JPH03501484A

JPH03501484A - ヒトＦｃγレセプター３

Info

Publication number: JPH03501484A
Application number: JP1506363A
Authority: JP
Inventors: ペルツ，ゲイリー・エイ; モーア，ケヴィン・ダブリュー
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1988-05-27
Filing date: 1989-05-24
Publication date: 1991-04-04
Anticipated expiration: 2012-09-24
Also published as: WO1989011490A1; AU3740089A; EP0791653A1; GR3034698T3; EP0343950A2; KR900701843A; ATE321134T1; EP0791653B1; DE68929546D1; EP0449828A1; EP0343950B1; EP0791653B9; KR0149012B1; DE68929546T4; EP0343950A3; US5976831A; DE68929256T2; ATE197053T1; DE68929546T2; ES2150898T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＦｃ７レセプター■ 良里至旦互本発明は、一般に治療用化合物に関し、より詳細にはヒト免疫グロブリンＧに対する可溶性および膜結合型の低親和性レセプター、それをコードする被酸、およびこの種のレセプターの診断・治療用途に関する。

！二免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ部分に対するレセプターは細胞性免疫防御において中心的な役割を演する。３種類の前記レセプターが確認されている：単量体１ｇＧに対して高い親和性ヲモつ７２キロダルトン（ｋＤ）レセプターは単球と一部のマクロファージに存在し、単量体ｒｇＧに対して低い親和性をもつ４０　ｋ　Ｄ　Ｉ７セプターは単球、好中球、好酸球、血小板およびある種のヒト腫瘍細胞系列に存在し、そして単量体ＩｇＧに対して低い親和性をもつ５０〜７０　ｋ　Ｄ　Ｉ／セプターは好中球、好酸球、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージに存在する。これらの３種類のＦｃ７レセグターはそれぞれＦｃ７ＲＩ。

Ｆｃ７ＲＩＩおよびＦｃ７ＲＩ［［と呼ばれている：　Ｕｎｋｅｌｅｓｓ　ａｔ　ａｌ、。

Ａｎｎ、Ｒｅｖ、ｌ＋＋＋ｍｕｎｏ１．、　Ｖｏｌ、６．　ｐ、２５１−２８１　（１９８８）。

ＩｇＧ被覆血小板のＦｅ７ＲＩＩ［媒介除去は、過度の出血によっ（ｉｍ＋ｍｕｎｅ　ｆ、ｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ　ｐｕｒｐｕｒａ　；　Ｉ　Ｔ　Ｐ　）の発生において重要な役割を演すると考えられる：　ｖｏｎ　ｄｅｍ　Ｂｏｒｎｅ、　ｐ、２２２−２５６、Ｉｍｍｕｎｏｈａｅｍａｔｏｌｏ　、Ｅｎｇｅｌｆｒｉｅｔ　ｅＬ　ａｌ、、ｅｄｓ、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。

Ａｒｎｓｔｅｒｄａｍ、１９８４）　＠　Ｃ１ａｒｋｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａ＋＋ｙ　Ｅｎ　１ａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｄ、。

Ｖｏｌ、３１４．　ｐ−１２３Ｆｒ１２３９　（１９８６）は、難治性ＩＴＰ患者ヘノリカンド阻正抗Ｆｃ７Ｒｎ［抗体の注入が血小板数の一時的増加をもたらしたと報じている。この観察は、ＩＴＰの大男の有害症状が、ＩｇＧ被覆被覆板小板上合部位を遮断するか又はその結合部位についてＦｃ７ＲＩＩ［と競合する作用物質の投与により、一時的に改善されうろことを示唆している。

臨床免疫学の別の分野において、免疫グロブリンと抗原から成る集合体（いわゆる“免疫複合体”）の血清レベルの上昇は多種多様の疾患、特に全身性エリテマトーデス（Ｓ　Ｌ　Ｅ）や慢性関節リウマチのような自己免疫病と関係している。このような複合体の血清レベルは自己免疫疾患の存在について診断する上で非常に役立っている：例えば、Ｔｂｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ａｍ、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、。Ｃｏ１．１００．　ｐ、５３１−５９１　（１９８０）　。

現在、免疫複合体の血清レベルの検定法には、ある種の補体またはりウマトイド因子蛋白に対する複合体の親和性を利用する固相検定と、免疫複合体を優先的に結合するＲａｊｉ細胞の性Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，＋　１９８６）中のＴｈｅｏｆ　ｉ　１ｏｐｏｕｌｏｓｅｔ　ａｌ、、　ｃｈａｐｔｅｒ　２８およびＴｏＬｈ　ａｔ、　ａｌ、。ｃｈａｐｔｅｒ　２９゜あいにく、哺乳類細胞を土台とした多くの検定法と同様に、Ｒａｊｉ細胞検定法は実施するのが難しく、免疫複合体へのＲａｊｉ細胞結合がもともと可変的であるために精密なコントロールと基準を必要とする。

前述のことを考慮すると、医学社会にとっては、十分に特性決定がなされて、広く入手可能で、容易に培養しうる細胞系列を利用した別の免疫複合体検定法を提供することが有益であるだろう。さらに、もしも可溶性ＦｃＦＲが難治性ＩＴＰの実際的な緊急治療を可能とするに足る量で生産されるならば、それもまた有益であるだろう。

及里五夏旬本発明は、可溶性および膜結合ヒ）Ｆｃ７Ｒｎ［ポリペプチド、それらの変異蛋白、それをコードしうる核酸、並びに前記ポリペプチドおよび変異蛋白の診断・治療用途に関する。

本発明はヒトＦｃ７ＲＩ［［をフードするｃＤＮＡの発見に基づいている。Ｆｃ７ＲＩ［［コード化挿入物（第１図に示す）を含むｃＤＮＡクローン、ｐＣＤ（ＳＲＩ＋）は米国メリーランド州ロックビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号６７７０７として大腸菌に１２株ＭＣｌ０６１により寄託された。

本発明の好適な実施態様は、次式により定義される２重置換および１重欠失配列の群から選ばれたアミノ酸配列を有する蛋白を含む：Ｘ（Ａｒｇ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（入ｓｐ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｐｒｏ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（八ｌａ）　−Ｘ（Ｖａｎ）　− χ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｐｈｅ）　−Ｘ（Ｌ４Ｌｌ）　−。

Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ｐｒｏ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（Ｔｒｐ）　−Ｘ（Ｔｙｒ）　−Ｘ（Ａｒｇ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　− Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ａｓｐ）　−Ｘ（Ｓｉｒ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ｃｙｓ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　− Ｘ（Ｇｌｙ）　−Ｘ（Ａｌａ）　−Ｘ（Ｔｙｒ）　−Ｘ（Ｓ＠ｒ）　−Ｘ（Ｐｒｏ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（ＡＳＰ）　−Ｘ（八ｓｎ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　− Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（Ｔｒｐ）　−Ｘ（Ｐｈｅ）　−Ｘ（Ｈｉｓ）　−Ｘ（Ａｓｎ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ａｓｎ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　− Ｘ（Ｉｌｇ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（Ａｌａ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−ｘ（ｓｅｔ）　−Ｘ（Ｔ）Ｉｒ）　−Ｘ（Ｐｈａ）　 −Ｘ（：ｆｌｅ）　−、Ｘ（Ａｓｐ）　−Ｘ（Ａｌａ）　−Ｘ（Ａｌａ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ａｓｐ）　−Ｘ（Ａｓｐ）　−Ｘ（Ｓｉｒ）　−Ｘ（ｃｌｙ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ｔｙｒ）　−Ｘ（入ｒｇ）　−Ｘ（Ｃｙｓ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ａｓｎ）　−Ｘ（Ｌｅｔユ）　−Ｘ（Ｓｉｒ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｓａｒ）　− Ｘ（入ｓｐ）　−Ｘ（Ｐｒｏ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｇｌｎ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ｖａｎ）　−Ｘ（Ｈｉｓ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　− Ｘ（ａｌｙ）　−Ｘ（Ｔｒｐ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ（Ｌａｕ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）−Ｘ（入１ａ）　−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｘ（Ａｒｑ）　−Ｘ（Ｔｒｐ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｐｈｅ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　 −ｘ（ｃｌｕ）　−Ｘ（入ｓｐ）　−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｘ（工１ｅ）　−Ｘ（Ｈｉｓ）　−Ｘ（Ｌａｕ）　−Ｘ（Ａｒｇ）　−”（ＣＹり　−Ｘ（Ｈｉｓ）　−Ｘ（Ｓａｒ）　−Ｘ（Ｔｒｐ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ａｓｎ）−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（入１ａ）−Ｘ（Ｌａｕ）−Ｘ（Ｈｉｓ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｔｙｒ）　−Ｘ（Ｌａｕ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　− Ｘ（入ｓｎ）　−Ｘ（Ｐ’ｈ＠）−Ｘ（Ｈｉｓ）　−刈工ｌ＠）−Ｘ（ｒ’ｒｏ）−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ａｌａ）−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（入ｓｐ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−Ｘ（Ｇｌｙ）　−Ｘ（Ｓｅｔ）　 −Ｘ（Ｔｙｒ）、＋　Ｘ（Ｐｈｉ）　−Ｘ（Ｃｙｓ）　−Ｘ（入ｒｇ）　−Ｘ（Ｇｌｙ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｇｌｙ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ａｓｎ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｓａｒ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（八ｓｎ）　−Ｘ（Ｉｌｅ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｉｌｅｌ　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（ＧＩＹ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ａｌａ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｉｌｇ）　−Ｘ（Ｓｉｒ）　−Ｘ（Ｓａｒ）　−Ｘ（Ｐｈｉ）　−Ｘ（Ｓａｒ）　−Ｘ（Ｐｒｏ）　−Ｘ（Ｐｒｏ）　−Ｘ（Ｇｌｙ） ×（八ｒｇ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ａｓｐ）　−Ｘ（Ｌａｕ）　−Ｘ（Ｐｒｏ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ａｌａ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　− Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｐｈ＠）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ｐｒｏ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（Ｔｒｐ）　−Ｘ（Ｔｙｒ）　−Ｘ（八ｒ９）　− Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｌａｕ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ａｓｐ）　−Ｘ（Ｓ＠ｒ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｌａｕ）　− Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ｃｙｓ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（Ｇｌｙ）　−Ｘ（入１ａ）−Ｘ（Ｔｙｒ）−Ｘ（Ｓｅｒ）−Ｘ（Ｐｒｏ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）−Ｘ（Ｐｈａ）　−Ｘ（Ｈｉｓ）　−χ（Ａｓｒ＋）　−χ（Ｇｌｕ）　−χ（５ｅｒ）　 −χ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｉｌａ）　−Ｘ（Ｓａｒ）　−Ｘ（Ｓａｒ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−Ｘ（Ａｌａ）　−Ｘ（Ｓｉｒ）　−Ｘ（Ｓａｒ）　−刈Ｔｙｒ）　− Ｘ（Ｐｈａ）　−Ｘ（ＩＩｓ）　−χ（Ａｓｐ）　−Ｘ（入１ａ）　−Ｘ（Ａｌａ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（入ｓｐ）　−Ｘ（Ａｓｐ）　− Ｘ（Ｓａｒ）　−Ｘ（Ｇｌｙ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（ＴＹｒ）　−Ｘ（入ｒｇ）　−Ｘ（Ｃｙｓ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（入ｓｎ）　− Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｓａｒ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｌａｕ）　−ｘ（ｓｅｔ）　−Ｘ（入ｓｐ）　−Ｘ（Ｐｒｏ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　− Ｘ（Ｌａｕ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　−Ｘ（ｖａｌ）　−Ｘ（Ｈｉｓ）　−Ｘ（ＩＩｓ）　−Ｘ（Ｇｌｙ）　−Ｘ（Ｔｒｐ）　−Ｘ（Ａｓｎ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　− Ｘ（入１ａ）−Ｘ（Ｌｅｕ）−Ｘ（Ｈｉｓ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ｐｈａ）　−Ｘ（Ｔｙｒ）　−Ｘ（Ｉｌｅ）　−Ｘ（Ｐｒｏｌ　−Ｘ（Ｌｙｓ）−Ｘ（入１ａ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｌｅｕ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（Ａｓｐ）　 −Ｘ（Ｓａｒ）　−Ｘ（Ｇｌｙ）　−Ｘ（Ｓａｒ）　−Ｘ（Ｔｙｒ）　−Ｘ（Ｐｈａ）　−Ｘ（Ｃｙｓ）　−Ｘ（入ｒｇ）　−Ｘ（Ｇｌｙ）　−Ｘ（Ｌｓｕ）　 −Ｘ（Ｐｈｅ）　−Ｘ（Ｇｌｙ）　−Ｘ（Ｓｉｒ）　−Ｘ（Ｌｙｓ）　−Ｘ（入ｓｎ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−Ｘ（Ｇｌｕ）　 −Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ａｓｎ）　−Ｘ（Ｉｌｅ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｉｌｅ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｇｉｎ）　−χ（Ｇｌｙ）　 −Ｘ（Ｌａｕ）　−Ｘ（Ａｌａ）　−Ｘ（Ｖａｌ）　−Ｘ（Ｓｅｒ）　−Ｘ（Ｔｈｒ）　−Ｘ（Ｉｌｅ）−Ｘ（Ｓｅｒ）−Ｘ（Ｓａｒ）−Ｘ（Ｐｈｅ）−Ｘ（Ｐｈｅ）−Ｘ（Ｐｒｏ）−Ｘ（Ｐｒｏ）　−Ｘ（Ｇｌｙ）式■ ここで、Ｘ　（Ｘ　ａ　ａ　）はアミノ酸Ｘａａに対する同義Ｌ−アミノ酸の群を表す。ある群に含まれる同義アミノ酸は、その群の構成員間の置換がその分子の生物学的機能を保持するように、十分に類似した物理化学的性質を有する：　Ｇｒａｎｔｈａｍ、　５ｃｉｅｎｃｅ。

’１０１．１８５．　ｐ、８６２−８６４　（１９７４）およびＤａｙｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｔ１ａｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　３９７２．　Ｖｏｌ、５．　ｐ−８９−９９゜また、先に示した配列において、特にほんの少数のアミノ酸が欠失されて、しかも機能フンホメーションにとって重要なアミノ酸（例えば、いくつかのシスティン残基）が除去または置換されないならば、生物学的機能を変更することなくアミノ酸の欠失を行うことが可能であることは明白である：　Ａｎｆｉｓｅｎ、“蛋白鋼の折りｌ；たみを支配する原理”、　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、１８１．　ｐ、２２３−２３０　（１９７３）。欠失によりて生じた蛋白および変異蛋白は本発明の範囲内である。本明細書で式Ｉまたは■の蛋白のアミノ酸残基が番号で示されるとき、その番号は蛋白のＮ末端から数えたものである。

各アミノ酸に対する同義アミノ酸の好適な群とより好適な群は表Ｉに示しである。各アミノ酸のそれぞれの群は斜線（１）で区別される。斜線の左側のアミノ酸は最も好適な群を構成する。同一線上のすべてのアミノ酸はより好適な群を構成する。

式Ｉまたは■に関連して本明細書で用いる“Ｎ！置換”とは、ゼローＮ個の置換によって、それぞれ式■または■の天然アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列の群を表し、その際置換用アミノ酸はその置換位置のアミノ酸と同義のアミノ酸の適当な群から選ばれる。すなわち、Ｘ（Ａｌａ）が置換位置にあるとすると、その位置のＡｌａはＳｅｒ％ＴｈｒまたはＧｌｙで置換することができる。

同様に、式Ｉまたは■に関連して本明細書で用いる“８重欠失”なる用語は、アミノ酸のゼローＮ個の欠失によって、それぞれ式■または■の天然アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列の群を表す。

アーゼなどを明記するために標準略号が採用される：例えば、Ｃｏｈｎ、“Ｉ− アミノ酸の命名法および略号表示”、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、１０６．　ｐ、３−１７　（１９８４）　；　Ｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：　Ａ　Ｐｒｏｂｌｅｍｓ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、２ｎｄ　ｅｄ、（Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｍｅｎｌ。

Ｐａｒｋ、　１９８１）　；およびＲｏｂｅｒｔｓ、　”制限エンドヌクレアーゼ名簿”、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、６８．　ｐ、２７−４０　（１９７９）。

同義アミノ酸の好適な群およびより好適な群アミノ酸　同義アミノ酸群Ａｌａ　八ｌａ　Ｓｅｒ　／　Ｔｈｒ　ＧｌｙＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　／　Ｇｉｎ工１ｅＩｌａ　Ｖａｌ　／　Ｌｅｕｌ、ｕＬｅｕ　Ｖａｌ　／　１．１ｅＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｉｒ　Ａｌａ　／　Ｌｙｓ図面の簡単な説明第１図パートＡおよびＢ（２枚のシートを並べて解読するようになっている）は、ｐｃＤ　（ＳＲｇ）−ＧＰ５のｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を示す；第２図は、Ｆｃ７ＲＩＩｌｒ変異体として分泌される、可溶性ヒトＦｃ７ＲＩＩＩを生産するために挿入された停止コドンの相対位置を示す；第３図は、以下の実施例■で生産された可溶性Ｆｃ７ＲＩＩ［のゲル電気泳動分析の結果を示す；および第４図パートＡおよびＢ（２枚のシートを並べて解読するようになっている）は、ｐｃＤ　（ＳＲｇ）−ＮＬＩＯのｃ　ＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列を示す。

発明の詳細な説明本発明は、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に結合しうるポリペプチドをコードする核酸を含む。これらのポリペプチドはヒトＦｃｌＲｍから誘導される。本発明は、ヒ）Ｆｃ７ＲＩ［［の可溶性および膜結合ポリペプチドを含む。これらのポリペプチドおよび他の修飾型は標準蛋白工学技法を使って容易に製造される。

ひとたび天然蛋白の核酸配列および／またはアミノ酸配列が得られると、その天然配列に突然変異を実際上生じさせるためにいろいろな技法が利用可能となるｅ　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２２９．　ｐ、１１９３−１２０１　（１９８５）中で５ｈｏｒｔｌｅは、本発明に適用できる核酸突然変異誘発［例えば、ＺｏＪＩｅｒ　ａｎｃｌ　Ｓ＋ｏｉＬｈ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎインターロイキン −２変異蛋白”と題するＭａｒｋらの米国特許第４５１８５８４号；これらの文献は参照によりここに引用するものとする］、またはいわゆる“カセット”突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ　ｅｔ　ａｌ、。Ｇｅｎｅ、　Ｖｏｌ、３４．　ｐ、３１５−３２３　（１９８５）およびＥｓｔｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２３３゜ｐ、６５９−６６３　（１９８６）に記載錘且ユ姐虹ト旦、　Ｖｏｌ、８３．　ｐ、５９７−６０３　（１９８６）に記載される］によりつくられる。

アミノ酸修飾をもつポリペプチド（すなわち、変異蛋白）はいろいろな状況において望ましいだろう。例えば、好ましくない副作用はある種の変異蛋白によって軽減されるかもしれず、特にその副作用が目的の活性部分と異なるポリペプチド部分に関係している場合はそうである。いくつかの発現系では、天然ポリペプチドはプロテアーゼによる分解を受けやすい。このような場合に、その感受性配列を変更する所定のアミノ酸の置換および／または欠失は収量を相当に高めることができる：例えば、英国特許出願第２１７３−８０４−Ａ号（ここでは、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の２７５位のＡｒｇがＧｌｙまたはＧｌｕで置換される）。また、変異蛋白は精製法においてその収量を高め、かつ／また酸化、アシル化、アルキル化、または他の化学修飾を受けやすいアミノ酸を排除することによって蛋白の貯蔵寿命をのばすことができる。例えば、メチオニンは容易に酸化されてスルホキシドを形成するが、これは多くの蛋白では生物学的活性の減少につながる：例えば、Ｂｒｏｔ　ａｎｄＷｅｉｓｓｂａｃｈ、　Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　Ｖｏｌ、２２３．　ｐ、２７１　（１９８３）。

メチオニンはしばしば生物学的活性をほとんど又は全く減少させない、より不活性のアミノ酸で置換される：例えば、オーストラリア特許出願第ＡＵ−Ａ−５２４５１／８６号。細菌の発現系では、コンホメーション的に必ずしも必要でないシスティン残基を排除または置換することによって、収量増加が時には期待できる：例えば、Ｍａｒｋらの米国特許第４５１８５８４号。

好ましくは、本発明の可溶性形態のＦｃ７ＲＩＩは、Ｆｃ７ＲＩＩＩｃＤＮＡのトランスメンブラン部分と細胞内部分のコード領域に先立って（すなわち、そのコード領域の５′方向または“上流”方向に）停止コドンを導入することによって得られる。これは特定部位の突然変異誘発を使って有利に行われる。トランスメンブラン部分は高い平均疎水度をもつ約２０〜２５浦の残基を含むアミノ酸セグメントの存在によって簡単に同定することができる：例えば、Ｗｉｃｋｎｅｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２１０．　ｐ、８６１−８６８（１９８０）およびＧｒｅｅｎ８ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏ！、、　Ｖｏｌ、４．　ｐ。

６９−９５　（１９８６）。

プラスミドｐｃＤ　（ＳＲ＊）−ＧＰ５は、Ｏｋａｙａｍａ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ。

Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、２．　ｐ、１６１−１７０　（１９８３）およびＶｏｌ、３．　ｐ−２８０−２８９（１９８３）に記載されるｐｃＤシャトルベクターと類似しているが、発現を高めるために、Ｔａｋｅｂｅ　ｅｔ、　ａｌ、、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、８゜ｐ、４６６−４７２　（１９８８）　ｌ：：記載さｔＬ６ＨＴＬＶ　（１）レトロウィルス由来のロング・ターミナル・リビー１− （ＬＴＲ）の部分の下流挿入によって、ＳＶ４０プロモーターが修飾されている。好都合なことに、このプラスミドは大腸菌Ｋ１２株ＭＣ１０６１または同様の宿主内で増殖できる。

本発明のＦｃ７Ｒｍの免疫グロブリンＧ結合特性は標準技術によって測定される；例えば、（１）膜結合Ｆｃ＃Ｒｍの場合には：ＩｇＧ被覆赤血球（ＲＢ　Ｃ）の存在下でロゼツトを形成するか、または熱処理により集合されたヒトＩｇＧを優先的に結合する、Ｆｃ７Ｒｍ　ｃＤＮＡでトランスアエクトされた細胞の能力；または（２）可溶性Ｆｃ７ＲＨの場合には：ヒトＩｇＧを含む免疫吸着カラムにより溶液からＦｃ７Ｒｍを優先的に分離する能力、またはＩｇＧ被覆ＲＢＣとＦｃ７ＲＩＩＩをもつことが知られている細胞とのロゼツト形成を阻止する能力。前者の測定は蛍光標識を付けたヒトＩ　ｇ　Ｇ分子を用いて行うことができる：例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ、　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｂｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、了ｎｃ、、　Ｊｕｎｃｔｉｏｎ　Ｃ１ｔｙ、　ＯＲ，１９８５）　ｏ後者の測定は分離したヒｌ−１ｇ’　Ｇと、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ研究所（Ｒｉｃｂｍｏｎｄ、　ＣＡ）から市販されている活性化セファロースカラムと、からＩｇＧカラムを作製することにより実施できる。

ロゼツト検定は当分野で標準的である：例えば、Ｒｏｓｅ　ｅｔ　ａｌ。

、ｅｄｓ、、　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇＹ＋　３ｒｄ　Ｅｄ。

（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，、１９８６）中のＷｉｎｃｈｅｓｔｅｒ　ｅｔ、　ａｌ、、　ｃｈａｐｔｅｒ　３１゜ひとたび本発明のｃＤＮＡがクローン化されると、広い範囲の発現系（すなわち、宿主と発現ベクターの組み合わせ）を使って本発明蛋白を生産することができる。使用可能な宿主細胞の種類には細菌、酵母、昆虫、哺乳類などが含まれるが、これらに限定されない。発現系を選択して、それによる蛋白生産を最適化するには、以下に挙げる多くの要因を考察して釣合いを取ることが必要である：すなわち（１）発現しようとする蛋白の性質、例えばその蛋白は一部の宿主生物に有毒であったり、宿主プロテアーゼによる分解を受けやすかったり、あるいは不活性なフンホメーシ３ンでまたは宿主内において不溶性の形態で発現されたりする；　（２）対象の蛋白に対応するメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の性質、例えばそのｍＲＮＡはｍＲＮＡの機能的寿命を急激に短くする宿主エンドヌクＩ／アーゼに特に感じやすい配列をもっていたり、あるいは出発コドンやリポソーム結合部位を遮蔽して宿主内での翻訳開始を阻止する二次構造を形成したりする；（３）コード領域に隣接する３′−および５′−領域における宿主適合性の発現調節配列の選択、利用可能性、並びに配置−一これらにはプロモーター、５′−および３′−プロテクター配列、リポソーム結合部位、転写ターミネータ−、エンハンサ−、ポリアデニレート付加部位、キャップ部位、イントロン−スプライス部位などが含まれる；　（４）蛋白が宿主によりプロセッシングされうる分泌シグナル配列をもつかどうか、または宿主に内在するシグナル配列をコードする発現調節配列が成熟蛋白をコードする領域へ移行すべくスプライシングされねばならないかどうか：　（５）宿主のトランスフェクシヨンまたはトランスフォーメーションの利用可能な方式および効率、並びに一時的な発現が望まれるのかあるいは安定した発現が望まれるのか：（６）蛋白発現用の希望する宿主培養系の規模およびコスｌ−；（７）翻訳後修飾が望まれるか、またはどのような種類の翻訳後修飾が望まれるか、例えば希望するグリコジル化の程度および種類は宿主の選択に影響する；（８）発現された蛋白を宿主細胞および／または培地の蛋白や他の物質から容易に分離できるか、例えばいくつかの場合には後続の精製工程を助けるために特殊なシグナル配列をもつ融合蛋白を発現させることが望ましい、例えば５ａｓｓｅｎｆｅｌｄ　ｅｔ、　ａｌ。。

ｅｄｓ、　Ｇｅ　ｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　０ｔｈｅｒ　ｔｈａｎ　Ｅ、ｃｏＩｉ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉｎ、　１９８２）　：および（ｌＯ）当分野で習熟した者に知られた同様な要因。

上記の諸要因を考慮して特定の発現系の選択および／または”修飾を行うための指針を提供する文献が多数利用できる：例えば、ｄｅ　Ｂｏｅｒ　ａｎｄ　５ｈｅｐａｒｄ、″大腸菌による外来遺伝子発現を最適化するための戦略”＋　ｐ、２０５−２４７．　Ｋｒｏｏｎ、　ｅｄ、　Ｇｅｎｅｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８３）は、数種の大腸菌発現系について説明している：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｓＬｒｙ。

Ｖｏｌ、１６．　ｌ５ｓｕｅ　４．　ｐ、３４９−３７９　（１９８４）およびＢａｎｅｒｊｉ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｖｏｌ、５．　ｐ、１９−３１　（１９８３）は、哺乳類細胞にトランスフェクションおよびトランスフォーメーションを起こす方法について述べている；　Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄ、　ｅｄｓ、。

Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　（Ｂｕｔｔｅｒｖｏｒｔｈｓ、　ＢｏｓＬｏｎ＋　１９８６）は、大腸菌、酵母、および哺乳類細胞による遺伝子発現の所定の論題について述べている：そしてＴｈ１ｌｌｙ、　Ｍａｔｎ＋ｎａｌｉａｎ　ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（ＢｕｔｔｅｒｖｏｒＬｈｓ、　Ｂｏｓｔｏｎ＋　１９８６）は哺乳類発現系について説明している。

同様に、特定ｃＤＮＡと発現調節配列を連結および／または操作して、本発明で使用するのに適した発現ベクターを作製および／または修飾するための技術および条件について記載している多くの文献が利用可能である：例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｇｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ研究所、　Ｎ、Ｙ、、　１９８２）　；　Ｇｌｏｖｅｒ、　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ５）；およびＰｅｒｂａｌ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ本発明で使用するのに適した発現系には、Ｉｔａｋｕｒａ　ａｎｄＲ４ｇｇｓの米国特許第４７０４３６２号（細菌発現）　、Ｃ１ａｒｋらの米国特許第４６７５２８５号およびＨａｍｅｒの米国特許第４５９９３０８号（哺乳類発現）、並びにＫｕｒｊａｎらの米国特許第４５４６０８２号（酵母発現）に記載されるものが含まれる。

従って、上記特許は参照によりここに引用するものとする。

ＳＶ４０を出合としたベクター（例えば、ｐｃＤベクター）を使用するとき、好適な宿主はＣ０Ｓ７細胞系列である。これはＧｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ旦、　Ｖｏｌ、２３．　ｐ、１７５−１８２　（１９８１）に記載されており、ＡＴＣＣから寄託番号ＣＲＬ１６５１として入手できる。

本発明の可溶性Ｆｃ７ＲＩ［［はＩＴＰ治療用の薬剤組成物として投与される。

この種の組成物は薬学的担体中に有効量のＦｃ７ＲＩｆｆを含有する。薬学的担体は本発明組成物を患者に与えるのに都合のよい、適合性の、無毒性物質でありうる。一般に、前記薬物の非経口投与に適した組成物はよく知られている：例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、　１５ｔｈ　Ｅｄ、　（ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　１９８０）　ｏまた、本発明組成物は植え込み可能な薬剤デリバリ−システムを使って患者の体内に導入することもできる：例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｔｏｘｉｃｏｌ、、　Ｖｏｌ、２４．　ｐ、１９９−２３６　（１９８４）。

非経口的に投与される場合、可溶性Ｆｃ７ＲＩ［［は薬学的担体と共に注入可能な単位用量形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化されるであろう。このような担体は本来無毒性であって、非治療的である。担体の例は生理食塩水、リンガ−液、デキストロース液、およびハンクス液である。不揮発性油やオレイン酸エチルのような非水性担体も使用できる。好適な担体は５％デキストロース／食塩水である。担体は少量の添加剤、例。

えば等張性および化学的安定性を高める物質（例、緩衝剤、防腐剤）を含んでいてもよい。可溶性ＦｃγＲｍは好ましくは集合体や他の蛋白を実質的に含まない精製形態で、約５〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲、好ましくは約１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲に製剤化される。

ＩＴＰと関連した血小板減少症を改善するのに有効な量の可溶性Ｆｃ７ＲＩ［ｒを患者に与える投薬方式を選択することは、可溶性Ｆｃ７Ｒｍの血清回転率、免疫障害と関連した内因性の競合Ｆｃ７ＲＩ［［の血清レベル、可溶性Ｆｃ７ＲＩ［［の免疫原性などを含めて、いくつかの要因に左右される。好ましくは、投薬方式は患者に与える可溶性Ｆｃ７ＲＩ［［の量を、許容できるレベルの副作用と調和させて、最大限にするようにする。従って、患者に与える可溶性Ｆｃ７Ｒ］ＩＩの量は、使用する個々の可溶性Ｆｃ７Ｒｍおよび治療すべき病気の重症度に幾分か左右される。適切な用量を選択する指針は、可溶性ＦｃγＲｍとほぼ同じ大きさのポリペプチドである抗体および抗体断片の治療用途に関する文献に見いだせる：例えば、Ｆｅｒｒｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、、　Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（Ｎｏｇｅｓ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　Ｐａｒｋ　Ｒｉｄｇｅ。

ＮＪ、　１９８５）中のＢａｃｈ　ｅｔ　ａｌｏ、　ｃｈａｐｔｅｒ　２２；およびＨａｂｅｒ　ｅｔａｌ、、　ｅｄｓ、、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７７）中のＲｕ５ｓｅｌｌ、　ｐ、３０３− ３５７およびＳｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　ｐ、３６５−３８９゜好ましくは、用量は約１−２０ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。

哀五男以下の寅施例は本発明の例示に役立つ。ベクターおよび宿主の選択、並びに試薬の濃度、温度、他の変数の値は、本発明の適用を例示するためのものであり、それを制限するものとして解釈されるべきでない。

好ましくは、安定したＦｃ７ＲＩ［Ｉ発現を可能にする哺乳類細胞系列は、選択マーカーを保有するベクターと宿主適合性プロモーターおよびＦｃ１ＲＴｆｌ　ｃＤＮＡ挿入物を保有するベクターとを使って宿主哺乳類細胞を同時にトランスフェクトすることにより作られる。ｐｃＤ　（ＳＲｓ）−ＧＰ５の場合、適当な宿主にはチャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣｏＳサル細胞、およびマウスＬ細胞、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから寄託番号ＣＣＬ１．３として入手できるチミジンキナーゼ欠損変異株（ｔｋ−）Ｌ細胞が含まれる。選択マーカーは宿主ゲノムに完全に組み込まれたＦｃγＲｍ遺伝子を含む確率が高い宿主細胞を選ぶことを可能にする。一般に、トランスフェクション溶液中のｐｃＤ　（ＳＲｓ）−ＧＰ５対マーカー含有ベクターの比は約１ｏｌｌである。従って、マーカー遺伝子が宿主ゲノムに組み込まれるならば、ｐｃＤ　（ＳＲｓ）−ＧＰ５も一層高い濃度で組み込まれることになるであろう。

また、選択マーカーは復帰変異体細胞が異常増殖しないように目的の形質転換細胞の培養物を守る手段を提供する。

ｔｋ−マウスＬ細胞に、ｐｃＤ　（ＳＲｓ）−ＧＰ５とｐＳＶ２ｔｋ（ＳＶ４０初期プロモーターの支配下ｊ二あるチミジンキナーゼ遺伝子を保有するｐＳＶ２プラスミド）とを使って同時にトランス７工クシ厘ンを起こさせる。ｐ　Ｓ　Ｖ　２プラスミドはＭｕｌｌｉｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２０９．　ｐ、１４２２−１４２７　（１９８０）、およびＳｕｂｒａｍａｎｉ　ａｔ　ａｌ、、　Ｎｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｌ−１，ｐ、８５４−８６４　（１９８１）に記載されており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ肩ンから寄託番号３７１４６として入手できる。

両方のプラスミドは大腸菌、例えばＡＴＣＣから寄託番号３３６９４として入手できるＨ８１０１株中で増幅させ、塩化セシウム平衡遠心により精製する。ｌＯ％ウシ胎児血清を含むダルベツコ修飾イーグル培地（ＤＭＥ）１０ｍ　Ｉ中の約ｌＸｌ０’のｔｋ−Ｌ細胞の浮遊液をファルコン３００３培養皿に入れ、５％炭酸ガス定温器を使って３７℃で２０時間培養する。その後、培地を新しいｌＯ％ウシ胎児血清含有ＤＭＥ　１０ｍ１と取り替え、この培養物をさらに４時間インキュベートするゆインキュベージ１ン後、０．５ｍｌの溶液Ａ（５０ｍＭヘベス、２８０ｒｎＭ　ＮａＣｌ、１．５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，２２）と０．５ｍｌの溶液Ｂ（２ＭＣ＋ｌＣＩ！、ｌＯｕｇ　＄）ＣＤ　（ＳＲＩ＋）−ＧＰ５、ｌｕｇ　ｐＳＶ２　ｔ　ｋ）を培地に加え、この培養物を５％ＣＯ３雰囲気中３７℃で２４時間インキュベートする。その後、細胞はＨＡＴを含む選択培地（例えば、Ｓｔｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）におく、２週間後、生存しているコロニーを限界希釈によりサブクローニングし、クローンはＦｃ７ＲＩＩｒの発現について検定する。

本発明のＦｃｌＲｍを発現する安定したー乳類形質転換細胞は、免疫複合体の検定においてＲａｊｉ細胞系列と置き換えることができる：例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ｃｈａｐｔｅｒ　２８゜）ｊａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔ、ｏｒｙ　ｌｌｌＩｌｍｕｎｏｌｏｇｙ、３ｒｄ　Ｅｄ。

（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ，１９８６）。

ヒトＩｇＧに対する抗血清はウサギを使って調製し、硫酸アンモニウム沈澱とその後のアニオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セルロース　５２；　Ｗｈａｔｍａｎ　ＣｈｅｍｉｃａｌＳｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｌｔｄ、。

Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、　Ｅｎｇｌａｎｄ）での分画化によりＩｇＧ画分を単離する。市販の抗血清も使用できる。抗血清のＩｇＧ画分は５　ｍ　ｇ　／　ｍｌとなし、１ｍ＋を＋２Ｊで標識する。

ヨウ素化および透析後、約３×１０″ｃｐｍ／μｇの比活性とするために、抗血清はリン酸緩衝溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で１ｍｇ／ｍｌに希釈する。Ｆｃ７Ｒ１１ｒ　ｃＤＮＡにより形質転換された細胞は７２時間培養後収穫し、培地２００μｌ中の２×ｌＯ“細胞の部分を１．５ｍｌプラスチック製エッペンドルフ巴錐チューブ（ＢｒｉｎｋＩＩｌａｎｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　Ｎ、Ｙ、；カタログ番号２２−３６−４１１−１）に入れる。

各チューブにスピナー培地（Ｃａ”とＭｇ”を含まないイーグル最少培地）１ｍｌを加え、細胞を８００Ｘｇで８分遠心する。上清を吸引し、細胞ベレットをスピナー培地５０μｍ中に再度浮遊させる。試験すべき血清は０．１５Ｍ　ＮａＣ１，（生理食塩水）で４倍に希釈し、２５μＩを形質転換細胞に加える。５〜ｌＯ分ごとに手で穏やかに撹拌しながら３７℃で４５分間インキュベートシタ後、細胞はスピナー培地で３回洗う。最終洗浄後、５〜ｌＯ分ごとに穏やかに撹拌した細胞は、１０ｇ／Ｉのヒト血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）を含むスピナー培地で希釈しｊ；Ｉ！＋ｌニー標識ウサギつヒｌ−Ｉ　ｇ　Ｇと４℃で３０分反応させる。インキュベージ１ン後、細胞を３回洗い、上溝を完全に吸引して途さ、そして細胞ペレットの放射能をガンマカウンターで計測する。検定はすべて２通り行う。絶対カウント数、インプットの百分率、または抗体のマイクログラム数として表される取込み量は、いろいろな量の集合ヒトＴ、　ｇ　Ｇ　（ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　：　Ａ　ＨＧ　）を含む正常ヒト血清（補体源）とインキュベートした細胞による放射、性抗体取込みの標準曲線を参照する。

血清中の免疫複合体の量は希釈係数について補正した後のＡＨＧの量に等しいと考えられ、血清１ミリリツトル当たりのＡＨＧ同等物のマイクログラム数として表される。可溶性ＡＨＧは生理食塩水１ｍｌ当たり６．５ｍｇのコーン７ラクシヨン（Ｃｏｂｎ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）　Ｉｆまたは単離したヒトＩｇＧの溶液から形成され、６３℃で３０分加熱し、遠心して不溶性の大きい集合体を除く。その後、上溝は緩衝液で希釈して最終濃度を約１．６ｍｇ／ｍｌとする。この調製物のアリコート（０，５ｍ１）は−７０℃で保存され、１力月程度も使用することができる。

放射性抗体取込みの標準曲線は次のように作成される。ＡＨＧの５０μｍ部分く蛋白８０μｇ）を食塩水で連続的に希釈する（１１の２倍希釈物）。次に、新たに得られた、または−７０℃で保存した、正常ヒト血清（補体源）の２倍希釈物５０μｍを各ＡＨＧ希釈物に加え、慎重に混合し、３７℃で３０分インキュベートする。その後、各混合物２５μｌを２通りずつ２×ｌＯ暢細胞に加える（２０ μｇから約２０ｎｇまでのＡＨＧを含む血清の４倍最終希釈物）；この混合物をインキュベートし、洗浄し、放射性標識抗体ど反応させる。その後、テスト血清と同様に放射能を計測する。正常ヒト血清の４倍希釈物（基準曲線における補体源として使用）２５μｌとインキュベートした細胞による放射性抗体取込みの基底線（バックグラウンド）も作成される。

最近、ＩｇＧ集合体の標準調製物と破傷風トキソイド−ヒト抗破傷風トキソイド免疫複合体の標準調製物が国際免疫学者協会の援助の下に開発され、スイス赤十字社輸血サービスから入手できる：例えば、Ｎｙｄｅｇｇｅｒ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｃｌ１ｎ、Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

Ｖｏｌ、５８．　ｐ、５０２−５０９　（１９８４）。

実施例■、可溶性ヒトＦｃ７ＲＩＩＩの構築可溶性Ｆｃ７ＲＩＩ［は、ｐｃＤ　（ＳＲｔ）−ＧＰ５のＦｃ７Ｒ’ｍｃＤＮＡ挿入物のオリゴヌクレオチドにより誘導される特定部位の突然変異誘発を使つて構築した。ｐｃＤ　（ＳＲｔ）−ＧＰ５の全ｃＤＮＡ挿入物は、２．４キロベースのＢａｍＨＩ断片としてブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）　Ｋ　Ｓプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）にサブクローニングし、その後−末鎖ＤＮＡを調製した。

ＴＡＡ停止コドンとＢａｍＨ１部位をコードする合成オリゴヌクレオチド（最小寸法約１８ヌクレオチド）（第２図に太字体で示す突然変異を含む）は、ＤＮＡポリメラーゼＩ大型断片（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）を使う相補鎖合成のためのプライマーとして使用した。第２図には、ＦｃｌＲｍｃＤＮＡによりコードされる主要ドメインに対する停止コドンとＢａｍＨ１部位の位置が示しである：Ｓはシグナルペプチドをコードする領域を表し、ＥＣはＦｃ７Ｒ］Ｉ［の細胞外ドメインをコードする領域を表し、ＨはＦｃ７ＲＩ［［の疎水性、すなわちトランスメンプラン、ドメインをコードする領域を表し、そしてＣは細胞質ドメインをフードする領域を表す。第２図に示すように停止コドンを導入すると、細胞質ドメインとトランスメンブランドメインの両方を欠失した変異体Ｆｃ７ＲＩ［［が生成される；これは修飾ＤＮＡ配列のそばに略称”５Ｆｃ７ＲＩ［［”で示されるように可溶性である。この変異体の本性をＤＮＡ配列”解析により確認した後、それをｐｃＤ（ＳＲｇ）ベクターのＢａｍＨ１部位にサブクローニングし、大腸菌内で増幅させ、そしてエレクトロボレーシ」ンによりＣ０Ｓ７細胞にトランスフェクシヨンを起こさせた。トランスフェクションの１日前に、１００ｍｍ培養皿当たり（１，５〜２．０）ＸＩＯ ’個程度のＣ０８７サル細胞を、６％ウシ胎児血清と２ｍＭグルタミンを含むダルベツコ修飾イーグル培地（ＤＭＥ）にまいた。トランスフェクシヨンを実施するために、トリプシン処理により細胞を収穫し、計数し、無血清ＤＭＥで２回洗い、無血清ＤＭＥ中に（１〜７）　Ｘ　ｌ　Ｏ＠／ｍ　１の細胞を浮遊させた。

ＤＮＡを加えて２５μｇ／ｍｌとなし、この混合物を室温で１０分放置し、その後０．８ｍｌに０．４ｃｍ滅菌キュベツト中でＢｉｏ　Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）シーンパルサーを使って２５０Ｖ、９６０マイクロフアラツドのパルスをかけた。パルス電圧をかけた後、細胞は１０分放置し、（１，５〜２．０）ＸＩＯ＠／１００ｍｍ培養皿で６％ウシ胎児血清含有ＤＭＥにまいた。７２時間後、上滑を回収して可溶性Ｆｃ７ＲＩ［ｒについて検定した。

Ｃ０Ｓ７培養上溝中の可溶性ＦｃｌＲｍはゲル電気泳動によりさらに分析し、免疫沈降させた。この結果は第３図に示しである。レーン１，３および６はそれぞれ、可溶性ＦｃｌＲｍｃＤＮＡを保有するｐｃＤでトランスフェクトしたＣ０Ｓ７細胞の培養上清からの蛋白を含む。レーン１の蛋白は非特異的マウスＩｇＧ、抗体により免疫沈降された：レーン３の蛋白は、おそらく抗体のＦｃ部分と可溶性ＦｃｌＲｍとの結合により、ヒトＩｇＧにより免疫沈降された；そしてレーン６の蛋白はＦｃｌＲｍの細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体３Ｇ８により免疫沈降された。対照レーン（レーンｌ）に隣接するサイズマーカーはキロダルトンである。可溶性Ｆｃ７ＲＩ［Ｉは約４０キロダルトンの゛幅広バンドに一致する。レーン４および７は、可溶性Ｆｃ７ＲＩＩＩ　ｃＤＮＡを保有するｐｃＤでトランスフェクトしかつツニカマイシンの存在下で培養したＣ０Ｓ７細胞の培養上清からの蛋白を含む。ツニカマイシンは蛋白へのＮ結合炭水化物の翻訳後結合を阻害する。これは４０キロダルトンバンドの見掛は上の不均一性の本性を調べようとして使用された。

第２図に示すように、ツニカマイシンはより低分子量の２つのバンドを出現させ、これは可溶性Ｆｃ７ＲＩＩｒの脱グリコジル化と一致する。ツニカマイシンはＭａｒｔｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　８４：　８０９−８１３　（１９８７）に記載の通りに培養物に加えた。レーン２および５はそれぞれ、レーン３と４およびレーン６と７のＣｏＳ細胞と同じ遺伝子操作（ただし、プラスミドＤＮＡはトランス７エクシーンの手順に含まれなかった）を受けたＣＯ５７細胞の培養上清からの蛋白を含む。

ｃＤＮＡライブラリーは、ヒト・ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞系列より抽出したｍＲＮＡから、ｐｃＤ（ＳＲｇ）発現ベクターを使って作製された。このライブラリーは、ランダムプライムＤＮＡラベリング（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ。

１ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）により３１ｐで放射性標識した、ｐｃＤ（ＳＲｇ）　−ＧＰ５のｃＤＮＡ挿入物由来のプローブを使ってスクリーニングした。ヒトＩｇＧ結合活性を示すクローンｐｃＤ（ＳＲｅ）−ＮＬＩＯが得られた。ｐｃＤ　（ＳＲｇ）−ＮＬＩ　ＯのＣＤＮＡ挿入物の配列は第４図に示しである。このＦｃ７Ｒｍのアミノ酸配列とｐｃＤ　（ＳＲｇ）−ＧＰ５によりコードされるアミノ酸配列とは、細胞外ドメインにおいてたった６個のアミノ酸が相違するだけで、非常に類似していることが分かる。

本発明実施態様の前記記載は例示および説明のために提供された。それらは本発明を網羅するものではなく、また本発明を開示された細部に限定するものでもない。明らかに、前記の教示を考慮して多くの修正および変更が可能である。実施態様は本発明の原理およびその実際的使用を最もよく説明するために選択して記載してあり、これにより当分野で習熟した者は様々な実施態様において、意図する特定用途に合うような修正を施して、本発明を最大限に利用することができる。本発明の範囲はここに添付の請求の範囲によって定められるものとする。

出願人はｐｃＤ　（ＳＲｇ）−ＧＰ５を米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシａン（ＡＴＣＣ）に受託番号６７７０７として寄託した。この寄託は微の培養物寄託に関するＡＴＣＣ協定により提示された条件の下に行われ、これは寄託物が３５Ｕ、Ｓ、Ｃ，１２２および３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，１，１４に従って米国特許商標局長官に利用可能となり、そして米国特許の発布の際には一般の人々に利用可能となることを保証し、また寄託物を維持することを命じている。

寄託された菌株が利用可能となることは、特許法に従って担当行政機関により許可された権利に違反して本発明を実施するための許可として解釈されるべきではない。

ｒＶａｌＬｙｓＴｈｒＡ＊ｎ工１ｅＥｎｄＦＩＧＵＲＥ　Ｉ　ＰＡＲＴ　Ａ７０　＋１　９０ＣＴＡＧＴＴＴＣＡＣＣＴにＧＣＡＴＣＣＣＧ人ＣＴＧ人ＡＧ人ＴＣＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＬ、＠ｕＶａｌＳｅｒＡｌａＧｌｙＭ＠を人ｒｇＴｈｒＧ：１ｕＡｓｐＬ＊ｕＰｒｏＬｙ−人１ａＶａｌＶａＡＡＧＴＧＣＣ人ＣＧＣＡＣＣＣＴ人ＣＴＣＣＣＣＴＧ人ＣＣ人Ｃ人人ＴＴＣＣ人ＣＡＣ人ＣＴにＧＴ’ｒＴＬｙｓＣｙｓＣ１ｎＧｌｙ人１ａＴｙｒＳ＊ｒＰｒｏＧ１ｕＡ＊ｐＡ＊ｎＳ七ｒＴｈｒＣ１ｒ＋τｒｐＰｈｅＡＣＡＧＴＣＣＡＣＧＡＣλＧＴＧにＡＧ人ＧＴＡＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＡＡＡＣＣＴＣＴＣＣ人ＴｈｒＶａｌＡｓｐ人−ｐｓ＠ｒＧｌｙＧｌｕＴｙｒＡｒｇＣｙｓＧｌｎＴｈｒＡｓｎＬ＊ｕＳｅｒＴ人人ＴＯτＧＴＯ’ｒ’ｒＣＡＣ人Ｇ人ＣＴＣＴＣＡＡＣＡＴＣＡＣＣ人τＣＡＣＴＣＡＡＣＧＴＴＴＣ：０人−ｎＶ８ｓ＠ｒｓ＊ｒｃ１ｕＴｈｒＶａ１人−ｎ工１＊ＴｈｒニューτｈｒＧｌｎＧｌｙＬ＊ｕ人し＊ｕｖａ１Ｍ＊ｔ’／ａｌＬ＊ｕＬ＊ｕＦ’ｈａ人１ｍＶａｌ＾５ｐＴｈｒｃｌｙＬ龜ｕＴｙｒＰｈｓｓ＊ＦＩＧＵＲＥ　Ｉ　ＰＡＲＴ　ＢＬＩＯＦＩＧＵＲＥ　３　ＰＡＲＴ　ＡＬＩＯＦＩＧＵＲＥ　３　ＰＡＲＴ　Ｂ手続補正書平成　２年１１月２７日

Claims

【特許請求の範囲】

１．可溶性または膜結合ヒトＦｃＩＲＩＩＩから成る蛋白。
２．ヒトＦｃＩＲＩＩＩの細胞外ドメインから成る、請求項１記載の蛋白。
３．次式により定められる２重置換および１重欠失配列より成る群から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項１記載の蛋白：【配列があります】または【配列があります】ここで、Ｘ（Ａｌａ）はＡｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＧｌｙを表し；Ｘ（Ａｒｇ）はＡｒｇまたはしｙｓを表し；Ｘ（Ａｓｎ）はＡｓｎ、ＡｓｐまたはＳｅｒを表し；Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐ、ＧｌｕまたはＡｓｎを表し；Ｘ（Ｃｙｓ）はＣｙｓであり；Ｘ（Ｇｌｎ）はＧｌｎまたはＧｌｕを表し；Ｘ（Ｇｌｕ）はＧｌｕ、ＡｓｐまたはＧｌｎを表し；Ｘ（Ｇｌｙ）はＧｌｙ、ＡｌａまたはＳｅｒを表し；Ｘ（Ｈｉｓ）はＨｉｓまたはＡｓｎを表し；Ｘ（Ｉｌｅ）はＩｌｅ、ＶａｌまたはＬｅｕを表し；Ｘ（Ｌｅｕ）はしｅｕ、ＶａｌまたはＩｌｅを表し；Ｘ（Ｌｙｓ）はしｙｓ、ＡｒｇまたはＡｓｎを表し；Ｘ（Ｍｅｔ）はＭｅｔまたはＬｅｕを表し；Ｘ（Ｐｈｅ）はＰｈｅであり；Ｘ（Ｐｒｏ）はＰｒｏまたはＡｌａを表し；Ｘ（Ｓｅｒ）はＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＧｌｙまたはＡｓｎを表し；Ｘ（Ｔｈｒ）はＴｈｒ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＬｙｓを表し；Ｘ（Ｔｒｐ）けＴｒｐであり；Ｘ（Ｔｙｒ）はＴｙｒであり；そして，Ｘ（Ｖａｌ）はＶａｌ、Ｉｌｅ、ＡｌａまたはＬｅｕを表す。
４．前記群は前記式の１重置換配列より成る、請求項３記載の蛋白。
５．前記式中：Ｘ（Ａｌａ）はＡｌａまたはＳｅｒを表し；Ｘ（Ａｒｇ）はＡｒｇを表し；Ｘ（Ａｓｎ）はＡｓｎまたはＡｓｐを表し；Ｘ（Ａｓｐ）はＡｓｐまたはＧｌｕを表し；Ｘ（Ｃｙｓ）はＣｙｓであり；Ｘ（Ｇｌｎ）はＧｌｎであり；Ｘ（Ｇｌｕ）はＧｌｕまたはＡｓｐを表し；Ｘ（Ｇｌｙ）はＧｌｙまたはＡｌａを表し；Ｘ（Ｈｉｓ）はＨｉｓであり；Ｘ（Ｉｌｅ）はＩｌｅまたはＶａｌを表し；Ｘ（Ｌｅｕ）はＬｅｕまたはＶａｌを表し；Ｘ（Ｌｙｓ）はしｙｓまたはＡｒｇを表し；Ｘ（Ｍｅｔ）はＭｅｔであり；Ｘ（Ｐｈｅ）はＰｈｅであり；Ｘ（Ｐｒｏ）はＰｒｏであり；Ｘ（Ｓｅｒ）はＳｅｒ、ＡｌａまたはＴｈｒを表し；Ｘ（Ｔｈｒ）はＴｈｒ、ＳｅｒまたはＡｌａを表し；Ｘ（Ｔｒｐ）はＴｒｐであり；Ｘ（Ｔｙｒ）はＴｙｒであり；そしてＸ（Ｖａｌ）はＶａｌまたはＩｌｅを表す請求項３記載の蛋白。
６．前記群は前記式の１重置換配列より成る、請求項５記載の蛋白。
７．次のアミノ酸配列を有する請求項６記載の蛋白：【配列があります】または【配列があります】
８．可溶性または膜結合ヒトＦｃＩＲＩＩＩをコードすることができる核酸。
９．次式により定義される２重置換および１重欠失配列から選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる、請求項８記載の核酸：【配列があります】または【配列があります】ここで、Ｘ（Ｘａａ）により表される各種アミノ酸は請求項３で定義した意味を有する。
１０．次式から選ばれるポリペプチドをコードすることができる、請求項９記載の核酸：【配列があります】
１１．有効量の可溶性ヒトＦｃＩＲＩＩＩを投与することから成る、ヒトにおける免疫血小板減少性紫斑病の治療方法。
１２．前記投与段階は約１〜２０ｍｇ／ｋｇ（前記ヒトの体重）／日の範囲の量の前記可溶性ヒトＦｃＩＲＩＩＩを静脈投与することを含む、請求項１１記載の方法。
１３．サンプル中の免疫複合体を検出する方法であって：細胞の表面に発現されるＦｃＩＲＩＩＩをコードするｃＤＮＡ挿入物を保有するベクターにより形質転換された細胞を用意し；免疫複合体を含むサンプルに該細胞をさらし、これにより免疫複合体をＦｃＩＲＩＩＩによって細胞の表面に結合させ；細胞の表面に結合している免疫複合体を標識し；そして細胞に結合している標識された免疫複合体の量を測定する；各工程から成る方法。
１４．前記細胞はマウスＬ細胞またはＣＯＳサル細胞であり、前記ベクターはｐｃＤ（ＳＲ■）−ＧＰ５およびｐｃＤ（ＳＲ■）−ＮＬ１０から選ばれる、請求項１３記載の方法。