JPH03501161A

JPH03501161A - 抗原決定基を模倣する方法並びに組成物

Info

Publication number: JPH03501161A
Application number: JP63506435A
Authority: JP
Inventors: ネーベル，キャシー・ディー
Original assignee: ゾーマ・コーポレーション
Priority date: 1987-08-07
Filing date: 1988-07-12
Publication date: 1991-03-14
Also published as: EP0371056A4; WO1989001337A1; NZ225371A; EP0371056A1; ZA885125B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】抗原決定基を模倣する方法並びに組成物発明の背景［発明の分野］本発明は一般に免疫学の分野に関係し、より詳細には、抗原決定基の模倣に関係している。ここで用いる“抗原決定基”なる用語は、完全なまｌ；は断片化した免疫グロブリン分子と結合、複合体化、または反応することができる化学的構造を意味するものである。この種の構造にはハブテン、レセプター、マーカー、エピトープなどが含まれる。

１９６０年代に蛍光活性化細胞選別機（ＦｌｎｏｒｅｓｃｓｎｃｅＡｅｊｉｖａｌｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｏｒｌｅｒ：Ｆ　Ａ　ＣＳと略す）が出現した結果、細胞生物学の研究には小さな改革が起こった。

（Ｆ　Ａ、　ＣＳの原理の詳細については、例えば、ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　Ａｐｐｌｉｃｘｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｂｉｏｌｏ！！　、１Ｇ？９　。

Ａｌ！ａＲ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋを参照されたい、）ＦＡＣ３は、この年代の初期には、主として細胞周期（Ｃ＋、Ｓ。

Ｇ、、Ｍ、またはＧｏ）における個々の細胞の位置に従って細胞集団を選別する手段として用いられたが、次第に発達して細胞反応速度論の研究、細胞レセプタータンパク質の同定および定量化、並びに免疫学研究のための細胞表面抗原および抗体の定量化に用いられる基本的な機器となった。本発明が関係するのはこの後者の分野である。

細胞表面抗原、および抗体とこの種の抗原との相互作用の研究におけるＦＡＣ３の位置は明確に樹立されている。ＦＡＣ３はリガンド／レセプター相互作用の研究を行う免疫学者にとって重要な道具となっている。このようなＦＡＣＳ分析には、フルオレセイン標識抗体が対象の抗原上の抗原決定基について未標識抗体と競合する競合検定が含まれる。この種の検定は研究者に抗原と競合抗体の両方についての価値ある情報を提供することができる。抗体はより適切には、抗体の反応性断片や治療または診断成分などと複合体化した抗体が使用されるので、免疫グロブリンと呼ばれる。

しかしながら、研究の対象となり得る抗原に関してはいくつかの制限がある。例えば、内部マーカーはＦＡＣ５分析の場合利用できない。ウィルス抗原は約０．１μより小さいピリオン上に存在し、ＦＡＣ５分析にとって厄介な被分析体である。さらに、対象の抗原をもつある種の細胞、特に細菌細胞はコストの問題、健康上の危険性、細胞維持の困難性などの諸要因のためにＦＡＣ５分析にとって望ましくない被分析体である。従って、これまでにＦＡＣ３分析を適用し得なかっｌ；抗原決定基を模倣するのに有用な組成物および方法の必要性が存在する。望ましくは、この種の新規なｍ酸物および方法は、対象抗原の安定した、コスト的に見合った供給源を提供するばかりでなく、以前にＦ　Ａ、　ＣＳを使って分析するのが困難であった抗原をもつ粒子のサイズを増加させるであろう。

［関連文献の説明］米国特許８４３７６１１０号は、一般にイムノアッセイ法、特にモノクローナル抗体を用いる二部位またはサンドインチ検定における改良を開示している。

Ｓｏｇａｒｂａｋｅｒ　ｅｒ−リー、、Ｆｌｏｗ　ｃｙｌｏｍｅｔｒｙ：Ｇｅｎｅｒａｌ　ｐｒｉｎｃｉ−ｐｌｅｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　５ｅｌｅｃｔｅｄ　５ＬｕｄｉＣｓ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒｂｉｏｌｏＨ（フローサイトメトリーニ一般原理および腫瘍生物学の研究への応用）ｏＦＩｏｖ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　ＡｐｐｌｉｃａＬｉｏｎｓｉｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｂｉｏｌｏ（ｙ、ｐ、Ｉ２５−５３．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ。

Ｉｎｃ、、Ｉ９７９゜前記著者らは腫瘍生物学や特定の用途に関係した場合のフローサイトメトリーの基本的原理について述べている。

Ｌｏｋｅｎ　ａｎｄ　５ｊｘｌｌ、Ｊ、１ｍｍｏｎｏ、ｌ＋１ｅｔｈ、（１９８２）５東：Ｒ８５−Ｒｌ１２は、免疫学分野での分析・分離用機器としてのフローサイトメトリーの使用を開示している。

Ｒａｊｅｖｓｋｙ　ａｎｄ　Ｔｓｋｅｍｏｒｉ、　Ａｎｍ、ｌ１ｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８３］：５６９−０７は、イディオタイプの遺伝学、発現、機能を含めた基礎科学について開示している。

Ｂｅａｕｍｉｅｒ　ｅｒ　ｓｌ、、Ｊ、Ｎａｃｌ、Ｍｅｄ、（１９８０２７，８４−４８は、３種類の異なるヒトメラノーマ関連抗原、ｐ９７、グロテオグリカン、およびＧＤ、ガングリオシドに対する放射性標識モノクローナル抗体の免疫反応性を評価するために開発されたガンマシンチレーションカウンターを用いる検定を開示している。

Ｒｏｂｉｎｓ　ｅｌ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｔｏ＋＋ｏ、Ｍｅｔｂ、（１９８６）９０：１６５−７１は、フローサイトメトリーを用いた腫瘍反応性抗体及び複合抗体の定量測定、および競合によるの測定を開示している。

発明の要約抗原／抗体反応の研究、抗原決定基および免疫グロブリンの研究に有用な新規方法が提供される。対象の抗原１５合物質の抗イデイオタイプである免疫グロブリン分子を発現し得る不滅細胞株を、該抗原結合物質が結合する抗原決定基まｌ；はエピトープの代わりに用いる新規方法が提供される。前記細胞株の細胞は免疫グロブリンを細胞表面マーカーとして産生ずるように操作される。これ１」対象の抗原決定基の安定した、効果的な供給源をもたらし、以前には利用できなかったエピトープを利用できるようにし、さらｌこＦＡＣ５分析を適用し得ない物質上１丁見られたマーカ〜を増幅させる。

慢−匡ｐ旦見笠狙第１図は、本発明方法を用いるＦ　／’、　ＣＳ競合検定を示ずグラフである。

第２図は、ターゲラ！−ＸＭＭＭＥ−Ｔ　０１細胞と濃度を次第に増加さ刊たＸＭＭＭＥ−００１モノクローナル抗体とをイン・キュベー　トした場合の抗体／抗原相互作用を示すグラフであり、結合曲線の平坦域は抗体の飽和濃度を表す。

を町Ｏ叉基運−東９限−榮旺−吸本発明は抗原決定基まｔ−はエビ）・−ン′を模倣する新規方法を提供する。これらの方法はＦ　Ａ　ＣＳ分析を用いる抗原／抗体反応の研究・分析に特１こ遇１．でおり、とりわｉｔ　Ｆ　Ａ　ＣＳ競合検定において利用される。

本発明によれば、不滅細胞が対象の抗原決定基をもつ物質の代わりに用いられる。本発明ｌごおいで有用な不滅細胞ＩＪ、免疫グログリン分子を発現し得るものである。

これらの細胞は免疫グロブ１ｊン分子を細胞表面マーカーとして産生ぼろように操作される。

対象の免疫グロブリン分子は通常、対象のモノクローナルまたはポリクローナル抗体の抗イデイオタイプ免疫グロブリンであるだろう。このような対象の抗体には細菌やウィルス病原体上に存在するエピトープ、腫瘍細胞表面マーカー、細胞内マーカー、ホルモンマーカーなどに結合するものが含まれる。

本発明によれば、免疫グロブリン分子は不滅細胞によって発現される。これらの細胞は自然界から単離されるか、または当分野で知られた技術のいずれかを用いて作られる。対象の抗体を免疫原として用いて、抗イデイオタイプ免疫グロブリン分子を分泌する不滅のハイブリツド免疫細胞を作る技術により得られたハイブリドーマ細胞が特に有用である。ノ・イブリド−″、１細胞株を作製する技術の詳細については、、ＧｏｄｉＢ、Ｊ、Ｗ、、Ｍｏｎｏｅｌｏｍｘｌ　ＡｎＬｉｂｏｄｉＣｓ＋Ｐｒ１ｏｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｅｔｉｅｅ、（）９１６）Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄ、、ムｃｔｄｅ＋＊１ｃＰｒｅｓｓを参照されたい（この技術内容は参照によりここに引用される）、これらのノ〜イブリドーマ細胞はネズミー不ズミ、不ズミーヒト、まｔ；はとトーヒトでありうる。まｌ二、組投えＤＮＡ技術を使って、本発明で用いる／＼イブリドーマ細胞を“遺伝子工学的に作製する“こともできる。

本発明によれば、不滅細胞は対象の免疫グロブリン分子を細胞上の細胞表面マーカーとして産生ずるように操作される。好適な操作方法は細胞を約４℃に冷却することであり、発現された免疫グロブリンの分泌はこの温度において本質的に止まる。細胞の化学的操作は、免疫グロブリン上の結合部位を変えてしまう恐れがあるために、あまり好適ではない。

ひとたび巧・滅細胞が得られると、それらは多数の検定法で抗原決定基の代替物として用いられる。本発明における好適な検定法は、不滅細胞上の結合部位について対象の抗体または複合抗体と競合するフルオレセイン標識抗体を用いるＦＡＣ５ｖ１台検定法である。この種の検定法および当分野でよく知られた他の検定法は、抗に／抗体反応に関する有用なデータを提供し、診断・治療用の免疫複合体の品質管理において重要な手段となっている。

対象の抗原を用いる別の形態の競合イムノアッセイ（この場合は対象の抗原に代えて不滅細胞を用いる）はあまり好適な検定法ではない。この種の検定法の例としては、不滅細胞を検出可能な標識で（例えば、標識抗体または同様なもので、直接または間接的に）標識し７て、細胞表面免疫グロブリンと反応する支持体結合抗体を用いる競合検定においてその不滅細胞を使用するような検定法であるだろう。このような検定法では、既知量の標識不滅細胞が抗体結合部位についてテスト試料中の未知量の対象抗原と競合するであろう。

当分野で習熟した者は、本発明の範囲内で多種多様の検定法が使用できること、本発明の抗原決定基代替物に代えた場合それぞれの検定法が若干の修飾を必要とすることを理解するであろう。

以下Ｑ）実に例は例示するＴこめのものであり“Ｃ１本発明を制限するものではない。

タイプモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）の生産およμ−週−５１１マウスＣ５７を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コトクシＰン（Ａ、　Ｔ　ＣＣ）寄託番号ＨＢ８７５９（１９８５年３月２６日に寄託）のＸＭＭＭＥ−００１と呼ばれるモノクローナル抗メラノーマ抗体で免疫した。−次免疫（２００ μｇ／マウス）は７・ノドバッド（足裏のふくらみ）を含む複数の箇所に完全７０インドアシユＩ（ントにより投与した。１週間後、二次免疫（４００μｇ／マウス）を不完全フロインドアジュノ（ントにより投与し、その後フットパッドを含む複数の箇所にリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）により３回の注射（４００μｇ／マウス）を１週問おきに行った。最終免疫は細胞融合の数日前に行い、複数の箇所にＸＭＭＭＥ−００１抗体を４００μｇ投与した。

牌細胞は摘出後ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ１５８１の細胞株ＳＰ２１０−Ａｇ１４と融合させた。これらの細胞を９６ウエル中のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）選択培地にまき、その後ＸＭＭＭＥ−００１抗体のＦ（ａｂ’）＊領域を用１．するＥＩＡＬ、より活性についてスクリーニングした。数個の陽性ウェルはクローン化し、ＸＭＭＭＥ−ＯＱ　１抗体またはＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９１５９　（１９８６年７月３日に寄託）のＸＭＭＭＥ−００３抗体（ＸＭＭＭＥ−００１が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する対照のモノクローナル抗メラノーマ抗体）に対して再度活性を調べｊ；。陽性ウェルはいろいろな環境でのそれらの反応性についても調べた。本実施例では、Ｈｙｂｒｉ−ｄａｔマニホールドの９６ウエルに対応するニトロセルロースの９６個所のそれぞれの１２：００位置に、Ｘ　Ｍ　Ｍ　Ｍ　Ｅ　−００１−Ｆ（ａｂ′）、を約０．３３ｊ１ｇ点在させた。ＸＭＭＭＥ−００１抗体　０．６μｇを７：００位置に点在（接触）させ、ＸＭＭＭＥ−００３抗体　０．７メｇを５：ＯＯ位置に点在させた。その後、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ　９１６０（１９８６年７月３日に寄託）の抗イディオタイプＸＭＭＭＥ−ｒ　０１ハイブリドーマ培養物由来の上溝（トリス緩衝溶液（ＴＢＳ）でｌ：２に希釈）をマニホールドに加え、イディオタイプと反応させｔ；。次に、ニトロセルロースを対照緩衝液（ｐＨ７，２）まＩ；はいろいろな酸性ｐＨ緩衝液（ｐＨ３，４，５，６）のいずれかとインキュベートした。インキュベーション後、各ウェルにＩｇＭおよびＩｇＧ、、を予め吸着させたヤギの抗マウスＩ　ｇＧ＋を加え、続いてペルオキシダーゼで標識したウサギの抗ヤギ抗血清を加えた。

その後、酵素基質４−クロロナフトールおよび過酸化水素を加えｔ；。各ウェルの１２：００と７：００の位置において響きに発色したが、５：００位置では発色せず、このことは抗イデイオタイプ抗体の存在を示唆しＩ；。

ｒ　ｇＧ、サブクラスのクローン株ＸＭＭＭＥ−夏Ｏ１は、ＸＭＭＭＥ−００１イデイオタイプとのみ反応することが分かり、その相互作用はｐＨ５で解離した。また、ＸＭＭＭＥ−ｒ　０１抗体は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣ５）分析においてメラノーマ細胞株（特異的ターゲット）へのＸＭＭＭＥ−００１の結合を阻害し、抗イデイオタイプ活性が確認できた。

■、抗イディオタイプハイブリドーマ細胞を用いるＦＡモノクローナル抗体ＸＭＭＭＥ−００１は、ＦＡＣ５競合検定で標識抗体として使用するｌ：めに、次の方法に従ってフルオレセインで標識した：ＸＭＭＭＥ−００１抗体は２．８ｍｇ／ｍｌの初期濃度でＩＸリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、１）Ｈ７，０中に調製した。ＰＤ−１０Ｇ２５Ｍ　セファデックスカラム（Ｐｂｉｒｍｉｃｉｉ　Ｆｉｌｌｅ　Ｃｈｃｍｉｃｘｌｓ）を重炭酸塩／ＮａＣ１緩衝液（０，１Ｍ　炭酸塩／重炭酸塩、０．５Ｍ　ＮａＣｌ。

ｐＨ９，０）で平衡化し、このカラムの頂部に抗体２．ｓｍｌを加えた。抗体はＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７，ｏ）　３．ｓｍｌで溶離し、氷水浴に入れた１　０　ｍ　ｌビーカー中で約４℃に冷却しｔ：。フルオレセインインチオシアネート（Ｆ　Ｉ　ＴＣ）溶液は、１２ｍｍＸ７５．ｍｍホウケイ酸チューブに、ＦＩＴＣ２００μｇおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２００ｐＮを加えて調製した。その後、このチューブは使用に先立ってアルミニウム箔で遮光した。抗体溶液を４℃で安定化させた後、この抗体溶液にＦＩＴＣ溶液を一滴ずつ絶えず撹拌しながら加えた。

（Ｆ　Ｉ　ＴＣ／抗体比：　２５ｊＬｇ　Ｆ　Ｉ　ＴＣ／ｍｇ抗体）。

ＦＩＴＣ溶液の添加後、この混合物を覆い、遮光し、氷水浴中で３時間撹拌した。その後、この混合物の２．５ｍｌアリコーｉ・を、ＰＢＳアジ化物緩衝液（１０ｍＭＮａＰＯ，，０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０２％アジ化ナトリウム、　ｐＨ７，０）で平衡化したＰＤ−１０Ｇ２５Ｍ　セファデックスカラムの頂部ｌ二加えた。ＦＩＴＣ標識抗体（ＸＭＭＭＥ−００１−ＦＩＴＣ）　はＰＢＳアジ化物緩衝液３．ｓｍｌで溶離し、アルミニウム箔で遮光しｔ：　１５　ｍ　ｌ遠心チューブ中に集めＩ；。フルオレセイン／抗体比（Ｆ　／　Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ　）はＬＫＢスペクトロメーターを使って計算した。吸光度は２８０ｎｍおよび４９６ｎｍにおいて読み取り、次の式に従って比を計算した二Ｆ　／　Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ比は２．２であると算出されｔ；。ＸＭＭＭＥ−００１−ＦＩＴＣ溶液は遮光して４℃で保存した。

２、ＦＡＣ５競合検定ダルベツコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）、１％ピルビン酸Ｎａ、１％２００ｍＭグルタミン中で生育させたＸＭＭＭＥ−Ｉ　０１ハイブリドーマ細胞は、細胞と培地を５０ｍ１遠心チユーブに加え、１２０Ｏｒｐｍ、４℃で５分間遠心することにより上溝培養物から回収した。上溝は真空フラスコに取り付けた無菌ピペットを使って除いた。この回収方法は細胞上の抗原部位（一部分泌された免疫グロブリンを含む）を乱さない。細胞は先に述べＩ；ようにＤＭＥＭ５〜１０ｍ１中４＝浮遊させた。細胞の生存能力は、細胞浮遊液１’０ＯＪ１１を０．４％トリバンプルー９００メ１で希釈し、細胞計数器で数えることにより測定した。生存能力はこの検定に要する生存能力〉９５％よりも低い９３゜５％であった。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）上層を一度施した後、生存能力は９６％になった。生存能力の測定後、細胞は１０８Ｍ１胞／ｍ＋の濃度に希釈した。

ＦＡＣ３分析用の全試料は層流フード下に水浴中で調製しｌ；。試薬類はすべて冷蔵保存した。細胞浮遊液の１ｍｌアリコートを検定用の１２Ｘ７５ｍｍチューブ（ファルコン＃２０５４または同等物）に入れｔ；。このチューブを１２０Ｏｒｐｍ、４℃で５分間遠心し、上清をデカントしｔ；。その後、チューブは試験管ラックに配置しＩ；吸収材料上に逆さまに置き、できるだけ多くの上溝を吸収させた。残存する上溝はガーゼで吸い取って除いた。

細胞は１ｍｌのＰＢＳ−ＢＳＡ／チューブを加え、穏やかに振動させて気泡の形成を避けながら細胞を浮遊させ、洗浄した。洗浄後、チューブを遠心し、上溝をデカントし、余分の上清を上記のように吸い取った。各試料にＰＢＳ−ＢＳＡを正確に１ｍｌ加え、細胞を再度浮遊させに　。

競合用の抗体および免疫複合体はＸＭＭＭＥ　−００１＃５１１０２（標準’）　、ＸＭＭＭＥ−００１−Ｒ，ＴＡ＃６０４０７、ＸＭＭＭＥ−００１−ＲＴＡ　＃６０５０５、およびアジ化物を含むＸＭＭＭＥ−００１＃５０５１３からなっていた。ＸＭＭＭＥ−００１−ＲＴＡ免疫複合体は米国特許第４５９００７１号に記載の通りに製造した（前記特許は参照によりここに引用するものどする）。各競合体は初めに４メｇ／２０μ！　（０，２ｊ１ｇＺ戸１）に希釈し、次にそれぞれの段階的希釈物２１１ｇ／２０μＩ、１μｉｒ／ｚｏｐ＋、および０．５μｇ／２０ｐｌを調製した。各希釈物は二通りの試料を調製するのに十分な量であった。先に記載した通りに製造した蛍光標識抗体ＸＭＭＭＥ−００１−ＦｒＴＣは、１％ＢＳＡ含有ダルベツコＰ　Ｂ　Ｓ　（ＳｉＥｌ＊）２０１１１中の飽和濃度（ｌＩｔｇ／２０μｍ）へ希釈した。自然発生蛍光対照を除くそれぞれの試料チューブに、競合用および標識済み抗体および／または複合体のアリコートを加えた。すべての試料は暗室中水上で１時間インキュベートした。

インキュベーション後、試料は、細胞の凝集を避けて単細胞浮遊液とするために、ＦＡＣ５分析の直前にチューブから各試料をピペットで分取し、３７μニテソクス（ｎｉｔｅｘ）フィルターを通してチューブ健から再分注することにより濾過した。その後、各試料は二重レーザーＦＡＣＳ　ＩＶ　（Ｂｇｅｔ＋＋＋＋− Ｄｉｃｋｅｏｓｏｎ、　Ｍｔ４ｉ＊ｖ、　ＣΔ）を使って、６５０および７５０のＰＭＴ電圧において緑色のＦＬＤＯＲＥＳＢＲＩＴＥミクロビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、　ＷｏｒｒｉｎＨｏｎ、　Ｐ＾）で補正した後分析した。試料は７５０ｖで分析し、この分析から死細胞を排除するために、前方散乱を取り出し、さらに中間分布を取り出した。この分析の結果を第１図に示す。

第１図は、蛍光分布（Ｆ）の平均を計算し、二通りの試料の平均値の平均をとり、逆数となし、自然発生蛍光を差し引き、そして競合抗体または複合体（Ｃ）と標識抗体（Ｌ）の濃度比をプロットすることにより得られた。

Ｌ（ＫＬ）およびＣ’（Ｋｃ）の平衡定数の比を用いて、次の方程式を導いた：１／Ｆｃ”（Ｋｃ／Ｋｔ）×［（１／Ｆｏ）Ｘ　［Ｌ］　ＩＸ　［Ｃ］Ｘ（１／ＦＯ）上記式中、ＦｃおよびＦｏはそれぞれ、各［Ｃ］のＦ値およびＣの不在下でのＦ　（Ｉｔであり、直線状である、および勾配Ｓ　−（ＫＣ／ＫＬ）Ｘ　［（１／ＦＯ）Ｘ　ＣＬ］　］。

抗体または複合体（Ｃ１）と標準抗体（ＳＴＤ）（Ｃ２）の相対結合は、これらのプロットの勾配の比に等しいそれらの結合定数の勾配の比からめた（　ｓ　ｉ／　ｓ　ｘ−Ｋ　ｃ＋／ＫＣ２）。

第１図の結果は、ＸＭＭＭＥ−１０１細胞株が以前に用いられたターゲット微小細胞ＯＭ　ｉ　ｎ　ｏ　ｒ　ｃ　ｅ　Ｉ　ｌ　）の適当な代替物となりうろことを示した。

当分野で習熟した者は、本発明が研究・分析用の対象となりうる抗原決定基を模倣するための新規な方法を提供することを理解するであろう。本方法は、以ｔ＋ｆｒにはＦＡＣ５分析を適用できなかった抗原決定基が今や研究の対象となりうるという点で、従来技術の改良である。本発明はさらに免疫学的分析・研究用の抗原決定基の安定した、効果的な供給源を提供する。

前記発明は、理解し易くするために、例示や実施例によってやや詳しく説明したが、当分野で習熟した者Ｊこは、添付の請求の範囲内で、ある種の修飾を行い得ることが明らかであるだろう。

勾配　Ｏ，ト〃第　２　凹ＸＭＰＩＭＥ−１０１１’ｍ−ＩＭＥ−００ｊ−ＦＪ’ＴＣとめ幽しト噛１劇〔 −→−Ｘｌ’ｌ開Ｅ−００１−ＦＩＴＣＦＯＰ　２３国際調査報告一＋＋ａｉｏｒ＊１Ａｎｅｌｌ＋Ｉ＋＋６１　Ｎ６．　ｐ（Ｔ／じ５８Ｂ１０２３４２

Claims

【特許請求の範囲】

１．抗原結合物質に結合される抗原を用いて前記抗原結合物質の存在または濃度を測定する方法において、前記物質の抗イディオタイプである免疫グロブリン分子を発現し得る不滅細胞を前記抗原の代わりに使用し、前記細胞が前記免疫グロブリンの結合部位を含む細胞表面マーカーとして前記免疫グロブリンを発現することにより改良された前記方法。
２．前記方法は蛍光活性化細胞選別機（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡｃｔｉｖｚｔｃｄＣｅｌｌＳｏｒｔｅｒ）を使用する、請求項１記載の方法。
３．前記不滅細胞はハイブリドーマ細胞である、請求項１記載の方法。
４．前記ハイブリドーマ細胞はネズミ／ネズミハイブリドーマ細胞である、請求項３記載の方法。
５．前記ネズミ／ネズミハイブリドーマ細胞はＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９１６０をもつＸＭ泌ＭＥ−１０１ハイブリドーマ細胞である、請求項４記載の方法。
６．前記抗原結合物質は免疫グロブリンである、請求項１記載の方法。
７．前記免疫グロブリンはＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８７５９をもつハイブリドーマ細胞株ＸＭＭＭＥ−００１により産生される、請求項６記載の方法。
８．前記不滅細胞を約４℃の温度で維持して前記免疫グロブリンの分泌を止めることをさらに含む、請求項１記載の方法。
９．前記免疫グロブリンは検出可能な標識で標識される、請求項１記載の方法。
１０．前記標識は蛍光標識である、請求項９記載の方法。
１１．前記蛍光標識はフルオレセインイソチオシアネートである、請求項１０記載の方法。
１２．既知量の標識抗原を使用し、免疫グロブリンに結合された前記標識抗原の量を検出することから成る、試料中の抗原の存在または量を測定する方法において、前記抗原の結合部位とよく似た結合部位をもつ免疫グロブリン分子を発現し得る標識不滅細胞を前記標識抗原の代わりに使用し、前記細胞が前記結合部位を含む細胞表面マーカーとして前記免疫グロブリンを発現することにより改良された前記方法。
１３．前記不滅細胞はハイブリドーマ細胞である、請求項１２記載の方法。
１４．前記ハイブリドーマ細胞はネズミ／ネズミハイブリドーマ細胞である、請求項１３記載の方法。
１５．前記不滅細胞を約４℃の温度で維持して前記免疫グロブリンの分泌を止めることをさらに含む、請求項１２記載の方法。
１６．ターゲット抗原への免疫複合体の結合を、標識した非複合体化第一免疫グロブリン分子との競合状態で測定することから成る、ターゲット抗原に対する免疫複合体の結合活性を測定する方法において、前記免疫複合体の抗体成分の抗イディオタイプである第二免疫グロブリン分子を発現し得る不滅細胞を前記抗原の代わりに使用し、前記細胞が前記第二免疫グロブリンの結合部位を含む細胞表面マーカーとして前記第二免疫グロブリンを発現することにより改良された前記方法。
１７．前記方法は蛍光活性化細胞選別機を使用する、請求項１６記載の方法。
１８．前記不滅細胞はハイブリドーマ細胞である、請求項１６記載の方法。
１９．前記ハイブリドーマ細胞はネズミ／ネズミハイブリドーマ細胞である、請求項１８記載の方法。
２０．前記ネズミ／ネズミハイブリドーマ細胞はＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９１６０をもつＸＭＭＭＥ−１０１ハイブリドーマ細胞である、請求項１９記載の方法。
２１．前記免疫複合体は免疫毒素である、請求項１６記載の方法。
２２．前記免疫毒素はＸＭＭＭＥ−００１−ＲＴＡである、請求項２１記載の方法。
２３．前記不滅細胞を約４℃の温度で維持して前記第二免疫グロブリンの分泌を止めることをさらに含む、請求項１６記載の方法。
２４．前記標識した第一免疫グロブリンは蛍光標識で標識される、請求項１６記載の方法。
２５．前記蛍光標識はフルオレセインイソチオシアネートである、請求項２４記載の方法。
２６．前記第一免疫グロブリンはＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ８７５９をもつハイブリドーマ細胞株ＸＭＭＭＥ−００１により産生される、請求項２５記載の方法。