用いて、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩ［によりｐＮＭ４８０プラスミ ドを切断し、ＨｉｎｄＩ［Ｉ部位を適当に末端修復してＭ１３ベクターから切り 取ったＢ　ａｍＨＩ−Ｈａｅｌｌｌプロモータ断片を入れた）。表２は、関与す る０ＲＦｓ。 用いたＭ］３クローン名、使用したｐＮＭベクター、及び融合産生物中で沈降す る、鶏痘０ＲＦｓによりコードされるアミノ酸数（即ち、開始メチオニンコドン から前方に）の一覧である。 表　２ 構築物との暫定融合構築物 １　ｐＮＭ　４８０　ｐＮＭＧＦ３２　２０２　ｐＮＭ　４８１　ｐＮＭＧＪＩ ３Ｍ　７３　ｐＮＭ　４８１　ｐＮＭＧＥ２３　３４　ｐＮＭ　４８２　ｐＮＭ ＧＡ５　１３５　ｐＮＭ４８２　ｐＮＭＧＫ４　１０　１８９６　ｐＮＭ４８Ｑ 　ｐＮＭＧＦ６　９ ７　９ＮＭ　４Ｂ２　ｐＮＭＧＢ８６　１３７　ｐＮＭ　４８０　ｐＮＭＳＡＵ ４　２８　ｐＮＭ　４８２　ｐＮＭＧＣ４４１４３９５１０ｐＮＭ　４８１　ｐ ＮＭＧＦ７　３　未知＋１　ｐＮＭ４８０　ｐＮＭＧＬ８　３７１２　ｐＮＭ　 ４８２　ｐＮＭＧＦ７８　１０３ＦＰ４ｂ　ｐＮＭ　４８１　ｐＮＭ４ｂ３０　 ３４　２８３ＦＰ４ｂ　ｐＮＭ　４８１　ｐＮＭ４ｂ３１　２１　２９２（Ｃ） 暫定検定系におけるプロモータ試験２４の細胞組織培養皿（Ｌｉｎｂｒｏ）中に 植えつけたニワトリ胚繊維芽細胞を、細胞が８０〜９０％の集約状態に達した時 点で鶏痘ウィルスＨＰ　４４Ｉ株に感染させた。感染後種々の時間にＤＮＡを、 リン酸カルシウムトランスフェクション操作により、細胞中に導入した。ＦＰＶ 感染細胞におけるこの暫定検定系においてベーターガラクトシダーゼ活性を発現 することが判明したベーターガラクトシダーゼ遺伝子と融合したワクシニアＩＮ Ｋプロモータを含むプラスミドｐＭＭ６を用いて、感染多発性、ＤＮＡトランス フェクションに関する時間、及びトランスフェクションのためのＤＮＡ量に関し て最適化した。個々の実験間に変動が認められたけれども、陽性としてはｐＮＭ ６で、陰性としては無関係な配列を含むプラスミドで内部コントロールした場合 、採用した方法は一定状態で働いた。 ２４穴中プレート中の細胞を１細胞当たり１　ｐｆｕ　（７）ＦＰＶ　ＨＰ４４ １で感染させた。以下の順序で成分を加えることにより、９６穴プレート中に沈 殿物を調製した：ｐＮＭプラスミドＤＮＡ（０，２〜〜５Ｉ１９）　＋　１．ｃ ｉＦ　ＰＶ　ｒヘルハーＪ　ＤＮＡ、１００Ｓ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，１ ２）、及び最後１ニア　７１１（Ｄ　２Ｍ　ＣａＣｕ２゜プレートをタップして 内容物を静かに混合し、次いで細胞感染後４〜２０時間目時間当な沈殿物を加え た。室温で３０分放置後、過剰沈殿物を除去し、５％Ｏ８を含む１９９液を０． ５ｍｌ加えた。トランスフェクトした細胞を正常としてさらに４８時間再インキ ュベートした。 ベータ・ガラクトシダーゼ活性は、以下の通りに検定した。 組織培養液を吸引により注意深く取り出し、細胞を５０成の０．２５Ｍトリス・ 塩酸ｐＨ７，５，５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）中に再懸濁した。次いで 、再懸濁細胞を３回解凍して、ベーターガラクトシダーゼ含量検定のために９６ 穴プレートに移した。 各溶解産物に６０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，４０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏａ、Ｉ ＱｍＭ　Ｋ　Ｃｌ、ＩｍＭ　Ｍ　ｇ　（Ｉ’２、５０ｍＭ　２−メルカプトエタ ノールを含有する緩衝液１／ｌｉｉ！と、６０ｍＭ　Ｎ　ａ　２　ＨＰ　Ｏ４， ４０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４に溶解した２■／ｍｌのオルトニトロフェニルガラクト ース（ＯＮＰＧ）１００麿を加えた。０ＮＰＧはベータ・ガラクトシダーゼに対 する比色基質であり、無色から黄色に変化する。検定は発色するまで３７°Ｃで ２時間までの間インキュベートされ、その後、反応を停止するために２Ｍ　Ｎａ ２Ｃｏ３を加えた。黄色の強度は、ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートリーダーで、各穴の ４０５　ｎｍでの吸光度を測定することにより測定した。 プロモータ検定の結果 ｐＭＨ２３からの１１の最大主要０ＲＦｓの前面から、及びＦＰ４ｂ遺伝子（上 記参照）の前面からの配列を一時的融合ベクター　（１２ｃＺ遺伝子を含有する ベクター）中にクローニングし、プロモータとしてのそれらの活性を暫定検定系 で測定した。上記表２は、これらの構築物の一覧である。試験した１４のＦＰＶ プロモータ構築物のうち、５つは一貫してプロモータ活性を有することが判明し た。これらは２つのＦＰ４ｂ構築物、ＯＲＦ　８（１３，２に遺伝子）プロモー タ、０ＲＦ５　（１２，５に遺伝子）プロモータ、及び０ＲＦＩＯ（３３、ＯＫ 遺伝子）プロモータであった。 これらはすべて、本発明のプロモータである。残りの構築物は、低レベルの活性 を示した。表３は、３つの実験の結果を示す。 星印は本発明のプロモータを含む構築物を示す。 表　３ 実験Ａ ４Ｏ５ｎｍにおける光学密度 最終構築　添加ＤＮＡ量（２０時間ｐ、ｉ、）ｌ　ｐＨＭＧＦ３２　０．０１１ 　０．０５７　０．０４２　未実施 ３　ｐＮＭＧＥ２３　０．０＋３　０．０６６　０．０２４４　未実施 ”５　ｐＮＭＧＫ４　０．０２６　０．０９８　０．ＩＣ３６ｐＮＭＧＦ６　０ ．０４７　０．０９３　０．０５７７　ｐＮＭＧＢ８６　０．　［１３１［１， ０７９０，０２７７ｐＮＭＳＡＵ４　０．０２４　０．０６５　０．０＋６”８ 　ｐＮＭＧＣ４４０，０３３０，１２９０，２４８”１０　ｐＮＭＧＦ７　’　 ０．０２７　［１，０７１０，１３８ＩＩ　ｐＮＭＧＬ８　０．０３　０．０５ ２　０．０６２１２　ｐＮＭＧＦ７ｇ　０．０４　０．０６３　０．０６９”Ｆ Ｐ４ｂ　ｐＮＭ４ｂ３１）　０．０６５　［１，１９７０，３ＩＱ”ＦＰ４ｂ　 ｐＮＭ４ｂ３０　０．０５７　０．２０３　０．２６０実　験　Ｂ　（Ａより早 （ＤＮＡを添加）ｌ　ｐＮＭＧＦ３２　０．００　０．０１　０．０５２　ｐＮ ＭＧＪ］３Ｍ　Ｏ，０３０，０００，０２３ｐＮＭＧＥ２３　０．０２　０．０ ３　０．０６４　ｐＮＭＧＡ５　０．０３　０．３９　０．０８”５　ｐＮＭＧ Ｋ４　０．１８　０．５９　０．８９６　ｐＮＭＧＦ６　０．０１　０．０＋　 ０．０２７　ｐＮＭＧＩＩｌ１６　０．Ｈｔｌ、Ｈ［１，０４７ｐＮＭＳＡＵ４ 　０．０３　０．０４　０．０３’８　ｐＮＭＧＣ４４０，１１０，２２Ｇ、７ ］”１０　ｐＮＭＧＦ７　０．０ｇ　０．１０　１１１６ＩＩ　ｐＮＭＧＬ８　 ０．０６　０．０５　０．０４１２　ｐＮＭＧＦ７８　０．０５　０．０５　０ ．０７”ＦＰ４ｂ　ｐＮＭ４ｂ３０　Ｇ、３５　０．２７　０．５８”ＦＰ４ｂ 　ｐＮＭ４ｂ３１　０．２８　０．３２　０．４４全　ｐＭＨ２３Ｑ、ＧＩ　（ １，（１２０，０２Ｎｏ　ＤＮＡ　Ｏ，０１０，０１０，０１実　験　Ｃ（Ｂの 繰返し） ４０５ｎｍにおける光学密度 ］　ＩＩＮＭＧＦ３２　０．００　０．０７　０．０４２　ｐＮＭＧＪ１３Ｍ　 Ｏ，０２０，Ｇ？　０．０８３　ｐＮＭＧＥ２３　０．０６　０．０１　０．０ ０４　ｐＨＭＧＡ５　０．０５　０．００　［１，０９’５　ｐＮＭＧＫ４　０ ．０７　０．１３　０．７４６　ｐＮＭＧＦ６　０．０５　０．０５　０．０２ ７　ｐＨＭＧＢｇ６　０．０５　０．０７　０．［１８７ｐＮＭｓＡＵ４　０． ０４　（１，０５０，０５”８　ｐＮＭＧＣ４４０，０５０，１８０，６５’１ ０　ｐＨＭＧＦ７　０．０２　０．０５　０．３１１１　ｐＮＭＧＬ８　０．０ ３　０．０６　０．０９＋２　ｐＮＭＧＦ７ｇ　０．０３　０．０３　０．０２ ’ＦＰ４ｂ　ｐＮＭ４ｂ３０　０．２８　０ＪＯ１，２４”ＦＰ４ｂ　ｐＮＭ４ ｂ３１　０．１１　０．２５　１．１８全　ｐＭＨ２３０，１００，［１６０， １ＯＮｏ　ＤＮＡ　Ｏ，０３０，０４０，０４実験Ａに関しては、ＤＮＡを２０ 時間宿主感染に加え、実験Ｂ及びＣに関しては、実質的に互いに２倍となるよう にし、ＤＮＡを４時間宿主感染に加えた。感染より早期に加えた場合、プロモー タの中には非常に高い活性を示すと思われるものが認められたことは興味深い。 例えば、４時間宿主感染では、０ＲＦ５プロモータは、０ＲＦ８プロモータより 高レベルの活性を示し、一方、遅く加えた場合には低レベルであった。０ＲＦ５ は相対的に感染後期に加えた場合には十分に機能しない初期プロモータであると 思われる。他方、ＯＲＦ　１０プロモータは、感染後期に加えた場合にはより十 分に機能すると思われる。ＦＰ４ｂ構築物はともに、−貫して高レベルを示す。 ＦＰ４ｂを試験するために用いた構築物の配列のうち、０ＲＦ８　（１３，２Ｋ ）　、０ＲＦ５　（１２，５Ｋ）　、及びＯＲＦ　１０　（３３Ｋ）プロモータ を以下に示す。各配列は関連するｐＮＭベクターからのＤＮＡで開始し、終始す るが、これは介在配列が鶏痘配列＋Ｍ＋３ＤＮＡからいかに作製されるかを示す 。推定上プロモータ配列のうち２つは、２つの別個の構築物で試験されており、 各々、融合産物中の配列をコードする異なる数のＯＲＦアミノ酸を有する。これ らは、ＦＰ４ｂ３０／ＦＰ４ｂ３１ペア及びｐＮＭＧ８８６／ｐＮＭＳＡＵ４ペ アである。両方の場合とも、２つの異なるメンバーのペア間のプロモータ活性レ ベルは非常によく似ていて、これは融合産物中の鶏痘遺伝子の長さが決定的なも のではないことを示す。 Ｐａｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｒ　ｐＮＨ４ｂ３０゜Ｐａｒｔ 　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐＨＭ４＋３１゜Ｐａｒｔ　Ｏｆ　 ｔｈｅ　ＳｅＱυｅｎＣｅ　ｏｆ　ｐＮＭＧＣ４４゜Ｐａｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　 ５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐＮＨＧＫ４゜Ｐａｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｑｕｅ ｎｃｅ　ｏｆ　ｐＮｌづＧ「７゜鶏痘ウィルスへの遺伝子の挿入 相同組換え法により、外来遺伝子をウィルス内に導入する。 この方法は、ワクシニアウィルスに関して文献に詳細に記載されていて、類似の 手法を鶏痘ウィルスに対して用い得る。 １、ウィルス感染及びＤＮＡのトランスフェクション約８０％融合時に、２５， ７ボトルのＣＥＦ細胞を、１ｍｌの無血清媒質中に溶解した鶏痘ウィルスの弱毒 化株約１０’ｐｌｕ（約３ｐｌｏ／細胞）に感染させる。そのボトルを時々静か に掻き混ぜながら、３７℃で２時間インキユベートシ、次いで５％ウシ血清を含 む１９９液（Ｇｉｂｃｏ）を５ｍｌ加え、細胞を３７℃でさらに２時間インキュ ベートする。 この２時間が終了する３０分前にＤ　Ｎ　Ａ　／　Ｃａ　Ｐ　Ｏ４沈降物を調製 完了する。「１型構築物」を含有し、したがってＦＰＶの非必須領域＋２Ｉｌ！ ｇの鶏痘ヘルパーＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ２０／ｉを、プラスチックｂｉ ｊｏｎ中の１　ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ＨＢ　Ｓ）　ｐ）Ｉ　７．１２（ＨＢ 　Ｓは０．８１８％Ｎ　ａ　Ｃｐ　（ｖ／ｖ）、０．５９４％ＨＥＰＥＳ　（Ｗ ／ｖ）、０．０２％Ｎａ２ＨＰＯ４無水物（ｗ／ｙ）、ＩＭＮａＯＨでｐＨ７， ＋２に調節）に加える。６６成の２Ｍ　Ｃａ　Ｃ１２をｂｉｊｏｎの側壁を伝う ように徐々に加える。これを室温で２０〜３０分放置し、微細沈降物を形成させ る。 ２時間インキュベート後、室温でＨＢＳを用いて細胞を２回洗浄し、沈降物を静 かに細胞に加える。これを室温で４０分間放置し、次いで５％ウシ血清を含む１ ９９液５ｍｌを加え、細胞を３７℃で３〜４時間インキュベートする。次いでそ の媒質を新鮮な媒質に代える。 ２、組換え株の検出 ウィルスを細胞中で３〜５日間増殖させた後（これは完全細胞変性が認められる 場合である）、細胞＋上澄を採取し、３回凍結解凍する。次いで子孫ウィルスを 、１０ｃｍシャーレ当たり約５００〜１０００プラークでＣＥＦ細胞上にプラー ク形成させ、１％低ゲル化温度観点を含む媒質を前面を庇うように加える。次い でプラークをニトロセルロース上に載せ、Ｌ、　Ｖｉｌｌａｒｅａｌ等（Ｓｃｉ ｅｎｃｅ　１９６．　１８３〜１８５　（１９７７））の方法により鶏痘ウィル ス内に挿入中の外来遺伝子からのＤＮＡでプローブする。プローブに引っかかる ことが判明したプラークを寒天層（４℃に維持されていた）からつまみ取って、 ３回凍結解凍し、再プラーク化させる。次いてプラークを再び外来ＤＮＡでプロ ーブして、組換えウィルスが寒天層から首尾よく単離されていることを確証する 。 組換えウィルスによるニワトリ感染 鼾化後５日目の２２羽のヒヨコを容器内（４６Ｘ　４６Ｘ　５８−）に入れる。 ニワトリ胚繊維芽細胞中で増殖させた１、　５ｘ　１０８ｐ、　１．　ｕのウィ ルスを含有する水８０ｍ１を用いて微細噴霧を発生させるためにスプレーガンを 用いる。ヒヨコが箭化後２６日目になった時にこのワクチン接種を繰り返す。 実施例　２ プロモータは、ＲＮＡの転写を指令するウィルスＤＮＡにおける信号である。し たがって、強力なプロモータは、弱いプロモータよりも大量の転写を指令する。 これは、有効なプロモータの確認方法として用いる。放射能標識ウィルスＲＮＡ をニトロセルロースフィルター上に固定させたウィルスＤＮＡの制限断片と交雑 した場合、強力なプロモータを含むウィルスの特定領域が確定され得る。後期Ｒ ＮＡに関しては、後期ＲＮＡ転写体はそれらの遺伝子の末端を過ぎておそらくは 隣接制限断片内に向かい、それゆえマツピング法の任意の試みを混乱させるため に、領域確定は困難であると予測される。しかしながら、初期ＲＮＡに関しては 、それは有用なアプローチである。（「初期Ｊ　ＲＮＡは、ＤＮＡ複製前に作製 されるＲＮＡであり、［後期Ｊ　ＲＮＡはＤＮＡ複製後に作製される、と定義さ れている。 より早期に、即ち蛋白質合成前に作製されるＲＮＡは、「前初期ＲＮＡＪと呼ば れる）。前初期類の放射性標識ＲＮＡを作製するのに便利な方法は、好適な緩衝 液ｙ製つィルス、デオキシヌクレオチド三燐酸（このうちの１つは放射性標識さ れている）を含むｉｎ　ｖｉｔｒｏ系を用いるものである。これは、ワクシニア ウィルスに関して、Ｓ、　Ｖｅｎｋａｌｅｓａｎ及びＢ、　Ｍｏ５ｓ　（Ｊ、　 ＶｉｒｏｌｏｇＹ３７゜７３８〜７４７　（１９８１））によって記載されてお り、この方法での１ｎｖＨ＋ｏ　（即ち試験管中）で産生されるＲＮＡは、ｉｎ 　ｖｉｖｏ　（即ち組織培養中）で産生される場合と同一様式を示すことが判明 ウィルスをヒヨコ胚繊維芽細胞（ＣＥ　Ｆ）中で増殖させ、以下のように精製し た：　ＣＥＦの７５ｃ、？フラスコ４０本を５Ｘ１０６ｐｆｕ／フラスコのＰＰ ９　（ＨＰ４４０のプラーク精製単離体）に感染させた。そのフラスコを３７℃ で５日間インキュベートした。 次いで培地中に振りかけた後、７．００Ｏｒｐｍで１５分回転させた。 その後、ウィルスを含む上澄を４°Ｃで３０分間、１５．００００　＋ｐｍで遠 心分離した。ウィルスペレットをプールし、４０ｍ１の燐酸緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ ）中に再懸濁した。これをｌｏｍｌの３５％（ｗ／ｖ）　ショ糖液のクッション 上に層にし、１５．（ＩＨＱ　ｒｐｍで３０分、遠心分離した。その後、ウィル スペレットを１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁した。つぎにこれを２０〜５０％（ｗ＃ ）　シヨ糖液勾配上で層にし、１５．００００　＋ｐｍで３０分間遠心分離した 。２つのウィルス帯を採取し、プールして、２つの２０〜６０％メトリザミド勾 配上で層としく勾配当たり約１ｍ１）、３０，０００　＋ｐｍで１８〜２０分間 遠心分離した。次いでウィルス帯を収集した（勾配当たり１ｍ１）。 標識ＲＮＡのｉｎ　ｖｉｌｒｏ合成（Ｓ、　Ｖｅｎｋａｌｅｓａｎ及びＢ、Ｍｏ ５ａ　（１９８１年、上記引用文中）に基づく） 上記操作から得られた１０９ｐｆｕの精製ウィルス粒子を下記と同様に用いて標 識ＲＮＡを産生じた。ウィルス溶液を調製して０．０５％Ｎｏｎ１ｄｅｌ　Ｐ− ４０（ＮＰ−４０）とし、氷上に１時間放置した。 つぎにこれを、５０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８，５）　、ｌ０ｍＭジチオトレイト ール、５ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭのＧＴＰ及びＣＴＰ、］Ｏｎ＋Ｍ　ＪＣＬ、１０ ０　μＭ　Ｓ−アデノシルメチオニン（人ｄｏＭｅｊ）　、及びＩｎ　μｃｉの ３２ｐ−標識ＵＴＰを含む溶液に加えて、全量を５１１ｐ、とする。 ３０℃で３０分後、新鮮なＡ＋ＩｏＭｅ液（同量）を加えて、反応液をさらに３ ０分、インキュベートした。１０ｍＭのＥＤＴＡを加えて反応を停止し、試験管 を氷上に置いた。つぎに３０，０００　＋ｐｍで３０分遠心分離してウィルスを ペレット化したが、上澄には、標識ＲＮＡが含まれていた。その上澄にドデシル 硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えて最終濃度を０．２５％とし、混合液をＴＥ　 （ＩＯｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ７，５、Ｉ＋＋＋Ｍ　ＥＤＴＡ）中に飽和した等 容量のフェノールで抽出した。水性層を取り出してジエチルエーテルで抽出し、 １／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５容量のエタノールを加えて、ＲＮ Ａを沈降させた。ＲＮＡを１５，０００　＋ｐｍで１０分間回転し、ペレットを ４ｍｌのチオシアン酸グアニジン溶液（６Ｍチオシアン酸グアニジン、０．５％ Ｎ−ラウリルサルコシンナトリウム、５ｍＭクエン酸ナトリウム、（１，１Ｍ　 ２−メルカプトエタノール）中に再懸濁した。これをＣｓ　Ｃｊ２　／ＥＤＴＡ 　（５，７Ｍ　ＣｓＧ！。 ０、　ＩＭ　ＥＤＴＡ）の１　ｍｌクッション上で層とし、１８℃で１８〜２０ 時間、３８．０００　＋ｐｍで遠心分離して、ＲＮＡをペレット化した。上澄を 注意深く除去して捨て、ＲＮＡペレットを５００成のピロ炭酸ジエチル−処理水 中に再懸濁した。 ＤＮＡとのハイブリダイゼーション ａ）制限消化物 ＦＰＶ　ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物及びＩｌ、２ｋｂ　Ｂａｍ旧クワクローンａ ｍＨＩ　／ＥＣＯＲＩ消化物を０．９％アガロースゲル上で分離した。サザンブ ロッティングによりＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移行した。月、　２ ｋｂ断片からのＭ＋３クローンの一本鎖調製物をニトロセルロース上にスポット し、真空下でＨ℃で２時間固定する（１ｍｌ培養から得たＤＮＡの１／１０）。 フィルターヲｌｏｍｌノ５　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（Ｓ　Ｓ　Ｃ１；！０．１５Ｍ　Ｎ ａＧ２．０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）中で６０℃で２時間予備ハイブリダ イズした。プローブとして使用中の標識ＲＮＡの懸濁液を、フィルターを加える 前に３分間煮沸した。プローブ及びフィルターを、振盪しながら、６０℃で１８ 〜２０時間インキュベートした。そのフィルターを２ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ 中で、４２℃テ３０分間洗浄し、つぎに０．１ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中テ２ ５℃テ３０分洗浄して、その後Ｘ線フィルムに露呈した。 結　果 標識ウィルスＲＮＡは、ＦＰＶ　ＤＮＡの消化物中の２つのＥｃｏＲＩ断片のみ を強力にハイブリダイズすることが判明した。 一方は７９０ｂｐ　、他方は３８３０ｂｐである（特に約６．０００ｂｐの領域 では、いくつかのさらに大きな帯は弱くハイブリダイズした）。 ＲＮＡはまた、ｌ］、２ｋｂ　Ｂｘｍ旧断片のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化物に おける３８３０ｂｐ帯ともハイブリダイズした。アガロースゲルから精製された ７９０ｂｐ及び３８３０ｂｐの大きさの標識ＥＣ０ＲＩ　ＦＰＶ　ＤＮＡは、Ｇ ＋ｕｎｓｊｅｉｎ　＆　Ｈｏｇｎｅｓｓの十分公知の方法によって、ｐＵｃ１３ にクローニングされたＦＰＶ　ＤＮＡ断片のＥＣ０ＲＩライブラリをプローブす るのに用いた。したがって、いくつかのｐυＣＩ３クローンを確認したが、これ をまた標識ｉｎ　ｖＨｒｏ　ＲＮＡでプローブした。その結果得られたＰ　Ｕ　 Ｃ１３クロ一ン群をプローブして２つに分類し、７９０ｂｐの大きさのウィルス 挿入物を有するものと、３８３Ｄｂｐの大きさの挿入物をもつものとに分けた。 ３８３０ｂｐの大きさのクローンをＩｌ、２ｋｂ　Ｂａｍ旧断片（ヌクレオチド ６１６２〜９９９２　：　Ｅ　ｃｏＲＩ部位に下線を施す）から得られた標識３ ８３０ｂｐ断片でプローブした結果、同じものであることが判明した。３８３゜ ｂｐ断片は、強力にプロモートされる０ＲＦ８及びＯＲＦ　１０遺伝子の全体を 含む。さらに、７９０ｂ、クローンの各末端がら得られる約＋２０ｂｐの配列を 調べられている（下記参照）。この７９０ｂｐクローンと下に示す配列情報を用 いて、この遺伝子の５′末端及びそこからプロモータ領域を容易に確認すること ができる。 以下に示すものは、７９０ｂｐ断片の両端付近から確定された部分的配列である （各末端からの２〜３のヌクレオチドはシーケンシングされていない）。上記６ ８０という番号は断片の正確な長さが分からない場合の近似値である。Ｎ＝未確 定ヌクレオチド。 ＴＧＴＣＡＴＣＡＴＡ　ＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡ　ＡＡＴＧＴＡＡＴＡＴ　ＡＡＴ ＴＡＧＣＧＣＣＴＧＡＴＴＧＴＧＴＣＧＡＴＡＣＡＴＴＡＴｌｏ　２０　３０　 ４０　５０　６０ ＣＧＧＧＴＧＡＡＡＡ　ＧＴＣＣＡＣＣＧＴ人　人ＴＡＴＴＧＣＴＴＴ　ＴＡＴ ＣＧＧＴＴＧＴ　ＡＴＴＴＡＣＣＡＣＧ　ＴＡＴＡＣ−−−|− −一一一一一未決定配列　−−−−−−−−−−−−−−一−−−−−ＧＴＴＣ ＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴ　ＴＡＡＴＧＴＡＣＧＴ　ＴＡＴＴＴＴＧＴＡＡ　ＴＡ ＡＴＧＴＴＴＡＴ　ＡＴＡＡＡＴＴＡＣＣＡＴＡＣＴＴＴＡＮm ６９０　７００　７１０　７２０　７３０　１４ＯＮＡＴＴＡＴＡＡＡＴ　ＡＴ ＴＧＡＡＧＴ＾＾　＾ＡＧＡＡＴＡＧＴＣＴＡＡＡＴＴＡＣＣＴ　ＡＡＣＡＴＡ ＧＡＡＣＡＴＣＡＴｂ）　Ｉｌ、２ｋｂ断片から得られるＭ１３クローン１１、 ２ｋｂ断片から得られる一連の一本鎖Ｍ１３クローンをニトロセルロース上にス ポツティングした。クローンは、断片中の各種用開放読み枠（ＯＲＦ）が、その ＯＲＦから予測されるＲＮＡと同じ配位のクローン（即ちＲＮＡとハイブリダイ ズできない）と、逆配位の（即ちそのＯＲＦからのＲＮＡとハイブリダイズする と予測される）クローンとによって表わされるように選択した。そのクローンを 以下に示す。 ヌクレオチドＮｏ、ハイブリダイズ ＊これはクローンの実際の末端ではないが、しかしほぼそれがシーケンシングさ れる点までである。 結　果 下記のクローンのみがｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＲＮＡとハイブリダイズした：ＧＧ２ 　非常に強力に（ＯＲＦ５プロモータ）ＧＣ６１弱く ＧＪ２４　非常に強力に（「同配位クローン」であるという事実にもかかわらず ） ＧＢ８４　中等度に強＜　（ＯＲＦＩＯプロモータ）これらの結果は、前初期強 カプロモータの確認にＲＮＡ転写法を用いるのが合理的であることを確証するも のである。したがって、０ＲＦ５及びＯＲＦ　１０プロモータを含むクローンは ［＋１ＲＮＡと強力にハイブリダイズした。０ＲＦ８プロモータを含むクローン からは何の信号も得られなかったが、これはおそらく、それが前初期段階で作用 しないためであろうと思われる。 ＧＦ２４（ヌクレオチド８７８５〜８５８４）の強力なハイブリダイゼーション は、多分、８８４４で遺伝子末端を越えて、０ＲＦ９　（８６３２〜８８３５） をコードするＤＮＡ中へ十分に奏効するＯ　ＲＦ　１０遺伝子（ヌクレオチド９ ６８６〜８８４４）に対して転写されるｍＲＮＡの結果である。 当然、前初期プロモータが必要とされる場合は０ＲＦ５、ＯＲＦ　１０．及びｒ ７９０ｂｐ　Ｊプロモータが唯一良好な選択であると思われる、ということにな る。 ↓ ＨＩＩ　りＦ＊−立イ云ｊ 冒讐首］　１０８ノ２ Ｅ＄　ｑｆ＝ψ禰神天 −フρ、スミｙ′Ｉ）ＨＡ ［ＩＩ刊　外疋連Ｘ云シ １票　１ｏぞ／り 匹コ計姓鴻確我 ｌ◎ｌ　々７０−、−ング右ψ４ −１クスミ←゛Ｄ寮 補正書の写しく翻訳文）提出ｉＦ（特許法第１８４条の８）平成２年４月２３日 １、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００９２２２、発明の名称　鶏痘ウ ィルスプロモータ３、特許出願人 住　所　イギリス国、ロンドン・ニス・イー・　１・　６・ビー・ニー、ニュウ イントン・コーズウエイ・　１０１／名　称　ナショナル・リサーチ・ディベロ ップメント・コーポレイション ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正書の提 出年月日　１９９０年１月１７日６、添附書類の目録 （１）補正書の翻訳文　１通 （ツ・３紙１） 相同性が高いということにはならず、事実、本発明者の未発表データは、これが 真相でないことを示唆している。 さらに従来技術は、「発明の要約」の項の後で言及するつもりであり、その内容 も明らかにされる。 発明の要約 本発明の多くは、いくつかのＦＰＶ遺伝子の位置を定め、プロモータ性強度に関 してそれらに関連した５′非コード領域を試験し、それによっである強力なプロ モータを選択することによって生じた。 ＦＰＶゲノムのいくつかの領域は、本発明に至る研究で調べられてきた。それら のいくつかはＤＮＡを酵素ＢａｍＨＩで切断し、それによって生成されるプラス ミドの範囲内から約１１．２キロベースの挿入体を有するものを選択し、そのＤ ＮＡ長を調べることによって生じる。別のものは、ＦＰｖゲノムを無作為（ラン ダム）クローニングし、これらの配列を上記ワクシニア４ｂ遺伝子のＤＮＡの配 列と比較することによって生じた。 その結果、４つの強力なプロモータが判明したので、本発明はそれらを含む種々 のＤＮＡ分子を提供する。ポックスウィルスＤＮＡのプロモータについては、現 在、科学的には十分には分かっていない。遺伝子の５′又は「上流」末端までの 一定の領域は、転写に関与するＲＮＡポリメラーゼを結合することによりメツセ ンジャーＲＮＡにゲノムＤＮＡを転写するのに役立つので、その遺伝子の開始コ ドンを含むＲＮＡの転写が可能となるということは公知である。このような上流 領域が「プロモータ」と呼ばれる。上流配列のヌクレオチドのどれがプロモーシ ョンに不可欠で、どれが不可欠でないか、あるいは公知のプロモータの正確には どれが最小でどれが最大の長さなのかをはっきりということはできない。プロモ ータがどのあたりで、どの位の長さであるか正確に分からないのは一見、かなり 不満足であるようであるが、ＤＮＡの転写に役立つ領域外の別のＤＮＡを含入す ることについては通常何の害もないため、実際には問題でない。さらに、後述す る通り、それは、こめ領域をさらに精確に測定するための冗長な実験によって可 能となる。これらの全情況においては、したがって、プロモータの配列に言及す るよりむしろ、それが先行する遺伝子に言及することによってプロモータを定義 する方がより妥当である。問題の遺伝子のうち４つは、ＢａｍＨＩ断片のオープ ン読み枠０ＲＦ８、ＯＲＦ遺伝子に対応する（最高度の相同性を示す）ＦＰＶの 遺伝子である。最後に記載したＦＰＶ遺伝子は、便宜上ＦＰ４ｂと呼ばれる。こ れらの遺伝子は、以下の実施例１で十分に確認される。 これらの遺伝子は種々の方法で定義することができるが、もちろん、１つの鎖の 間、あるいはＦＰＶの種類の間で、それらの配列の差異は疑いなく小さいという ことは常に共通している。 それらを定義する便利な、且つ任意の方法の１つは、それらがコードする適当な 長さのアミノ酸配列に言及することである。 最初の１０個、さらに好ましくは最初の２０個のアミノ酸といったところが、Ｆ ＰＶにおる独特の配列を形成すると考えるのが理にかなっている。したがって、 ４つの遺伝子のある慣用的定義は、以下に示すと同様の最初の２０個のアミノ酸 に基づくものである： （＋）ＦＰ４ｂ遺伝子。これは以下の開始配列を有する、約６５７個のアミノ酸 の蛋白質をコードする。 Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　人ｈｐ　Ｓｅｔ　Ａｓｎ　ｌｌｅ　Ａｌｌ　ｌｌｅ　 ＧＩ＋＋Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｔｎ　Ｉｌｅ　ＬｅＩＩ Ｌｅａ　Ｇｌｗ（２）ＢａｍＨＩ断片０ＲＦ８遺伝子。以下の開始配列を有する 、約１１６個のアミノ酸の蛋白質をコードする。 Ｍｅｔ　ＧＩＯＧｌｕ　ＧＩＦ　ＬＴＩ　ＰＩＯＡｒｇ　Ａｕｇ　Ｓｅｔ　Ｓｅ ＋＾１ａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　丁＋ｐ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　ＧＴＩ 　ＧＩＹ（３）ＢａｍＨＩ断片０ＲＦ５遺伝子。以下の開始配列を有する、約１ ０５個のアミノ酸の蛋白質をコードする。 Ｍｅｔ　ＩＩｅ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｌ１　Ａｓｎ　Ｌ７ｓ　人ｌＩ 　ＬｅａＧｌＨＳｅｔ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｓｅｔ　人ｌｐ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｌ ＴＩ　Ｔｈｒ（４）ＢａｍＨＩ断片０ＲＦＩＩ）遺伝子。以下の開始配列を有す る、約２８０個のアミノ酸の蛋白質をコードする。 Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖｘｌ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　 １ｌｅＬＪｌ　ＬＴＩ　Ｍ！１　人＋ｎ　ｌｌｅ　Ｔａｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌ ｙｓ　Ｉｌｅ遺伝子　（１）〜（４）に関しては、２０個のアミノ酸における変 動は異なるＦＰＶ株間で生じるであろうことは、もちろん理解できる。おそらく 、全遺伝子に関して少なくとも９０％の相同性が認められるが、しかし、最初の ２０個のアミノ酸に関しては相同性が低くてもよく、おそらくは３〜４つまでの 差異が認められる。しかしながら、最初の１０〜２０個のアミノ酸配列における 異所性の正確な度合いは何であれ、どの遺伝子が意図するものに関して当業者は いかなる疑いもないことは確かである。 まもなく、ＦＰＶゲノムの部分的地図を作製できると予測される。その他のポッ クスウィルス同様、ＦＰＶは、その両端間に類似性を有する直鎖ゲノムを有する 。その末端配列は逆に反復される。これらの末端逆転反復（ＴＩＲｓ）内では、 直列的反復配列が存在する。指示されたＢａｍＨＩ消化によりこれらの末端逆転 反復（Ｔ　Ｉ　Ｒ）配列を含有するクローンが生じ、検査したＦＰＶ株のＴＩＲ 内には、約１１．２ｉｂ断片の一端（本明細書で後述する配列の左手）で約３． ７〜４．Ｏｋｂの長さが存在することが確定されている。ＦＰ４ｂ遺伝子は、そ のゲノムの中心領域にあることは確かである。０．７９ｋｂ配列のどのあたりで あるがは、目下不明である。 （ビリ給　２　） 一方は７９０ｂｐ　、他方は３８３０ｂｐである（特に約６．０００ｂｐの領域 では、いくつかのさらに大きな帯は弱くハイブリダイズした）。 ＲＮＡはまた、Ｉｌ、　２ｉｂ　Ｒａｍ旧断片のＥｃｏＲＩ　／　ＢａｍＨＩ消 化物における３８３Ｑｂｐ帯ともハイブリダイズした。アガロースゲルから精製 された？９０ｂｐ及び３８３０ｂｐ（７）大きさの標識ＥｃｏＲＩ　ＦＰＶ　Ｄ ＮＡは、Ｇｒｕｎｔｌｅｉｎ　＆　Ｈｏｇｎｅｓｓの十分公知の方法によって、 ｐＵｃＩ３にクローニングされたＦＰＶ　ＤＮＡ断片のＥＣ０ＲＩライブラリを プローブするのに用いた。したがって、いくつかのｐＵｃＩ３クローンを確認し たが、これをまた標識ｉｎ　ｖｉｆｒｏ　ＰＩＮＡでプローブした。その結果得 られたＰ　Ｕ　Ｃ１３クロ一ン群をプローブして２つに分類し、？９０ｂｐの大 きさのウィルス挿入物を有するものと、３８３０ｂｐの大きさの挿入物をもつも のとに分けた。３８３［１ｂｐの大きさのクローンをＩｌ、２ｋｂ　Ｂｍｍｍ新 旧（ヌクレオチド６１６２〜９９９２　：　Ｅ　ｃｏＲＩ部位に下線を施す）か ら得られた標識３８３０ｂｐ断片でプローブした結果、同じものであることが判 明した。３８３０ｂｐ断片は、強力にプロモートされる０ＲＦ８及び０ＲＦＩＯ 遺伝子の全体を含む。 ｂ）　１１．２ｉｂ断片から得られるＭ＋３クローン＋１．２ｉｂ断片から得ら れる一連の一本鎖Ｍ！３クローンをニトロセルロース上にスポツティングした。 クローンは、断片中の各種用開放読み枠（ＯＲＦ）が、そのＯＲＦから予測され るＲＮＡと同じ配位のクローン（即ちＲＮＡとハイブリダイズできない）と、逆 配位の（即ちそのＯＲＦからのＲＮＡとハイブリダイズすると予測される）クロ ーンとによって表わされるように選択した。そのクローンを以下に示す。 （ｇｌＩ　１９≦、う） 当然、前初期プロモータが必要とされる場合は０ＲＦ５、ＯＲＦ　１０プロモー タが唯一良好な選択であると思われる、というこ七になる。 請求の範囲 １、　ＦＰＶベクター中に挿入される外来遺伝子の転写を促進するための鶏痘ウ ィルス（ＦＰＶ）プロモータＤＮＡであって、下記のＦＰＶ　ＤＮＡ遺伝子のい ずれかのプロモータから成り、事実上、該遺伝子をコードしておらず（非コード 配列）且つ１５０ヌクレオチドまでの長さである、該遺伝子の５′末端側の配列 から構成されるＤＮＡ　： （１）開始配列として Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　人（ｐ　Ｓｅ＋　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌｘ　ｌｉｅ　 ＧｌｕＧｌｕ　Ｖａｌ　１４１　Ｔｙ＋　Ｐ＋ｏ　Ａ＋ｎ　ｌｌｅ　ＬｅＵ　Ｌ ｅＩＩ　Ｇｌｕ又はこのような配列の変異体を有する約６５７個のアミノ酸から 成る蛋白質をコードするＦＰ４ｂ遺伝子；（２）開始配列として Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　ＧＩＩＩ　Ｇｌ！　Ｌｙｔ　Ｐｒｏ　Ａｕｇ　Ａｕｇ　Ｓｅｔ 　５ｅｔＡＩＡ　Ｖｌｌ　Ｌｅｕ　Ｔａｐ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｐ＋ｏ　 ＣＴＩ　Ｇｌｙ又はこのような配列の変異体を有する約１１６個のアミノ酸から 成る蛋白質をコードするＢａｍＨＩ断片０ＲＦ８遺伝子；（３）開始配列として Ｍｅｔ　ｌｌｅ　ｌｌｅ　Ａｒｇ　Ａｕｇ　Ａｓｎ　Ａｃｎ　Ｌｙ＋　Ａｌａ　 ＬｅｕＧＩ７　Ｓｅｔ　ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｓｅｔ　Ａｓｐ　Ｐ’ｂｅ　ＩＩｓ　 Ｌ７Ｓ　Ｔｈｒ又はこのような配列の変異体を有する約１０５個のアミノ酸から 成る蛋白質をコードするＢａｍＨＩ断片０ＲＦ５遺伝子；（４）開始配列として Ｍｅｔ　ＬＴＳ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ａｕｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　 １ｌｅＬＢ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｌｙ ｓ　ｌｌｃ又はこのような配列の変異体を有する約２８０個のアミノ酸から成る 蛋白質をコードするＢａｍＨＩ断片ＯＲＦ　１０遺伝子。 国際調査報告 １ｍ−１１内１１ｗｌ１ａ＋ＡａＴｈｃ１１レ−シー−−媚−ＰＣＴ／ＧＢ８８ １００９２２−２−５Ａ　２５０６４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＦＰＶベクター中に挿入される外来遺伝子の転写を促進するための鶏痘ウイ ルス（ＦＰＶ）プロモータＤＮＡであって、下記のＦＰＶ ＤＮＡ遺伝子のいず れかのプロモータから成り、事実上、該遺伝子をコードしておらず（非コード配 列）且つ１５０ヌクレオチドまでの長さである、該遺伝子の５′末端側の配列か ら構成されるＤＮＡ： （１）開始配列として 【配列があります】 又はこのような配列の変異体を有する約６５７個のアミノ酸から成る蛋白質をコ ードするＦＰ４ｂ遺伝子；（２）開始配列として 【配列があります】 又はこのような配列の変異体を有する約１１６個のアミノ酸から成る蛋白質をコ ードするＢａｍＨＩ断片ＯＲＦ８遺伝子；（３）開始配列として 【配列があります】 又はこのような配列の変異体を有する約１０５個のアミノ酸から成る蛋白質をコ ードするＢａｍＨＩ断片ＯＲＦ５遺伝子；（４）開始配列として 【配列があります】 又はこのような配列の変異体を有する約２８０個のアミノ酸から成る蛋白質をコ ードするＢａｍＨＩ断片ＯＲＦ１０遺伝子；並びに （５）コードスタンドがＦＰＶ　ＲＮＡと強力にハイブリダイズし、少なくとも 一部が約７９０ｂｐ配列内にあって、その５′末端付近に配列； 【配列があります】を、またその３′ 末端付近に配列： 【配列があります】を含む遺伝 子。 ２．非コード配列が遺伝子の開始コドン直前で１００ヌクレオチドまでの長さで ある請求項１記載のＦＰＶプロモータＤＮＡ。 ３．非コード配列が遺伝子の開始コドン直前で８０ヌクレオチドまでの長さであ る請求項２記載のＦＰＶプロモータＤＮＡ。 ４．遺伝子の開始コドン直前で１００ヌクレオチドまでの下記の配列： 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 【配列があります】 のいずれか、又はこのような配列の変異配列である、請求項２記載のＦＰＶプロ モータＤＮＡ。 ５．挿入物としてＦＰＶの非必須領域（ＮＥＲ）配列を含むクローニングベクタ ーから成る組換えベクターであって、上記ＮＥＲが請求項１、２、３又は４記載 の（ａ）プロモータＤＮＡ、及び（ｂ）その下流につながり該プロモータにより 転写可能な外来遺伝子から成るＤＮＡによって中断される、前記ベクター。 ６．挿入物として、次の順に （１）鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）ゲノムの第１相同組換え可能配列、 （２）ＦＰＶゲノムの非必須領域（ＮＥＲ）の第１部分内の配列、 （３）請求項１、２、３又は４記載のＦＰＶプロモータＤＮＡ、 （４）転写上プロモータの下流にある外来遺伝子（鶏痘ウイルスＲＮＡポリメラ ーゼがプロモータと結合したとき、外来遺伝子を田ＲＮＡ中に転写する） （５）ＦＰＶゲノムの同一ＮＥＲの第２部分内の配列であって、第一及び第二配 列がＦＰＶゲノム内のＮＥＲの第１及び第２部分と同じ相対配向である配列、（ ６）ＦＰＶゲノムの第２相同組換え可能配列であって、上記配列（１）及び配列 （６）がＦＰＶゲノムのＮＥＲの側面に配置し、それらがＦＰＶゲノム内に存在 する場合と同じ組換えベクター内での相対配向を示す配列、を含有するクローニ ングベクターより成る組換えベクター。 ７．外来遺伝子と転写可能に結合する請求項１、２、３又は４記載のＦＰＶプロ モータから成るＤＮＡカセット。 ８．請求項７記載のＤＮＡカセットを含む組換えクローニングベクター。 ９．請求項５又は６記載の組換えベクターの挿入物ＤＮＡによる親ＦＰＶの相同 組換え産物である組換え鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）。 １０．請求項９記載のウイルスに感染した動物細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養物。 １１．動物細胞がニワトリ細胞である請求項１０記載の培養物。 １２．請求項９記載の組換えＦＰＶで接種することから成る反応性動物のワクチ ン接種方法。 １３．動物がニワトリである、請求項１２記載の方法。