JPH03500818A - 骨吸収測定のための尿分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 骨吸収測定のための尿分析 本発明は骨吸収速度測定法に関するものである。さらに詳しく述べるならば、そ れは特殊な尿中架橋アミノ酸、並びに分解した骨コラーゲンに由来するアミノ酸 を含むペプチド断片を数量化する方法に関する。

発明の背景 骨粗軽症は人における最も一般的な骨疾患である。骨折し易くなる初期骨粗彪症 は骨格骨量の進行性正味喪失に起因する。米国では１５００〜２０００万人がこ の疾患にかかっていると推定される。その根本原理は、骨再形成における、すな わち骨組織の合成速度と分解速度との、年令依存性不平衡である。毎年約１２０ ０万の骨粗髪症関連骨折が老人におこり、そのうち約５３８．０００例は背骨の 圧迫骨折で、約２２７．０００例は股関節部骨折で、その他にかなりの数の以前 に骨折した末梢骨がある。股関節骨折の１２〜２０％は、ひどい外傷および出血 をおこすため致命的であり、生きている患者の半数は療養所のケアを必要とする 。

骨粗眩症関連損傷による総コストは年間最低７０億ドルに達する［バーンズ（Ｂ ａｒｎｅｓ、Ｏ，Ｍ、）　、科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）２３６巻９１４ページ（ １９８７）　］。骨骨粗症は閉経後女性に最も一般的であり、彼女らは平均して 、閉経後１０年間で骨量の１５％を失う。この病気は年をとった男性および若い 無月経の女性運動家にもおこる。骨粗髪症の重大かつ増大しつつある社会的およ び経済的結果にもかかわらず、患者または健常者の骨吸収速度を測定する方法は ない。

この病気をモニターすることがむづかしい主な理由は骨吸収速度測定法がないこ とである。

骨量測定法は、中性子活性化分析による全身的カルシウム測定または光子吸収法 による成る骨の鉱質量測定に依ることが多い。これらの方法は骨量が減少してい るかどうかの長期的印象を与え得るだけである。摂取量を排出量と比較すること によるカルシウム平衡の測定は時間がかかり、信頼できない。そして骨鉱質が長 期にわたって失われているかどうかを間接的に評価できるに過ぎない。減少した 骨量および変化した骨代謝を測定するために現在使用できるその他の方法として は、選択した骨部分（腰、踵骨）での定量的走査ラジオメトリーおよび腸骨稜バ イオプシーの組織形態測定がある。前者は単一の骨の特定部位の骨鉱質含量の粗 測定値を与える。組織形態測定は、新しく沈着した骨のつぎ目（ｓ　ｅ　ａｍ） と吸収面との釣合いの半定量的評価である。

２４時間の分解骨の全身排出量を知るための尿検査はずっとより有効である。鉱 質研究（たとえばカルシウム平衡）は信頼性をもって、或いは容易にはこれをす ることができない。骨吸収は鉱質および有機基質の分解を含むから、体液中の新 たに分解した骨生成物の特異的生化学的マーカーが理想的インデックスになる。

幾つかの可能性のある有機インデックスが試験された。たとえば、オキシプロリ ン（はとんどコラーゲンに限定されるアミノ酸であり骨およびその他のすべての 結合組織の主要構造蛋白質）が尿中に排泄される。その排泄速度はある状態、特 に、骨ターンオーバーが大きく増加する代謝的骨疾患であるベージェット病にお いては増加することが知られている。この理由で尿中オキシプロリンはコラーゲ ン分解を示すアミノ酸マーカーとして広く用いられている［シンガー（Ｓｉｎｇ ｅｒ、Ｆ、Ｒ，）ら（１９７８）の“骨代謝疾患（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　Ｂｏｎ ｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ）”■巻（＾ｖｉｏｌｉ、　Ｌ、　Ｖ、およびＫｒａｎｅ、 　Ｓ、　Ｍ、編）４Ｈ−５７５ページ、アカデミツクプレス、ニューヨークコ。

ゴヴアード（Ｇｏｖｅｒｄｅ　）　（米国特許第３．６００．１３２号）は、体 液、たとえば血清、尿、腰椎液、その他の細胞間をモニターする方法を開示して いる。詳しく述べるならば、この発明者は、たとえばベージェット病、マルファ ン症候群、骨形成不全症、コラーゲン組織の新生物増殖および種々の形の矯小発 育症などの病的状態において、生物学的液体中のオキシプロリン量によって測定 されるコラーゲン同化または異化の増加を明らかにすることができた。この発明 者はオキシプロリンを過酸化水素およびＮ−クロロ−ｐ−トルエンスルフォンア ミドで酸化してピロールにし、それをｐ−ジメチル−アミノ−ベンズアルデヒド 中で比色測定することによってオキシプロリンを測定した。

ベージェット病の場合には増加した尿中オキシプロリンは多分はとんどが骨分解 に由来するが、オキシプロリンは概して、特異的指数として用いることができな い。

尿中オキシプロリンの多くは新しいコラーゲン合成に由来しく新しく形成された 蛋白質のうちのかなりの量は組織構造に組み込まれることなく分解し、排泄され る）、また成る種の血液蛋白質並びにオキシプロリンを含むその他の蛋白質のタ ーンオーバーに由来するかも知れない。

その上蛋白質分解に由来する遊離オキシプロリンの約８０％が肝臓で代謝され、 尿中には決してあられれない［キヴイリコ（Ｋｉｖｉ＋ｉｋｏ、に、１．　）　 （１９７０）のＩｎｔ、　Ｒｅｖ、Ｃａｎｎａｃｔ、Ｔｉ５ｓｕ＋ｅ　Ｒｏｓ、 ５巻９３ページおよびヴアイス（Ｗｅｉｓｓ。

Ｐ、　Ｈ，）およびクライン（Ｋｌｅｉｎ、Ｌ、）　（１９６９）のＩ、Ｃ１１ ｎＩｎｖｅｓｔ、　４８巻１ページ］。

ヒドロキシリジンおよびそのグリコシド誘導体（両方共コラーゲン蛋白質に独特 である）はコラーゲン分解のマーカーとしてオキシプロリンより正確であると考 えられた。しかしながらオキシプロリンについて上に記したと同じ理由で、ヒド ロキシリジンおよびそのグリコシドは多分等しく非特異的な骨吸収マーカーであ る［フレイン（Ｋｒａｎｅ、　Ｓ、　Ｍ、　）およびシモン（Ｓｉｍｏｎ、　Ｌ 、　Ｓ、　）　（１９８１）のＤｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、２２巻１８ ５ページコ。

コラーゲンに特異なアミノ酸に加えて、骨質の種々の非コラーゲン性蛋白質、た とえばオステオカルシン、またはその分解産物が、骨代謝測定を目的とするイム ノアッセイの基礎を形成した［プライス（Ｐｒｉｃｅ、　Ｐ、　Ａ、　）ら（１ ９８Ｑ）　、Ｊ、Ｃｌ１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、６６巻８７８ページおよびガンドバ ーグ（Ｇｕｎｄｂｅｒｇ、Ｃ，Ｍ、　）ら（１９８４）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｘｙ ｍｏｌ、　１０７巻５１６ページ］。

コラーゲンの架橋 最も遺伝的タイプのを椎コラーゲンのポリマーは、正常に機能するためにはアル デヒド仲介性架橋の形成を必要とする。コラーゲンアルデヒドは二、三の特異的 リジンまたはヒドロキシリジン側鎖から、リジン酸化酵素の作用によって誘導さ れる゛。新しく形成されたコラーゲンポリマー内のこれらアルデヒドの自発的分 子内および分子間反応によって種々のニー、三−および四官能性架橋アミノ酸が 形成される。架橋残基の種類は組織の種類と共に特異的に変化する［Ｅｙｒｅ、 　Ｄ、　Ｒ，ら（１９８４）　、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５３巻 ７１７−７４８ページ参照コ。架橋の二つの基礎的径路は、一つはリジンアルデ ヒドに基礎を置き、他はヒドロキシリジンアルデヒドに基礎を置く縞模様の（６ ７ｎｍ反復）繊維性コラーゲンで区別される。リジンアルデヒド径路は成人皮膚 、角膜、強膜およびラット尾鍵に優勢であり、その他の軟結合組織にもよくおこ る。ヒドロキシリジンアルデヒド径路は骨、軟骨、靭帯、大部分の鍵および体内 の大部分の内部結合組織に優勢である［ＥＹｒｅ、　Ｄ、　Ｒ，ら（１９７４） 　、上記参照コ。機能する径路は、リジン残基がテロペプチド部位（ここには後 に、リジル酸化酵素によってアルデヒドが形成される）でヒドロキシル化される かどうかによって支配される［バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ、Ｍ、Ｊ、　）ら（１９ ７４）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　１３９巻４６１ページ］。リジンアルデヒド 径路の成熟した架橋アミノ酸の化学構造は未知であるが、ヒドロキシリジンアル デヒド径路の成熟産物としてはヒドロキシピリジニウム残基が確認された。どち らの径路でも、そして大部分の組織で、中間体である水素化硼素還元可能の架橋 残基は新しく形成されたコラーゲンが成熟するにつれて消失する。

これはそれらが比較的短命の中間体であることを示唆している［Ｂａ１ｌｅｙ、 　Ａ、　Ｊ、ら（１９７１）　、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　、１６巻８６ページ］。

例外は骨と歯である。ここでは還元可能残基がかなりの濃度で生存期間中存在す る。この理由は一部には明らかに、新しくつくられたコラーゲン繊維の急速な鉱 質化がその後の自発的架橋による相互作用を阻害するからである［Ｅｙ＋ｅ、Ｄ 、Ｒ，（１９８１）　“鉱質化結合組織の化学および生物学（Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍ ｉｓＤｙ　ａｎｄ　ＢｉｏｌＢｙ　ｏｆ　Ｍｉｎｅｒａｌｉｘｅｄ　Ｃｏｎｎｅ ｃｊｉｎｅ　Ｔｉ５ｓｕｅｓ　）　（Ｖｅｉｓ、Ａ、編集）５ト５５ページ、エ ルセヴイール、ニューヨーク、およびウオルターズ（Ｗａｆｅｒｓ、　Ｃ，）ら （１９ｇ３）　Ｃａ１ｃ、Ｔｉ５ｓ、Ｉｎｊｌ、　３５巻４０１−４０５ページ ）］。

３−ヒドロキシピリジニウム架橋の二つの化学構造が確認された（構造式Ｉおよ び■）。両化合物共、本来蛍光性で、同じ特異的励起と発光スペクトルを有する ［）ジモトＤ、ら（１９７７）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅ ｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　７６巻１１２４ページ、およびＥｙｒｅ、Ｄ、Ｒ，（１ ９８１）　Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｂｉｏｃｈｅω、２２巻５０ページ］。これらのア ミノ酸を組織加水分解産物中に溶し、逆相ＨＰＬＣおよび蛍光検出を用いて高感 度で直接測定することができる（Ｅｙ＋ｅ、　Ｄ、　Ｒ，ら（１９１１４）Ａｎ ａｌＹｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３７巻３８０−３８８ページ）。

構造式Ｉ　構造式■ 成長しつつある動物ではこれらの成熟架橋は鉱質化コラーゲンよりも骨の非鉱質 化コラーゲンフラクションにより多く集中することが報告された（ベインズＡ、 　Ｊ、ら１９８３、Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　Ｂｉｏｐｈｙｇ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｒ ｎｍｒｒΩ、１１３巻、１９７５）　。しかしながら若いウシまたは成人の骨に 対するその他の研究はこの概念を支持していない［Ｅ４ｒｅ、Ｄ、Ｒ，（１９８ ５）著“鉱質化組織の化学および生物学（Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ７　ａｎｄ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｌ　Ｍｉｎｅｒａｌｉｘｅｄ　Ｔｉ５ｓｕｅ＋）　”　、 　／＜　トラ−（Ｂａｔｉｅｒ、Ｗ、４．　）編、　１０５ページ、Ｅｂｓｃａ 　Ｍｅｄｉａ社、バーミンガム、アラバマ］。

冗長なペプチド分離法と一般的アミノ酸分析を用いて人尿中にコラーゲンヒドロ キシピリジニウム架橋が存在することを始めて報告したのはＧｕｎｉａ　−Ｓｍ ＮｈおよびＢＯａｃｅｋであった（　Ｇｕｎｊａ　−ＳｍＨｈ　、　２およびＢ ｏｕｃｅｋ、　Ｒ，Ｊ。

１９８１、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１９７巻７５９−７６２ページ）。その当時彼 等はＨＰ型の架橋しか知らなかった。

ロビング（Ｒｏｂｉｎｓ、　Ｓ、Ｐ、　１９８２　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　 ２０７巻６１７−６２０ページ）は、ウシ血清アルブミンに抱合した遊離アミノ 酸に対する高濃度のポリクローナル抗体を用いる、尿中ＨＰを測定するための酵 素結合免疫測定法を報告した。この測定法は関節疾患でおこる関節破壊の増加を モニターするための指数を提供するためのものであり、口前にずっと多く分布す るという研究結果に基づいている。

酵素結合免疫測定法に関するさらに最近の研究で、ロビングは、ウシ血清アルブ ミンに共有結合したピリジノリンに対する抗血清に対してリジルピリジノリンは 反応しないと報告した（ロビングら１９８６、Ａｎｎ、　Ｒｈｅｕｍ、　Ｄｉｓ ｅａｓｅｓ４５巻９６９−９７３ページ）。軟骨破壊をあられすロビングの原指 数は、主として軟骨に由来するヒドロキシリジルピリジノリンが関節軟骨吸収度 に比例する濃度で尿中に見出されるという発見に基づいている。原則としてこの 指数は総体内軟骨喪失量を測定するために用いられる。しかしながら骨吸収に関 する情報は手に入らない。実際、ロビングの測定法は軟骨破壊よりもむしろ、リ ウマチ様関節炎におこる増加した骨再形成を広く測定していたようにみえる。

そこで人における全身骨吸収速度を測定できる方法が必要である。最も有用なこ の種の方法は、体液、特に尿に適用できる方法である。その方法は敏感で、すな わち１ピコモルまで定量できなければならない。そして２４時間骨吸収速度を速 かに測定して種々の治療（たとえばエストロゲン）の経過を評価できるようでな ければならない。

発明の概要 骨コラーゲン吸収に由来する３−ヒドロキシピリジニウム架橋をもつペプチドフ ラクションの体液中濃度を数量化することから成る絶対的骨吸収速度測定法を提 供する。定量段階は、骨コラーゲン吸収に由来する３−ヒドロキシピリジニウム 架橋をもつペプチドフラクションに特異的な免疫学的結合パートナ−と、体液と を接触させることから成る。発明の一実施態様では、体液を接触前に任意に精製 する。この精製段階は、カートリッジ吸着および溶出分子篩クロマトグラフィー 、透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロ マトグラフィー、これらの組み合わせなどを含む多数の標準的方法のなかから選 択される。

本発明は、体液中の３−ヒドロキシピリジニウム架橋をもつペプチド断片濃度を 定量するその他の方法も含む。

これらの方法としては電気化学的滴定、自然蛍光スペクトル分析、および紫外線 吸収がある。電気化学的滴定は、さらに精製することなく体液で直接行うことが できる。

しかしながら過剰量の汚染物質のためにこれが不可能の場合は、体液を電気化学 的滴定前に先づ精製する。電気化学的検出前の適した精製法としては、透析、イ オン交換クロマトグラフィー、アルミナクロマトグラフィー、分子篩クロマトグ ラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびイオン交換吸収お よび溶出がある。

３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含む体液の蛍光測定法は、骨吸収を定量する もう一つの方法である。蛍光測定法は、さらに精製することな（体液で直接行う ことができる。しかしある種の体液、特に尿では、蛍光測定法の前に体液の精製 を行うことが好ましい。この精製段階は尿の一部を水溶液に対して透析し、非透 析物内に保持される一部精製されたペプチド断片を生成することから成る。それ から非透析物を凍結乾燥し、イオン対溶液に溶かし、アフィニティークロマトグ ラフィーカラム上に吸着させた。クロマトグラフィーカラムをある量のイオン対 溶液で洗い、その後ペプチド断片を溶出液でカラムから溶出する。これら精製し たペプチド断片をそれから加水分解し、加水分解物をクロマトグラフィーで分離 する。クロマトグラフィー分離は、高性能液体クロマトグラフィーか、ミクロボ ア（ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ　）高性能液体クロマトグラフィーで行われる。

本発明は、体液から得られる、他のヒトペプチドをほとんど含まない、骨コラー ゲン由来のペプチド断片を含む。ペプチド断片は３−ヒドロキシピリジニウム架 橋、リジノリン架橋を含む。

骨Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド領域から誘導される３−ヒドロキシ ピリジニウム架橋をもつ特異的ペプチド断片は次のアミノ酸配列を有する。

ここでに−に−にはヒドロキシリジルピリジノリンまたはりジルピリジノリンで 、Ｇｉｎはグルタミンかまたは完全に環化したピロリドンカルボン酸である。

本発明は、骨Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド領域から誘導される ３−ヒドロキシピリジニウム架橋含有ペプチド断片をも包含する。これらのカル ボキシ末端テロペプチド配列はりジルピリジノリンまたはヒドロキシリジルピリ ジノリンのどちらかと架橋する。このようなペプチド配列の列は次の構造式によ ってあられされる。

ここでに−に−にはヒドロキシリジルピリジノリンまたはりジルピリジノリンで ある。

本発明は、３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有する骨コラーゲン由来のペプチ ド断片に特異的なモノクローナル抗体を生成する融合細胞ハイブリッドを含む。

本発明は、融合細胞ハイブリッドによって産生されるモノクローナル抗体（検出 可能マーカーに結合した抗体も含む）をも含む。検出可能マーカーの例は、酵素 、発色団、フルオロフォア、助酵素、酵素団害物質、化学ルミネッセント物質、 常磁性金属、スピンラベル、放射性核種である。本発明は、骨コラーゲンから誘 導され、３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含むペプチド断片に特異的なモノク ローナル抗体を含んで成る、体液中に認められる骨コラーゲン吸収に由来する３ −ヒドロキシピリジニウム架橋含有ペプチド断片の量を測定するのに有用な試験 キットを含む。この試験キットのモノクローナル抗体を上記の検出可能のマーカ ーに結合させる。

図面の簡単な説明 第１図は骨コラーゲン中のヒドロキシピリジニウム残基対年令のグラフである。

第２図はヒドロキシリジルピリジノリン（ＨＰ）：リジルピリジノリン（Ｌ　Ｐ ）の地対年令のグラフである。

第３ａ図は３−ヒドロキシピリジニラ架橋を含む主なペプチド断片の位置を示す 、アミン末端テロペプチドの典型的逆相ＨＰＬＣ自然蛍光溶出曲線である。

第３ｂ図は３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含む主なペプチド断片の位置を示 すカルボキシ末端テロペプチドの典型的逆相ＨＰＬＣ自然蛍光溶出曲線である。

第４Ａ図は正常人尿のペプチド断片の加水分解物をあられす、自然蛍光の典型的 逆相ＨＰＬＣ溶出曲線である。

第４Ｂ図はベージェット病患者の尿中ペプチド断片の加水分解物をあられす自然 蛍光の典型的逆相ＨＰＬＣ溶出曲線である。

好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は再吸収された骨コラーゲンに由来するリジルピリジノリン（Ｌ　Ｐ）　 −およびヒドロキシリジルピリジノリン（ＨＰ）ペプチド断片は両方共、代謝さ れずに尿中に排泄されるという発見に基づいている。本発明は、その他の結合組 織は明白な量のＬＰを含まず、成熟骨コラーゲンのＨＰ：ＬＰの比は一生を通じ て比較的一定である、という発見にも基づいている。

第１図は人の皮質骨および海綿状骨のＨＰおよびＬＰ濃度を年令に関して比較し たものである。骨コラーゲン中のＨＰ＋ＬＰ架橋の濃度は１０才ないし１５才ま でに最大に達し、成人前命中適当に一定に保たれることがわかる。

さらに、第２図に示されるＨＰ　：　ＬＰの比は生涯を通じてほとんど変化せず 、約３．５：１のところで一定している。これらの基礎データは、骨コラーゲン 中の３−ヒドロキシピリジニウム架橋が比較的一定にとどまり、したがって骨コ ラーゲン分解に由来する体液は、絶対的骨吸収速度に比例する濃度の３−ヒドロ キシピリジニウム架橋ペプチド断片を含むことを示している。

ＬＰは骨コラーゲンに特異的な３−ヒドロキシピリジニウム架橋であるから、最 も簡単に絶対的骨吸収速度を測定する方法は、体液中の３−ヒドロキシピリジニ ウム架橋、より好ましくはりジルピリジノリン（Ｌ　Ｐ）架橋を含むペプチド断 片の濃度の定量に基づくものである。この説明および添付の請求の範囲に用いら れる定量（ｑｕａｎｊｉｔａ＋ｉｎｇ）という語は、分光光度法、重量測定、容 量測定、電量分析、免疫測定、電位差測定または電流測定手段を含む（だがこれ らに限定されるわけではない）適した手段によって、体液の部分中の３−ヒドロ キシピリジニウム架橋含有ペプチド断片の濃度を測定することを意味する。適し た体液としては尿、血清および滑液がある。好ましい体液は尿である。

尿中ペプチド濃度は尿量が増加するにつれて減少するから、尿を体液として選ぶ 場合は固定時間中、たとえば２４時間中に集めた尿プールから尿の一部をとるこ とが好ましい。この方法で２４時間の絶対的骨吸収速度が計算される。別法とし て、尿中ペプチドを、尿中に見出だされるマーカー物質、たとえばクレアチニン に対する比として測定する。この場合は骨吸収の原指数は尿量に無関係である。

本発明の一実施態様において、尿中に見出されるリジルピリジノリン架橋含有ペ プチド断片に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体がつくられ る。

ペプチド断片はどの患者の尿からも分離される。しかしながらこれらペプチドは ベージェット病患者または副甲状腺機能亢進症患者の尿から分離するのが好まし い。それは、これら患者に見出されるペプチド断片の濃度が高いからである。

尿ペプチドの分離 活性ベージェット病患者から得た尿を低多孔度透析チューブ（＞３，５００スペ クトロボア）で４℃で４８時間透析し、かさの大きい溶質を除去する。これらの 状態では問題のペプチドは大部分が除去されずにとどまる。凍結乾燥した非透析 質をその後Ｂｉｏ−Ｇｅｔ　Ｐ２　（２００−４００メツシユ）のカラム（９０ ｃｍＸ　２．５ｃｍ　）から１０％酢酸で室温で溶出する（２（１０ｍｇ部分ず つ）。集めたフラクションの２９７ｎｍ励起／３９５ｎｍ発光の蛍光を測定する ことによって、架橋ペプチドを含む溶出液部分を確認し、このプールを凍結乾燥 する。この材料をＢｉｏ−Ｇｅｌ　Ｐ　−４カラム（２００−４００メツシユ、 ９０ｃｍＸ　２．５ｃｍ　）で１０％酢酸で溶出することによりさらに分離する 。上の溶出液の蛍光をモニターすることによって二つの隣接するフラクションプ ールを見分ける。より早く溶出されるフラクションは、骨Ｉ型コラーゲンの三重 らせん体に由来する第三の配列に結合した。骨Ｉ型コラーゲンαＩ　（Ｉ）鎖の カルボキシ末端テロペプチド領域に由来する二つのアミノ酸配列を有するペプチ ド断片に富む。これら三つのペプチド配列は３−ヒドロキシピリジニウムで架橋 される。これと重なり合う遅い方のフラクションは、３−ヒドロキシピリジニウ ム架橋によって結合した。骨Ｉ型コラーゲンのアミノ末端テロペプチド領域に由 来するアミノ酸配列を有するペプチド断片に富む。その後側々のペプチドは、Ｔ ＳＫ　ＤＥＡＥ−５−ＰＷカラム（Ｂｉｏ　Ｒａｄ７、５ｃｍ　Ｘ　７．５ｍｍ 　）上のイオン交換ＨＰＬＣによって上で得られた二つのフラクションの各々か ら分離される。その際溶出は１０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリルを含む０．０２Ｍ トリス−ＨＣＩＩ、ｐＨ７，５中ＮａＣｌ１　（０−０，２Ｍ）の勾配で行われ た。アミノ末端テロペプチド基礎およびカルボキシ末端テロペプチド基礎架橋ペ プチドは、０．０８Ｍおよび０．１５Ｍ　ＮａＣｌ間の、蛍光の連続３〜４ピー クに溶出する。カルボキシ末端テロペプチド基礎架橋ペプチドが最初に一連の蛍 光ピークとして溶出し、主要（■ｉｏｒ　）および少量（ｍｉｎｏｒ　）アミノ 末端テロペプチド基礎架橋ペプチドが勾配の終りの方で特徴的ピークとして溶出 する。これらの各々を集め、凍結乾燥し、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄ ａｃ　２１８　Ｔ　Ｐ　５４．２５ｃｍＸ　４．６ｍｍ）上クロマトグラフィー にかけ、０．０１Ｍ）リフルオロ酢酸中アセトニトリル：ｎ−プロパツール（３ ：ＩＶ／■）の勾配（０−１０％）で溶出した。この方法によって、ベージェッ ト患者の単一２４時間尿から、３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含む個々のペ プチド断片が、約１００〜５００μｇ分離される。分離された主要ペプチドのア ミノ酸組成は、回収アミノ酸の全数化学量論（４ｈｏｌｅ　ｎｕｍｂｅｔ　Ｎｏ ｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ）によって、純度および分子の大きさが確認された。エド マン分解によるアミノ末端配列分析は、１型コラーゲンの公知の架橋部位の配列 並びにぴったり合う（ｍａｔｃｈｉｎｇ）アミノ酸組成から予測される基本的コ ア構造を確認した。Ｇ２（Ｉ）鎖のアミノ末端テロペプチド配列は、多分アミノ 末端グルタミンが公知のように環化してピロリドンカルボン酸を生成するため、 配列分析からさえぎられた。上記の方法によって得られるアミノ末端テロペプチ ドの典型的溶出曲線は第３ａ図に示される。得られた主要ペプチド断片は、アミ ノ酸配列：　（Ａｓｘ）　２　（Ｇｌり　２　（Ｇｌｙ）　５　Ｖａｌ−Ｔｙｒ −５ｅｒ−Ｔｈｒを有する。ここで、Ａｓｒはアミノ酸ＡｓｐかＡｓｎであり、 ＧＩｘはアミノ酸ＧｌｎかＧｌｕである。このペプチドの配列は下記の構造式■ によってあられされる。正常尿は構造式■によって示されるペプチド断片を、ベ ージェット病患者の尿より少量含む。

構造式　■ ここでに−に−にはＨＰまたはＬＰ架橋アミノ酸をあられし、Ｇｌｎはグルタミ ンまたは完全に環化したピロリドンカルボン酸をあられす。

上記のように逆相ＨＰＬＣによって分離したカルボキシ末端テロペプチド基礎架 橋ペプチドを第３ｂ図に示す。この図かられかるように、これらのペプチドはさ らに、各々が３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含む一連のカルボキシ末端テロ ペプチドに分離される。第３ｂ図に示される主要ペプチドを上記のように分析し 、アミノ酸組成：　（Ａｓｐ）　５　（Ｇｌｕ）　４　（Ｇｌｙ）　１０　（Ｈ ｉｓ）　２（Ａｒｇ）　２　（Ｈｙｐ）　２　（Ａｌａ）　５を有することが判 明した。このペプチドの配列は下記の構造式■によって示される。第３ｂｌｆｆ ｌの小さい（ｍｉｎｏ「）ピークとしてあられれるその他のカルボキシ末端テロ ペプチド基礎架橋ペプチドは、構造式■で示される構造にアミノ酸が付加したも のおよびその構造からアミノ酸が欠落したものをあられす。これらの小ピーク内 に含まれるペプチドはいずれも下記のように免疫源としての使用に適している。

構造式　■ Ａｓｐ−Ｇ１７−Ｇｉｎ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−＾１ａ■ ここでに−に−にはＨＰまたはＬＰ架橋アミノ酸をあられし、Ｇｉｎはグルタミ ンまたは完全に環化したピロリドンカルボン酸をあられす。

上記構造によってあられされるペプチドの同等物としでは、尿中ペプチド構造に 若干の変化が生じたものが含まれる。変化の例は、構造式■および■のＮおよび Ｃ末端へのアミノ酸付加並びに若干の末端アミノ酸欠落である。構造式■によっ てあられされる骨吸収に由来する分子の、より小さいペプチド断片が、特に尿中 にあられれる。これらは第３ｂ図に見られるカルボキシテロペプチド断片の小ピ ークとなってあられれ、アミノ酸組成および配列分析によって確認される。構造 式■および■によってあられされるハプテンに対して産生ずる抗体はわずかに変 化した構造をもつ尿中ペプチドと交差反応すると予想される。成る状態では、骨 吸収に由来する尿中ペプチドに対する患者特異的抗体が産生されるのが所望であ る。このような場合には上記と同じ方法を用いて、構造式■および■によってあ られされる構造からほんの少し変化した構造をもった尿中ペプチドを分離する。

骨吸収を指数化するための免疫学的方法生理的液体から得られる骨コラーゲン由 来のペプチド断片に特異的に結合し得る免疫学的結合パートナ−は、当業者に公 知の方法によってつくることができる。これらのペプチド断片を分離するための 好ましい方法は上記の通りである。ここで用いる免疫学的結合パートナ−という 語は、抗体および抗体断片を意味する。

構造式■および■およびそれらの同等物によってあられされるペプチドに特異的 に結合するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体は当業者に公知の方法 によってつくられる。たとえば、キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　人。

Ｍ、）著（１９８６）　“生物学および分子生物学における実験技術（Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓＤｙ　ａｎｄ 　Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　）　”　１３巻、エルセヴイールを参照され たい。上記ペプチドまたは分離されたその同等物に対する抗体をつくることは可 能である。しかしながらこれらのペプチド断片の分子量は５、ｏｏｏ以下である から、ハプテンを担体分子に結合させることが好ましい。適した担体分子として はウシ血清アルブミン、卵アルブミン、チログロブリンおよびスカシガイのヘモ シアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）があるが、これらに限られるわけではない。

ハプテンが担体蛋白質に結合するとき、そのハプテンの定位は、抗血清の特異性 にとって極めて重要であることは当業者には公知である。その上、すべてのハプ テン−蛋白質結合物が等しく成功する免疫源となるわけではない。したがって特 定のハプテンを担体蛋白質に結合させるプロトコールの選択は、選択した尿中ペ プチド断片のアミノ酸配列に依存する。たとえば、構造式■にょってあられされ る尿中ペプチド断片が選択される場合、好ましいプロトコールは、このハプテン をカルボジイミドでＫＬＨまたはその他の適した担体と結合させることを含む。

これにより、ハプテンの大部分がＧ１７のカルボキシ末端によって結合し、それ によって好ましい抗原決定基、すなわちＴｙｒおよび３−ヒドロキシピリジニウ ム架橋、をプライムド（ｐｔｉｍｅｄ）を椎動物抗体産生細胞（例、Ｂリンパ球 ）に与えることが確実になる。

その他の尿中ペプチド断片は、その出所によって、異なる結合プロトコールを必 要とするかも知れない。よって、多数の結合剤が適切に用いられる。これらには カルボジイミド、ゲルタールアルデヒド、混合無水物並びにホモニ官能性および ヘテロ三官能性試薬があるが、これらに限られるわけではない［たとえば、ピア ス（Ｐｉｅｒｃｅ）１９８６−８７カタログ、ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ 　ＣｈｅｍｉｃａＩ　Ｃｏ、　）　、ロックフォード、ＩＬｌ、参照］。好まし い結合剤はカルボジイミドおよびヘテロ三官能性試薬、たとえばｍ−マレイミド ベンジル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）である。

ハプテンを担体分子に結合する方法は当業者には公知である。たとえば、チャー ド（Ｃｈａｒｄ、　Ｔ　）　（１９８７）著“生物学および分子生物学における 実験技術”６巻。

（パーツーエルセヴイール、Ｎ、Ｙ、）を参照されたい。

ハプテン−担体分子免疫原に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の どちらもつくることができる。

しかしながらモノクローナル抗体（ＭＡｂ）をつくるのが好ましい。この理由で マウスで免疫を行うのが好ましい。マウスの免疫プロトコールはアジュバントを 含むのが普通である。適したプロトコールの例はチャード（１９８７）が記載し ている（上記参照）。免疫マウスから牌細胞をとり、ホモジナイズし、その後ポ リエチレングリコールの存在下で癌細胞と融合させて融合細胞ハイブリッドをつ くる。これは骨コラーゲンに由来するペプチド断片に特異的なモノクローナル抗 体を産生ずる。このようなペプチド断片の例は上記構造式■および■によってあ られされる。適した癌細胞としては骨髄腫、肝癌、癌腫および肉腫細胞がある。

スクリーニングプロトコール、選択したハイブリッド細胞を増殖させ、選択した ハイブリッド細胞によって産生されるモノクローナル抗体を収獲するプロトコー ルを含むこの方法の詳細な説明はガルフル（Ｇ＋＋Ｉｊｒｅ、　Ｇ）およびミル スティン（Ｍｉｌｓｊｅｉｎ、　Ｃ）（１９８１）のＭｅｓｈ、　Ｅｕｔｙｍｏ ｌ、　７３巻１ページに記されている。

好ましい予備的スクリーニングプロトコールは、骨コラーゲン吸収に由来し、３ −ヒドロキシピリジニウム架橋を含むペプチド断片を固相ラジオイムノアッセイ にかけることを含む。

上記の方法またはこれ出回等の方法によってつくられた免疫学的結合パートナ− １特にモノクローナル抗体は、種々の免疫測定法で用いられ、体液中の、骨コラ ーゲン吸収に由来する３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有するペプチド断片の 濃度を定量する。これらの免疫測定法は検出可能マーカーに結合したモノクロー ナル抗体または抗体断片を含む。検出可能マーカーの例としては酵素、助酵素、 酵素阻害物質、発色団、フルオロフォル、化学ルミネッセント物質、常磁性金属 、スピンラベル、および放射性核種があるが、これらに限られるわけではない。

骨吸収を指数化するのに適した標準的免疫測定法の例は、エライザ（ＥＬ　Ｉ　 ＳＡ）　（ｅｎｘｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏ＋ｂｅｎ＋ａｓｓａ ｙ）［イングヴアル（ｌｎｇｖａｌｌ、Ｅ、）　（１９８１）　Ｍｅｔｈ。

ＥｎＢｍｏｌ、　７０］　、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）および“サンド イッチ”免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）であるが、これらに限られるわけでは ない。最も簡単な形では、これらの免疫測定法を用いて、体液を、骨コラーゲン 吸収に由来する３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有するペプチド断片に特異的 な免疫学的結合パートナ−と単に接触させることによって、骨吸収の絶対速度を 知ることができる。上述の免疫測定法は未処理体液に対して直接行うのが好まし い。しかしながら場合によっては汚染物質がその測定を妨害することがあり、体 液の一部精製が必要となるかも知れない。部分的精製法には、カートリッジ吸収 および溶出、分子篩クロマトグラフィー、透析、イオン交換、アルミナクロマト グラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびこれらの組み合わ せがあるが、これらに限られるわけではない。

本発明により使用するのに適した試験キットは、上述のように製造された、体液 中の骨コラーゲン吸収に由来する３−ヒドロキシピリジニウム架橋を有するペプ チド断片に特異的に結合するモノクローナル抗体を含む。この試験キットのモノ クローナル抗体が上述の種類の検出可能マーカーに結合するのが好ましい。

骨吸収を指数化するための電気化学的方法骨吸収を指数化するための別法は、３ −ヒドロキシピリジニウム架橋を有するペプチド断片の物理的特性を測定するこ とから成る。骨吸収の指数化に適したこのような物理的特性の一つは電気化学的 検出による。この方法はたとえば尿のような体液の一部を、３−ヒドロキシピリ ジニウム環を含むペプチドの検出に適した酸化還元電位と釣り合っている電気化 学的検出器に注入することから成る。３−ヒドロキシピリジニウム環は、フェノ ールであるから、可逆的酸化を受ける。したがって電気化学的検出器（たとえば ５１００Ａ型Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ、販売元ｅｓａ　４５ウイギンズ　アヴエニュ ー、ベッド−フォード、Ｍ、Ａ、）は骨吸収に由来する尿中ペプチドの濃度測定 のために適した非常に好都合な器具である。二つの基礎的型の電気化学的検出器 が現在市販されている〔アンペア測定（例、Ｂｉｏ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｓ ｙｓｔｅｍｓ）およびクーロン測定（ＥＳＡ社、ベッドフォード、　ＭＡ　０１ ７３θ）検出器］。両方共、本発明による使用に適している。しかしながら後者 の装置の方が本来感度がより高＜、シたがってカラム溶出液中の分析すべき分子 を完全に酸化または還元できるからより好ましい。その上遮蔽または保護電極が 分析電極の上流に置かれ、妨害物質を選択的に酸化または還元し、それによって 選択性を改良することができる。本来、分析電極の電圧は試料分子の酸化還元電 位に合わせられ、１箇以上の処理前セル（ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｃｅｌ ｌ）が試料中の妨害物を破壊するようにセットされる。好ましい測定法において は最適感度を与える正しい電圧を決定するために、リジルピリジノリンまたはヒ ドロキシリジルピリジノリンを含む標準ペプチドの標準的電流／電圧曲線が作成 される。この正しい電圧をその後体液に依って変化させ、汚染物による妨害を最 小にし、感度を最適にする。

電気化学的検出器およびそれを使用する最適条件は熟練せる当業者には公知であ る。複雑な体液混合物を電気化学的検出器で、妨害なしに直接分析できることが よくある。よって大部分の患者では体液の前処理は不要である。

しかしながら若干の場合には、妨害化合物が測定法の信頼性を減らすかも知れな い。そのような場合には体液（たとえば尿）の前処理が必要かも知れない。

よって、本発明のもう一つの実施態様では、精製ペプチド断片を電気化学的に滴 定する前に、体液を先づ精製する。その精製段階は、透析、イオン交換クロマト グラフィー、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラ フィー、分子篩クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせを含む（だがこ れらに限られない）種々の方法で行われる。好ましい精製プロトコールでは、２ ４時間尿試料の軽量した一部（２５ｍｌ！　）を低多孔度透析チューブで透析し て混入している蛍光溶質を大部分除去する。非透析質をその後凍結乾燥し、１％ へブタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ、）（イオン対溶液）に溶かし、ペプチドをＷａ ｔｅｒｓ　５ｅｐ−Ｐａｋ　Ｃ−１８カートリツジに吸着させる。このカートリ ッジをその後１％ＨＦＢＡ５ｍｌで洗い、それから１％ＨＦＢＡ中５０％メ中ソ ０ル３ｍｌで溶出する。

別の好ましい精製法は、尿の計量した部分をイオン交換吸着フィルターに吸着さ せ、吸着フィルターを緩衝溶出液で溶出することから成る。３−ヒドロキシピリ ジニウム架橋を有するペプチド断片を含む溶出フラクションを集め、測定する。

もう一つの好ましい精製法は分子篩クロマトグラフィーを用いる。たとえば尿の 一部をＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ２またはセファデックスＧ−２０カラムに入れ、＋０ ００−５０００ダルトン範囲内に溶出するフラクションを集める。上記方法の組 み合わせを用いて尿またはその他の体液を精製または部分的に精製し、３−ヒド ロキシピリジニウム架橋を有するペプチド断片を分離することは熟練せる当業者 には自明である。上記の方法によって得られた精製または部分的に精製したペプ チド断片は付加的精製法にかけられるか、さらに処理するか、または部分的精製 状態で直接測定される。付加的精製法としては、高性能液体り所望の場合はミク ロボアＨＰＬＣを用いて部分的精製ペプチド断片を分離することを含む。これら のペプチドはその後電気化学的滴定によって定量される。好ましい電気化学的滴 定プロトコールは、電気化学的検出器（Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ　５１０ＱＡ型）の 検出用セルの酸化還元電位を純粋ＨＰで最大シグナルに合わせることから成る。

その後その検出器を用いて、部分的精製された尿中ペプチドを分離するために用 いたＣ−１８ＨＰ、ＬＣカラムからの溶出液３−ヒドロキシピリジニウム架橋を 有するペプチド断片の濃度を定量するためのまた別の好ましい方法はこれらペプ チド断片の特徴的自然蛍光を測定することである。

３−ヒドロキシピリジニウム架橋以外には天然に発生する蛍光物質をほとんど含 まない体液では、それ以上体液を精製せずに蛍光測定が直接行われる。この場合 、Ｅｙｒｅ、　Ｄ、　Ｒ，らのＡｎａｌｙｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３７巻３ ８０ページ（１９８４）に記載されているものとほとんど同様の方法で、ペプチ ド断片はＨＰＬＣによって分離され、ＨＰおよびＬＰアミノ酸残基の自然蛍光が ２９７１１１１１で励起されて３９５ｎｍで測定される。

本発明により、蛍光測定は尿で行うのが好ましい。しかし尿は、蛍光測定を実施 する前に除去しなければならない天然に発生する蛍光混入物を含むのが普通であ る。

よって尿試料を先づ、上で電気化学的検出のために記したように部分的に精製す る。この部分的に精製した尿試料をそれから上述のように蛍光測定することがで きる。

別法として、部分的に精製した尿試料またはその他の体液中のＨＰおよびＬＰ架 橋ペプチドをＥ　ｙｒｅ　ら（１９８４）（上記参照）が記載したように６Ｍ　 ＨＣｌ中で約１０８℃、約２４時間で加水分解することができる。このプロセス は、′トリペプチド’ＨＰおよびＬＰ架橋のリジン前駆体に結合したアミノ酸を 加水分解し、構造式Ｉおよび■によってあられされる遊離ＨＰおよびＬＰアミノ 酸を生成する。これらの小さい“トリペプチド”をその後上記の方法、好ましく はＨＰＬＣによって分離し、自然蛍光を測定する（励起２９７ｎｍ　、発光３９ ０ｎｍ　）。

任意に、体液（好ましくは尿）を、アセトニトリル／メタノール５〜ＩＯＶ／Ｖ ％を加えた後Ｃ−１８逆相アフイニテイーカートリツジを直接通過させる。非滞 留物をたとえば水酸化テトラブチルアンモニウムなどのカチオン性イオン対試薬 で０．０５−０．　ＩＯＭに調節し、第二のＣ−１８逆相カートリツジを通過さ せる。洗浄した滞留物（蛍光ペプチドを含む）を第二カートリッジからアセトニ トリル：水（またはメタノール：水）で溶出し、乾燥し、蛍光ペプチドを逆相Ｈ ＰＬＣまたはミクロボアＨＰＬＣによって、０．　ＯＩＭ　トリフルオロ酢酸（ 溶離剤中）などのアニオン性イオン対試薬を用いて分析する。別法としての、ま たはこのペプチド精製操作法に含まれる、Ｂｉｎ　Ｇｅｔ　Ｐ　２　（Ｂｉｏ− Ｒａｄ　ｔａｂｓ）または同等のゲル濾過媒質を用いる分子篩段階を用いること ができる。

第４Ａ図は、正常人尿からのペプチド断片加水分解物について、逆相ＨＰＬＣに よって分離された自然蛍光の溶出曲線を示す。与えられた成分の範囲内の積分面 積を測定することによって、試料中のその成分の濃度を決める。正常人尿および パージエツト病患者の尿のＨＰ：ＨＰ比は両方共約４．５：１である（第４Ｂ図 ）。これは骨そのものに見出される比４：１よりわずかに高い（Ｅｙｒｅ　ｒｔ 　ａｌ、、１９８４　）。尿に見出される比較的高い比は、尿中のＨＰフラクシ ョンの一部がたとえば食事などの骨以外のソースから、またはその他のコラーゲ ン分解ソース、すなわち軟骨異化作用からくることを示している。骨だけに由来 するＬＰを用いて骨吸収の絶対的指数を提供するのが好ましいのはこのためであ る。しかしながらたとえばリウマチ様関節炎などの場合のような過剰の軟骨分解 がない場合、または骨が急速に吸収される場合にはＨＰまたはＨＰ＋ＬＰの組み 合わせが骨吸収の指数として用いられる。

本発明を好ましい実施態様に関連づけて説明したが、以上の明細書を読んだ当業 者は、ここに示される内容に種々の変化、等価物の変換および変更を加えること ができる。したがって発明はここに詳細に説明された以外の方法で実施され得る 。よって、ここで特許証によって付与される保護は、添付の請求の範囲およびそ の等価物によってのみ制限される。

ρヶ・ズ・ １ｉ　１５力＆　２’？７ｎｑｔｃ、ｒｆ、３ε（ｈｔｍ。

寵Ｌ　厭１９に朝、１ｌａ７伽机 り込λ−ノクカｆｔＥｂｚｑｚしわ　、１ｆＬ３β０先仇手続補正書（方式） 平成２年５月２８日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０３７２２ ２、発明の名称 骨吸収測定のための尿分析 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　アメリカ合衆国、ＨＩｆ１５　ワシントン州。

シアトル、ルーズベルト　ウェイ　ノースイースト　４２２５．スィート　３０ ３名称　ワシントン　リサーチ　ファンデーション東京都新宿区下落合二丁目１ ４番１号 ５、補正命令の日付　自発補正 ６、補正の対象　明細書及び請求の範囲７、補正の内容　別紙の通り明細書及び 請求の範囲の浄書（内容に変更国際調査報告 ｌｍ５ｍ５ｌｌｅ＋＋ａｌ＾−”””ＰＮｏ　ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０３７２２

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．骨コラーゲン吸収に由来し、３−ヒドロキシピリジニウム架橋をもつペプチ ド断片の体液中濃度を定量することから成る絶対的骨吸収速度測定法。
2. ２．３−ヒドロキシピリジニウム架橋がリジルピリジノリンである請求項１記載 の方法。
3. ３．３−ヒドロキシピリジニウム架橋がヒドロキシリジルピリジノリンである請 求項１記載の方法。
4. ４．体液が尿である請求項１記載の方法。
5. ５．定量段階が体液を、骨コラーゲン吸収に由来する３−ヒドロキシピリジニウ ム架橋をもつペプチド断片に特異的な免疫学的結合パートナーと接触させること を含んで成る請求項１記載の方法。
6. ６．接触段階の前に、さらに体液精製段階を含む請求項５記載の方法。
7. ７．精製段階が、カートリッジ吸着および溶出、分子篩クロマトグラフィー、透 析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロ マトグラフィーから成る群から選択される方法から成る請求項６記載の方法。
8. ８．定量段階が紫外線吸収分光法、自然蛍光分光法および電気化学的滴定から成 る群から選択されるものを含んで成る請求項１記載の方法。
9. ９．定量段階が電気化学的滴定を含んで成る請求項１記載の方法。
10. １０．電気化学的滴定の前に、さらに体液精製段階を含んで成る請求項９記載の 方法。
11. １１．体液精製段階が、透析、イオン交換クロマトグラフィー、アルミナクロマ トグラフィー、分子篩クロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマト グラフィーから成る群から選択される方法を含んで成る請求項１０記載の方法。
12. １２．精製段階が、体液をイオン交換吸着フィルターに吸着させ、イオン交換吸 着フィルターを溶出し、３−ヒドロキシピリジニウム架橋をもつペプチド断片を 含む溶出液を集める諸段階から成る請求項１０記載の方法。
13. １３．体液の精製後、３−ヒドロキシピリジニウム架橋をもつペプチド断片を分 離することをさらに含んで成る請求項１０記載の方法。
14. １４．定量段階が蛍光測定を含んで成る請求項１記載の方法。
15. １５．蛍光測定段階の前に体液精製段階をさらに含んで成る請求項１４記載の方 法。
16. １６．体液精製後、ペプチド断片を加水分解しそれによって加水分解物を生成す る段階をさらに含んで成る請求項１５記載の方法。
17. １７．ペプチド断片を加水分解後、加水分解物を分離する段階を含んで成る請求 項１６記載の方法。
18. １８．分離段階がクロマトグラフィー分離から成る請求項１７記載の方法。
19. １９．クロマトグラフィー分離段階が高性能液体クロマトグラフィーから成る請 求項１８記載の方法。
20. ２０．精製段階が （ａ）尿の一部を緩衝水溶液に対して透析し、それによって部分的精製ペプチド 断片含有非透析質を生成し、（ｂ）その非透析質を凍結乾燥し、 （ｃ）凍結乾燥せる非透析質をイオン対溶液に溶解し、 （ｄ）非透析質をアフィニティークロマトグラフィーカラムに吸着させ、 （ｅ）吸青した非透析質を多量のイオン対溶液で洗い、 （ｆ）ペプチド断片を含むアフィニティーカラムを溶出液で溶出する 諸段階から成る請求項１５記載の方法。
21. ２１．非透析質を吸着する前に、非透析質を分子篩カラムと接触させる段階をさ らに含んで成る請求項２０記載の方法。
22. ２２．体液から得られ、他のヒトペプチドを実質上含まない骨コラーゲン由来ペ プチド断片。
23. ２３．３−ヒドロキシピリジニウム架橋を含む請求項２２記載のペプチド断片。
24. ２４．リジルピリジノリン架橋を含む請求項２２記載のペプチド断片。
25. ２５．ヒドロキシリジルピリジノリン架橋を含む請求項２２記載のペプチド断片 。
26. ２６．３−ヒドロキシピリジニウム架橋によって結合した、骨Ｉ型コラーゲンの アミノ末端テロペプチド領域に由来するアミノ酸配列から成るペプチド断片であ って、アミノ酸組成（Ａｓｘ）２−（Ｇｌｘ）２−（Ｇｌｙ）５−Ｖａｌ−Ｔｙ ｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒを有し、ヒドロキシリジルピリジノリンまたはリジルピリジ ノリン残基１箇をもち、ここでＡｓｘはアミノ酸ＡｓｐまたはＡｓｎで、Ｇｌｘ はアミノ酸ＧｌｕまたはＧｌｎ である請求項２２記載のペプチド断片。
27. ２７．アミノ酸配列 【配列があります】 から成り、ここでＫ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリジルピリジノリンまたはリジルピリ ジノリンで、Ｇｌｎはグルタミンまたは完全に環化したピロリドンカルボン酸で ある請求項２２記載のペプチド断片。
28. ２８．骨Ｉ型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチド領域に由来するアミノ酸 配列から成る請求項２２記載のペプチド断片。
29. ２９．アミノ酸配列がリジルピリジノリン架橋を含む請求項２８記載のペプチド 断片。
30. ３０．アミノ酸配列がヒドロキシリジルピリジノリン架橋を含む請求項２８記載 のペプチド断片。
31. ３１．アミノ酸配列 【配列があります】 から成り、ここでＫ−Ｋ−Ｋはヒドロキシリジルピリジノリンまたはリジルピリ ジノリンである請求項２８記載のペプチド断片。
32. ３２．体液が尿、滑液および血清から成る群から選択される請求項２２記載のペ プチド断片。
33. ３３．体液が尿である請求項３２記載のペプチド断片。
34. ３４．請求項２２記載のペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体を産生する 融合細胞ハイブリッド。
35. ３５．請求項３４記載の融合細胞ハイブリッドによって産生されるモノクローナ ル抗体。
36. ３６．検出可能マーカーと結合した請求項３５記載のモノクローナル抗体。
37. ３７．検出可能マーカーが、酵素、発色団、フルオロフォール、助酵素、酵素阻 害剤、化学ルミネッセント物質、常磁性金属、スピンラベル、および放射性核種 から成る群から選択される請求項３６記載のモノクローナル抗体。
38. ３８．骨コラーゲン吸収に由来し、３−ヒドロキシピリジニウム架橋をもつペプ チド断片の体液中の量を定量するための請求項３５記載のモノクローナル抗体を 含んで成る試験キット。
39. ３９．モノクローナル抗体が検出可能マーカーに結合する請求項３８記載の試験 キット。
40. ４０．免疫原として請求項２７記載のペプチド断片の使用。
41. ４１．請求項２７記載のペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体を産生する 融合細胞ハイブリッド。
42. ４２．請求項４１記載の融合細胞ハイブリッドによって産生されるモノクローナ ル抗体。
43. ４３．検出可能マーカーに結合した請求項４２記載のモノクローナル抗体。
44. ４４．免疫原として請求項３１記載のペプチド断片の使用。
45. ４５．請求項３１のペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体を産生する融合 細胞ハイブリッド。
46. ４６．検出可能マーカーに結合した請求項４５記載のモノクローナル抗体。