JPH10101697A - 新ペプチド、人工抗原およびイムノアッセイキット - Google Patents

新ペプチド、人工抗原およびイムノアッセイキット

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JPH10101697A
JPH10101697A JP9209441A JP20944197A JPH10101697A JP H10101697 A JPH10101697 A JP H10101697A JP 9209441 A JP9209441 A JP 9209441A JP 20944197 A JP20944197 A JP 20944197A JP H10101697 A JPH10101697 A JP H10101697A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＨＩＶによって誘導される抗体の検出のため
の、迅速で感度の高い特異的なアッセイを提供する。 【解決手段】 精製人工ペプチドであって、ペプチドが
化学的酸化手段によって形成された二つのシステイン残
基間にイオウ架橋を有し、かつエピトープを構成するＨ
ＩＶの天然に現われるアミノ酸配列に対応し、かつ該エ
ピトープの各側に位置する二つのシステイン残基を有す
るアミノ酸配列を有する人工ペプチド。上記人工ペプチ
ドから主になる、ＨＩＶによって誘導される抗体と反応
する精製人工抗原。上記の人工抗原を診断用抗原として
用いることを特徴とする、体液サンプルをイムノアッセ
イ（特にＥＬＩＳＡ）に供する、ＨＩＶによって誘導さ
れる体液サンプル中の抗体の検出法、およびこの方法の
ための診断用イムノアッセイキット。上記の抗原を免疫
成分として含むワクチン組成物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エピトープを構成
するＨＩＶの天然に現れるアミノ酸配列に対応し、かつ
該エピトーブの各側に位置する二つのシステイン残基を
有するアミノ酸配列を有しており、さらに化学的酸化手
段によって形成された二つの該システイン残基の間にイ
オウ架橋を有してなる人工ペプチドに関する。さらに、
本発明は、ＨＩＶによって誘導される抗体と反応する人
工抗原、ＨＩＶによって誘導される体液サンプル中の抗
体を検出する方法、該方法のための診断用イムノアッセ
イキット、および免疫化成分として少なくとも一つの本
発明抗原を含んでなるワクチン組成物、に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】後天
性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、汚染された血液また
は血液製剤を通しても伝播される性的に伝播される疾患
である。これは、感染してＴ−４リンパ球および単球に
潜伏して棲息するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ、以前
にはＨＴＬＶ−III と称された）によって起きる（Wong
-Staal、F.およびGallo 、R.C.: Human T-lymphotropic
retroviruses. Nature 317 、395-403 、1985）。慢性
ＨＩＶ感染者は、ほとんどの場合は性的接触によってＨ
ＩＶを伝播するかもしれない。感染の間、免疫応答が低
下して、５０〜７０％の場合でＡＩＤＳが発症する。感
染者の残りの最終結果についてはまだわかってはいな
い。ＡＩＤＳは発病すると、致死的であって、日和見感
染、カボジ肉腫やその他の腫瘍および／または神経疾患
によって特徴づけられる。
【０００３】ＨＩＶ感染を診断するために、ウイルスを
分離したり、抗体応答を測定したりする。ウイルス分離
は、無症候性ＨＩＶ感染者の３０〜５０％で、ＡＩＤＳ
発病患者の９０〜１００％で成功する。抗体応答は、Ｈ
ＩＶの種々の構造的および酵素的構成分に対しての免疫
グロブリンからなる。これらには、ウイルスのエンベロ
ーブタンパク質糖タンパク質（ｇｐ）１２０、経膜的
（transmembrane)タンパク質ｇｐ４１およびこれらの前
駆体ｇｐ１６０、内部構造群抗原（interior structura
l group antigens）ｐ２４、１７および７／９およびこ
れらの前駆体ｐ５５、酵素であるところの逆転写酵素
（ＲＴ）ｐ６５／５１およびエンドヌクレアーゼｐ３２
およびプロテアーゼが含まれる。ＨＩＶゲノムの調節領
域のタンパク質に対する抗体も作られる。ＨＩＶ感染者
の正しい同定は、そのヒトの産生する免疫グロブリン
（Ｉｇ）の型（１種または複数種）およびイムノアッセ
イに用いられる抗原の正しい成分に依存する。
【０００４】抗体検出による診断を確立するためによく
用いられる一つの方法は、酵素免疫法（enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA))（Sarngadharan、M.G.、
Popovic 、M.、Bruch 、L.、Schuepbach、J.およびGall
o 、R. C.: Antibodies reactive with human T-lympho
tropic retroviruses (HTLV-lll) in the serum of pat
ients with AIDS. Science 224、506-508 、1984；schu
epbach, J.、Haller、O.、Vogt、M.、Luethy、R.、Joll
er、H.、Oelz、O.、Popovic 、M.、Sarngadharan、M.
G. およびGallo 、R. C.: Antibodies to HTLV-lll in
Swiss patientswith AIDS and pre-AIDS and in groups
at risk for AIDS. The New Engl. J.Med. 312、265-2
70 、1985）。ウイルス抗原でコートしたマイクロプレ
ートのウェルと調べる血清サンプルとを反応させて、洗
浄して、抗ヒトＩｇを加える。後者の試薬を酵素でラベ
ルする。洗浄の後、血清サンプルに特異的抗ウイルスＩ
ｇが存在する場合のみ酵素でラベルした抗ヒトＩｇが残
る。酵素の基質を加えてこれを可視化して、分光光度計
によって呈色反応で定量する。この陽性ＥＬＩＳＡ反応
を確認するために、次いで血清サンプルを、例えば、電
気泳動的に分画したウイルスサブコンポーネントを含む
ウエスタンプロットに加える。ウエスタンプロット上の
免疫反応によってＩｇがウイルスサブコンポーネントに
特徴的なバンドと反応するかどうかが示されよう。通
常、二つの異なる特徴的なバンドがＨＩＶ抗体の明確な
診断の確立には必要とされる。
【０００５】ＨＩＶ抗体検出の信頼性は、ＥＬＩＳＡプ
レートの試薬に依存する。感染細胞の溶解物は細胞夾雑
物を含むかもしれず、これによって誤った陽性の血清学
的反応が起きる（Saag、M. S. およびBritz 、J.：Asym
ptomatic Blood donor witha false positive HTLV-lll
western blot. The New Engl. J. Med.314、118 、198
5、Martin、P.W.、Burger、D.R.、Caouette、S.およびG
oldstein 、A.S.: Importance of confirmatory tests
after strongly positive HTLV-lll screening tests.
The New Engl. J. Med.314 、1577、1986）。通常、ウ
イルス溶解物は、ｇａｇタンパク質の過剰表示（over-r
epresentation)をし、エンベロープタンパク質はより少
なく、これによって間違った陰性反応が生じる。天然の
ウイルス溶解物に加えて、組換え体によって産生された
ポリペプチドも生産されている（Ghrayeb 、J.、Kato、
I.、Mckinney、S.、Huang 、J. J. 、Chanda、P. K. 、
Ho. D. D. 、Sarngadharan、M. G. 、Chang 、T. W. お
よびChang 、N. T.: HumanT-cell lymphotropic virus
type lll (HTLV-lll) core antigens: synthesisin Esc
herichia coli and immunoreactivity with human ser
a. DNA 5 、93-99、1986; Chang 、T. W. 、Kato、I.、
Mckinney、S.、Chanda、P.、Barone、A. D. 、Wong-Sta
al、F.、Gallo 、R. C. およびChang 、N. T.: Detecti
on of antibodies to human T-cell lymphotropic viru
s-lll (HTLV-lll) with an immunoassay employing a r
ecombinant Eschericha coli-derived viral antigenic
peptide. Bio/Technology 3, 905-909 、1985）。これ
らのアッセイの特異性および感受性はよいが、１００％
ではない（Chang 、T. W. ら：同上、Deinhardt 、F.、
Eberle、J.およびGuertler、L.: Sensitivity and spec
ificity of eight commercial and one recombinant an
ti-HIV ELISA tests. Lancet、40、1987）。エンベロー
プタンパク質ｇｐ１２０は分離物間で異なり（Wong-Sta
al、F.ら：同上、Weiss 、R. A. 、Clapham 、P. R. 、
Weber 、J. N. 、Dalgleish 、A. G. 、Lasky 、L. A.,
およびBerman、P. W. ：Variable and conserved neutr
alization antigens of human immunodeficiency viru
s. Nature 324、572-575 、1986）、したがって、これ
らからのペプチドは通常ＥＬＩＳＡ抗原としては推奨さ
れない。代わりに、ｇｐ４１に対する抗体は、ＨＩＶ感
染の最も感度のよい診断基準とみなされてきた（Sarnga
dharan、M. G.,ら：同上、Schuepbach、J., ら：同
上）。ｇｐ４１は、種々の分離物間でよく保持されてい
る領域を含んでいる。ｐ２４に対する抗体は、病気の進
行とともに消失する（Lange 、J.M.A.、Paul、D. A. 、
Huisman 、H. G. 、de Wolf 、F.、Van der Berg、H.、
Coutinho、R. A. 、Danner、S. A. 、van der Noordaa
、J.およびGoudsmit、J.：Persistent HIV antigenaem
ia and decline of HIV core antibodies associated w
ith transition to AIDS. British. Med. J. 293 、145
9-1461 、1986）が、早期に現れるものである。既知の
抗体の応答については、抗ｐ２４および抗ｇｐ４１の組
合せの測定がしたがってすべての場合で最も信頼できよ
う。
【０００６】ウエスタンブロットの実施は時間がかかり
高価である。ＥＬＩＳＡで用いる信頼できる抗原を生産
することが好ましいようである。いまのところ、単独の
アッセイで１００％の特異性と感度を得られるものはな
い（Deinhardt 、F.、ら：同上、Lange 、J.M.A.、ら：
同上）。
【０００７】最近、Gnann J.W.ら（Journal of Virolog
y 、Aug. 1987 、p. 2639-2641）は、ＨＩＶのｇｐ４１
に由来する１２個のアミノ酸のペプチドを同定したが、
これはＨＩＶ感染血清からの血清の１００％に認められ
た。記述されたペプチドは二つのシステイン残基を含ん
でおり、著者らはジスルフィド結合形成がエピトープの
抗原構造における重要な役割を果たすという証拠を示す
ものであると述べていた。しかし、そのような証拠は出
されていなかった。著者らは、ペプチドは自然に環化し
たとみなしており、彼らはいわゆるジスルフィド結合を
還元することによってそれを証明しようとしたが、失敗
した。代わりに、彼らはシステインの一つをセリンに置
換した別の１２個のアミノ酸のペプチドを合成して、こ
れを試験したときにＨＩＶ−陽性試験血清の２２個のう
ちの二つとしか反応しなかった。著者らは、恐らくジス
ルフィド結合の形成を介して、両方のシステイン残基が
エピトープの抗原構造に必須であると結論づけている。
彼らは調べたペプチドにジスルフィド結合があったこと
を証明しておらず、該ペプチドの特定の位置においてセ
リンよりもシステインの方がよいことを示した。ペプチ
ド中の二つのシステインの存在は、環状構造と同意では
ない。環化には特定の化学的工程が必要である。すなわ
ち、酸化であり、その結果は方法によって異なり得る。
環化が自然に起きる場合には、それはしばしば不完全
で、重合を伴う。
【０００８】原発の（primary)ＨＩＶ疾患においては、
期間中抗体試験は陰性であるかもしれない（Marlink 、
R. G. 、Allan 、J. S. 、Mclane、M. F. 、Essex 、
M.、Anderson、K. C. およびGroopman、J. E.: Low sen
sitivity of ELISA testing inearly HIV infection. T
he New Engl. J. Med. 315 、1549、1986）。ＨＩＶに
対する抗体を検出するための、さらに感染の初期におい
て検出するための、単一で迅速で感度が高く特異的なア
ッセイの開発が最も望まれる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＨＩＶによっ
て誘導される抗体の検出のための、迅速で感度の高い特
異的なアッセイを提供する。本発明の一つの様相におい
て、エピトープを構成するＨＩＶの天然にみられるアミ
ノ酸配列に対応し、かつ該エピトープの各側に位置する
二つのシステイン残基を有しているアミノ酸配列を有し
ており、化学的酸化手段によって形成された二つの該シ
ステイン残基間のイオウ架橋を有する、人工ペプチドが
提供される。二つのシステイン残基間のイオウ架橋によ
るペプチドのこの安定化は、抗体結合活性の促進や最終
産物の化学的安定性などのペプチドの有用な性質をもた
らすと確信される。人工ペプチドは少なくとも二つのシ
ステイン残基を含み、これは環化してイオウ架橋を形成
する。連結される二つのシステイン残基は、それらの間
にエピトープを構成する一つまたはそれ以上のアミノ酸
残基（例えば２〜１０残基、例えば５残基）を有してい
てもよい。本発明による人工ペプチドが二つ以上のシス
テイン残基を含む場合にも、二つのシステイン残基間に
はイオウ架橋が化学的酸化手段によって一つだけ形成さ
れる。
【００１０】この様相の好ましい態様において、下記の
修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド
【化９】 および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、
【化１０】 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド
【化１１】 および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、
【化１２】 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド
【化１３】 および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、
【化１４】 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド
【化１５】 および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、
【化１６】 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド
【化１７】 および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、
【化１８】 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド
【化１９】 および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、
【化２０】 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド
【化２１】 および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド、
【化２２】 下記の修飾されたアミノ酸配列を有するペプチド
【化２３】 および下記の修飾された配列を含むそのより短い配列を
有するペプチド
【化２４】 からなる群から選択されること人工ペプチドが提供され
る。現在、最も好ましい人工ペプチドは下記のものであ
る。
【化２５】
【００１１】本発明による人工ペプチドは、特に下記の
ペプチドから選択される。
【化２６】
【化２７】
【化２８】
【化２９】 および上記各ペプチドにおける二つのシステイン残基間
のアミノ酸配列を含むそれらのより短い配列。
【００１２】本発明の他の様相において、ＨＩＶによっ
て誘導される抗体と反応する人工抗原が提供され、この
抗原は、エピトープを構成するＨＩＶの天然にみられる
アミノ酸配列に対応しかつ該エピトープの各側に位置す
る二つのシステイン残基を有するアミノ酸配列を有して
おり、さらに化学的酸化手段によって形成された該二つ
のシステイン残基の間にイオウ架橋を有する人工ペプチ
ドから主に成る。本明細書および請求の範囲において、
「人工ペプチドから主になる抗原」とは、抗原の抗体と
の反応は人工ペプチドに由来することを表す。本発明の
この様相の好ましい態様において、ＨＩＶによって誘導
される抗体と反応する人工抗原が提供され、上記に例示
したように、この抗原は、本発明による好ましい人工ペ
プチドから主になる。本発明による人工抗原は、担体、
例えばミネラル担体、例えば水酸化アルミニウム、燐酸
カルシウムなど、プラスチック表面、例えばマイクロプ
レートやビーズなど、タンパク質、例えばウシ血清アル
ブミンなど、あるいは免疫成分、例えばキーホールカサ
ガイヘモシアニン、などに固定化または結合させること
ができる。本発明による人工抗原は、今までのところ、
ＨＩＶによって誘導される体液サンプル中の抗体を検出
するための診断用抗原としてのみ用いられてきたが、こ
れらはＨＩＶに対するワクチン組成物中の免疫成分とし
て用い得ると信じられている。ペプチド（例Ｉ）（担体
を有しない）をサル（apes）に注射したところ、ペプチ
ドのＣ・末端部分に対する抗体が誘導された。
【００１３】このように、本発明のさらなる様相におい
て、本発明による人工抗原から選択される少なくとも一
つの抗原を、非毒性で製薬学上許容できる担体および／
または希釈剤とともに免疫成分として含んでなるワクチ
ン組成物が提供される。
【００１４】本発明のさらなる様相において、体液サン
プルをイムノアッセイに供して本発明による人工抗原を
診断用抗原として用いる、ＨＩＶによって誘導される該
体液サンプル中の抗体を検出する方法が提供される。体
液サンプルとしては、尿、唾液、涙液、乳汁、血清また
は血液が用い得る。本発明による人工抗原を診断用抗原
として用いることができるイムノアッセイは、酵素免疫
法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、
免疫拡散法または免疫電気泳動（ＩＥ）などいずれのイ
ムノアッセイでもよい。本発明のこの様相の好ましい態
様においてはＥＬＩＳＡが選択されるイムノアッセイと
して用いられる。
【００１５】本発明のさらなる様相において、本発明に
よる人工抗原を診断用抗原として含む、ＨＩＶによって
誘導される体液サンプル中の抗体を検出するための診断
用イムノアセッイキットが提供される。用いるイムノア
ッセイによって、キットは、陽性標準血清サンプル、陰
性標準血清サンプル、ＥＬＩＳＡの場合には酵素抱合体
（conjugate)および必要に応じて酵素抱合体のための基
質、さらには必要に応じて緩衝液（１種または複数種）
および／または洗浄液（１種または複数種）など他の構
成分を含むであろう。必要に応じて、キットの全試薬類
は、個別に封をした特定のラベルを付した試験管または
バイアルに含まれる。
【００１６】本発明による人工ペプチドの合成 本発明による人工ペプチドは、線状ペプチド配列を生産
するいかなる既知の方法を用いても生産できる。例え
ば、クローニング、分解、液体相における一つのアミノ
酸残基の次のアミノ酸残基との結合または最初のアミノ
酸のＣ末端が結合された固相（樹脂）に始まるアミノ酸
の他のアミノ酸への結合、それによって次のアミノ酸の
Ｃ末端は最初のアミノ酸等のＮ末端に結合されて最後に
完成されたペプチドが固相から遊離される（いわゆるメ
リフィールド合成）などの方法がある。一旦、適当な線
状のペプチド配列が準備できれば、その二つのシステイ
ン残基を環化するために化学的酸化手段に供され、それ
によってシステイン残基間にイオウ架橋が形成される。
【００１７】合成の一般的記述 以下の諸例において、全てのペプチドを、第二の結合後
の終止ステップを備えた二重の結合プログラムを用いて
アプライドバイオシステムズ４３０Ａペプチドシンセサ
イザー（Applied Biosystems 430A Peptide Synthesize
r)上で合成した。用いた樹脂は、４−メチル−ベンズヒ
ドリルアミン型の理論的負荷量０．６６ｍｅｑ／ｇであ
った（Peptides International、Louisville、KY、米
国）。合成の最終産物を、一晩真空中で乾燥させた。乾
燥後、ペプチド−樹脂をメタノール（７０ｍｌ）に懸濁
させて、アンモニアで飽和させた。加圧（pressurized)
スチール容器に入れて、マグネチックスターラーで攪拌
しながら一晩放置した。次いで、樹脂を濾過して分別し
て、メタノールで数回洗浄して、真空中で充分に乾燥さ
せた。次いで、ペプチドを、スカベンジャーとしてのア
ニソールおよびエチル−メチル−スルフィド（ＥＭＳ）
の存在下で液体フッ化水素（ＨＦ）による処理（ＨＦ：
アニソール：ＥＭＳ＝１０：０５：０５）よって樹脂か
ら切り出した。蒸発によってフッ化水素を除去した後、
残渣を酢酸エチル（１００ｍｌ）に懸濁させて、濾過し
た。固体を酢酸エチル（３×１００ｍｌ）を加えてフィ
ルター上で洗浄してから切り出したペプチドを酢酸（１
００ｍｌ）で抽出した。抽出物を２０％酢酸のメタノー
ル溶液で２ｄｍ3 の容量に速やかに希釈して、微かな茶
色になるまで０．１Ｍのヨウ素のメタノール溶液で処理
した。次いで、アセテート型のダウエックス（Dowex)１
×８イオン交換体（３ｇ）（Bio-Rad 、Richmond、CA）
を加えて、混合物を濾過した。濾液を蒸発させて、残渣
を１％酢酸水溶液から凍結乾燥させた。次いで、産生物
を、アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸水溶液
を含む適当な系の２０〜２５ミクロンのＶｙｄａｃ（Se
paration Group、CA）を充填したカラム上での逆相液体
クロマトグラフィーによって精製した。カラムからサン
プルを集めて、ボンダパック（Bondapak）Ｃ１８カラム
（Millipore 、Milford 、Mass.)を備えた分析用ＨＰＬ
Ｃ−Varian 5500 (Sunnyvale、CA）によって分析した。
純粋物質（＞９９．５％）を含む画分をプールして、溶
媒を蒸発させて、産生物を１％酢酸水溶液から凍結乾燥
した。最終ＨＰＬＣ分析を調整産物について行い、ペプ
チドの構造をアミノ酸分析およびＦＡＢ−ＭＳ（Fast a
tom bombardment spectrometyr）によって確認した。合
成中に用いた全てのアミノ酸は、α−アミノ−機能にお
いてｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基によって保護され
た。用いた側鎖保護は以下の通りである。 Ｓｅｒ（ＢＺＬ）、Ｔｈｒ（ＢＺＬ）、Ｔｙｒ（２−Ｂ
ｒＣｂｚ）、Ｌｙｓ（２−ＣｌＣｂｚ）、Ｏｒｎ（Ｃｂ
ｚ）、Ａｓｐ（ＢＺＬ）、Ｇｌｕ（ＢＺＬ）、Ａｒｇ
（Ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（Ｍｏｂ） アミノ酸誘導体は、Bachem AG 、（スイス）から入手し
た。
【００１８】例 Ｉ （ＨＩＶ−１−ｇｐ−４１に見出される配列に対応する
配列）
【化３０】 ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調
製した。ＨＰＬＣによる純度−９９．９％（３６％アセ
トニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸溶液、保持時間
は２ｍｌ／分で６．７９分、２２３ｎｍで検出）構造を
アミノ酸分析およびＦＡＢ−ＭＳによって確認した。
【００１９】例 II （Ｃ末端のより近くに位置するシステイン残基の挿入に
よって修飾された、ＨＩＶ−１−ｇｐ１２０に見出され
る配列に対応する配列）
【化３１】 ペプチドを合成の一般的記述に記載の方法によって調製
した。構造をアミノ酸分析およびＦＡＢ−ＭＳによって
確認した。
【００２０】例 III （ＨＩＶ−１−ｇｐ−４１に見出される配列に対応する
配列）
【化３２】 ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調
製した。構造をアミノ酸分析およびＦＡＢ−ＭＳによっ
て確認した。
【００２１】例 IV （ＨＩＶ−１−ｇｐ−４１に見出される配列に対応する
配列）
【化３３】 ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調
製した。構造をアミノ酸分析およびＦＡＢ−ＭＳによっ
て確認した。
【００２２】例 Ｖ（参考例） （ＨＩＶ−１−ｇｐ−４１に見出される配列に対応する
配列）
【化３４】 ヨウ素を用いる酸化手段を除いて、ペプチドを合成の一
般的記述に記載した方法に従って調製した。 純度＞９８．５％（ＨＰＣＬ） 構造をアミノ酸分析およびＦＡＢ−ＭＳによって確認し
た。
【００２３】例 VI（参考例） （ＨＩＶ−１−ｇｐ−４１に見出される配列に対応する
配列）
【化３５】 ヨウ素を用いる酸化手段を除いて、ペプチドを合成の一
般的記述に記載した方法に従って調製した。構造をアミ
ノ酸分析およびＦＡＢ−ＭＳによって確認した。
【００２４】例 VII （ＨＩＶ−２−ｇｐ−４１に見出される配列に対応する
配列）
【化３６】 ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調
製した。構造をアミノ酸分析およびＦＡＢ−ＭＳによっ
て確認した。
【００２５】例 VIII （膜内外のＨＩＶ−２に見出される配列に対応する配
列）
【化３７】 ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調
製した。構造をアミノ酸分析およびＦＡＢ−ＭＳによっ
て確認した。
【００２６】例 IX （膜内外のＨＩＶ−２に見出される配列に対応する配
列）
【化３８】 ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調
製した。構造をアミノ酸分析およびＦＡＢ−ＭＳによっ
て確認した。
【００２７】例 Ｘ （膜内外のＨＩＶ−２に見出される配列に対応する配
列）
【化３９】 ペプチドを合成の一般的記述に記載した方法に従って調
製した。構造をアミノ酸分析およびＦＡＢ−ＭＳによっ
て確認した。
【００２８】ＨＩＶによって誘導される抗体の、血液サ
ンプルにおける検出 ＨＩＶによって誘導される抗体の、血液サンプルにおけ
る検出のために、ＥＬＩＳＡを用いた（Engvall 、E.お
よびPerlmann、P.：Enzyme-linked immunosorbent assa
y （ELISA)．lll Quantification of specific antibod
ies by enzymelabelled anti-immunoglobulin in antig
en-coated tubes. J. Immunol. 109 、129-135 、197
2）。材料： プレート：Nunc 96 F 、Roskilde、デンマーク 抱合体：ＨＲＰＯウサギ抗−ヒトＩｇ、Dakopatts 、Gl
ostrup、デンマーク緩衝液： 炭酸緩衝液：０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ約
９．５ 緩衝液Ａ：燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｃａ++およ
びＭｇ++を含まないもの、０．５％ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）および０．５０％ツイーン２０＋２０％胎児
ウシ血清（ＦＣＳ）を含むもの。４℃で１〜３日保存で
きる。 ＯＰＤ緩衝液：０．０３４７Ｍクエン酸、０．０６６７
Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ５．５、１カ月保存できる。
ＯＰＤ錠剤、Dakopatts 、Glostrup、デンマーク。 洗浄溶液：０．０５％ツイーン２０を含む０．９％Ｎａ
Ｃｌ
【００２９】方法：コーティング：コーティング抗原
（試験ペプチド）の溶液、５〜２０μｇ／ｍｌ、を炭酸
緩衝液に調製する。１００μｌの溶液をストライプ（st
ripes)または９６穴マイクロプレートの各ウェルに加え
る。室温で一晩（１８時間）で吸着が起きる。コートさ
れたプレートは、内容物とともに４℃で使用時まで保存
できる。 血清アッセイ： １．プレートを洗浄液で４回洗浄する。 ２．緩衝液Ａで１：１００に希釈した血清１００μｌを
加える。 ３．一つのウェルに緩衝液Ａのみ１００μｌを加え、こ
れを対照とする。 ４．３７℃で６０分間インキュベートする。（この間
に、抱合体を希釈する、６を参照されたい） ５．洗浄液で４回洗浄する。空にする。 ６．１００μｌの抱合体、例えば、緩衝液Ａで１：１
５，０００に希釈したＨＲＰＯウキザ抗−ヒトＩｇＧ、
ＩｇＡ、ＩｇＭ（例えば、５μｌを０．７５ｍｌに加
え、１：１００に希釈する）。 ７．３７℃で３０分間インキュベートする。（この間
に、基質溶液を調製する、９を参照されたい） ８．洗浄溶液で４回洗浄する。空にする。 ９．１００μｌのＯＰＤ基質を加える（６錠剤／１０ｍ
ｌＯＰＤ緩衝液。清浄な容器を用いる。錠剤の溶解には
１５〜２０分を要する。溶解したら４μｌＨ２Ｏ２／１
０ｍｌを加える）。 １０．室温で３０分間インキュベートする。反応を１０
０μｌの２．５ＭＨ２ＳＯ４で停止させる。 １１．プレートを４９０ｎｍで読む。陰性の値は０．２
５０以下であるべきである。
【００３０】上記の材料と方法とを用いて、次の材料
を、感染患者からの血清サンプル中のＨＩＶによって誘
導される抗体の検出のための診断用抗原（コートした抗
原）として試験した。 Ａ．組換えタンパク質ｇｐ１６０（昆虫細胞中のバクロ
ウイルス（Baculo-virus）中で発現された）。Repligen
Corp. Cambridge、Mass. 、米国から入手。 Ｂ．組換えポリペプチドｐ１２１（ｇｐ４１の保存領域
を有し、大腸菌（E.coli）でクローニングされた）。Re
pligen Corp. Cambridge、Mass．、米国から入手。 Ｃ．本明細書の例Ｖ（参考例）に記載の合成ペプチド
（システイン残基を一つだけ含み、環状ではない）。 Ｄ．本明細書の例Ｉに記載の人工ペプチド。 Ｅ．本明細書の例IIに記載の人工ペプチド。 ＨＩＶ感染ヒト患者からおよび非感染者からの血清サン
プルを試験した。これらの血清学的な性状は、ウエスタ
ンブロットによって確認しておいた。結果は次に示され
る通りであった。 ＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡ 被検材料 感 度 特異性 被検者数 （％） （％） Ａ． ９７．７ １００ ９５ Ｂ． ９７．５ ７５ ８７ Ｃ． ９３．９ ９０．７ ３７０ Ｄ． １００ ９９．９ ２２２５ Ｅ． １００ １００ ８０ 上記の結果から、試験した人工ペプチド（Ｄ．および
Ｅ．）は、ともに優れた感度と優れた特異性を示すこと
が明らかである。
【００３１】同様に、次の追加の本発明による人工ペプ
チドを試験した。すなわち、 Ｆ．本明細書の例III に記載の人工ペプチド、 Ｇ．本明細書の例IVに記載の人工ペプチド、 Ｈ．本明細書の例VIIIに記載の人工ペプチド、 Ｉ．本明細書の例IXに記載の人工ペプチド、および Ｊ．本明細書の例Ｘに記載の人工ペプチド。 以下の結果が得られた。 ＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡ 被検材料 感 度 特異性 被検者数 （％） （％） Ｆ． ９２．１ （１００） ５０ Ｇ． ８４．２ （１００） ３１ Ｈ． １００ ９８．７ １８０ Ｉ． １００ ９８．７ １８０ Ｊ． １００ ９０ ２１ これらのペプチド（Ｆ．〜Ｊ．）はペプチドＤ．および
Ｅ．ほどには良くないが、これらはＨＩＶによって誘導
される抗体との良好な反応性を示す。
【００３２】環状と線状のペプチドの、血清学的反応性
の比較 上記の材料および方法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、例Ｉの
環状ペプチドおよびそれに対応する例VIの線状のペプチ
ドを異なる血清濃度で試験した。次の結果が得られた。 ＨＩＶ抗体ＥＬＩＳＡ ＨＩＶ血清陽性、ｎ＝６６ ペプチド 血清希釈 ペプチドとの 最高吸光度を有す 量、μｇ 陽性反応数 る血清希釈物の数 環 状 線 状 環 状 線 状 ５ １／２０ ６６ ６６ １／１００ ６１ ６０ １１８ ７８ １／５００ ２７ １９ １５４ １４５ １０ １／２０ ６６ ６６ １／１００ ６５ ６１ １６６ ３０ １／５００ ３６ １３ １６６ １３９ ２０ １／２０ ６６ ６６ １／１００ ５８ ５９ １２９ ６７ １／５００ ２３ １９ １４７ １４４ 反応総数 ４６７ ４２８ ４１３ １７５ ＨＩＶ血清陰性、ｎ＝２２ ペプチド 血清希釈 ペプチドとの 最高吸光度を有す 量、μｇ 陽性反応数 る血清希釈物の数 環 状 線 状 環 状 線 状 ５ １／２０ ０ ０ ２ １１ １０ １／２０ ０ ０ ５ ２ ２０ １／２０ ０ ０ １ １ 反応総数 ０ ０ ８ １４
【００３３】上記比較の結果は、対応する線状のペプチ
ドと比較した環状ペプチドの優位性を示している。両ペ
プチドとも最低血清希釈における全ての血清で陽性とな
る。しかし、反応は線状ペプチドでは急激に低下し、一
方、環状ペプチドでは陽性抗体反応性のための構造を保
持することができる（上記の表、３および４列目を参照
されたい）。これは、低い抗体価を（titres）を有する
血清の確実な検出を可能にするために必要な特徴であ
る。ＥＬＩＳＡにおける吸光度値の直接比較によって、
環状ペプチドが線状ペプチドにはるかに優ることが示さ
れる（上記の表の５および６列目を参照されたい）。抗
体一陰性血清についてはその関係は逆である。特異性は
両ペプチドで１００％であるが、バックグランド値は線
状ペプチドの方が高い。これは、特異的および非特異的
反応の両方において環状ペプチドが有利であることを示
している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルデン、ウラ スエーデン国ソレントゥナ、ビドファレス ベーグ、11

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】精製人工ペプチドであって、ペプチドが化
    学的酸化手段によって形成された二つのシステイン残基
    間にイオウ架橋を有すること、およびペプチトが下記の
    ペプチド 【化１】 下記のペプチド 【化２】 下記のペプチド 【化３】 および下記のペプチド 【化４】 および上記各ペプチドにおける二つのシステイン残基間
    のアミノ酸配列を含むそれらのより短い配列のペプチ
    ド、からなる群から選択されること、を特徴とする、エ
    ピトープを構成するＨＩＶの天然に現われるアミノ酸配
    列に対応し、かつ該エピトープの各側に位置する二つの
    システイン残基を有するアミノ酸配列を有する人工ペプ
    チド。
  2. 【請求項２】抗原がエピトープを構成するＨＩＶの天然
    に現われるアミノ酸配列に対応し、かつ該エピトープの
    各側に位置する二つのシステイン残基を有するアミノ酸
    配列を有しており、さらに化学的酸化手段によって形成
    された二つの該システイン残基の間にイオウ架橋を有す
    る人工ペプチドから主になり、抗原が下記のペプチド 【化５】 下記のペプチド 【化６】 下記のペプチド 【化７】 および下記のペプチド 【化８】 および上記各ペプチドにおける二つのシステイン残基間
    のアミノ酸配列を含むそれらのより短い配列のペプチ
    ド、からなる群から選択される人工ペプチドから主にな
    ることを特徴とする、ＨＩＶによって誘導される抗体と
    反応する精製された人工抗原。
  3. 【請求項３】人工抗原を担体に固定化または結合させる
    ことを特徴とする、請求項２に記載の精製人工抗原。
  4. 【請求項４】請求項２または３に記載の人工抗原を診断
    用抗原として用いることを特徴とする、体液サンプルを
    イムノアッセイに供する、ＨＩＶによって誘導される体
    液サンプル中の抗体の検出法。
  5. 【請求項５】請求項２または３に記載の人工抗原を診断
    用コーティング抗原として用いることを特徴とする、該
    サンプルを酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）に供する、請求項
    ４に記載の検出法。
  6. 【請求項６】診断用抗原として請求項２または３に記載
    の人工抗原を含むことを特徴とする、ＨＩＶによって誘
    導される体液サンプル中の抗体の検出のための診断用イ
    ムノアッセイキット。
  7. 【請求項７】追加的に陽性標準血清サンプル、 陰性標準血清サンプル、 酵素抱合体、 必要に応じて、酵素抱合体のための基質、および必要に
    応じて、緩衝溶液および／または洗浄溶液を含むことを
    特徴とする、請求項６に記載の診断用イムノアッセイキ
    ット。
  8. 【請求項８】非毒性で製薬学上許容される担体および／
    または希釈剤とともに、請求項２または３に記載の人工
    抗原から選択される少なくとも一つの抗原を免疫化成分
    として含むことを特徴とする、ワクチン組成物。
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