JPH03501210A - プラスミド及びコスミドを得る方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プラスミドおよびコスミドを得る方法および装置本発明は、完全なプラスミドお よびコスミドを得る方法および装置に関する。

プラスミドは、染色体外の環状２本鎖ＤＮＡ分子であり、多くの菌株に見られる 。その大きさは、ｌｋｂから２００−３００ｋｂであり、例えば染色体よりも相 当小さい。

従来技術において、種々のバクテリア内に存在するプラスミドを遠心分離により 分離することは知られている。バクテリア細胞の遠心分離では、プラスミドは２ ０％のオーダーの低収率でしか得られない。現在、プラスミドは、多くの用途が あり、特にハイブリダイゼーションのプローブとしてまたはベクターとして用い られている。従って、プラスミドの需要が高まるにつれて、極めて高収率で完全 なプラスミドを得る可能性は、当業者にとって大いに興味あることである。

その結果、本発明者は、特に完全なプラスミドおよびコスミドを１００％に近い 収率で得ることができ、かつ低コストで容易に実施できる点において、従来方法 の欠点を持たない完全なプラスミドおよびコスミドを得る特定の方法を提供し、 該方法を遂行するだめの自動化装置を提供することを目的として研究を重ねてき た。

本発明の目的は、適当な培地で培養されたバクテリア細胞中に存在する完全なプ ラスミドおよびコスミドを得る方法を提供することである。該方法は、第１段階 で、バクテリア細胞を培地から分離し、第２段階で、該細胞を適当なゲルに封入 し、次いで適当な試薬と接触させることにより細胞壁を溶解させ、次いで、適当 な試薬の少くとも１種により封入された細胞を可溶化させて、更に第３段階で、 上記ゲルに封入されている溶解した細胞を適当な電場に置き、電気泳動を惹起さ せて、上記細胞中に存在する完全なプラスミドおよびコスミドを選択的に分離す ることを特徴とする。

細胞壁の溶解は、リゾチームを使用して公知の方法で実施される。

上記方法の一実施態様によれば、細胞壁の溶解は、封入ゲルの凝固の前に実施さ れる。

上記方法の他の一実施態様によれば、細胞壁の溶解は、封入ゲルの凝固の後に実 施される。

さらに他の一実施態様によれば、封入ゲルは、特に限定するものではないが、０ ．１−５％濃度のアガロースである。

本発明方法のさらに他の一実施態様によれば、適当な蛋白質分解酵素および脂質 洗浄溶媒からなる群から選ばれた試薬を用いて、化学的に或いは生化学的に溶解 を実施する。

酵素としては、特にプロテイナーゼに１プロナーゼまたは他の適当なプロテアー ゼが挙げられ、適当な洗浄剤としては、特にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） が挙げられる。例えば、プロテイナーゼにとＳＤＳの組合わせが非常に有益であ る。

上記実施態様の好ましい組合わせにおいては、上記可溶化はゲルの凝固の前に行 なわ°れる。

上記実施態様の他の好ましい組合わせにおいては、上記可溶化はゲルの凝固の後 に行なわれる。

本発明方法の他の実施態様によれば、電気泳動は２〜１２時間行なわれる。

上記実施態様のおける好ましい組合わせにおいては、電気泳動は公知の方法でパ ルス化された電場で実施される。

この様な実施態様においては、必要な場合は、細胞の可溶化の間、無論有利な熱 調節手段により電気泳動システムの冷却を行なう。

また、本発明は、バクテリア細胞中に存在する完全なプラスミドおよびコスミド を得るための装置に関する。該装置は、培地からの細胞分離手段の少くとも１個 ；処理チャンバーの少くとも１個；上記処理チャンバーに隣接しかつ組合わされ ている電気泳動支持体としての電気泳動ゲルの少くとも１種；電気泳動を起こす 電場を与えるための手段の少くとも１個：上記電気泳動ゲルを上記処理チャンバ ーと接触させるための可動のおよび／または出し入れ可能な手段；および上記分 離手段、上記接触手段および電場を印加するための手段をシーケンシャルコント ロールするための自動化マイクロプロセッサ−を備えていることを特徴とする。

有利な実施態様によれば、上記装置は、細胞の培養チャンバーの少くとも１個お よび該細胞を培養チャンバーから処理チャンバーに移送する手段を更に有する。

上記移送手段は、一方では培養チャンバーに接続され、他方では処理チャンバー に接続する移送チューブおよび該培養チャンバｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｄｅｖｉｃｅ ）を有している。

この実施態様の一改変例によれば、上記差圧装置はぜん動ポンプである。

この実施態様の別の改変例によれば、上記差圧装置は、培養チャンバーに接続さ れた加圧手段である。

この実施態様のさらに他の改変例によれば、上記差圧装置は、処理チャンバーに 接続された真空ポンプである。

本発明の装置の別の実施態様によれば、処理チャンバーが、その底部に８０ｋＤ ａよりも大きい分子量の分子の分離に適した多孔性膜により構成された分離手段 を有するタンクであることが有利である。

上記の実施態様において、上記タンクは、その内の１つが、電場印加手段である 電極の１つに隣接し、透析膜である３枚の固定化された壁を有する。また、電気 泳動ゲルを処理タンクに接触させるように設置するための可動手段は、最も単純 には、上記タンクの第４の壁を与える定規（ｒｕｌｅ）であり、処理タンク中の ゲルの流れの方向に位置する。

改変した一実施態様において、タンクは、ゲルの流れる方向に位置する４個の取 り外し可能な定規により構成され、電場を作る手段である電極の１つは、必要で あれば、透析膜に隣接する。

好ましい一実施態様においては、細胞を培養チャンバーから処理チャンバーに確 実に移送する真空ポンプは、上記膜を通って培地を吸引するための減圧状態を同 時にもたらす。

本発明は、電気泳動の後の完全なプラスミドおよびコスミドのサイトの位置決定 をするための検出器を有することが有利である。

従って、本発明の手段を組合わせることにより、完全なプラスミドおよびコスミ ドの高速自動分離の実現化は容易である。

」二足の特性に加えて、本発明は別の特性を有する。該特性は、下記の記載から 明らかであり、下記の記載は、本発明の方法を実際に行なう実施例および装置に ついて、添付の図面を参照しつつ説明するものである。

第１図は、本発明の詳細な説明する図式である。

第２図は、本発明装置の一部の一実施態様を説明する長手方向の断面図である。

第３図は、本発明装置の一部の別の一実施態様を説明する長手方向の断面図であ る。

しかしながら、これらの図面および対応する説明部分並びに実施例は、本発明を 具体的に説明するために記載した。

にすぎず、本発明は、これに限定されるものではないことは、言うまでもない。

プラスミドおよびコスミドを得るための本発明の方法は、第１図において説明さ れる。プラスミドまたはコスミドの宿主バクテリアは、適当に選択され、種々の プラスミドまたはコスミドを担う種々のバクテリア細胞を同時に成長させること ができる一定数の仕切り１１〜１．、を有する細胞培養チャンバー１中で培養さ れる。適当な細胞濃度が得られた後、培養物を移送手段２により処理タンク４内 に移送する。この移送手段２は、記載の実施態様においては、チューブ２１およ び真空ポンプ６により構成されている。次いで処理タンクはカバー（図示せず） が取り付けられる。

細胞濃度の測定は、種々の方法で実施され、限定されるものではないが、特に比 色定量により実施される。次いで細胞を培地から分離させる。分離手段は、処理 タンク４の底部にある適当な膜５であり、例えば、これに限定されるものではな いが、特に８０ｋＤａ以上の分子を残留させる限外濾過膜“テフロン（Ｔｅｆｌ ｏｎ）”　（デュポンの商標名）である。

真空ポンプ６は、培養チャンバーから処理チャンバーへの細胞の移送を確実に行 なうと同時に、上記膜を通じて培地を吸引移動させる減圧をも発生させる。チュ ーブ２１に接続した一連のピペット３、〜３ａは、試薬および特にアガロース（ 次いで約６５℃に加熱される）の導入を可能にし、該細胞の封入を可能にする； 次いで細胞壁は、例えばリゾチームなどにより溶解される；リゾチームは、該細 胞と接触するように５−１０分間維持される。この溶解は、封入ゲルが３７℃の オーダーの温度で固化する前または後とは無関係に実施して好い。

次いで、細胞を可溶化する。細胞の可溶化は、適当な酵素により、好ましくは洗 浄剤と併用して、例えば特に限定するものではないが、プロテイナーゼにとＳＤ Ｓとの併用によって、封入ゲルの固化の前後とは無関係に行なうことができる。

細胞の可溶化の後、パルスされているかされていない重環タンク４の可動壁の一 つである可動壁１１を引っ込めることにより、処理タンク４を電気泳動ゲル層７ に連結させる。処理された細胞を含有するゲルと電気泳動ゲルとの間にある隙間 を電気泳動ゲルで充填する。処理タンク４の壁１２は、透析膜である。電極８は 、所望の電気泳動に適した電場を与えることを可能とする。

処理タンク４および電気泳動ゲル７の層は、コンテナー３０中にあり、該コンテ ナー中には、電気泳動緩衝液および電極８がある。検出器９により、プラスミド およびコスミドの泳動サイトが位置決定される。

本発明の方法によれば、２〜１２時間の短期間内に、特にプラスミドおよびコス ミドを得ることができる。コスミドはゲル上を泳動し、一方、染色体は泳動出発 レベル（ｔｈｅｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｐｏｓＨ）に維持されているが 、他方可溶化生成物（ペプチドなど）はゲルにより維持されない。

第２図は、本発明装置の一部の実施態様を縦断面図で示したものである。読図は 、可動壁１１およびその内の１つが、処理タンク４に近接する電極８に隣接し、 かつ透析膜１２である３枚の固定化された膜を含むタンク４を示す。

処理タンク４および電気泳動ゲル７の容器３０は、下記のものを含むニ ー例えば、これに限定されるものではないが、特に８０ｋＤａ以上の分子を残留 させる限外濾過膜“テフロン（Ｔｅｆ　ｔｏｎ）“などの適当な膜５の形態で、 処理タンク４の底部に位置する適当な支持体１３、 一電極８で示される電場を作る手段。

真空ポンプ６は、培地から細胞を分離する手段５と組合わされる。

検出器９は、プラスミドおよびコスミドの泳動サイトの位置決定を可能にする。

第３図は、本発明の装置の別の実施態様の縦断面を図式的に示したものである。

読図は、２枚の可動壁１１および２枚の固定壁を含む処理タンク４を示す。

処理タンク４および電気泳動ゲル７の容器３０は、下記のものを有するニ ー例えば、これに限定されるものではないが、特に８０ｋＤａ以上の分子を残留 させる限外濾過膜“テフロン（Ｔｅｆ　５ｏｎ）”などの適当な膜５の形態で、 処理タンク４の底部に位置する適当な支持体１３、 一４極８で示される電場を作る手段。

真空ポンプ６は、培地から細胞を分離する手段５と組合わされる。

検出器９は、プラスミドおよびコスミドの泳動サイトの位置決定を可能にする。

上記の装置は、プラスミドおよびコスミドを得る本発明方法の実施を可能にする 。

実施例１ 培養チャンバー１中で、抗生物質を含有するＬＢ培地（バクトドリプトン、バク トイ−スト抽出物および塩化ナトリウム）において、３７℃で、単離されるべき プラスミドを含むバクテリアを培養する。該バクテリアを処理タンク４に移送し 、真空ポンプ６を作動させて、膜５を通過させることにより濾過して、培地を除 去する。３７℃に維持された１％アガロースを処理タンク４に流し入れ、１５分 間冷却して、バクテリアを含有するアガロースを重合させ、得られた塊を６ｍｇ ／ｍｌリゾチーム溶液中で、室温にて１０分間培養する。１０％ドデシル硫酸ナ トリウムを含有する５ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテイナーゼに溶液を加え、熱制御 手段により４２℃にて１時間培養する。この様にして処理された細胞を７０ボル ト（約６０ｍＡ）にて３時間電気泳動に供する。こうして、第４ａ図（矢印）に 示されるように、所望のプラスミドを得る。カラム４ｂはサイズマーカー（Ｈｉ ｎｄ■と称されるラムダファージ）を示す。

実施例２ 実施例１の手法に従って、電気泳動を１０ボルト（約９ｎ＋Ａ）にて１２時間実 施する。第５ｂ図（矢印）に示されるような所望のプラスミドが得られる。カラ ム５ａはサイズマーカー（ＨｉｎｄＩ［Ｉと称されるラムダファージ）を示す。

上記から明らかなように、本発明は、上記により明確に記載した実際の方法、実 施態様および用途に限定されるものではない。それどころか、本発明は、本発明 の構成および目的からはずれない限り、当業者にとって自明である全ての改変を も含む。

ａ　ｂ　ａ　ｂ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　第１段階において、培地からバクテリア細胞を分離し、第２段階において、 細胞を適当なゲルに封入し、次いで細胞壁を適当な試薬との接触により溶解し、 次いでゲルに封入された細胞を適当な試薬の少くとも１種により可溶化させ、第 ３段階において、上記可溶化した細胞をゲルに封入させたまま、電気泳動を惹起 する適当な電場に供し、細胞中に存在する完全なプラスミドおよびコスミドを単 離することを特徴とする、適当な培地で培養されたバクテリア細胞中に存在する 完全なプラスミドおよびコスミドを選択的に得る方法。 ２　封入ゲルの固化の前に、細胞壁の溶解を実施する請求項１に記載の方法。 ３　封入ゲルの固化の後に、細胞壁の溶解を実施する請求項１に記載の方法。 ４　封入ゲルが濃度０．１〜５％のアガロースである請求項１乃至３のいずれか に記載の方法。 ５　細胞の可溶化が、適当な蛋白質分解酵素および適当な洗浄溶媒から選ばれた 試薬により、化学的または生化学的に実施されることを特徴とする、請求項１乃 至４のいずれかに記載の方法。 ６　封入ゲルの固化の前に、細胞の可溶化を実施する請求項５に記載の方法。 ７　封入ゲルの固化の後に、細胞の可溶化を実施する請求項５に記載の方法。 ８　電気泳動が２から６時間実施される請求項１乃至７のいずれかに記載の方法 。 ９　電気泳動を公知の方法によりパルス化電場で実施する請求項８に記載の方法 。 １０　バクテリア細胞を培地から分離するための手段の少くとも１個（５）；処 理チャンバーの少くとも１個（４）；上記処理チャンバーに隣接しかつ組合わさ れた電気泳動の支持体としての電気泳動ゲルの少くとも１個（７）；電気泳動を 惹起する電場を与えるための手段の少くとも１個（８）；電気泳動ゲルを処理チ ャンバーに接触させるようにための可動のおよび／または出し入れ可能な手段（ １１）；および上記分離手段、上記の接触のための手段および電場印加手段をシ ーケンシャルコントロールするための自動化マイクロプロセッサーを含むことを 特徴とする、バクテリア細胞中に存在する完全なプラスミドおよびコスミドを得 るための装置。 １１　細胞用培養チャンバーの少くとも１個（１）および細胞を培養チャンバー から処理チャンバーに移送する移送手段（２）をさらに有する装置であって、該 移送手段が、一方で培養チャンバーと接続し、他方で処理チャンバーと接続して いる導入チューブ（２１）および培養チャンバーと処理チャンバー間の差圧装置 を含むことを特徴とする請求項１０に記載の装置。 １２　差圧装置がぜん動ポンプである請求項１１に記載の装置。 １３　差圧装置が培養チャンバーに接続された過剰圧発生装置（ｅｘｃｅｓｓｐ ｒｅｓｓｕｒｅｇｅｎｅｒａｔｏｒ）である請求項１１に記載の装置。 １４　差圧装置が処理チャンバーに接続された真空ポンプである請求項１１に記 載の装置。 １５　処理チャンバーが、その底部に、８０ｋＤａ以上の分子量の分子の分離の ための適当な多孔性膜からなる分離手段（５）を有するタンクであることを特徴 とする請求項１０乃至１４のいずれかに記載の装置。 １６　タンクが、３個の固定化された壁を有し、その壁の１つが電場を作るため の手段である電極（８）の１つに隣接しかつ透析膜（１２）であり、また電気泳 動ゲルを処理チャンバーに接触させるための可動手段が、処理タンク内へのゲル の流れに向かって位置する上記タンクの第４の壁を与える定規（１１）であるこ とを特徴とする請求項１５に記載の装置。 １７　タンクが、同時に動くことができかつゲルの流れに向かって位置する４個 の定規（１１）により規定され、電場を作る手段である電極（８）１つが透析膜 （１２）に隣接できることを特徴とする請求項１５に記載の装置。 １８　培養チャンバーから処理チャンバーへの細胞の移送を確実にする真空ポン プ（６）が、膜を通って培地を吸引するための減圧を同時に発生させることを特 徴とする請求項１４乃至１７のいずれかに記載の装置。 １９　電気泳動の後の完全なプラスミドおよびコスミドのサイトの位置決定をす る検出器（９）を有することを特徴とする請求項１０乃至１８のいずれかに記載 の装置。 ２０　処理チャンバーの加熱の温度制御のためおよび／または電気泳動中の冷却 のための手段を有することを特徴とする請求項１０乃至１９のいずれかに記載の 装置。