JPH03501574A - 走化性ペプチドによる走化性の刺激 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチドによる　の１ 肢丘公立 本研究の一部は、国立衛生研究所からの補助金により支援されたものであり、そ の結果として政府は本発明について一定の権利を有する。

本出願は、米国特許出願番号０７１０１３．３４３号（１９８７年２月１１日出 願）（現米国特許４，６９３，７１８号）の一部継続出願である。

なお、上記出願は米国特許臼１１０６１７９３，２２５号（１９８５年１０月３ １日出願）の継続出願である。

！！茨土 本発明は走化性刺激に関し、と（に人工臓器に関する。

主皿旦閲丞 血管を人工臓器により置換す；ことは、現代の血管外科において重要かつ共通の 業務となっている。ある用途には、患者の体の他の部位からとられた静脈又は動 脈が使用されるけれども、多（の人工臓器は、種々の大きさに調製され、かつす ぐに使用に供するよう照面状態で保存された人工材料から調製される。

心臓血管用人工材料には下記に示すようにいくつかの重要な性質がある： １、　血栓症及び塞栓症の防止（抗トロンボゲン性）；λ　血液細胞に対する最 少の損傷及び最少の血液細胞癒着性： ３、人工挿入物として長寿命；及び、 ４、天然血管の物理的、化学的性質、たとえば同等の弾性率及び引張強さを有す る高い順応性。

他の有用な特性は、人工臓器を新たに合成された内部弾性環膜により徐々に置換 し、及び／又は統合することにより、血管壁を修復するよ・う結合組繊細胞の内 皮化及び侵入をひき起す走化性反応である。

人工血管として最も普通に使用される繊維はダクロン（Ｄａｃ−ｒｏｎ）　（商 品名、デュポン社製）から作られる。ダクロンは、ポリエチレンテレフタレート から得られる合成ポリエステル繊維である。ダクロンは、いくつかの織物に、ま た他の材料と組合せて使用されてきた。しばしば使用される材料の例としては、 デバキーエラスティソクダクロン（ＤｅＢａｋｅｙ　ＥｌａｓｔｉｃＤａｃｒｏ ｎ）布ＣＣ，Ｒ，バード社の一部門であるＵＳＣ工製）があげられる（カタログ 番号００７８３０）　、その他、通常使用される材料としては、フェルト化した ポリウレタン、及びポリテトラフルオロエチレンがあげられる（Ｂｅｒｋｏｗｉ ｔｚ他、Ｓｕｒｇｅｒｙ　７２＋２２１（１９７２）　；Ｗａｇｎｅｒ他、Ｊ、 Ｓｕｒｇ、Ｒｅｓ、　＋上、　５３（１９５６）；ｇｏｌｄｆａｒｂ他、Ｔｒａ ｎｓ、Ａａ＋、Ｓｏｅ、Ａｒｔ、Ｉｎｔ、Ｏｒｇ、、ＸＸＩＩＩ、　２６８（１ ９７７））。通常、これらの材料には、走化性物質は併用されていない。

その他の人工臓器として最近開発されたものには、Ｙａｎｒ＋ａｓａｎｄ　Ｂｕ ｒｋｅ　Ｊ、Ｂｉｏｍｅｄ、Ｍａｔ、、Ｒｅｓ、１４＋６５−８１（１９８０） に開示される人工皮膚がある。人工皮膚は、組成物としてコラーゲン／グリコサ ミノグリカン（ＧＡＧ）を有し、皮膚全厚損傷の代替物とするテストで成功を収 めたものである。上記皮膚膜は、長期間にわたり、拒絶反応や交換の必要又は他 の侵入操作なしに感染や体液流失を効果的に防止してきている。適切に設計され た上記人工皮膚は、傷の収縮を阻止してきた。そして、人工皮膚は、その少なく とも一部は、新たに合成された結合組織により置換される。さらに、この人工皮 膚についてはＹａｎｎａｓ他、皿上ｚ　１０７〜１３Ｈ１９８０）　、及びＤａ ｇａｌａｋｉｓ他、皿上ル５１１〜５２８（１９８０）にも記載されている。走 化性を存する合成物質は、普通、これらのものとともに使用されてはいない。

繊維芽細胞の人工臓器への侵入を促進するある物質は、血小板由来成長因子（Ｐ ＤＧＦ）であり、有力な繊維芽細胞の化学誘引剤である。残念ながら、ＰＤＧＦ は合成することができず、血小板から得なければならないため、この種の物質を 大規模に利用することは非現実的である。

最近、米国特許第４，６０５，４１３号に記載されているように、走化性ペプチ ドがトロポエラスチン中で固定された。この物質は、式ＡＰＧＶＧＶ及びその活 性置換体ＶＧＶＡＰＧで示され、ｂ−アミノ酸を繰返し単位として有する走化性 ペプチドであり、ここで、Ａはアラニンを、Ｐはプロリンを、Ｇはグリシンを、 ■はヴアリンをそれぞれ表わす。この物質は容易に走化性を示し、また人体に本 来備わっているものであることから、生体内テス）　（ｉｎ　ｖｉｖｏ）での使 用に特に適しているが、たとえば細胞の特異性、感受性に関し、走化性刺激の面 でさらに改良する余地がある。

したがって、繊維芽細胞及び内皮細胞を人工臓器に誘引し、上記窓器を再生天然 組織への合体を促進することが可能な人工の、及び合成の容易な走化性物質が要 求されてきている。

Ｈるための　のｂ したがって、本発明の目的は、繊維芽細胞及び内皮細胞に対し走化性を有する合 成物質を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、皮膚や血管壁などの再生組織と容易に合体する人工臓 器を提供することにある。

本発明のさらに別の目的は、従来のものよりもはるかに高い刺激活性を有する走 化性物質を提供することにある。

本発明のこれら、及びその他の目的は、後述するごとく容易に明らかとなるが、 走化性を刺激する方法を提供することにより達成された。上記方法は、下記式で 示される走化性ペプチドを人工臓器層へ、該層に対する走化性を増大させるに十 分な量導入することからなる： 弐Ｂ’−Ｘ−（ＡＧＶＰＧＬＧＶＧ）ｎ−（ＡＧＶＰＧＦＧＶＧ）ｍ−Ｙ−Ｂ” ここで、ＡはＬ−アラニンのペプチド形成残基であり；ＰはＬ−プロリンのペプ チド形成残基であり；Ｇはグリシンのペプチド形成残基であり；■はＬ−ヴアリ ンのペプチド形成残基であり；ＦはＬ−フェニルアラニンのペプチド形成残基で ありｉＬはＬ−ロイシンのペプチド形成残基であり；ＢｌはＨｌ又は生体相容性 のＮ−末端基であり；ＢｌはＯ）Ｉ、　Ｂｌが非毒性の金属イオンを示すＯＢ３ 、又は生体相容性のＣ−末端基をそれぞれ表わし； ＸはＧＶＰＧＦＧＶＧ、　ＧＶＰＧＬＧＶＧ、　ＶＰＧＦＧＶＧ、　ＶＰＧＬＧ ＶＧ、　ＰＧＦＧＶＧ。

ＰＧＬＧＶＧ、　ＧＦＧＶＧ、　ＧＬＧＶＧ、　ＦＧＶＧ、　ＬＧＶＧ、　ＧＶ Ｇ、　ＶＧ、　Ｇ、又は共有結合であり；ＹはＡＧＶＰＧＦＧＶ、　ＡＧＶＰＧ ＬＧＶ、　ＡＧＶＰＧＦＧ、　ＡＧＶＰＧＬＧ。

ＡＧＶＰＧＦ、　ＡＧＶＰＧＬ、　ＡＧＶＰＧ、　ＡＧＶＰ、　ＡＧＶ、　ＡＧ 、　Ａ　、又は共有結合、であり；ｎは０〜５０の整数であり；ｍはＯ〜５０の 整数であり；ただし、ｎ及びｍがともにＯの場合、Ｘ及びＹは、ＸとＹとが組合 される位置において化走化性ペプチドが少なくとも３つのアミノ酸残基を有する ように選ばれる。

本発明はまた、前記の方法により調製された走化性マトリックスと人工臓器とか らなるものである。

図面の簡単な説明 添付図面と関連させて下記の詳細な説明を参照すれば、本発明のより完全な理解 とそれに付随する多くの利益とが得られるであろう。

第１図はＡＧＶＰＧＦＧＶＧに対する繊維芽細胞の走化性量応答を示すグラフで ある。

第２図はＧＦＧＶＧＡＧＶＰに対する繊維芽細胞の走化性量応答を示すグラフで ある。

第３図は繊維芽細胞のヒト血小板由来成長因子に対する反応による走化性量を示 すグラフである（比較例）。

第４図は繊維芽細胞のＶＧＶＡＰＧに対する反応による走化性量を示すグラフで ある（比較例）。

第５図は、ＰｈｅとＬｅｕとを含むノナペプチドの２５ＭＨｚ　、　２９°Ｃで のＤＭＳＯ−ｄ、中の１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルである。ここでａはＨ−ＧＦ ＧＶＧＡＧＶＰ−０１（ｂはＨ−ＧＬＧＶＧＡＧＶＰ−０）１である。

第６図は、囚人動脈内皮細胞単一層の典型的な相対照像である。これらは「丸面 」の分散パターンを示している。Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬと共にインキュベーショ ンの後、細胞は斑点のある蛍光分散パターンを示す。これは、受容体に媒介され る内部細胞を経由して細胞に吸収されたＬＤＬ標識誘導体の細胞内での局在を示 している。すべての細胞は、細胞間に一般に存在する着色濃度の変動にともなっ て、照査基準に対し明確な蛍光標識を示している。

第７図は、囚人動脈内皮細胞のエラスチンの繰返しを有するノナペプチドに対す る反応による移行を示す。ここで、ＧＦＧＶＧＡＧＶＰは−・−テ、ＧＬＧＶＧ ＡＧＶＰ　は−・−テ示されティる。

正味のフィブロネクチンの移行はり、ｐ、ｆ、当り３０細胞について−・−で、 ｈ、ｐ、ｆ、当り４６細胞については曲線−・−で示されている。バックグラウ ンドの移行は、２種のノナペプチドに対しり、ｐ、ｆ、当りの細胞数がそれぞれ ３８及び９５であった。

第８図は、囚人動脈内皮細胞のエラスチンの繰返しを有するノナペプチド、ＶＧ ＶＡＰＧに対する反応による移行を示す。フィブロネクチンの正味の移行は、ｈ 、ｐ、ｆ、当り２８細胞であり、このときバックグラウンドの移行はり、ｐ、ｆ 、当り３８細胞であった。

好遣ユ止」■お工疲咀 本発明は、血管壁や、ヒトや動物の有する靭帯等の弾性物質に存在する弾性繊維 の構造に関する研究の結果として生まれた。血管壁、皮膚、肺、及び靭帯等の弾 性繊維の中心部は、トロポエラスチンと呼ばれる単一の蛋白質から得られる。血 管壁からとり出されるトロボエラスチンのポリペプチド連鎖は、Ｓａｎｄｂｅｒ ｇと彼の共同研究者とにより、ヘキサペプチド（Ａ１ａ＝Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａ ｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ）ｎの繰返し、ペンタペプチド（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｕｙ− Ｖａｌ−Ｇｌｙ）の繰返し、及びテトラペプチド（Ｖａｌ−Ｐｒ。

−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）の繰返しを含むものと示されている。

ここで、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ　、及びＧｌｙはそれぞれアラニン、プロリン 、ヴアリン、及びグリシンアミノ酸残基を示す、（本出願においてペプチドは、 標準的な実務慣行に従い、ＮＨ！末端アミノ酸残基を式の左側に、右側にＣｏ！ Ｈ末端アミノ酸残基を書くことにより表現する。）へキサペプチド高分子は合成 されるものであるが、それはセロファン様のシートを形成する。

したがって、ヘキサペプチドは天然材料中で構造的な役割を占めているものと考 えられている。

しかしながら、最近の研究によれば、ヘキサペプチドやその配列置換物は、生体 系において弾性繊維前駆体蛋白質を合成する繊維芽細胞に対し走化性を有するこ とが示唆されている。上記発見、及び天然材料の種々の置換物についての関連す る研究の結果として、ヘキサペプチド連鎖を基礎とする合成材料が米国特許４， ６０５，４１３号に開示、クレームされている。

トロボエラスチンに関する研究がさらになされ、ノナペプチドが単一連鎖中に４ 回繰返し存在していることが明らかにされている。

上記繰返し単位を基礎とする材料の特性の研究により、上記連鎖を有する合成材 料がさきに見い出されたヘキサペプチド連鎖を基礎とする合成材料よりもむしろ 高い活性ををする有力な走化性薬品であることが示されたウノナベブチドは、そ の最大活性点において、３０ｎｇ／ｍの血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）　と同 等の活性を示す。したがって、ノナペプチドは、さきに見い出されたヘキサペプ チドと同様、十分に有力なものであり、その活性をヘキサペプチドの場合と同様 もしくは若干低い濃度で実現するものである。再生組織へ合体するよう設計され た人工臓器が、下記式の走化性ペプチドを合体させることにより処理される場合 、弾性繊維を有する合成繊維芽細胞及び／又は内皮細胞の浸入の促進が期待され る：式Ｂ’−Ｘ−（ＡＧＶＰＧＬＧＶＧ）ｎ−（ＡＧＶＰＧＦＧＶＧ）ｍ−Ｙ− Ｂ”ここで、ＡはＬ−アラニンのペプチド形成残基であり；Ｐはし一プロリンの ペプチド形成残基であり；Ｇはグリシンのペプチド形成残基であり；ＶはＬ−ヴ アリンのペプチド形成残基であり；ＦはＬ−フェニルアラニンのペプチド形成残 基でｔ＃）；ＬはＬ−ロイシンのペプチド形成残基であり；ＢｌはＨｌ又は生物 相容性のＮ−末端基であり；Ｂ２は０Ｈ１Ｂ３が非毒性の金属イオンであるＯＨ ３であり；ＸはＧＶＰＧＦＧＶＧ。

ＧＢＰＧＬＧＶＧ、　ＶＰＧＦＧＶＧ、　ＶＰＧＬＧＶＧ、　ＰＧＦＧＶＧ、　 ＰＧＬＧＶＧ、　ＧＦＧＶＧ、　ＧＬＧＶＧ。

ＦＧＶＧ、　ＬＧＶＧ、　ＧＶＧ、　ＶＧ、　Ｇ、又は共有結合であり；ＹはＡ ＧＶＰＧＦＧＶ。

ＡＧＶＰＧＬＧＶ、　ＡＧＶＰＧＦＧ、　ＡＧＶＰＧＬＧ、　ＡＧＶＰＧＦ、　 ＡＧＶＰＧＬ、　ＡＧＶＰ、　ＡＧＶ。

ＡＧ、　Ａ　、又は共有結合、であり；ｎは０〜５０の整数、ｍは０〜５ｏの整 数であり；ただしｎ及びｍがともに０の場合、Ｘ及びＹは、Ｘ及びＹが組合され る位置において走化化性ペプチドが少なくとも３つのアミノ酸残基を有するよう に選ばれる。このようにして、人工臓器層は、人工走性ペプチドの濃度勾配の供 給源となる。

単離された１（−ＡＧＶＰＧＦＧＶＧ−ＯＨのようなノナマー及びポリノナペプ チドは、ともに走化性特性を有する。ノナペプチド、Ｈ−ＧＰＧＶＧＡＧＶＰ− ＯＨＬよ、Ｈ−ＡＧＶＰＧＦＧＶＧ−ＯＨと実質的に同等の走化性活性を示した 。走化性活性は他の配列、すなわちＨ−ＧＶＰＧＦＧＶＧＡ−ＯＨ。

Ｈ−ＶＰＧＰＧＶＧＡＧ−０１１，Ｈ−ＰＧＦＧＶＧＡＧＶ−０）１．　Ｈ−Ｆ ＧＶＧＡＧＶＰＧ−０１（、Ｅｌ−ＧＶＧＡＧＶＰＧＦ−ＯＨ，Ｈ−ＶＧＡＧＶ ＰＧＦＧ−ＯＨ，及びＨ−ＧＡＧＶＰＧＦＧＡ−０）！、　ニツィテも期待され る。ポリノナペプチドが存在するとき、化合物（多分、生体内テスト（ｉｎ　ｖ ｉｖｏ）での酵素反応により得られるフラグメントの形をとっている）は、ｎ又 はｍの値に関係なく走化性を示す、しかしながら、操作の容易さのためには、ま た分子量の大きな化合物は溶解性に限界があり、がっ操作性に難があるため、ｎ 及びｍの和は１００以下であることが好ましい。

ｎ及びｍの好ましい値はそれぞれ１〜１ｏであり、５前後が最も好ましい。

Ｂ１及びＢ！はそれぞれＨ及びＯＨであることが好ましい。上式より、本発明の ペプチドはｎによって関連づけられるノナペプチドの繰返しと、ｍにより関連づ けられるペプチドの繰返しとから成り立ちうろことがみてとれる。ｎが０１がっ ｍが１以上のとき、得られる化合物は米国特許出願筒７９３，２２５号、現米国 特許第４．６９３，７１８号に記載のものと同一である。ｎ及びｍがともにＯの とき、Ｘ及びＹは、得られる走化性ペプチドがＸ及びＹの位置で少なくとも３つ のアミノ酸残基を有するように選ばれる。さらに好ましくは、ｎ及びｍが０のと き、Ｘ及びＹは、得られるペプチドがＸとＹとが組合される位置に少なくとも５ つのアミノ酸残基を有するよう選ばれる。さらに好ましくは、走化性ペプチドは ５〜４０のアミノ酸残基を育するものが選択される。ペプチドが５つのアミノ酸 を有するとき、それはＧＦＧＶＧであることが好ましい。最も好ましくは、走化 性ペプチドは９つのアミノ酸残基を有する。ｎは１以上であることも好ましい。

また、ｍがＯよりも大きいとき、ｎは１以上、又はＸもしくはＹがロンシン残基 を含む残基であることも好ましい。最も好ましくは、ｎが１、かつｍが０である 。

ポリノナペプチドが前記のいかなるノナペプチドモノマーを用いても合成されう ろことに注意すべきである。かように、ポリノナペプチドは一般に、ｒｉ’−（ ｍ返し単位）ｎ−Ｂ”構造をとる。ここで、Ｂ１及びＢ２は後に議論する末端基 を表わす。繰返し単位は、前記ノナマーの任意の置換配列でよい。実際、走化性 ペプチドがノナペプチド「モノマー」からは合成されず、むしろ成長中のペプチ ドへのアミノ酸の連続付加により合成される場合（たとえば自動ペプチド合成機 中、又は人工遺伝子の使用による）、繰返し単位の設定は、ある程度任意になさ れる。たとえば、ペプチド、Ｈ−ＧＦＧＶＧＡＧＶＰＧＦＧＶＧ／ＩＧＶＰＧＦ ＧＶＧＡＧＶＰＧＦ−Ｏｆ（は、数あるうちの下記のいかなる繰返し単位及び末 端基からでも構成されるものと考えられる。

Ｈ−（ＧＦＧＡＧＡＧＶＰ）　３−ＧＦ−ＯＨ，Ｈ−Ｇ−（ＦＧＶＧＡＧＶＰＦ Ｇ）　３−Ｆ−ＯＨ９Ｈ−ＧＦ−（ＧＶＧＡＧＶＰＧＦ）　ｘ−ＯＨ，Ｈ−Ｇ− （ＦＧＶＧＡＧＶＰＧ）　３−Ｆ−ＯＨ，Ｈ−ＧＰ−（ＧＶＧＡＧＶＰＧＦ）　 ５−ＯＨ，Ｈ−ＧＦＧ−（ＶＧＡＧＶＰＧＦＧ）　ｚ−ＶＧＡＧＶＰＧＦ−ＯＨ ，Ｈ−ＧＦＧＶ−（ＧＡＧＶＰＧＦＧＶ）　２−ＧＡＧＶＰＧＦ−ＯＨ、又は、 Ｈ−ＧＦＧＶＧ−（ＡＧＶＰＧＦＧＶＧ）　、−ＡＧＶＰＧＦ−ＯＨ。

走化性ペプチドの合成は、ペプチド化学者により簡単かつ容易になされる。得ら れるペプチドは、−ｉにＢ’−（繰返し単位）ｎ　（繰返し単位）ｍ−Ｂ”の構 造を有する。ここで、Ｂｌ及びＢ２は、それぞれ分子末端のアミノ基及びカルボ キシル基に対し化学的相容性を有する任意の末端基を表わす。そして、ｎ及びｍ ！！Ｏ〜約５０である。ＢｌがＨｌかつＢ２がＯ）Ｉのとき、ｎは１、ｍはＯで あり、化合物はノナペプチドである。ｎ又はｍが１より大きいとき、化合物はポ リノナペプチド（ここでは、しばしばポリペプチドとして言及されてきている） である。１つ以上のアミノ酸残基又は通常のポリノナペプチド配列には存在しな いアミノ酸残基の断片が、得られる分子の走化性が完全に失なわれない限り、ポ リノナペプチド鎖中に散在している可能性がある。前記式及び下記の議論によっ て明確に示されるごとく、本発明はノナマー又はポリノナペプチドのより大きな ペプチド鎖への合体をも包含する。ここでは、Ｂ１及びＢ２はより大きなペプチ ド鎖の残余を表わす。

Ｂ１及び８２末端基の他の例として、遊離アミノ基、カルボキシル基、もしくは その塩を有するペプチド繰返し単位の一部、ポリペプチド合成中に存在した、又 はポリペプチド形成後に付加された生体相容性基を有するブロック基を担持する ペプチド又はアミノ酸単位、などがあげられる、ブロック基の例としてはｔ−ブ チロキシカルボニル、フォルミル、分子のアミノ端及びメチルエステル等のエス テルに対するアセチル、及びアミド、たとえば分子の酸端に対するアンモニア、 メチルアミンのアミド、等があげられる。末端基は決定的なものではなく、要す るにペプチドの走化性を破壊せず、また分子に生体非相容性を賦与しないかぎり 、いかなる有機又は無機基であってもよい。本出願において用いられる生体相容 性なる語は、問題とする成分が、移植が必要とされる人工臓器と同程度又はそれ 以上に有害である程度に、それが移植された有機体を傷つけないことを意味する 。

ポリペプチドポリマーの調製法は、Ｒａｐａｋａ及びＩＪｒｒｙ、　Ｉｎｔ。

Ｊ、Ｐｅ　ｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、旦９７　（１９７８）　、　Ｕ ｒｒｙ他、Ｂｉｏｃｈｅｉｎｉｓｔｒ　、−１３，６０９（１９７４）、及びＵ ｒｒｙ他、Ｊ、１１ｏ１．Ｂｉｏｌ、、　９６．１０１（１９７５）等に開示さ れており、それらはここにおいて引用されている。

これらのペプチドの合成は、ここに開示されるどのペプチドによっても簡単かつ 容易に変性されうる。下記の要約は、これらに限られるものではないが、ポリペ プチド合成の一般的方法の一例を示すものである。

本発明のポリノナペプチド形成の第１ステツプは、通常ノナペプチドモノマーの 合成である。ペプチド分子を製造するいかなる古典的方法も、本発明のポリマー のブロック構築のために使用できる。たとえば、ベンジル（Ｂｚβ）エステルｐ −トシレートとしてＣ末端アミノ酸を出発物質とする古典的溶液技術により合成 がなされうる。それぞれの連続するアミノ酸は、その水溶液カルボジイミド及び ｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾールによって成長中のペプチド鎖に結合する。使 用されるカルボジイミドの代表例としては、１−（３−ジメチルアミノプロピル ）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ４）があげられる。カッ プリング反応中、アミノ基は保護されている。それから、保護基は濃縮の行なわ れた後、除去される。好適な保護基はｔ−ブチロキシカルボニル（Ｂｏｃ）であ り、これはトリフルオロ酢酸により容易に除去される。

ヘキサペプチドモノマーの合成において最初に得られる生成物は、保護基を有す るノナペプチドである。たとえば、Ｂｏｃ−Ｌ’　Ａｌａ−Ｇｌｙ−ビＶａｌ− Ｌ’　Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌ’　Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌ’　Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚ ｌである。上記モノマーは、たとえばベンジルエステルをｐ　−二トロフェニル エステルに置換する、たとえばｐ−ニトロフェニルトリフルオロアセテートに効 率的に交換しかつＢｏｃ　保護基を除去することにより、反応性モノマーに変換 される。

得られる反応性モノマーは、必要に応じトリメチルアミンのような塩基は存在下 で重合され、ポリペプチドが得られる。

Ｈ−Ｖａｌ−ＯＭｅ等のブロック基が所望に応じ残存するＰ−ニトロフェニルエ ステルを非反応性末端基に変換するために、重合反応の終点に加えられてもよい 。

本発明のポリペプチド中に存在するすべてのアミノ酸は対応するＤＮＡコードン を有するので、ポリペプチドは、所望のアミノ酸配列に対応するコードンを含む 合成遺伝子を用いる遺伝子工学によっても製造されうる。

修飾化学構造や所望される場合、たとえば、ポリノナペプチド間、又は人工臓器 構造のペプチド形成部とポリペプチド鎖との間の架橋がなされる場合、側鎖基の ブロックされたりジン又はグルタミン酸（又は保護基除去後架橋可能な保護側鎖 基を有する他のアミノ酸）が、ポリペプチド鎖中に存在する通常のアミノ酸に代 えて利用されうる。類似構造を有するポリペンタペプチドの化学架橋合成につい ては、米国特許第４．１８７．８５２号に開示されており、ここで参照されてい る。

本発明の走化性ペプチドは、走化性が刺激される表面に共有結合的に付着してい る必要はない。

ペプチドは表面又は層中に存在していれば十分である。したがって、本発明で使 用される「表面又は層中への導入」の語句は、それが結果として化学結合を形成 しているかどうかにか＼わらず、本発明の走化性ペプチドを表面に付加するすべ ての方法を包含する。たとえば、ペプチドを含む溶液又は懸濁液は、人工臓器の 表面に塗布されうるし、又は臓器は走化性ペプチド溶液中に浸され、また走化性 ペプチド中で膨潤処理され、そして臓器マトリックス中に走化性ペプチドを残存 させ、水を排出して収縮される。

走化性ペプチドと人工臓器との間に共有結合を形成させることも可能である。た とえば、前記のごとく走化性ペプチドの合成中に、反応性のカルボキシル又はア ミノ末端基を有する種々の中間体が製造される。再生組織中に合体される多（の 人工臓器は、コラーゲン又は関連する材料から調製され、そのため、アミノ基、 カルボン酸基等の遊離アミン官能基を含む。ペプチド結合は、人工臓器の上記官 能基と前記反応性中間体との間で容易に形成される。

本発明において使用できる人工臓器のタイプはとくに制限されない。なぜなら、 走化性特性はペプチドに関係し、人工臓器そのものには関係しないからである。

しかしながら、人工臓器は、人工静脈、動脈、皮膚等の再生組繊に導入されるよ うなものであることが好ましい。人工の皮膚や血管壁を形成するのに有用な種々 の人工臓器について開示する公知文献は、本明細書の「光里立青景」欄に記載さ れており、これらが参照されている。

本発明の好ましい二つの形態としては、走化性ペプチドと、米国特許第４．２８ ０．９５４号に記載のコラーゲン／グリコサミノグリカン組成物を人工皮膚とし て使用する場合、及び前記ペプチドと、米国特許第４，１８７．８５２号、米国 特許出願第３０８，０９１号（１９８１年１０月２日出願）、及び米国特許出願 第４５２．８０１号（１９８２年１２月２３日出願）等に記載のポリペプチドを 基礎とする生体相容性を有する人工材料とを使用する場合、があげられる。なお 、上記すべての文献はここで参照されている。これらはペプチドを含む材料であ り、走化性ポリペプチドは、上記方法によってこれらの材料と共有結合により容 易に付着される。しかしながら、さきに示したごとく、共有結合は、走化性ペプ チドが人工臓器の表面又は気孔中に単に存在するにすぎない場合にも走化性かえ られることから、必要ではなく、むしろ実際上は好ましものではない。他の構造 のペプチドを含む表面を有する人工臓器もまた、その他のタイプの表面を有する 人工臓器より好ましい。もっとも、ダクロンやその他の合成繊維等、他のタイプ の表面は明確に含まれているわけではあるが。例としては鍵、靭帯等の天然材料 （たとえば、これらは同−生体中で、ある箇所から他の箇所へと移動する）、及 び合成、もしくは半合成材料があげられる。半合成材料は、コラーゲンのような 天然材料を処理することにより得られる。

特定の人工臓器に必要な走化性ペプチドの量は筒車な試験により容易に決定され うる。一般に、必要な走化性ペプチドの量はきわめて少ない。たとえば、走化性 を有さない表面に、表面での値として０．１ｍＭ〜１００ｒ＋Ｍの低濃度の走化 性ペプチドをドープすれば十分である。一般にこの目的のためには、表面１００ ｅＪ当り１０−９〜１Ｏ−３ｖ＋＋ｏｌのノナマー又はポリノナペプチドの繰返 し単位で十分である。走化性ペプチドの濃度としては、反応細胞において１０− １０〜１０−６？ｌが好ましく、１０°９〜１０〜７Ｍであることが好ましい。

前記の代替物、又は添加物として、本発明の走化性ペプチドを含む２成分の合成 バイオエラストマー、及び米国特許第４．１８７，８５２号に記載の弾性ポリペ ンタペプチドもしくはポリテトラペプチドが、種々の目的に利用されうる走化性 バイオポリマーとして作用する。本発明の走化性ペプチドは、米国特許出願第５ ３３，５２４号、現米国特許第４，５８９，８２２号に記載のごとく、合成バイ オエラストマーの天然架橋を含む系で使用されることも可能である。上記出願は 、リシルオキシダーゼにより酵素架橋されたバイオエラストマーを開示しており 、ここで参照されている。

前記の開示は、本発明を一般的に記述するものである。下記の実施例を参照する ことにより本発明はより完全に理解されうる。下記実施例は説明のためのみに供 されるものであり、記載内容のみに限定されるものではない。

実施例１ 繊維芽細胞と２種の本発明のノナペプチドとの走化性反応が以下に述べる方法に より測定される。

且料及堕力悲 未塁点隻！生供給皿 Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓモディファイド・イーグル媒体（ＤＭＥＭ）、非必須アミノ 酸、Ｌ−グルタミン、胎児牛血清、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液：　Ｇ ＩＢＣＯ、ジャグリン、オハイト。トリプシン１−３００８１ＣＮ　、クリーブ ランド、オハイオ。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）−ナトリウム塩：　Ｓ ｉｇｍａ　、セントルイス、Ｍｏ、ヒト血清アルブミン（）ＩｓＡ）　：アメリ カ国立赤十字、ワシントンＯ，Ｃ，。ヘマトキシリン：ハーレコ、ギブスタウン 、ＮＪ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）　：　Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンデ ィエゴ、ＣＡ、ポリカーボネート膜：ヌクレオボアツー１．．プレヂントン、Ｃ Ａ、硝酸セルロース膜：　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅコーポレーション、ベッドフォー ド、ＭＡ。

皿ｍ ２継代の牛胎児靭帯ヌッチェ（ｎｕｃｈａｅ）繊維芽細胞培養物を、Ｄｕｌｂｅ ｃｏ’ｓモディファイドイーグル（ＤＭＥ）媒体−１０％の牛胎児血清、２ｉＭ のし一グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸ペニシリン（１００ｕ　／　ｕ ｄｌ　）　、ストレプトマイシン（１００ｉ／ｄ）を含む−の入った７５ｃＪの プラスチック製組織培養フラスコ中で増殖した。これらの２縫代細胞培養物ば、 Ｒ，１１，５ｅｎｉｏｒとＲ，Ｂ。

１１ｅｃｈａｍ　（ワシントン大学、セントルイス、ＭＯ）により提供されたｌ 継代細胞培養物から得られた。靭帯ヌッチェに移植片は、根、胎後１８０日以上 の牛胎児から得られた。血小板由来成長因子が牛胎児血清中に存在する可能性が あるため、細胞は４８時間の断食の後収納された。培養後１〜２日で、細胞は） ・リプシン（ｐ）１７．４の０．０２５％のトリプシン、０．１％のＥＤＴＡを 含むフォスフェート塩水緩衝液）に分散され、さらに２ｍＭのグルタミン、０， １１の非必須アミノ酸、及び１　ｍｇ　／　ｍｌのヒト血清アルブミンを含む第 ２のＤＭＥ媒体中で二度洗浄した。細胞濃度はヘモシトメーターにより決定され 、最終濃度が１．５×１０５細胞／ｄとなるよう調整した。細胞は走化性検定の ために使用された。

走化二挟定 走化性実験には変形ボイデンチャンバーを改良した３０大の多室穴プレートを使 用した。上室及び下室の仕切りには０．４５−の硝酸セルロース膜上に重ねられ た８−のポリカーボネート膜が使用された。８坤膜には繊維芽細胞の付着を促進 するために５％ゼラチンにより前処理が施された。下室は、走化性ペプチドを含 む、又は含まない０．２４ｄの第２のＤＭＥ媒体を含み、又は含まない０．２４ ｄの第２のＤｌｉＥ媒体を含み、一方、上室には繊維芽細胞を含む０．３７ｄの 第２のＤＭＥ媒体を含む。

χチェッカー板検定においては、 上室にもペプチドが加えられた。充填板は高温インキュベ−ター中に３７°Ｃ， ＣＯ□雰囲気下で６時間放置された。その後、細胞懸濁液が吸引され、膜が回収 された。エタノール中で定着され、）Ｉａｒｒｉｓ’Ａ１ｕｍ　、ヘマトキシリ ン中で着色され、第１級プロパツール中で脱水素され、さらにキシレン中で洗浄 された。２つの膜間の細胞移動範囲の定量は明視野対物、接ＩＮレンズを備えた ４００倍光学顕微鏡によりなされた。ｌ実験条件当り３組の膜があり、１組当り ５つのランダムに選択された視野が調べられた。それぞれの実験には媒体のみに よるネガティブコントロールと血小板由来成長因子による陽性の対照が、下室に 設けられた。

高倍率視野での細胞数をポリカーボネート膜を通過して移動した正味の細胞数と して第１図〜第３図及び第１表〜第２表に示した。

下室中で媒体のみとともに移動した細胞数は、ペプチドの１つと反応して移動し た細胞数から減じた。

五−上一表 繊維芽細胞によるＡＧＶＰＧＦＧＶＧのチェック板分析１Ｏ−Ｉ＋９±２．３　 ５±１．６　５±１．２　−２±１．１結果は、平均±Ｓ、Ｅ、Ｍ、とじて表わ される（ｎ＝１５）。陽性対照、６０ＩＩｇ／ｄ＝２１でのＰＤＧＦ。

茅−」Ｌ−表 繊維芽細胞によるＧＦＧＶＧＡＧＶＰのチェック板分析フィルター上のペプチド 濃度（Ｍ） 結果は、平均±Ｓ、Ｅ、Ｍ、とじて表わされる（ｎ＝１５）。陽性対照、３０１ ！ｇ／ｄ＝５９でのＰＤＧＦ。

５１±土金底 基本分析はミカナル、テニスコンＡｚにより行なわれた。すべてのアミノ酸はグ リシンを除きＬ配座をとる。ｔ−ブチロキシカルボニル（Ｂｏｃ）アミノ酸とア ミノ配ベンジルエステル（Ｂｚｌ）　とはＢａｃｈｅｍ、　Ｉｎｃ、　＋トーラ ンス、ＣＡ、から購入した。

Ｗｈａ　ｔｍａｎ　、　Ｉ　ｎｃ、　、　ＮＪから得たシリカゲル板上で薄層ク ロマトグラフィーを行ない、異なる溶媒系でのＲｆ値をめた。Ｒｆ’　クロロフ ォルム（Ｃ）、メタノール（Ｍ）、酢酸（Ａ）、９５：５　：　３、　Ｒｆ２Ｃ ＭＡ　（８５：　１５　：　３　）　、　Ｒｆ’ＣＭ八　（７５：２５：３）　 、Ｒｆ’酢酸エチル、酢酸、エタノール（９０：　１０　：　１０）。ヘキサペ プチドは、５ｅｎｉｏｒ他、Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．９９　；　８７０〜８７４ （１９８４）の記載に従がい合成し、精製した。ノナペプチドの合成は溶液法に より行なわれた。それを下記のスケムｌ及び２に示す。

スケム　Ｉ Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙス ケム　２ Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｎ、　Ｐｒ。

ＣＦ３Ｃ０２Ｈ−Ｈ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ　（ＩＩ　）　：　Ｂ ｏｃ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｕｙ−ＯＢｚｌ（Ｉ）（１０，０ｇ　、　２３．７２ ｍｎｏ＋）を１００雌のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）とともに１時間撹拌し、減 圧下で溶媒を除去した。残渣をトリチュレートしエーテルにて、濾過し、エーテ ルで洗浄し、乾燥してブロックされていないペプチドを９．４ｇ（収率：９１％ ）得た。

Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−シａｌ−ＧＬｙ−ＯＢｚｌ　（ｍ　）　：　Ｂｏｃ− Ｐｈｅ−ＯＨ（９，１６ｇ　。

３４．５４ｍｍｏｌ）を１００ｍＩｌのジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）中に 溶解し、０°Ｃに冷却してＮ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ）　（３，８３戚） を添加した。溶液を一１５°Ｃに冷却し、インブチルクロロフォーメー）　（Ｉ ＢＣＦ）（３，９６ｄ、３０ｎｍｏｌ）を、撹拌上温度を一１５±１°Ｃに保ち 徐々に添加した。上記温度で撹拌を１５分間行なった後、予備冷却された■の溶 液（９，４ｇ、２１．５９　ｍｍｏｌ）とＮＭＭ（２，４ｄ）とをＤＭＦ（４０ ｄ）中に添加し、水浴温度にて２時間撹拌を続けた。Ｋ）Ｉｃ（ｈの飽和溶液を ｐＨ８，０とするよう添加し、さらに３０分間撹拌した。反応混合物を冷却した ９０％飽和ＮａＣ１溶液（Ｌｏｏｍ）中に注入し、得られた沈澱を濾過し、飽和 ＮａＣＲ５及びｔ（，０で洗浄し、乾燥した。酢酸エチルによりペプチドを結晶 させ、■を１０ｇ得た（収率：　８１．５％）。Ｒｆ”は０．８３、Ｃ１゜Ｈ４ ゜Ｎ４０７の分析計算値：０６３゜３５　、ｌ（７，０９、Ｎ　９．８５％。実 測値：　Ｃ６２，９６、Ｈ７，３７、Ｎ　９．８６％。

Ｈｏｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（ＩＶ）　：　Ｉ ｆに７いて述べた方法によりｍ　（８，０ｇ、１４ｎｍｏｌ）のブロックを除去 し、無水過剰混合法によりＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨにカップリングさせた。■で述 べた方法により標記の化合物を収率９８．６％にて得た。Ｒｆ！０．７５、Ｃ３ ２）１４３ＮｓＯ８の分析計算値ＨＣ６１，４２、Ｈ６，９２、Ｎ　１１゜１９ ％。

実測値ＨＣ６１，１２、ｌ（７，２１、Ｎ　１１．１９％。

Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ （Ｖｌ）　：　Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｖ）　（２９）　（１，８９ｇ 、６．０２ｍｍｏｌ）　と１−ヒドロキシヘンシトリアゾール（ＨｏＢｔ）　（ ０，９２ｇ　、　６．０２ｍｍｏｌ）をＤＩＩＦ（２０ｄ）中に添加し、水塩凍 結混合物により冷却し、１（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボ ジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣＩ）（１，１５ｇ、６．０２ｍｍｏｌ）と１５ 分間反応させた。■をＨについて述べた方法によりブロック除去し、このブロッ ク除去ペプチドの水冷溶液（３，５ｇ、５，４ｍｍｏ１）とＮ？１Ｍ（０，６１ ｄ）をＤｌ’ｌＦ（２０ｍ）中に添加し、それを上記活性酸成分中に添加し、室 温にて２日間撹拌した。減圧下で溶媒を除去した。残渣をクロロフォルム中にと り、水、２０％クエン酸、水、飽和ＮａＨＣＯ３、水にて洗浄し、無水Ｍｇ５Ｏ ，上で乾燥して所望のペプチドを得たく３．４ｇ１収率：　７５．７％）　、　 Ｒｆ’　０．２７、Ｒｆ”　０．７１、Ｃ＊ｚＨｓｑＮＪ＋。の分析計算値：Ｃ ６１，３６％、Ｈ７，２３、Ｎ　１１．９３％、実測値：Ｃ６１，２５、Ｈ７， ６６、Ｎ　１２．０８％。

Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ　（ＶＩＡ）　：上記ペプチドは、■の合成 について述べた無水混合法により調製された。収率８１％、Ｒｆ’　０．２４、 Ｒｆ’０．９２　、ＣｌＪｔ４ＮｚＯｓの分析計算値：　Ｃ６０，１６、Ｉ（７ ，１３、Ｎ　８．２５％。実測値：　Ｃ５９，６８、）Ｉ　７．１７．８８．０ ９％。

Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＨ（■）：■（１６，９７ｇ　、　５０ｍｍｏｌ） を氷酢酸中にとり、触媒として４０ｐｓｉの１０％Ｐｄ／ｃの存在下に一晩水素 化した。

触媒をシーライトを用いて濾過し、減圧下で溶媒除去した。

残渣を飽和ＮａＨＣＯ３溶液にとり、ＥｔＯＡｃ（３χ）により抽出し、冷却し 、ｐ）１２．０となるよう酸性化し、ＥｔＯＡｃ　（３Ｘ）により再抽出した。

　ＥｔＯＡｃの組合された抽出物は飽和ＮａＣｌで洗浄し、減圧下で濃縮した。

残渣をＥｔＯＡｃ　：石油エーテル（１：１）によりトリチュレートし、得られ た沈澱を濾過、石油エーテルで洗浄、乾燥した（１０．９　ｇ、収率：　８７． ５％）　、　Ｒｆ’０．５２、Ｃｌ０ＲＩＩＮ！Ｏ５・１／２ＨｚＯの分析計算 値：　Ｃ４６，５０、Ｈ７，４Ｌ　Ｎ１０．８４％。実測値：　Ｃ４６，６４、 ）Ｉ　７．４１、Ｎ　１０．８４％。

Ｂｏａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ− Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（ＩＸ）　：■をＥＤＣＩ／ＨＯＢｔを用いて■の調製につい て述べた方法によりブロック除去した■とカップリングさせて所望のペプチドを 収率８４．８％で得た。　Ｒｆ”０．７６　、Ｒｆ’　０．２８、Ｃ４７Ｈ６？ Ｎ９０１２の分析計算値：　Ｃ５９，２２、Ｈ７，０８、Ｎ　１３．２２％。実 測値：Ｃ５８゜７３、Ｈ７，５５、Ｎ　１３．１４％。

Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｇ　Ｉｙ−Ｖａ　１−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａ 　１−Ｇ　１ｙ−ＯＨ（Ｘ）　：■で述べたごとく、ノナペプチドベンジルエス テル（ＩＸ）を水素化し、定量収率で酸を得た。Ｒｆ’０．２４、Ｃ４ｏ１（ｏ ＋ＮＪ＋ｚ　’　ＨｚＯの分析計算値：　Ｃ５５，０９、Ｈ７，１６、Ｎ　１４ ．３％。実測値：　Ｃ５４，６９、）１７．１６、Ｎ　１３．８１％。

ＨＣＯｚＨ−）１−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ −Ｖａｔ−Ｇｌｙ−ＯＨ（ＸＩ）　：Ｘ（２０ｍｇ、０．０２３ｍｍｏ１）を９ ５〜９７％のギ酸（０，６ｄ）とともに６時間撹拌し、減圧下で濃縮した。残渣 を蒸留水にとり、凍結乾燥して定量収率にて製品を得た。Ｒｆ３０．６５゜これ により最初の配列の合成を完了した。

Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ（ＸＩ［［）　：第２配列 を得るために、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ（χ■）をＴＦＡを用いてブ ロック除去し、■で述べたごとく、■とカップリングさせ、保護テトラペプチド を収率６７．４％にて得た。Ｒｆ２０．８０　、Ｒｆ’０．８０　、　ＣｒｖＨ ａｏＮａＯ７の分析計算値：　Ｃ６０，５４、Ｈ７，５２、Ｎ　１０．４６％。

分析値Ｃ６０，８０、Ｈ７，５３、Ｎ　１０．５６％。

Ｂｏａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ− Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ（ＸＶ）　：　ＴＦＥを用いＸＩ［をブロック除去した後、塩 をＥＤＣＩ／１０！Ｉｔを用いてＸＩＶとカップリングさせ、■の調製と同様に 操作を行なった。

標記の化合物を収率７５．５％にて得た。Ｒｆ”０．５７　、　Ｃ４７Ｈ＆？Ｎ ９０１ｇの分析計算値：　Ｃ５７，０６、Ｈ７，２３、Ｎ　１２．７４％。実測 値：Ｃ５４，２３、Ｈ７，１０、Ｎ　１２．７４％。

Ｂｏｃ−Ｇ　ｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｙ−Ｖａ　ｌ−Ｇ　ｌｙ−Ａｌａ−Ｇ　１ｙ −Ｖａ　１−Ｐｒｏ−ＯＨ（Ｘ　Ｖｌ　）　：上記ペプチドχＶをｘ■の調製に ついて述べた方法により水素化し、定量収率にて製品を得た。Ｒｆ’０．２２　 、　Ｃ４゜Ｈ＊＋ＮｅＯ，アの分析計算値：　Ｃ５５，６６、Ｈ７，１２、Ｎ　 １４．６０％。実測値：　Ｃ５５，８６、Ｈ７，２３、Ｎ　１４．１４　％。

１（ＣＯｚＨ−Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ −シａｌ−Ｐｒｏ−ＯＮ（Ｘ■ン：ペプチドｘ■をギ酸で処理し、ＸＩで述べた ごと（操作した。

Ｒｆ３０．０６　、これにより第２配列の合成を完了した。

猪来 ２種のノナペプチドについての１３Ｃ核磁気共鳴スペクトルによりこれらの純度 が示された。エラスチンノナペプチドＡＧＶＰＧＦＧＶＧ　（化合物ＸＩ）とそ の置換配列ＧＦＧＶＧＡＧＶＰはともニエラスチン合成靭帯ヌソチェ繊維芽細胞 に対する化学的誘引剤である。

第１図は、１０−１　ｔ〜１０−　ＳＭの範囲の濃度のノナペプチドとの反応に よる繊維芽細胞の実際の移行を示す。ＡＧＶＰＧＦＧＶＧに対する最大活性は１ ０−　”Ｍであった。４本の曲線が描かれ、それらすべては１０１Ｍにおいてピ ークを示した。その置換配列ＧＦＧＶＧＡＧＶＰ　（化合物Ｘ■）を１０−　’ 　”−１０−Ｓの範囲の濃度について試験した（第２図）。再び１０−’Ｈにお いて最大反応を示した。

再度、４種の実験がなされ、それらはすべて１０−釘にて最大活性を示した。第 ３図は、繊維芽細胞の、ヒト血小板由来因子との該因子をそれぞれ０　、３　、 ３．１０，２０．３０，４０，５０゜６０　、７０　、９０　、３００　、及び ３０００ｎｇ／ｍ用いたときの反応を示す。

３０ｎｇ／　ｄ　（１ｎＭ）で最大活性かえられる。トロボエラスチンのへキサ ペプチド、ＶＧＶＡＰＧ、は繊維芽細胞に対し走化性を有し、１０−”Ｍにて活 性ピークを示す（第４図）。このような試験を２種について行ない、ともに１０ −　”Ｍにてピークを得た。

「チェッカー板分析」を２種のノナペプチドを用いて行ない、走化性としての繊 維芽細胞を移行を特定した。ペプチドを上室、下室、又はそれら双方に添加し、 ポジティブ、ネガティブ、又はＯ勾配をそれぞれ設定した。第１表及び第■表は 、ＡＧＶＰＧＦＧＶＧ　、及びＧＦＧＶＧＡＧＶＰ　ニ関し、細胞ハホシティプ 勾配との反応により好ましく移行し、ネガティブ又は０勾配とは反応しないこと を示している。第１表及び第２表に示すデータは、それぞれ３回、及び２回繰返 したものである。すべての場合において、データは第１表及び第２表に示される パターンに従った。データは、繊維芽細胞のランダム（化学運動性）によりむし ろ直進（走化性）移行を促進し、そしてペプチドが真の化学誘引剤であることを 示している。陽性対照たる３０μｇ／ｍｌのＰＤＧＦと比較して、ノナペプチド はＰＤＧＦと同程度の移行を促進する。

災施班又 林粁及グ方抜： 東益上春亘坐倶給１ 変性媒体１９９、牛胎児血清トリプシン−ＥＤＴＡ、及び抗生物質溶液をＧＩＢ ＣＯ，Ｃｈａｇｒｉｎ、　０）１．より得た。ポリカーボネート及び硝酸セルロ ース膜をＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ　、及 びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｖｐ、、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、＋より得た。ヘマ トキシリン染料はＨａｒｌｅｃｏ　、　Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、Ｎ、Ｊ、より、ヘ マカラー染料をＡｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、 ５ｔｏｕｅ　Ｍｏｎｎｔａｉｎ、ＣＡ、より得た。ヒトプラズマフィブロネクケ ンはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ＋ＣＡ、より得た。

頼Ｉじ弓「４甥及工沫ｌＪ１裂 中脚部動脈の内皮細胞を外科用メス刃にて削りとり単離した。得られた細胞を、 ペニシリン、ストレプトマイシン、及び１０％の牛胎児血清を含むＨａｎｋ塩を 有する媒体１９９中で遠心分離することにより洗浄した。細胞凝集体を２７径の 針を通して押し出すことにより溶解した後、約１０４細胞／ｄ濃度で２５−のフ ラスコ中に細胞を散布した。そして、３〜４日で融合した。細胞は媒体１９９． １０％胎児牛血清、及び５％のＲｙａｎ成長補助剤（Ｄｒ、Ｕ、Ｓ、Ｒｙａｎ、 　ｔｌ、Ｍｉａｍｉ、　ＰＬ、）中で成長させた。細胞が融合に達したとき、Ｃ ｏ５ｔａｒ！Ｈ胞切削具により培養皿から除去した後、細胞は１：３の分離比で 副培養された。細胞の純度は、１−１′−ジオクタデシル−１、３、３、３’　 、３’−テトラメチルインドカルボシアニンパークロリド（Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤ Ｌ、　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ 、ＭＡ）で標識されたアセチル化した低濃度リボプロティン（Ｓｔｅｉｎ　ａｎ ｄ　５ｔｅｉｎ。

１９８０、　Ｎｅｔｌａｎｄ他、１９８５）による内皮吸尽の特定蛍光濃度によ り監視された。すべての研究が第１〜第５継代細胞についてなされた。これら１ 〜２日後に融合した初期継代細胞は、Ｒａｎｋｓ　Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌｔ 　５ｏｌｕｔｉｏｎ中の０゜０５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡに３７°Ｃ ，３分間溶解され、遠心分離され、２度洗浄されて、牛胎児血清を有しない媒体 １９９に再懸濁された。トリプシン反応は、大豆トリプシン阻止剤１■／ｄによ り停止した。細胞濃度はへモシトメータにより決定され、最終濃度が１０’／ｍ Ｉｌとなるよう調整された。

走■ま目支定 走化性反応は、二重膜技術を用いて、変形Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを改造した３ ０大の多盲穴板により検定された。コラーゲンを被覆された、０．４５μの硝酸 セルロース膜上に重ねられたポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含まない８μの ポリカーボネート膜によって、それぞれ媒体１９９に溶解された０、２４ｄのす ＜験ペプチド、及び０．３７ｄの細胞懸濁液を含む上室と下室とを分離した。コ ラーゲン前処理は、ポリカーボネート膜への細胞付着を促進するためになされた 。チェッカー板検定においては、直進細胞移行（走化性）とランダムな細胞移動 （化学運動性）とを区別するため、上下のチャンバー間の濃度勾配を、種々の濃 度の試験ペプチドを細胞懸濁液に添加することにより消失させた。すべての実験 に関し、底部チャンバー中の媒体のみは基線コントロールとして作用した。底部 の１００烏／ｄのヒトプラスマフィブロネクチンを陽性対照とした。充填板は５ ％炭酸ガス雰囲気の加湿インキュベータ中で３７°Ｃ，５時間培養された。組合 された膜が回収され、エタノール中で定着され、）Ｉａｒｒｆｓ　Ａｌｕｎへマ ドキシリンで着色され、等級プロパツールで水和され、キシレン中で洗浄された 。組合せ膜はスライドグラス上に載せられ、ｘ４００の明視野で２つの膜間の細 胞移動範囲が定量された。１つの実験条件当り３組の膜について、それぞれ５視 野をランダムに選びカウントした。

１５視野について平均値を計算し、標準平均誤差（Ｓ、Ｅ、＋１）とした。ｎは １５である。正味の細胞移行はペプチド濃度の関数としてプロットされるが、正 味の移行はペプチドとの反応により移動した平均細胞数より媒体をのちのと反応 により移動した平均細胞数を減じたものである。

走化性反応は、Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＨＤ）微小盲穴 チャンバーを用いても検定される。下の穴は３０ｍの媒体１９９士フィブロネク チンの試験ペプチドを含み、上側の穴は５５ｕの媒体１９９に懸濁された細胞を 含む。上下のチャンバーは、気孔サイズ８−でＰｖＰを含まない、長方形の、ゼ ラチン及びフィブロネクチンで処理されたポリカーボネート膜により分離された 。ゼラチンで前処理された膜は１００ｎ／ｄのフィブロネクチンのＰＢＳ溶液中 で室温２時間培養され、空気乾燥され、２週間以内に使用された。−たん組立チ ャンバー中に添加された細胞は、３７°Ｃ１９５％空気−５％炭酸ガス中で４時 間培養された。フィルターが除去され、移行しない細胞の最上層が削られ、移行 した細胞の底部層がエタノールで定着され、ヘマカラーで着色された。細胞移動 の定量は３０穴チヤンバーについても同様になされた。発明者の認識では、双方 のチャンバーに走化性を付与することは、双方の膜を処理すること（ゼラチン上 にフィブロネクチンを塗設する、しないにか〜わらず）と同程度に効果的である 。

さ工天上金底 合成法は前に議論したものと同様である。

第５図に２種のノナペプチドの１３Ｃ核磁気共鳴（ＣＭＩ？）スペクトルを示す 。これらは合成の正確さと最終生成物の純度を示している。第６図に牛動脈内皮 細胞単層の代表的な相対照像を示す。これは「先方」分散パターンを示している 。　Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬと共に培養した後、細胞は蛍光分散パターンを示した 。

それは、受容体を媒介する内部細胞を経由して細胞内に吸収された標識Ｌ　Ｄ　 Ｌ誘導体の細胞内移動を示している。すべての細胞は、典型的に存在する細胞間 の着色濃度変動をともなうコントロールに対しポジティブな蛍光標識を示す。

エラスチン合成ペプチドは、牛動脈内皮細胞に対する化学的誘引剤である。第７ 図には内皮細胞移行のための最大刺激を与える最適濃度を決定するために努力し て集められたデータを示す。エラスチン繰返しノナペプチドに対する反応量曲線 、及び初期流路内皮細胞は、双方のペプチド、Ｐｈｅ含有ノナ？−（ＧＦＧＶＧ ＡＧＶＰ）　、及びＬｅｕ含有ノナ？　−（ＧＬＧＶＧＡＧＶＰ）、につき最大 活性が、８　ＸＩＯ”１０Ｍ１こおいて得られることを示す。

これらの反応量実験は、Ｐｈｅ−ノナペプチドについて１０回、Ｌｅｕ−ノナペ プチドについて９回、それぞれ繰返しなされ、１回の目隠しカウントを含め（ス ライドに番号を付し、その番号が顕微鏡操作者に見えないようにしておく）すべ て同様の結果が得られた。第７図に２つの異なる実験により得られたデータを示 す。実験間で細胞反応性に変動があるため、フィブロネクチンの陽性対照に対し 得られたデータを規格化した。左の縦軸はフィブロネクチンの陽性対照の割合を 、右の縦軸は、高倍率視野（ｈ、ｐ、ｆ）当りの実際の移行細胞数をＰｈｅ及び Ｌｅｕを含有するペプチドの双方について表わしている。

ここで目盛の違いに注目すべきである。すなわち、Ｐｈｅ−ノナペプチドの実験 においては、陽性対照り、ｐ、ｆ、当り３０細胞でありＬｅｕ−ノナペプチドの 実鏝では、陽性対照はり、ｐ、ｆ、当り４６細胞である。このようにデータを規 格化したことにより、双方のノナペプチドがともに同様の濃度にてピークを示し 、かつ同程度の反応性を示していることが明らかとなる。曲線が２つの摺面を示 すのはいくつかの過程に起因しているのであろう。１つは、化学定性反応を引出 す細胞受容体の飽和の可能性であり、今１つは勾配減少の可能性である。

第１表にはチェッカー仮検定についてのデータを示す。走化性に対し期待される ように、対角線に沿った値は、２つのチャンバー内の濃度が平衡にあるとき、正 味Ｏの細胞移行を示している。対角線より上での移行は重要ではなく、一方下側 では正味の細胞移動が濃度に依存することを示している。

データは、繰返しエラスチンを有するノナペプチドが走化性（直進移動）を単な る増大したランダム移動よりもむしろ促進することを立証している。この実験は ７回繰返され、それぞれの実験が同様のパターンを示した。

エラスチンへキサペプチドも細胞移行をひき起したく第８図）。しかしながら、 最大活性を与える濃度は１０””？Ｉと１０倍ずれている。フィブロネクチンの 陽性対照と比較すると、ヘキサペプチドは２つのノナペプチドよりも活性が低い 。この実験は７回繰返し、同様のバタ・−ンが得られた。

第１表 ＧＦＧＶＧＡＧｌｉｌＰ（Ｍ）、ＧＦＧＶＧＡＧＶＰ（Ｍ）、上部室０　０（１ ６）　４±２１±２−３±１１０−１０６±２　１±２　３±２　−１土１８Ｘ 　１０−”　１９±２　１１±１−３±１３±１■ ペプチド純度はこれらの走化性実験に対し重要な点となる。

不純物がペプチド合成時から存在し、口・ノド間で変動した場合、細胞移行検定 に対し不適当な量が測定され、多分間違ったピークが得られる。不純物自体も走 化性反応をひき起す。

ＣＩＩＲスペクトルはペプチドの純度を検出する。走化性実験に化学誘引剤の純 度が重要であるように、さきに述べた陽性対照と反応する細胞集合の純度も重要 である。第６図は培養細胞の純度を示しており、第７図はこれらの内皮Ｉｒりが フィブロネクチンへ移行することを示している。

結果は、エラスチンノナペプチドが内皮細胞に対し化学的誘引剤として働くこと を示している。この知見は、エラスチンノナペプチドが数少ない純粋合成かつ化 学的に定義された走化性を担持しかつ適正なコストで筒便に使用可能な化合物で あるという点で重要である。また、特別な貯蔵や溶解技術を必要とせず容易に操 作することもできる。広範囲の因子が内皮細胞の移行に影響を与えている。いく つかは血液に由来する。すなわち、血小板因子、リンパ球生成物、培養白血球に 由来するミドジン因子、リンフォキン、インターフェロン、フィブリノーゲン及 びその断片等。多くの因子は溶液の形で組織から単離される。これらは腫瘍由来 因子、アンギオジン因子及び調合剤、及び成長因子を含んでいる。フィブロネク チン単独、及び／又はガングリオシドもしくはヘパリンとともに内皮細胞に対す る化学誘引剤を構成することが示唆されている。この幾分広範囲のリストから、 フィブロネクチン、フィブリノゲン、及びヘパリンは別として、走化性を維持し 、かつ容易に入手可能な純粋かつ化学的に定義された物質は数少ないことが明白 である。結果はこれらのノナペプチドが内前記知見は、とくに人工血管の分野で の生体材料の開発との有力な関連性を示している。最近の人工血管を含む生体材 料は、内皮材料の開発を適切に支援してはいない。将来の人工臓器は、合成微小 導管の性能向上のためとくに内皮細胞に重点を置いて、細胞付着、及び細胞成長 及び移行を支持する生体材料を使用する必要があることを示唆している。ノナペ プチドは内皮細胞の人工血管への移行に対し走化性刺激を提供することができる 。

アンギオジンにみられる最初の形態学的事件は、毛細血管内皮の移動である。走 化性の直進移行は、アンギオジンと新たな導管比の過程の一面として提出される 。エラスチンノナペプチドは内皮細胞の直進移動を促進するアンギオジン因子で あろう。それは毛細血管の組織への侵透をもたらす次のステップに進ませるであ ろう。

これまでに本発明は十分に説明された。当業者がここで言及された発明の精神と 範囲を逸脱しない限り、多くの変更と浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、ｆ 浄書（内容；こ変更なし） ＦＩＧ、２ 浄書（内容に変更なし） ０．３　３．０　３０　３００　３０００［ＰＤＧＦ］、　ｎｇ／ｍ１ ＦＩＧ、３ 浄書（内容に変更なし） ＶＧＶＡＰＣｔ二よるお魅ｉ１キ細ロ乞つ坊兜力ＦＩＧ、Ｑ ＦＩＧ、６ 浄書（内容に変更なし） ノブ公ア＋′ｌ′″とのウリ内友鉤吃り走化・辻ＦＩＧ、　７ 浄書（δ各に妄史−°シ） △久す公ブ＋ｖ゛＜ＶＧＶＡＰＧ）ヒのウシｎル、和名のＡノヒ・ト主ＦＩＧ、 ８ 手続補正書（方式） １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０１３２１ 、発明の名称 走化性ペプチドによる走化性の刺激 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ニーニービー　リサーチファウンディション４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１ｏ号静光虎ノ門ビル　電話５０４ −０７２１５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の（３）図面翻訳文 （４）委任状 （５）法人証明書 ７、　補正の内容 （１）　（４）（Ｓ）　別紙の通り ８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５　１通第１項の規定による書面 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（３）図面翻訳文　１通 （４）委任状及びその翻訳文　各１、 国際調査報告

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．人工臓器への走化性を刺激する方法であって、下記式： 【配列があります】 〔式中、ＡはＬ−アラニンのペプチド形成残基であり；ＰはＬ−プロリンのペプ チド形成残基であり；Ｇはグリシンのペプチド形成残基であり；ＶはＬ−ヴァリ ンのペプチド形成残基であり；ＦはＬ−フェニルアラニンのペプチド形成残基で あり； ＬはＬ−ロイシのペプチド形成残基であり；Ｂ１はＨ、又は生体相容性のＮ−末 端基であり；Ｂ２はＯＨ、Ｂ３が非毒性金属イオンであるＯＢ３、又は生体相容 性Ｃ−末端基、であり； Ｘは【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列が あります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】， 【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があり ます】，ＶＧ，Ｇ、又は共有結合であり； Ｙは【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列が あります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】， 【配列があります】，【配列があります】，ＡＧ，Ａ、又は共有結合であり；ｎ は０〜５０の整数であり； ｍは０〜５０の整数であり；ただしｎとｍとがともに０の場合、Ｘ及びＹは、走 化性ペプチドがＸ及びＹの組合される位置で少なくとも３つのアミノ酸を有する よう選択される〕で示される走化性ペプチドを選択し；そして前記ペプチドを人 工臓器層に、内皮細胞の前記人工臓器への侵入を増大させるのに十分な量導入せ しめることを含んで成る方法。
2. ２．ｎが１〜１０、かつｍが０〜１０である請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．ｎが約５、かつｍが０〜５である請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．ｎが１、及びｍが０である請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．前記ペプチドが【配列があります】又はその塩である請求の範囲第１項記載 の方法。
6. ６．Ｂ１がＨ、かつＢ２が、Ｂ３がアルカリ金属イオンであるＯＢ３である請求 の範囲第１項記載の方法。
7. ７．前記量が、前記表面１００ｃｍ２当りノナマー又は繰返し単位１０−９〜１ ０−３ミリモルである請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．前記人工臓器がポリペプチド構造を含有する請求の範囲第１項記載の方法。
9. ９．前記合体が、前記走化性ペプチドと前記表面との間の非共有結合を意味する 請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．前記合体が、前記走化性ペプチドと前記表面との間の共有結合を意味する 請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．前記表面がペプチド構造を含有する請求の範囲第１項記載の方法。
12. １２．人工臓器であって、下記式： １２．臓器表面が下記式で示される化学走性ペプチド表面に合体していることを 特徴とする人工臓器。 【配列があります】 〔式中、ＡはＬ−アラニンのペプチド形成残基であり；ＰはＬ−プロリンのペプ チド形成残基であり；Ｇはグリシンのペプチド形成残基であり；ＶはＬ−ヴァリ ンのペプチド形成残基であり；ＦはＬ−フェニルアラニンのペプチド形成残基で あり； Ｂ１はＨ、又は生体相容性のＮ−末端基であり；Ｂ２はＯＨ、Ｂ３が非毒性金属 イオンであるＯＢ３、又はＣ−末端基であり； Ｘは、【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列 があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】 ，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，ＶＧ，Ｇ、 又は共有結合であり； Ｙは、【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列 があります】，【配列があります】，【配列があります】，【配列があります】 ，【配列があります】，【配列があります】，ＡＧ，Ａ、又は共有結合であり； ｎは０〜５０の整数であり； ｍは０〜５０の整数であり；ただし、ｎ及びｍがともに０のとき、Ｘ及びＹは、 走化性ペプチドがＸ及びＹが組合される位置で少なくとも３つのアミノ酸を有す るよう選ばれる〕で表わされる走化性ペプチドを前記臓器の表面に導入している 人工臓器。
13. １３．ｎが１〜１０であり、そしてｍが０〜１０である請求の範囲第１２項記載 の人工臓器。
14. １４．ｎが約５、かつｍが０〜５である請求の範囲第１２項記載の人工臓器。
15. １５．ｎが１、かつｍが０である請求の範囲第１２項記載の人工臓器。
16. １６．前記ペプチドが【配列があります】、又はその塩である請求の範囲第１２ 項記載の人工臓器。
17. １７．前記Ｂ１がＨ、かつＢ２が、Ｂ３がアルカリ金属イオンであるＯＢ３であ る請求の範囲第１２項記載の人工臓器。
18. １８．前記量が、前記表面１００ｃｍ２当りノナマー繰返し単位１０−９〜１０ −３ミリモルである請求の範囲第１２項記載の人工臓器。
19. １９．前記人工臓器が構造ポリペプチドを含んで成る請求の範囲第１２項記載の 人工臓器。
20. ２０．前記走化性ペプチドを、該走化性ペプチドと前記表面との間に、非共有結 合により導入する請求の範囲第１２項記載の人工臓器。
21. ２１．前記走化性ペプチドを、該走化性ペプチドと前記表面との間に、共有結合 により導入する請求の範囲第１２項記載の人工臓器。
22. ２２．前記表面が構造ペプチドを含んで成る請求の範囲第２１項記載の人工臓器 。