JPH03501328A - 熱的に安定なα‐アミラーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 熱的に安定なα−アミラーゼの製造法 発明の背景 主ユ企立夏 本発明は、α−アミラーゼ酵素の改良された製造法に関する。

旦米肢五立説里 α−アミラーゼは、洗濯用洗剤や皿洗い用洗剤等の市販の洗浄用製品において有 用なよく知られている酵素である。α−アミラーゼはさらに、澱粉を水溶性の炭 水化物に転化させるのに有用であり、化学的又は酵素的作用により最終的に、種 々のり。

Ｅ、値を存するコーンシロップ、デキストロース、及びフルクトース含量の高い コーンシロップに転化させるのに特に適していα−アミラーゼは、バシラス・リ ケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のある特定の菌 株を培養することを含む微生物学的プロセスによって製造されている。このよう なプロセスの１つと菌株が英国特許第１，２９６．８３９号明細書に開示されて いる。

またホーワスＣＩＣｌ１ｌｏｒ　ｔｈ）による米国特許第４．４７３．６４５号 明細書では、他のプロセスと口株を開示している。こうした公知のプロセスを使 用すると、約５０〜約２．０００　リケホン（ｌｉｑｕｅｆｏｎ３）／ｍｌの酵 素活性を有する醗酵媒体が得られる。これらのプロセスにおいては通常、ピルベ ート、グルコナート、アラビノース、リボース、ガラクトース、マルトース、ラ クトース、可溶性澱粉、又はマンニトール等の、単糖類、二糖類、及び多糖類が 使用されているが、好ましい炭素源はラクトースである。ラクト−スキストロー ス、澱粉、澱粉加水分解物、及びデキストロースの結晶化後に残留する種々の物 質〔例えば“ＤＬ、７０”（ステイジー−コンチネンタル−７−ズ（Ｓｔａｌｅ ｙ−Ｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌ　Ｆｏｏｄｓ）の商品名）〕は、比較的安価で且つ 代謝も速いけれども、微生物学的なα−アミラーゼ製造における炭素源としては 従来使用されていない、α−アミラーゼの合成を抑制する物質であることがよく 知られているからである。ツクモト、　１．（Ｆｕｋｕｍｏｔｏ、　１．）らに よる１８０　Ｎａｔｕｒｅ　４３８（１９５７）を参照のこと。

主三二！と 本発明は、α−アミラーゼの新規な製造法を提供することによって従来技術の欠 点を解消する０本発明の製造法によれば、通常はα−アミラーゼの合成を抑制す る炭水化物を主要な炭素源として含有した栄養培地にて、バシラス・リケニホル ミスＡＴＣＣ５３，７２２微生物を培養し：培養中に前記の主要炭素源を前記培 地に供給し；培養中に前記主要炭素源を前記培地に供給する速度を調節すること によって、１分光たり培地１容に対して空気の流量がＯ−５〜１．０容であると きに、培養中に培地から発生する二酸化炭素のレベルを排ガス（ｏｆｆ−ｇａｓ ）の４．５〜６．５％に保持し：そして培地のｐＨを６．５〜７．０に保持する ことによって：熱的に安定なα−アミラーゼが製造される。

１１旦毘紅星■皿 本発明の製造法によって得られるα−アミラーゼは、米国特許第４，４７３．６ ４５号明細書に記載の方法に従って製造されるα−アミラーゼと同程度の熱安定 性ををする０本発明によるα−アミラーゼは低濃度のカルシウムイオンの存在下 にて安定であり、従来のほとんどの市販α−アミラーゼの場合より低い使用上の ｐＨｃ５．２）において機能を果たす０本発明の製造法によって得られるα−ア ミラーゼは、米国特許第４，４７３．６４５号明細書において特許請求されてい るアミラーゼの全ての機能上の利点を有するか又はそれらを凌ぐ０本発明の好ま しい製造法を使用すると、同等の培養時間にて米国特許第４．４７３．６４５号 明細書に開示の方法に対する最高収率と比較して、培地１ｄ当たり少なくとも約 ３倍の量のα−アミラーゼが得られる。

本発明の製造法は、バシラス・リケニホルミス〔生存可能な培養面が、５３．７ ７２の番号付けにてアメリカン・タイプ・カルチャー會コレクション（Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託されてい る〕の菌株を使用して実施される。

本発明の製造法においては、３８〜４４°Ｃの範囲（好ましくは４２”Ｃ）の温 度にて３〜６日間、醗酵作用を行わせる。醗酵は好気性状態にて行われ、空気の 流量は、１分光たり培地１容に対して０．５〜１．０容（好ましくは０．６容） である。

代謝が速くて且つ通常はα−アミラーゼの合成を抑制する好適な主要炭素源とし ては、デキストロース、キシロース、マンノース、スクロース、グリセロール、 及び澱粉加水分解物等がある。炭水化物の初期量は、培地のＯ〜２０χｗ／νの 範囲で変わりうる。

培地は、主要炭素源の他に窒素源及び他の必須栄養物（これらは全て当技術者に は公知である）を含有している１例えば、米国特許第４．４７３．６４５号明細 書を参照、適切な窒素源は、可溶性の硝酸塩やアンモニウム塩等の無機物質であ ってもよいし、あるいはイースト抽出物（ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ）、コー ン・ステイープ・リカー（ｃｏｒｎ　５ｔｅｅｐ　１ｉｑｕｏｒ）＋落花生粗び き粉（ｐｅａｎｕｔ　ｍｅａｌ）。

グルタミン酸−ナトリウム、大豆粉末（ｓａｙ　ｆｌｏｕｒ）、綿実粉末（ｃｏ ｔｔｏｎｓｅｅｄ　ｆｌｏｕｒ）、綿実粗びき粉（ｃｏｔｔｏｎｓｅｅｄ　ｍｅ ａｌ）、及び当技１↑１者によく知られている他の通常の有機窒素源等の有機物 質であってもよい。

本発明の好ましい実施態様においては、主要炭素源はデキストロースであり、窒 素源はコーン・ステイープ・リカーであり。

そして醗酵中にデキストロースが培地に供給される速度を調節することによって 、曝気速度が０．５〜ｌ　、　Ｑｖｖｍであるときに、二酸化炭素の発生量が好 ましくは排ガスの５〜６％に保持される。

アンモニア（無水状態でもよいし、水溶液の形でもよい）又は苛性ソーダ（水酸 化ナトリウム水溶液）を加えることによって。

ｐＦＩを６．７に保持するのが望ましい。

所望のレベルの酵素活性が達成された後、培地から酵素が回収される０回収方法 はよく知られており９例えば、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、アセトン、 又はエタノールによって沈澱を起こさせ、遠心分離又は濾過を行い９次いでこの 沈澱物を乾燥する。という方法がある。α−アミラーゼの最も一般的に得られる 製造物では、バシラス・リケニホルミス微生物が濾過によって全ブロス（ｂｒｏ ｔｈ）から除去された液状生成物として回収され２次いである特定の有効性を存 するα−アミラーゼとなるまで菌発又は限外濾過により濾液が濃縮される。

以下に実施例を挙げて９本発明の詳細な説明する。

皇立医上 Ａ、スーント（ｓｌａｎｔ　Ｏ飢 標準的な微性物学的方法を使用して、適切なワーキングストック培養物（ｗｏｒ ｋｉｎｇ　５ｔｏｃｋ　ｃｕｌｔｕｒｅ）からバシラス・リケニホルミスＡＴＣ Ｃ５３，７７２の新たなスラントを作製した。適切なワーキングストック培養物 は、凍結乾燥された培養物として、又は別個のスラント培養物として、凍結状態 にて保持することができる。スラント培地は通常、０．５１（ｗ／ｖ）のコーン スターチを含有したＤｉｆｃｏ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｍｅｄｉｔ＋ｎ＋　Ｎ ｏ、３からなる。新たなスラントを３７℃で２５〜３０時間成長させた後、シー ド醗酵槽（ｓｅｅｄｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）に接種した。

Ｂ、之二ヱ丘匪捜 新たなスラントの成長物を少量のＤｉｆｃｏ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｍｅｄｉ ｕ＋ｍＮｏ、３中に懸濁させ１次いで コーンスターチ：　２％ デキストロース：１．５％ コーン・ステイープ・リカー：　８％ Ｍａｚｕ　ＤＦ−３７Ｃ；　０．１％ ＸＨｘＰＯａｉ　ｏ、ｓ％ を含有したシード醗酵槽に直ちに移した。

曝気速度を０．６シｖａ＋とじて、４２°Ｃにて２５〜３０時間、シードの醗酵 を行った。撹拌速度はシード醗酵槽の容量によって変わるが。

通常は１５０”１ＯＱＯｒｐａ＋の範囲内である０本実施例においては。

１１の培地を含有した２０ｊ２容Ｉの容器にて、撹拌速度を７５０ｒｐｌＩｌと した。必要に応じてアンモニアガスを使用して、　ｐＨを６．５以上に保持した 。

Ｃ０■ 製造用醗酵槽に対する接種の程度は、初期接種容積の３％である０例えば、接種 される所望の醗酵槽の容積が１００．０ＯＯＡである場合、　３０００ｊ！のシ ード培養物が９７．０ＯＯｊ！の製造用培地に移される８本実施例においては、 　１１，６４０Ｊ！ｌ！の製造用培地に３６０１！ｌのシード培養物を移して、 ２０１容量の容器にてトータル１２．０００ｄとなるようにした。製造用培地は 。

コーンスターチ５４％ コーン・ステイープ・リカー；　６％ ＣａＣ１ｚ’２ＨｚＯ：　０．０３％ ＭｇＳＯ４・７ｔｌＺＯ：　０．１％ Ｍａｚｕ　ＤＦ−３７Ｃ：　０．２５％Ｍｎ５Ｏａ　：　痕跡量 ＫＺＢＰＯ４；　０．６７％ ＫＩｈＰ０４；　０．５％ デキストロース：２．４％ からなる。

リン酸カリウム塩は別々に殺菌処理を行い、無菌の製造用培地の歿りの成分に無 菌の状態で加えた。最初の炭水化物が完全に消耗（これは二酸化炭素の発生量が 急に少なくなること、及びＰＲが上昇することかられかる）した後、７０％デキ ストロース溶液（ＤＬ−７０，澱粉加水分解物、又はこれらの組合せ物として） の連続的な添加を始めた。ここでは、　ＤＬ−７０を炭素源として使用した。Ｉ ｓ気速度は０．６ｖｖＩ１１であった。デキストロース溶液は。

二酸化炭素の発生量が排ガスの５〜６％に保持されるような速度にて供給した。

一般には、グルコースを供給すると培地のｐ）ｌが低下し、必要に応じてアンモ ニアガスを加えることによってｐＨを６．７以上に保持した。

醗酵を１１６時間継続した。７６時間において、培地中のα−アミラーゼの活性 は６０６４リケホン／ｄ　（ホーワスによる米国特許第４．４７３．６４５号明 細書に記載のアッセイ法により測定）となった、１１６時間においては、活性は ７９６５リケホン／ｄとなった。

本発明の好ましい実３Ｉ態槙は、　ＡＴＣＣ５３，７７２微生物の他に。

ＡＴＣＣ５３，７７２の突然変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）や変異体（ｖａｒｉａｎ ｔｓ）、並びにこれらから導かれる遺伝学的に形質転換した微生物を使用するこ とも含んでいる。

好ましい実施態様を挙げつつ本発明を説明してきたが、当技術者は９本発明の精 神と範囲を逸脱することなく種々の変形が可能であることを認識しなければなら ない、このような変形は全て本発明の一部であると考えるべきである。

国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）通常はα−アミラーゼの合成を抑制する炭水化物を主要な炭素源とし て含有した栄養培地にて，バシラス・リケニホルミスＡＴＣＣ５３，７７２を培 養する工程；（ｂ）培養中，前記培地に前記主要炭素源を供給する工程； （ｃ）培養中に前記主要炭素源を前記培地に供給する速度を調節することによっ て，１分当たり培地１容に対して０．５〜１．０容の空気流量にて，培養中に前 記培地から発生する二酸化炭素のレベルを排ガスの４．５〜６．５％に保持する 工程；及び （ｄ）前記培地のｐＨを６．５〜７．０に保持する工程；の各工程を含む，熱的 に安定なα−アミラーゼの製造法。
2. ２．前記主要炭素液が，デキストロース，澱粉加水分解物，グリセロール，キシ ロース，マンノース，スクロース，及びこれらの混合物からなる群から選ばれる ものである，請求の範囲第１項に記載の製造法。
3. ３．前記栄養培地が，大豆粉末，コーン・スティーブ・リカー，綿実粉末，イー スト抽出物，落花生粗びき粉，可溶性硝酸塩，アンモニウム塩，及びこれらの混 合物からなる群から選ばれるものを窒素源として含有している，請求の範囲第１ 項に記載の製造法。
4. ４．前記栄養培地が，大豆粉末，コーン・スティーブ・リカー，綿実粉末，イー スト抽出物，落花生粗びき粉，可溶性硝酸塩，アンモニウム塩，及びこれらの混 合物からなる群から選ばれるものを窒素源として含有している，請求の範囲第２ 項に記載の製造法。
5. ５．前記培養が７２〜１４４時間行われる，請求の範囲第１項に記載の製造法。
6. ６．前記培養が３８〜４４℃の温度にて行われる，請求の範囲第１項に記載の製 造法。
7. ７．アンモニアを加えることによって前記培地のｐＨが６．５〜７．０に保持さ れる，請求の範囲第１項に記載の製造法。
8. ８．前記培養が７２〜１４４時間行われる，請求の範囲第２項に記載の製造法。
9. ９．前記培養が３８〜４４℃の温度にて行われる，請求の範囲第２項に記載の製 造法。
10. １０．アンモニアを加えることによって前記培地のｐＨが６．５〜７．０に保持 される，請求の範囲第２項に記載の製造法。