JPH03500965A - 細菌からのヒトインターロイキン‐４の抽出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌からのヒトインターロイキン−４の抽出発明の分野 本発明は、一般的には細菌からタンパク質を抽出する方法に関するものであり、 さらに詳しくは細菌中で発現されているヒトインターロイキン−４を抽出する方 法に関するものである。

発明の背景 インターロイキン−４（ＩＬ−４）は最近発見された天然タンパク質であり、感 染、癌、および自己免疫疾患に対する治療薬としての可能性が示唆されている。

ヒトＩＬ−４はヨコタ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪ ｓＡ、　Ｖｏｌ、８３．５８９４−５８９８　（１９８６）によって報告された 。マウスＩＬ−４はり−（Ｌｅｅ）他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　０品、Ｖｏｌ、８３．２０６１−２０６５　（１９８６）、およびツマ 他、懸旦圧、　ＶｏｌＪ１９、６４０−６４６　（１９８６）によって報告され た。

組み換えＤＮＡ技術がＩＬ−４の発見およびＩＬ−４を発現できる最近の作成に 応用された。これにより、このタンパク質の治療薬としての可能性を調査、開発 および認識するのに必要なＩＬ−４の大量産生への道が開かれた。しかしながら ＪＬ−４の臨床使用には、工Ｌ−４発現細胞の内容物や残滓が混入していない高 純度標品が必要とされる。したがってＪＬ−４発現細菌細胞から、十分な純度と 収量でＩＬ−４を抽出することが必要とされている。

発明の概要 本発明は、ＩＬ−４を含む細菌細胞の懸濁液を細菌を不活化する（殺す）薬剤で 処理し、不活化された細菌の細胞を破砕し、破砕液からＩＬ−４を回収すること によって、ＩＬ−４発現細菌からＩＬ−４を抽出できるという発見に基づいたも のである。本発明の方法により発酵槽（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）の外で生きた細菌 を扱うことが避けられ、培地及び細胞構成成分の混入を顕著に減少させる方法で ＩＬ−４が回収でき、その後の精製を効率的および経済的に行うことが可能第１ 図はプラスミドｐＫＧ−１８９−１２の構造地図である。

詳細な説明 本発明はＩＬ−４発現細菌細胞からＩＬ−４を抽出する方法を提供するものであ り、以下の過程を含む： （ａ）細胞を不活化する薬剤で細菌細胞を含むＩＬ−４懸濁液を処理すること； （ｂ）不活化した細菌細胞を破砕すること；（ｃ）破砕液からＩＬ−４を分離す ること。

本発明は、さらに詳しくは、遺伝学的に形質転換した細菌、特に大腸菌（Ｅ、　 ｃｏｌｉ）から産生されたヒトＩＬ−４を抽出するためのものである。ここで用 いた“形質転換した細菌°という語はヒトＩＬ−４を産生ずるように遺伝学的に 操作された細菌を意味する。このような遺伝学的操作は通常、細菌中への発現ベ クターの導入を必要とする。発現ベクターは自律複製および細菌ゲノムの遺伝子 に関連したタンパク質の発現が可能である。所望のタンパク質をコードするヌク レオチド配列が既知であるか入手可能であれば、細菌の発現ベクターの構築は当 業分野ではよく知られている。例えば、デバー（ＤｅＢｏｅｒ）は米国特許第４ ．５５１．４３３号において、細菌性発現ベクターで使用するためのプロモータ ーを開示している；ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）他は米国特許第４．６０’ｌ、 　９８０号で、またリッグス（Ｒｉｇｇｓ）は米国特許第４．４３１．７３９号 で、大腸菌発現システムによる哺乳動物タンパク質の産生を開示している；また 、リッグス（上述）、フェレッティ（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ）他（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、８３．５９９−６０３．１９８６） 、スブロート（Ｓｐｒ。

ａｔ）他（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、１３． ２９５９−２９７７．１９８５）、およびムレンバｙ　ハ（Ｍｕｌｌｅｎｂａｃ ｈ）他（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、　Ｖｏｌ、２６１゜７１９−７２２．１ ９８６）は、細菌中で発現させるための合成遺伝子の構築法を開示している。以 上のように、これらの参考文献を参考としてここに含める。ヒトの成熟ＩＬ−４ のアミノ酸配列はヨコタ他（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［ ＩＳＡ、　Ｖｏｌ、８３．５８９４−５８９８．１９８６）によって示され、ヨ コタ他（上述）に報告された匹Ｄベクターに組み込まれたヒトＩＬ−４をコード するｃＤＮＡはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；メ リーランド州、ロックビル）に受託番号５３３３７として寄託されている。多数 の細菌性発現ベクターおよび宿主が商業的に、またはＡＴＣＣから入手可能であ る。大腸菌は望ましい細菌宿主である。

本発明の方法を実施する際に、細胞を不活化する薬剤をＩＬ−４発現細胞懸濁液 に添加する。本発明で使用される薬剤としては、芳香族炭化水素または酸が含ま れる。細胞を不活化するのに使用可能な芳香族炭化水素の例としては、トルエン 、キシレンなどがある。

細胞を不活化するためにトルエンを使用する場合、最終濃度が約０．１から２％ （Ｖ／ν）となるようにトルエンを十分に加える。望ましい最終濃度は約１％（ ｖ／ｖ）である。トルエンを加えた後、約１時間、反応の撹拌を続けるが、通気 は停止する。次に、通気を再開始、培養液から発する空気中のトルエン濃度が引 火性の下限以下になるまで、反応を続ける。

細胞を不活化するために酸を使用する場合には、ｐＨが約１．０から約３．０、 望ましくはｐＨ２となるようにｊＬ−４発現細胞懸濁液に十分な酸を加える。本 発明で使用可能な酸の例としては、塩酸、硝酸、リン酸、および硫酸が含まれる 。リン酸が望ましい酸である。

細胞の不活化を完全に行うため、および／または、抽出されたＩＬ−４の収量を 向上させるために、以後“増幅剤”と呼ぶある種の試薬を酸と共にＩＬ−４発現 細胞懸濁液に添加してもよいことが見い出された。適当な増幅剤の例としては、 トリクロロ酢酸や過塩素酸が含まれる。

本発明の方法の酸添加過程の一つの態様において、ｐＢを約４から５、望ましく は４．５まで下げるために懸濁液にリン酸を添加し、次にトリクロロ酢酸をｐＨ ２，０まで下げるように添加する。

細胞をトルエンまたは酸で不活化した後、本発明の方法の以後の全ての過程は、 約θ℃から約４０℃、望ましくは０−４℃で行う。

細胞をトルエンまたは酸で不活化した後、細胞を破砕のために調製する。これは 、不活化細胞懸濁液のｐｎを調節するだけで行われるか、あるいは産物の濃度を 上げるために、まず遠心、濾過あるいはそのほかの通常の手段によって処理した 発酵培地から不活化細胞を分離し、次にそれを元の発酵体積と等量の水性緩衝液 または水に再懸濁し、最後にｐＨを合わせることによって行う。不活化細胞を再 懸濁する際に用いる緩衝液の例としては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、 トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン塩酸などがある。望ましい緩衝液はリ ン酸ナトリウムとトリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン塩酸である。不活化 細胞懸濁液のｐＨは塩基の添加によって６．０から９．０の間に調節する。ｐ［ ｌ調節過程で使用される適当な塩基の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カ リウムなどがある。

不活化細胞を破砕のために調製した後、細胞を破砕する。本方法の本過程では、 ホモゲナイゼーションや超音波破壊などの通常の細胞破砕法が用いられる。望ま しい破砕法は、マントン−ガラリン（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ）ホモゲナイ ザーを用いるホモゲナイゼーションである。破砕過程の目的は、懸濁液中に実質 的に全ての可溶性細胞成分が放出される程度までに、実質的に全ての細胞を破壊 することである。前の不活化過程で部分的な細胞破砕が行われ得るが、より完全 な細胞破砕がこの破砕過程で行われる。

破砕過程終了後、ヒトＩＬ−４が部分的に精製された不溶性複合物として見いだ され、遠心、濾過、またはそのほかの通常の手段によって回収される。

以下の実施例は本発明の詳細な説明するものである。材料および方法の改変が本 開示の目的と意図を逸脱する事なく行われ得ることは、本分野の当業者には明ら かであろう。

実施例 本実施例で用いられるヒトＩＬ−４発現プラスミドｐＫＧ−１８９−１２は、約 ３８００塩基対からなり、以下の配列を含む（第１図参照）：ａ）コンセンサス プロモーターｔａｃ−ｒｂｓ　；ズラウスキ（Ｚｕｒａｖｓｋｉ）他、ｆｆｏｕ ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、１３７．３５５４−３３６ ０　（１９８６年１１月）。

ｂ）成熟１１ｕ−ＩＬ−４のコー下配列；ヨコタ他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡＳＶｏｌＪ３．５８９４−５８９８　（１９８６年８月）。コ リコード配列の５′末端がｔａｃプロモーター配列の３′末端と連結される。

Ｃ）プラスミドｐＶＵ２０ｇ由来の温度感受性レプリコン、ｒｅｐ　ＣｏｐＴＳ ；バー／カールト（Ｈａｋｋａａｒｔ）他、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、　 Ｖｏｌ、１８３．３２６−３３２　（１９８１）。

ｄ）テトラサイクリン耐性の発現のためのｔｅｔ　’遺伝子コストクリフエ（Ｓ ｕｔＣｌｉｆｆｅ）、並違す狙口」」垣曲工づ江叩店違県」叩ユ１堕■正」封に 鉦４３．　ｐａｒｔ　１．７７−９０　（１９７９）、　コールド・スプリング ・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、プラスミドｐＫ Ｇ−１８９−１２を含有する大腸菌２９４株の活発に増殖している培養成約１ｍ ｌを１６リツトル発酵槽中の約１０リツトルの培地に加える。培地は、３０ｇ／ ｌのカゼイン加水分解物、２０ｇ／ｌの酵母抽出物、２０ｇ／ｌのグリセロール 、１０ｍｇ／ｌのテトラサイクリン塩酸、５ｇ／ｌのＫＥ２ＰＯｉ、１ｇ／ｌの ＭｇＳＯ４・７Ｂ、０．０．１ｍｌ／ｌの抗発泡剤と水からなる。

培養液の細胞密度が約４光学密度単位（６６ｈｍ、光路１ｃｍ）に達するまで、 ５Ｎ　Ｎａ０Ｉｌを用いてｐＨを７に維持し、通気および撹拌しながら温度を３ ０℃に保つ。温度を３７℃に上げて、３時間通気と撹拌を続ける。つぎに温度を ２５℃に下げ、以下の抽出法に進む。（注意：以下の全ての遠心は約１０．００ ０ｇで約１５分である）抽出法＾ １％（Ｖ／Ｖ）の最終濃度でトルエンを加える。通気を停止し、撹拌を約１時間 続ける。通気を再開し、培地から発する空気中のトルエン濃度が発火性の下限を 下回るまで撹拌を続ける。脱トルエン化した懸濁液を遠心し、ベレットを０．１ Ｍ　ｐＨ７，０のリン酸ナトリウム緩衝液で元の培養液の体積になるように再懸 濁する。得られる懸濁液の最終バイオマス濃度を未処理培養液の約３０光学密度 に対応するように調節する。約８０００ｐｓｉの圧力下で懸濁液をマントン−ガ ラリン研究用ホモゲナイザ−（モデル１５Ｍ）に通過させることにより、細菌細 胞を破砕する。破砕液を遠心し、上清を捨てる。ベレットは組み換えヒト　イン ターロイキン−４を含む。

抽出法Ｂ ｐＨ４，５となるように８５％リン酸溶液を加える。ｐｌＴ２となるように５０ ％トリクロロ酢酸溶液を加え、酸を加えた溶液を１時間撹拌する。以下の操作は ０℃から４℃の温度で行う。酸懸濁液を遠心する。

遠心後、上清を捨て、得られた細菌ペレットを元の培養液体積と等量になるよう に０．１Ｍ　ｐＨ８，５のリン酸ナトリウム緩衝液で再懸濁する。得られた懸濁 液のｐＨをＩＮ水酸化ナトリウムで７．０−７．５に調節する。中性懸濁液の最 終バイオマス濃度を未調製培養液の約３０光学密度に対応するように調節する。

２５℃、約８０００ｐｓｉの圧力下で中性懸濁液をマントン−ガラリン研究用ホ モゲナイザ−（モデル１５Ｍ）を通過させる事により、細菌細胞を破砕する。破 砕液を遠心し、上清を捨てる。ペレットは組み換えヒトインターロイキン−４を 含む。

Ｆｉｇｕｒｅ　１ 国際調査報告 国際調査報告

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）細菌細胞を含むインターロイキン−４（ＩＬ−４）懸濁液を、細胞 を不活化する薬剤で処理すること；（ｂ）不活化した細菌細胞を破砕すること； （ｃ）破砕液からＩＬ−４を分離すること；からなる、ＩＬ−４発現細胞からＩ Ｌ−４を抽出する方法。
2. （２）細菌細胞を不活化する薬剤が、トルエンまたは増幅剤の存在下での酸から なる群から選択されるものである、請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）細菌細胞を不活化する薬剤がトルエンである、請求の範囲第２項記載の方 法。
4. （４）細菌細胞を不活化する薬剤がリン酸、塩酸、硝酸、または硫酸からなる群 から選択されるものである、請求の範囲第２項記載の方法。
5. （５）増幅剤がトリクロロ酢酸または過塩素酸からなる群から選択されるもので ある、請求の範囲第２項記載の方法。
6. （６）細菌が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）である、請求の範囲 第１項記載の方法。
7. （７）インターロイキン−４がヒトインターロイキン−４である、請求の範囲第 １項記載の方法。