JPH03500648A

JPH03500648A - 新ペプチド、人工抗原およびイムノアッセイキット

Info

Publication number: JPH03500648A
Application number: JP63508893A
Authority: JP
Inventors: トロジナル，ジェルジー; ワーレン，ブリッタ; ルデン，ウラ
Original assignee: フエリング、アクチエボラーグ
Priority date: 1987-10-28
Filing date: 1988-10-27
Publication date: 1991-02-14
Anticipated expiration: 2013-10-30
Also published as: FI902143A0; FI902143A7; JP3231666B2; EP0396559A1; DE3855479D1; JPH10101697A; SE8704185L; NO302369B1; DK104590D0; IL88224A0; US5981170A; WO1989003844A1; DK104590A; JP2818797B2; NO901899D0; DE3855479T2; EP0396559B1; NO901899L; SE8704185D0; ATE141286T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新ペプチド、人工抗原およびイムノアッセイキット技　術　分　野本発明は、エピトープを構成するＨＩＶの天然ここ現れるアミノ酸配列に対応し、かつ該エピトープの各側乙こ位置する二つのシスティン残基を有するアミノ酸配列を有しており、さらに化学的酸化手段によフて形成された二つの該システィン残基の間にイオウ架橋を有してなる人工ペプチドに関する。ざらに、本発明は、ＨＩＶによって誘導される抗体と反応する人工抗原、ＨＩＶによって誘導される体液サンプル中の抗体を検出する方法、該方法のための診断用イムノアッセイキット、および免疫化成分として少なくとも一つの本発明抗原を含んでなるワクチン組成物、に関する。

背　景　技　術後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、汚染された血ｆＷまたは血液製剤を通しても伝播される性的に伝播されるｆＶＣ患である。これは、感染してＴ−４リンパ球および単球に潜伏して棲息するヒト免疫不全ウィルス（ＨＴ　Ｖ、以前にはＨＴ　Ｌ　Ｖ−ｍと称された）によって起きる（　Ｗｏｎｇ−５ｔａａｌ、　Ｆ、およびＧａ１ｌｏ、Ｒ，Ｃ，：　ＨｕｍａｎＴｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ　３１７．３９５−４０３．１９８５）　、慢性ＨＩＶ感染者は、はとんどの場合は染の間、免疫応答が低下して、５０〜７０％の場合でＡＩＤＳが発症する。感染者の残りの最終結果についてはまだわかってはいない。ＡＩＤＳは発病すると、致死的であって、日和見感染、カボジ肉腫やその他の腫瘍および／または神経疾患によって特徴づけられる。

ＨＩＶ感染を診断するために、ウィルスを分離したり、抗体応答を測定したりする。ウィルス分離は、無症候性ＨＩＶ感染者の３０〜５０％で、ＡＩ　ＤＳ発病患者の９０〜１００％で成功する。抗体応答は、ＨＩＶの種々の構造的および酵素的構成分に対しての免疫グロブリンからなる。これらには、ウィルスのエンベロープタンパク質糖タンパク質（ｇｐ）１２０、経膜的（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質ｇｐ４１およびこれらの前駆体ｇｐ　１６０、内部構造群抗原（１ｎｊｅｒｉｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｔｉｇｅｎｓ）　ｐ　２４．　１７および７／９およびこれらの前駆体ｐ５５、酵素であるところの逆転写酵素（ＲＴ）ｐ６５１５１およびエンドヌクレアーゼｐ３２およびプロテアーゼが含まれる。

ＨＩＶゲノムの調節領域のタンパク質に対する抗体も作られる。ＨＩＶ感染者の正しい同定は、そのヒトの産生ずる免疫グロブリン（Ｉｇ）の型（１種または複数種）およびイムノアッセイに用いられる抗原の正しい成分に依存する。

抗体検出による診断を確立するためによく用いられる一つの方法は、酵素免疫法（ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　（ＥＬＩＳＡ））　（Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、Ｍ。

Ｇ１、Ｐｏｐｏｖｉｃ、　Ｍ−１Ｂｒｕｃｈ、　Ｌ、、　５ｃｈｕｅｐｂａｃｈ、　Ｊ−およびＧａ１ｌｏ、　Ｒ，Ｃ，：　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎＴ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　（ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ）　ｉｎ　ｔｈｅｓｅｒｕｍ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ、　Ｓｃｉ’ｅｎｃｅ　２２４．５０６−５０８．１９８４；　５ｃｈｕｅｐｂａｃｈ、　Ｊ−１Ｈａｌ！ｅｒ、　０−０−１Ｖｏ、　Ｍ、。

Ｌｕｅｔｈｙ−Ｒ−５Ｊｏｌｌｅｒ、　Ｈ，，０ｅ１２．００、Ｐｏｐｏｖｉｃ、　Ｍ、、Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、　Ｍ、　に、およびＧａ１ｉｏ、Ｒ，Ｃ，：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ　ｉｎ　５ｗ１ｓｓ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈＡＩＤＳ　ａｎｄ　ｐｒｅ−ＡｉＤＳ　ａｎｄ　ｉｎ　ｇｒｏｕｐｓ　ａｔ　ｒｉｓｋ　ｆｏｒＡＩＤＳ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｔ、　Ｊ−Ｍｅｄ、　３１２．２６５−２７０．１９８５）。

ウィルス抗原でコートしたマイクロプレートのウェルと調べる血清サンプルとを反応させて、洗浄して、抗ヒトＩｇを加える。後者の試薬を酵素でラベルする。

洗浄の後、血清サンプルに特異的抗ウィルスＩｇが存在する場合のみ酵素でラベルした抗ヒトＩｇが残る。

酵素の基質を加えてこれを可視化して、分光光度計によって呈色反応で定量する。この陽性ＥＬＩＳＡ反応を確認するために、次いで血清サンプルを、例えば、電気泳動的に分画したウィルスサブコンポーネントな含むウェスタンプロットに加える。ウェスタンプロット上の免疫反応によってＩｇがウィルスサブコンポーネントに特徴的なバンドと反応するかどうかが示されよう。通常、二つの異なる特徴的なバンドがＨＩＶ抗体の明確な診断の確立には必要とされる。

ＨＩＶ抗体検出の信頼性は、ＥＬＩＳＡプレートの試薬に依存する。感染細胞の溶解物は細胞夾雑物を含むかもしれず、これここよって誤った陽性の血清学的反応が起きる（　Ｓａａｇ、Ｍ、　Ｓ−およびＢ’ｒｉｔｚ、Ｊ、二Ａｓｙｏ＋ｐｔｏｍａｔｉｃ　Ｂｌｏｏｄ　ｄｏｎｏｒ　ｗｉｔｈ　ａ　ｆａｌｓｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ）ＩＴＬＶＩＩＩ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ、Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎ３１−　Ｊ、Ｍｅｄ−３１４，１１８，１９８５、Ｍａｒｔｉｎ、　Ｐ、Ｗ、、Ｂｕｒｇｅｒ、　Ｄ−Ｒ，、Ｃａｏｕｅｔｔｅ、　Ｓ−およびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ａ、Ｓ、：　Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆ　ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ　ｔｅｓｔｓ　ａｆｔｅｒ　ｓｔｒｏｎｇｌｙ　ｐｏｓｉｔｉｖｅＨＴＬＶＩＩＩ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｔｅｓｔｓ−Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎ８１−　Ｊ−Ｍｅｄ。

３１４．１５７７．１９８６）。通常、ウィルス溶解物は、ｇａｇタンパク質の過剰表示（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）をし〜エンベロープタンパク質はより少なく、これによって間違った陰性反応が生じる。天然のウィルス溶解物に加えて、組換え体によって産生されたポリペプチドも生産されている（　Ｇｈｒａｙｅｂ、　、Ｊ−５Ｋａ　ｔｏ、１９、Ｍｃｋ　ｉ　ｎｎｅｙ。

Ｓｏ、Ｈｕａｎｇ、　Ｊ−Ｊｏ、Ｃｈａｎｄａ、　Ｐ、　Ｋ−５Ｈｏ、　Ｄ、　Ｄ−５Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、Ｍ−Ｇ、、Ｃｈａｎｇ、　Ｔ−Ｗ、およびＣｈａｎｇ。

Ｎ−Ｔ、：　）Ｉｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌ　ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　ＩＩＩ（ＨＴＬＶ−１１１）ｃｏｒｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓ：　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　１ｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗｉｔｈ　ｈｕｍａｎｓｅｒａ−ＤＮＡ’　５．９３−９９．１９８６；　Ｃｈａｎｇ、Ｔ−Ｗ−５Ｋａｔｏ、１０、ＭｃＫｉｎｎｅｙ、Ｓ、、Ｃｈａｎｄａ、Ｐ−５Ｂａｒｏｎｅ、Ａ、Ｄ−。

Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ、　Ｆ−１Ｇａｌｌｏ、Ｒ，Ｃ−およびＣｈａｎｇ、　Ｎ、Ｔ、：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　ｈｕｍａｎ　Ｔ−ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｔｒ’ｏｐｉｃ　ｖｉｒｕｓ−Ｉｌｌ　（ＨＴＬＶ −１ｆｔ）　ｗｉｔｈ　ａｎｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａｃｏｌｉ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｖｉｒａｌ　ａｎｔｉ３ｅｎｉｃ　ｐｅｐ’ｔｉｄｅ、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３．９０５−９０９．１９８５）。これらのアッセイの特異性および感受性はよいが、１００％ではない（Ｃｈａｎｇ、　Ｔ−Ｗ、ら：同上、　Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ、　Ｆ、、Ｅｂｅｒｌｅ、Ｊ、およびＧｕｅｒｔｌｅｒ、　Ｌ、：　５ｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｅｉ８ｈｔ　ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　ａｎｄ　ｏｎｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｎｔｉ −ＨＩＶ　ＥＬＩＳＡ　ｔｅｓｔｓ、　Ｌａｎｃｅｔ、　４０．１９８７）。

エンベロープタンパク質ｇｐ　１２０は分離物間で異なり（すｏｎｇ−５ｔａａｌ、Ｆ、ら：同上、　Ｗｅｉｓｓ、　Ｒ，Ａ−１Ｃ１ａｐｈａｒｎ％Ｐ、　Ｒ，、Ｗｅｂｅｒ、　Ｊ、　Ｎ、、Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ、　Ａ、　Ｇ、、Ｌａ５ｋｙ、　Ｌ−Ａ−、およびＢｅｒｍａｎ、　Ｐ−Ｗ、：　Ｖａｒｉａｂｌｅａｎｄ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ−Ｎａｔｕｒｅ　３２４．５７２−５７５．１９８６）、したがって、これらからのペプチドは通常ＥＬ　Ｉ　ＳＡ抗原としては推奨されない。代わりに、ｇｐ４］に対する抗体は、ＨＩＶ感染の最も感度のよい診断基準とみなされてきた（　Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ、　Ｍ、　Ｇ、！ら：同上、　５ｃｈｕｅｐｂａｃｈ、ｊ、、ら：同上）。ｇｐ４１は、種々の分離物間でよく保持されている領域を含んでいる。ｐ２４に対する抗体は、病気の進行とともに消失する（　Ｌａ’ｎｇｅ、　Ｊ、Ｍ、Ａ、、Ｐａｕｌ、Ｄ、　Ａ−５）Ｉｕｉｓｍａｎ、　Ｈ−に、Ｓｄｅ　ＷｏｌｆｌＦ、、Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｅｒｇ、　）１．、Ｃｏｕｔｉｎｈｏ、Ｒ１Ａ３、Ｄａｎｎｅｒ、Ｓ−Ａ−１ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｎｏｏｒｄａａ、　ｊ−およびＧｏｕｄｓｍｉｔ、ｊ、：　Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　）ＩＩＶ　ａｎｔ’ｉｇｅｎａｅｍｉａ　ａｎｄｄｅｃｌｉｎｅ　ｏｆ　）ＩＩＶ　ｃｏｒｅ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｔｏ　ＡＩＤＳ−Ｂｒ１ｔｉｓｈ−Ｍｅｄ、Ｊ、２９３、１４５９−１４６１．１９８６）が、早期に現れるものである。既知の抗体の応答については、抗ｐ２４および抗ｇｐ４１の絹合せの測定がしたがってすへての場合で最も信頼できよう。

ウェスタンプロットの実施は時間がかかり高価である。ＥＬ　Ｔ　ＳＡで用いる信頼できる抗原を生産すること力Ｓ好ましいようである。いまのところ、単独のアッセイで１００％の特異性と感度を得られるもの−はない（Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ、　Ｆ、、ら：同上、　Ｌａｎｇｅ、、Ｊ、Ｍ−Ａ、、ら：同上）。

最近、Ｇｎａｎｎ　Ｊ、Ｗ、ら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　Ａｕｇ。

１９８７、ｐ、　２６３９−２６４１）は、ＨＩＶのｇｐ４１に由来する１２個のアミノ酸のペプチドを同定したが、これはＨＩＶ５染血清からの血清の１００％に認められた。

記述されたペプチドは二つのシスティン残基を含んでおり、著者らはジスルフィド結合形成がエピトープの抗原構造における重要な役割を果たすという証拠を示すものであると述べていた。しかし、そのような証拠は出されていなかった。著者らは、ペプチドは自然に環化したとみなしており、　彼らはいわゆるジスルフィド結合を還元することによってそれを証明しよ°うとしたが、失敗した。代わりに、彼らはシスティンの一つをセリンに置換した別の１２個のアミノ酸のペプチドを合成して、これを試験したときにＨＩＶ−陽性試験血清の２２個のうちの二つとしか反応しなかフだ。

著者らは、恐らくジスルフィド結合の形成を介して、両方のシスティン残基がエピトープの抗原構造に必須であると結論づけている。彼らは調べたペプチドにジスルフィド結合があったことを証明しておらず、該ペプチドの特定の位置においてセリンよりもシスティンの方がよいことを示した。ペプチド中の二つのシスティンの存在は、環状構造と同意ではない。環化には特定の化学的工程が必要である。すなわち、酸化であり、その結果は方法によって異なり得る。環化が自然に起きる場合には、それはしばしば不完全で、重合を伴う。

原発の（ｐｒｉｍａｒｙ）　ＨＩ　Ｖ疾患においては、期間中抗体試験は陰性であるかもしれない（Ｍａｒｌ　ｉｎｋ、　Ｒ，Ｇ、、Ａ１１ａｎ、　、Ｌ　Ｓ、、Ｍｃｌａｎｅ、　Ｍ、　Ｆ、　、Ｅｓ５ｅｘ、　Ｍ、　、ＡｎｄｅｒＳＯｎ、、に、　Ｃ，およびＧｒｏｏｐｍａｎ、　Ｊ、　Ｅ、：　Ｌｏｗｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＥＬＩＳＡ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｉｎ　ｅａｒｌｙ　ＨＩＶｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎ３１−　．１．Ｍｅｄ、３１５．１５４９．１９８６）。

ＨＩＶに対する抗体を検出するための、さらに感染の初期において検出するための、単一で迅速で感度が高く特異的なアッセイの開発が最も望まれる。

発　明　の　開　示本発明は、ＨＩＶによって誘導される抗体の検出のための、迅速で感度の高い特異的なアッセイを提供する。

本発明の一つの様相において、エピトープを構成するＨＩＶの天然にみられるアミノ酸配列に対応し、かつ該エピトープの各側に位置する二つのシスティン残基を有しているアミノ酸配列を有しており、化学的酸化手段によフて形成された二つの該システィン残基間のイオウ架橋を有する、人工ペプチドが提供される。

二つのシスティン残基間のイオウ架橋によるペプチドのこの安定化は、抗体結合活性の促進や最終産物の化学的安定性などのペプチドの有用な性質をもたらすと確信される。

人工ペプチドは少なくとも二つのシスティン残基を含み、これは環化してイオウ架橋を形成する。連結されろ二つのシスティン残基は、それらの間にエピトープを構成する一つまたはそれ以上のアミノ酸残基（例えば２〜１０残基、例えば５残基）を有していてもよい。本発明による人工ペプチドが二つ以上のシスティン残基を含む場合にも、二つのシスティン残基間にはイオウ架橋が化学的酸化手段によって一つだけ形成される。

本発明のこの様相の好ましい態様において、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−５ｅｒ−ＮＨ２および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドおよび下記の（１ｇ飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドおよび下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドおよび下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配１列を有するペプチド−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ− Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−八５ｐ−９ｅｒ−ＮＨ２および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドおよび下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドおよび下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチドからなる群から選択される人工ペプチドが提供される。

現在、本発明による最も好ましい人工ペプチドは下記のものである。

本発明の他の様相において、ＨＩＶによって誘導される抗体と反応する人工抗原が提供され、この抗原は、エピトープを構成するＨＩＶの天然にみられるアミノ酸配列に対応しかつ該エピトープの各側ζこ位置する二つのシスティン残基を有するアミノ酸配列を有しており、さらに化学的酸化手段乙こよって形成された該二つのシスティン残基の間にイオウ架橋を有する人工ペプチドから主に成る。

本明細書および特許請求の範囲において、「人工ペプチドから主になる抗原］とは、抗原の抗体との反応能は人工ペプチドに由来することを表す。

本発明のこの様相の好ましい態様において、ＨＩＶによって誘導される抗体と反応する人工抗原が提供され、上記に例示したように、この抗原は、本発明による好ましい人工ペプチドから主になる。

本発明による人工抗原は、担体、例えばミネラル担体、例えば水酸化アルミニウム、燐酸カルシウムなど、プラスチック表面、例えばマイクロプレートやビーズなど、タンパク質、例えばウシ血清アルブミンなど、あるいは免疫成分、例えばキーホールカサガイヘモシアニン、などに固定化または結合させることができる。

本発明による人工抗原は、今までのところ、ＨＩＶによって誘導される体液サンプル中の抗体を検出するための診断用抗原としてのみ用いられてきたが、これらはＨＩＶに対するワクチン組成物中の免疫成分として用い得ると信じられている。本発明によるペプチド（例Ｉ）（担体を有しない）をサル（ａｐｅｓ）に注射したところ、ペプチドのＣ−末端部分に対する抗体が誘導された。

このように、本発明のさらなる様相において、本゛発明による人工抗原から選択される少なくとも一つの抗原を、非毒性で製薬掌上許容できる担体および／または希釈剤とともに免疫成分として含んでなるワクチン組成物が提供される。

本発明のざらなる様相において、体液サンプルをイムノアッセイに供して本発明による人工抗原を診断用抗原として用いる、ＨＩ　Ｖによって誘導される該体液サンプル中の抗体を検出する方法が提供される。体液サンプルとしては、尿、唾液、涙液、乳汁、血清または血液が用い得る。

本発明による人工抗原を診断用抗原として用いることができろイムノアッセイは、酵素免疫法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫拡散法または免疫電気泳動（ＩＥ）などいずれのイムノアッセイでもよい。

本発明のこの様相の好ましい態様においてはＥＬＩＳＡが選択されるイムノアッセイとして用いら本発明のざらなる様相において、本発明による人工抗原を診断用抗原として含む、ＨＩＶによフて誘導される体液サンプル中の抗体を検出するための診断用イムノアッセイキットが提供される。用いるイムノアッセイによって、キットは、陽性標準血清サンプル、陰性標準血清サンプル、ＥＬＩＳＡの場合には酵素抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）および必要に応じて酵素抱合体のための基質、さらには必要に応じて緩衝液（１種または複数種）および／または洗浄液（１種または複数種）なの全試薬類は、個別に封をした特定のラベルを付した試験管またはバイアルに含まれる。

ＩＴ″　ぺ°　′ム本発明による人工ペプチドは、線状ペプチド配列を生産するいかなる既知の方法を用いても生産できる。

例えば、クローニング、分解、液体相における一つのアミノ酸残基の次のアミノ酸残基との結合または最初のアミノ酸のＣ末端が結合された同相（樹脂）に始まるアミノ酸の他のアミノ酸への結合、それによって次のアミノ酸のＣ末端は最初のアミノ酸等のＮ末端に結合されて最後に完成されたペプチドが固相から遊離される（いわゆるメリフィールド合成）などの方法がある。一旦・適当７線状′）′ブチド配列が準備できれば、その二つのシスティン残基を環化するために化学的酸化手段に供され、それ乙こよってシスティン残基間にイオウ架橋が形成される。

ム　−　ル　、舌　述以下の諸例において、全てのペプチドを、第二。結合後の終止ステップを備えた二重の結合プログラムを用いてアブライドバイオシステムズ４３ＯＡペプチドシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３０Ａ　ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓ　ｉ　ｚｅｒ）上で合成した。用いた樹脂は、４−メチル− ベンズヒドリルアミン型の理論的負荷ｆｌｏ、６６ｍｅｑ／ｇであった（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ。

Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、　ＫＶ、米国）。合成の最終産物を、−晩真空中で乾燥させた。乾燥後、ペプチド−樹脂をメタノール（７０ｍｌ）に懸濁させて、アンモニアで飽和させた。

加圧（ｐ　ｒｅ、ｓＳｕ　ｒ　ｉ　ｚｅｄ　）スチール容器に入れて、マグネチックスターラーで攪拌しながら一晩放置した。次いて、樹脂を色違して分別して、メタノールで数回洗浄して、真空中で充分ζこ乾燥させた。次いて、ペプチドを、スヵヘンジャーとしてのアニソールおよびエチル−メチル−スルフィド（ＥＭＳ）の存在下で液体フッ化水素（ＨＦ）（こよる処理（ＨＦ：アニソール：ＥＭＳ＝１０：０５二０５）によって樹脂から切り出した。蒸発によフてフッ化水素を除去した後、残渣を酢酸エチル（１００ｍｌ）に懸濁させて、濾過した。固体を酢酸エチル（３Ｘ　１００ｍ１）を加えてフィルター上で洗浄してから切り出したペプチドを酢酸（１００ｍｌ）で抽出した。抽出物を２０％酢酸のメタノール溶液で２ｄｍ３の容量に速やかに希釈して、微かな茶色になるまで０．ＩＮのヨウ素のメタノール溶液で処理した。次いで、アセテート型のダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）　Ｉ　Ｘ　８イオン交換体（３ｇ）　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を加えて、混合物を濾過した。濾液な蒸発させて、残渣を１％酢酸水溶液から凍結乾燥させた。次いで、産゛生物を、アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸水溶液を含む適当な系の２０〜２５ミクロンのＶ　ｙ　ｄ　ａ　ｃ　（５ｅｐａｒａｔｉｏｎＧｒｏｕｐ、　ＣＡ）を充填したカラム上での逆相液体クロマトグラフィーによって精製した。カラムからサンプルを集めて、ボンダパック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）　ＣＩ　８カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｍｉｌｆｏｒｄ、　Ｍａｓｓ−）を備えた分析用ＨＰ　Ｌ　Ｃ−Ｖａｒｉａｎ　５５００　（５ｕｎｎｙｖａｌｅ、　ＣＡ）によって分析した。純粋物質（＞９９．５％）を含む両分をプールして、溶媒を蒸発させて、産生物を１％酢醒水溶液から凍結乾燥した。最終ＨＰ　Ｌ、　Ｃ分析を調整産物について行い、ペプチドの構造をアミノ酸分析およびＦＡＢ−Ｍ　Ｓ　（Ｆａｓｔ　ａｔｏｍ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）によって確認した。

合成中に用いた全てのアミノ酸は、α−アミノ−機能においてｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基によフて保護された。用いた側鎖保護は以下の通りである。

５ｅｒ（ＢＺＬ）、　Ｔｈｒ（ＢＺＬ）、Ｔｙｒ（２−ＢｒＣｂ２）、Ｌｙｓ（２−ＣＩＣｂ２）、０ｒｎ（Ｃｂｚ）、Ａｓｐ（ＢＺＬ）、Ｇｌｕ（ＢＺＬ）、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（Ｍｏｂ）アミノ酸誘導体は、Ｂａｃｈｅｍ　ＡＧ、（スイス）から入手した。

鮭ユ（ＨＴＶ−１−ｇｐ−４１に見出される配列に対応する配列） −Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐ’ｒｏ−Ｔｒｐ−へ５ｎ−Ａｌａ−９ｅｒ−ＮＨ２ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調製した。ＨＰＬＣによる純度− ９９，９％（３６％アセトニトリルのＯ−１％トリフルオロ酢酸溶液、保持時間は２ｍ１／分で６．７９分、２２３　ｎｍで検出）構造をアミノ酸分析およびＦ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓによって確認した。

鮭１（Ｃ末端のより近くに位置するシスティン残基の挿入によって修飾された、ＨＩ　Ｖ−１−ｇｐ　１２０に見出される配列に対応する配列）ペプチドを合成の一般的記述に記載の方法によフて調製した。

構造をアミノ酸分析およびＦＡＢ−ＭＳによって確認した。

附」（ＨＩ　Ｖ−１−ｇｐ−４１に見出される配列に対応する配列）ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調製した。構造をアミノ酸分析およびＦ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓによって確認した。

訃■ （ＨＩＶ−１−ｇｐ−４１に見出される配列に対応する配列）ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調製した。構造をアミノ酸分析およびＦ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓによって確認した。

九り工１土里工　− （ＨＩ　Ｖ−１−ｇｐ−４１に見出される配列に対応する配列）Ｈ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−−Ａ１ａ−９ｅｒ−ＮＨ２ヨウ素を用いる酸化手段を除いて、ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調製した・純度＞９８．５％（ＨＰＣＬ）構造をアミノ酸分析およびＦ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓによって確認した。

１　余（ＨＩ　Ｖ−１−ｇ　ｐ−４１に見出される配列に対応する配列）一へ１ａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−５ｅｒ−ＮＨ２ヨウ素を用いる酸化手段を除いて、ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従フて調製した。

構造をアミノ酸分析およびＦ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓによって確認（ＨＩ　Ｖ−２− ｇ　ｐ　４１に見出される配列に対応する配列） −Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−５ｅｒ−ＮＨ２ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調製した。構造をアミノ酸分析およびＦ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓによって確認した。

肚１（膜内外のＨＩＶ−２に見出される配列に対応する配列）ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調製した。構造をアミノ酸分析およびＦ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓによって確認した。

例■ （膜内外のＨＩＶ−２に見出される配列に対応する配列）Ｈ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ− Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔ’ｒｐ −Ｇｌｙ−ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調製した。構造をアミノ酸分析およびＦ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓによって確認した。

伶ＬＩ（膜内外のＨＩＶ−２に見出される配列に対応する配列）Ｈ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ− Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｔｒｐ− Ｇｌｙ−ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調製した。構造をアミノ酸分析およびＦ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓによって確認した。

一゛−゛　ルー１止五崖且ＨＩＶによって誘導される抗体の、血液サンプルにおける検出のために、ＥＬ　Ｉ　ＳＡを用いた（　Ｅｎｇｖａ　Ｉ　Ｉ、Ｅ、およびＰｅｒｌｍａｎｎ、　Ｐ、：　Ｅｎｚｙｍｅ−！ｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　（ＥＬＩＳＡ）＋　ＩＩＩ　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｂｙ　ｅｎｚｙｍｅ　１ａｂｅｌｌｅｄ　ａｎｔｉ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｉｎ　ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ　ｔｕｂｅｓ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ　１０９．１２９−１−３５．１９７２）。

柘貝ニプレート：　Ｎｕｎｃ　９６　Ｆ、　Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク抱合体：ＨＲＰ○ウサギ抗−ヒトＩ　ｇ、　Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク李１を衝ン使：炭酸暖衝液：０．０５Ｍ炭酸ナトリウム援衝液、ｐＨ本性　９．５緩衝液Ａ：燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｃａ”およびＭｇ”を含まないもの、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．５０％ツイーン２０＋２０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むもの。４℃で１〜３日保存できる。

ＯＰＤ緩衝液：　０．０３４７Ｍクエン酸、０．０６６７Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ，、ｐＨ５−５，１力月保存できろ。○ＰＤ錠剤、Ｄａｋｏｐａｔｔｓ、　Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク。

洗浄溶液：０．０５％ツイーン２０を含む０．９％コーティング：コーティング抗原（試験ペプチド）の溶液、５〜２０μｇ／ｍｌ、を炭酸緩衝液に調製する。

１００μｍの溶？夜をストライブ（ｓｔｒｉｐｅｓ）または９６穴マイクロプレートの各ウェルに加える。室温で一晩（１８時間）で吸着が起きる。コートされたプレートは、内容物とともに４℃で使用時まで保存できる。

血清アッセイ：１、プレートを洗浄液で４回洗浄する。

２、緩衝液Ａで１：１００に希釈した血清１００μｍを加える。

３．一つのウェルに緩衝ｉＡのみ１００μｍを加え、これを対照とする。

４．３７℃で６０分間インキュベートする。（この間に、抱合体を希釈する、６を参照されたい）５・　洗浄液で４回洗浄する。空にする。

６−１００７ｉ１の抱合体、例えば、緩衝液Ａでに１５．０００に希釈したＨＲＰＯウサギ抗−ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ（例えば、５μｍを０−７５ｍ１に加え、１：１００に希釈する）。

７．３７℃で３０分間インキュベートする。（この間に、基質溶液を調製する、９を参照されたい）８、洗浄溶液で４回洗浄する。空にする。

９．１００μｍのＯＰＤ基質を加える（６錠剤／１０ｍ１ＯＰＤ緩衝液。清浄な容器を用いる。錠剤の溶解には１５〜２０分を要する。溶解したら４μｌＨ２Ｏ２／１０ｍ１を加える）。

１０、室温で３０分間インキュベートする。反応を１００μｌの２．５ＭＨ２Ｓｏ４で停止させる。

１１、プレートを４９０ｎｍで読む。陰性の値は０．２５０以下であるべきである。

上記の材料と方法とを用いて、次の材料を、惑染思者からの血清サンプル中のＨＩＶによフて誘導される抗体の検出のための診断用抗原（コートした抗原）どして試験した。

Ａ、組換えタンパク質ｇｐ１６０（昆虫細胞中のバクロウィルス（Ｂａｃｕ　ｔｏ−ｖｉ　ｒｕｓ）中で発現された）ＯＲｅｐｌｉｇｅｎ　Ｃｏｒｐ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、、Ｍａｓｓ、、米国から入手。

Ｂ、組換えポリペプチドｐ１２１（ｇｐ４１の保存領域を有し、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）でクローニングされた）・Ｒｅｐｌｉｇｅｎ　Ｃｏｒｐ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍａｓｓ−、米国から入手００１本明細書の例■（参考例）に記載の合成ペプチド（システィン残基を一つだけ含みミ環状ではない）。

０２本明細書の例Ｉに記載の本発明による人工ペプチド。

８０本明細書の例■に記載の本発明による人工ペプチド。

ＨＩＶ感染ヒト患者からおよび非感染者からの血清サンプルを試験した。

これらの血清学的な性状は、ウェスタンプロットによって確認しておいた。

結果は次に示される通りであった。

一被検材料　感度　特異性　被検者数（％）　（％）Ａ、　９Ｌ７　１００　９５Ｂ、　９７．５　７５　８７ｃ　、　９３．９　９０−７　３７０Ｄ　、　１．００　９Ｌ９　２２２５Ｅ−１００１００８０上記の結果から、試験した本発明による人工ペプチド（Ｄ、およびＥ、　）は、ともに優れた感度と優れた特異性を示すことが明かである。

同様に、次の追加の本発明による人工ペプチドを試験した。すなわち、Ｆ８本明細書の例■に記載の人工ペプチド、Ｇ１本明細書の例■に記載の人工ペプチド、Ｈ９本明細書の例■に記載の人工ペプチド、１０本明細書の例■に記載の人工ペプチド、および３９本明細書の例Ｘに記載の人工ペプチド。

以下の結果が得られた。

被検材料　感度　特異性　被検者数Ｆ−９２−１（１００）　５０Ｇ、　８４．２　（１００）　３１Ｈ＋　’１００　９Ｌ７　、Ｌ８０Ｉ　、　１００　９８．７　１８０これらのペプチド（Ｆ、〜Ｊ−）はペプチドＤ、およびＥ、はどには良くないが、これらはＨＩＶによフて誘導される抗体との良好な反応性を示す。

′　°　べ　′　°　、上記の材料および方法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）を用いて、例１の環状ペプチドおよびそれに対応する例■の線状のペプチドを異なる血清濃度で試験した。

次の結果が得られた。

ふノＨＩＶ血清陽性、ｎ＝６６ペプチド　血清希釈　へ°ブチトーとの最高吸光度を有す量、μｇ　陽性反応数　る血清希釈物の数環状　線状　環状　線状ｔｏ　ｌ／２０　６６　６６１１５００　−旺　−■ 反応総数　４６７　４２８　４１３　１７５ＨＩＶ血清陰性、ｎ＝２２ペプチド　血清希釈　へ°ブチトーとの最高吸光度を有す量、μｇ　陽性反応数　る血清希釈物の数環状　線状　環状　線状２０　１／２０　０　０　Ｊ−ｕ反応総数　０　０　８　１４上記比較の結果は、対応する線状のペプチドと比較した環状ペプチドの優位性を示している。両ペプチドとも最低血清希釈において全ての血清で陽性となる。

しかし、反応は線状ペプチドでは急激に低下し、一方、環状ペプチドでは陽性抗体反応性のための構造を保持することができる（上記の表、３および４列目を参照されたい）。これは、低い抗体価を（ｔ　ｉ　ｔｒｅｓ）を有する血清の確実な検出を可能にするために必要な特徴である。

ＥＬＩＳＡにおける吸光度値の直接比較によフて、環状ペプチドが線状ペプチドにはるかに優ることが示される（上記の表の５および６列目を参照されたい）。

抗体−陰性血清についてはその関係は逆である。特異性は両ペプチドで１００％であるが、バックグランド値は線状ペプチドの方が高い。これは、特異的および非特異的反応の両方において環状ペプチドが有利であることを示している。

補正書の翻訳文（是出書（ｒ１許法第］８４条の８）平成　２　年夕　月　ノ　日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿　圀］、　国際出願の表示ＰＣＴ／ＳＥ　８８１００５７０３、特許出願人住　所　スエーデン国マルメ、ソルダトルブスベーゲン、５名　称　フエリング、アクチェボラーグ４、代理人（郵便番号１００〉東京都千代田区丸の内三丁目２番３号（１）　補正書の翻訳文　１　通国際出願時の「請求の範囲」の第１項、第３項力憤り除されております。

請　求　の　範　囲１１人工ベペプチドあって、ペプチドが化学的酸化手段によって形成された二つのシスティン残基間にイオウ架橋を有すること、およびペプチドが下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドＨ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−６ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｌａ−５ｅｒ−ＮＨ２および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドおよび下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドＨ−Ａ１　ａ−Ｖａ　１−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｓｕ−Ｇｌｙ−および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドＨ−Ｃ＜５−５ｅｒ二Ｇｌｙ−Ｌｙｓ二Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ７Ｔｈｒ−八１ａ−ＮＨ２および下記の１１コ飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドＨ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｔｒｐ− Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ− Ｔｈｒ−−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−５ｅｒ −ＮＨ２および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド）！−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ −Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−１（ｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−−Ｖａ　１−ＮＨ２および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドＨ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ１　ｎ −ＡＳｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ −および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドＨ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ− Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−９ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ− −Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｓ−’Ｈｉｓ−Ｔｈｒ −ＴＭ−Ｖａｌ−ＮＨ２および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチドからなる群から選択されること、を特徴とする、エピトープを構成するＨＩＶの天然に現われるアミノ酸配列に対応し、かつ該エピトープの各側に位置する二つのシスティン残基を有するするアミノ酸配列を有する人工ペプチド。

２、抗原がエピトープを構成するＨＩＶの天然に現われるアミノ酸配列に対応し、かつ該エピトープの各側に位置する二つのシスティン残基を有するアミノ酸配列を有しており、ざらに化学的酸化手段によって形成された二つの該システィン残基の間にイオウ架橋を有する人工ペプチドから主になり、抗原が下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドＨ−Ｇｌｙ−工１ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃ５ −５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｃｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドおよび下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドおよび下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドＨ−Ｃ５−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｃ￥５−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−ＮＯ３および下記のｉ１７飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、 −Ｃ５−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ｃｓ−下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドＨ−ハｓｎ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇ’Ｌ＋−Ｖａｌ−Ｃ５−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−−Ｔｈｒ− Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−３ｅｒ−ＮＯ３および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドＨ−Ｓｅｒ−Ｔｒ、ｐ−Ｇｌｙ −Ｃｉ−八ｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−−Ｖａｌ −ＮＯ３゜および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドおよび下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチドおよび下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するペプチド −Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−からなる群から選択される人工ペプチドから主になることを特徴とする、ＨＩＶによって誘導される抗体と反応する人工抗原。

３、人工抗原を担体に固定化または結合させることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の人工抗原。

４、請求の範囲第２または３項に記載の人工抗原を診断用抗原として用いることを特徴とする、体液サンプルをイムノアッセイに供する、ＨＩＶによって誘導される体液サンプル中の抗体の検出法。

５、請求の範囲第２または３項に記載の人工抗原を診断用コーティング抗原として用いることを特徴とする、該サンプルを酵素免疫法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）に供する、請求の範囲第４項に記載の検出法。

６、診断用抗原として請求の範囲第２または３項に記載の人工抗原を含むことを特徴とする、ＨＩＶによって誘導される体液サンプル中の抗体の検出のための診断用イムノアッセイキット。

７、追加的に陽性標準血清サンプル、陰性標準血清サンプル、酵素抱合体、必要に応じて、緩衝溶液および／または洗浄溶液を含むことを特徴とする請求の範囲第６項に記載の診断用イムノアッセイキット・８、非毒性で製薬掌上許容される担体および／または希釈剤とともに、請求の範囲第２または３項ζこ記載の人工抗原から選択される少なくとも一つの抗原を免疫化成分として含むことを特徴とする、ワクチン組成物。

国際論量報告畷−Ｉ−、帥−−−１ａ−−’ｔｌｌ−”’ｅＰＣＴ／ＳＥ８Ｂ１００５７０

Claims

【特許請求の範囲】

１．ベブチドが化学的酸化手段によって形成された二つのシステイン残基間にイオウ架橋を有することを特徴とする、エビトーブを構成するＨＩＶの天然に現われるアミノ酸配列に対応し、かつ該エビトーブの各側に位置する二つのシステイン残基を有するアミノ酸配列を有する人工ベブチド。
２．請求の範囲第１項記載の人工ベブチドであって、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】および下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド【配列があります】からなる群から選択されることを特徴とする人工ベブチド。
３．抗原がエビトーブを構成するＨＩＶの天然に現われるアミノ酸配列に対応し、かつ該エビトーブの各側に位置する二つのシステイン残基を有するアミノ酸配列を有しており、さらに化学的酸化手段によって形成された二つの該システイン残基の問にイオウ架橋を有する人工ベブチドから主になることを特徴とする、ＨＩＶによって誘導される抗体と反応する人工抗原。
４．請求の範囲第３項に記載の人工抗原であって、下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド、【配列があります】および下記の修飾されたアミノ酸配列を有するベブチド【配列があります】および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を有するベブチド【配列があります】からなる群から選択される人工ベブチドから主になることを特徴とする、人工抗原。
５．人工抗原を担体に固定化または結合させることを特徴とする、請求の範囲第３または４項に記載の人工抗原。
６．請求の範囲第３〜５項のいずれか１項に記載の人工抗原を診断用抗原として用いることを特徴とする、体液サンプルをイムノアツセイに供する、ＨＩＶによって誘導される該サンプル中の抗体の検出法。
７．請求の範囲第３〜５項のいずれか１項に記載の人工抗原を診断用コーティング抗原として用いることを特徴とする、該サンプルを酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）に供する請求の範囲第６項に記載の検出法。
８．診断用抗原として請求の範囲第３〜５項に記載の人工抗原を含むことを特徴とする、ＨＩＶによって誘導される体液サンプル中の抗体の検出のための診断用イムノアッセイキット。
９．追加的に陽性標準血清サンプル、陰性標準血清サンプル、酵素抱合体、必要に応じて、酵素抱合体のための基質、および必要に応じて、緩衝溶液および／または洗浄溶液を含むことを特徴とする、請求の範囲第８項に記載の診断用イムノアッセイキット。
１０．非毒性で製薬学上許容される担体および／または希釈剤とともに、請求の範囲３〜５項のいずれか１項に記載の人工抗原から選択される少なくとも一つの抗原を免疫化成分として含むことを特徴とする、ワクチン組成物。