JPH03501772A - 改良された化学ルミネセントエステル，チオエステルおよびアミドを用いるアッセイ法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

改良された化学ルミネセントエステル、チオエステルおよびアミドを用いるアッ セイ法 発明の分野 本発明は標識として化学ルミネセント抱合体を用いるアッセイ法およびイムノア ッセイ法に関する。 発明の背景 ある種の化合物は過酸化物または分子状酸素によって高いｐＨで処理すると光す なわち”化学ルミネセンス”を発する。元は過酸化物または分子状酸素がＳ？ま たはＳＰ３混成炭素中心を攻隼することにより形成される中間体の＠衰によって 発せられる。攻隼される炭素中心は連鎖、または機もしくは環系の一部でありＩ ：もよい。 これら化学ルミネセント化合物の石干についての特性および挙動はマツクカプラ （ＭｃＣαｐｒａ）、”有機化合物の１！学ルミネセンス’　Ｐｒｏｇｒａｍｓ 　ｉｎυｒｇａｔｓｉｃ　Ｃルａｍｉｓｔｒｙ豐０！、８．カルーセルズ（Ｃ′ αデデ％ｃｈａｒｍ　）およびスーザーランド（５ｓｃｈａｒｔａｎｄ　）　ｗ ８（ワイリー・アンドーサンズ　１９７３年〕により詳細に記述されており、こ れをここに参考として引用する。 化学ルミネセント化合物はイムノアッセイを含めた原型のアッセイ法においても 長年用いられている。その例は本国特許第４．３８３，０３１，４，３８０，５ ８０．４，２２６．９９３号その他多数の明細書中に見られる。しかし一般にこ れらの化合物は水溶液中での安定性が欠如するため、商業的アッセイには用いら れていない。この安定性の欠如は付足のエステル、チオエステルおよびアばドか うなる化学ルミネセント化合物の亜群にとって本質的に１１要である。これらの 化合物はエステルについては下記の一般的反応に従って反応する： 式中、Ａはアリール環または環系であり、Ｂは複Ｘ壊または環系である。この亜 群の化合物はエステル、チオエステルまたはアミド結合の早期加水分解によって １それらの化学ルミネセンスを矢う”傾向がある。いったんこの結合が加水分解 されると、その化合物はもはや化学ルミネセンスを効果的に発しない。この化合 物がアッセイに際して標識として用いられた場合、ｌ１ｌｉＲは徐々にその化学 ルミネセンス能を失い、従って信頼性のないアッセイ結果を生じる。 従って、加水分解を受けに（く、そのため水溶液中で向上した安定性を示す、ア ッセイ用の化学ルミネセントエステル、チオエステルおよびアミドを提供するこ とが望ま１−い。 発明の要約 本発明によれば、水溶液中での安定性が向上した化学ルミネセント化合物、丁な わち分子部分を用いる、特異的結合アッセイ法が開示される。化学ルミネセント 部分はエステル、チオエステルまたはアミドであり、それらにおいてエステル、 チオエステルまた←まアミド結合１工下紀の間に存在する：（ｌ）　上記結合が 連結している炭素原子を含む複素環または環系；その際複ｌＸ項また１１項系内 の異種原子は酸化状態にあり、これは上記炭素原子が過酸化物また１・１分子状 酸素の攻撃を受けやすくし、その結果中間体が生成し、これが減衰１−て化学ル ミネセンスを発する；および（２）　アリール環または環系。アリール環または 壌糸はＩｔ換６Ｊｌを少なくとも１個含む。この置換６員項（工２個以上の直換 丞乞含み、その際これら２個以上の［換丞のうち少なくとも２１固は上記結合の ２７０水分解に立体４害を与える。上記結合の加水分解に立体障害ン与える１イ ＆または２個以上の置換基は電子吸引基であってもよい。置換６＾ホは上記結合 の２７０水分解に二坏Ｉ諏害乞与える置換基のほかに、Ｉ［Ｉ２の（［換基１個 または２個以上な含んでもよい。これら惟の置換基も電子吸引基であってもよい 。 上記結合が連結している、複素環または環系中の炭素原子も弐　Ｒ，、Ｘ−の第 ２置換基を含んでもよ（、式中のＸはＯ５Ｎ、５およびＣよりなる群から選ばれ 、Ｒはいかなる基であってもよ（、ｎはＸが適正な原子価をもつ数１である。他 の化学ルミネセント部分も開示され、それらは複素環また４浪系、および式　Ｒ ｎ、Ｘ−の第２置換基％：％色とし、エステル、デオエステルまたはアミド結合 はこの複素環または環系と脱離基との間に存在する。 ここ（開示される化学ルミネセント部分も複素環または環系内のペリ位に置換基 を含んでもよい。 また本発明によれば、この種の化学ルミネセント部分を含む組成物およびアッセ イ牟ツトが開示される。 各図を通して各種部分を識別するために下記の略号を用いる： ＠Ｐ″はフェニルアクリジニウムエステルを表わす：＠ＤＭ”ｋｌ　（２、６− ジメチＡ／）フェニルアクリジニウムエステルを表わす； ＠ＤＭ（、”は（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニルアクリ ジニウムエステルを表わす；ｌｌＬ）ＭＳＩ′は（２，６−ジメテルー３−クロ ロスルホニル）フェニルアクリジニウムエステルヲ表わス；＠ＩＪＭＩＶ″＆工 （２，６−ジメテルー４−二トロ）フェニルアクリジニウムエステルを表わ丁； ＠Ｑ％ｃＬｔｍは（２，６−シメチルー４−トリメチルアンモニウム）フェニル アクリジニウムエステルヲ表わ丁；”ＤＭＢ“は（２，６−ヅメデル−４−ブロ モ）フェニルアクリジニウムエステルを表ワす； ″ｃ２”または”（：’１ＮＨ５”は４−（２−スクシンイミジルカルボキシエ チル）フェニルアクリジニウムエステルを表わす； ”ＤＭＥ”は（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル−９−エ トキシ−アクリダンエステルを表わす；および ”ＲＴ”″は室温を表わす。 第１図はｐｔｉ６．３．３５℃のリン酸緩衝液中における各種Ｎ−メチルアクリ ジニウムエステルの北部安定性データのグラフである。 第２図１工ｐＢ６．３．４５℃のリン酸緩衝液中における各ａｓ−Ｎ−メチルア クリジニウムエステル較安定性データのグラフである。 第３図はｐＨ８，０，３５℃のリン酸緩衝液中における各ａ、１ｌｖ−メチルア クリジ二クムエステりの比較安定性データのグラフである。 第４図はｐＨ１ｏ、４５℃ｌ’ｌン識緩衝液中における各種Ｎ−メチルアクリジ ニウムエステルの比較安定性データのグラフである。 第５図はｐＨ６，３，４℃の標準すン酸ｆｌｋ衝液中におけるＤＭＮ％ＤＭＣお よびＣ２ＳＭＳエステルＩＱＧ＠合体の比較安矩性データのグラフである。 第６図はｐＨ７，３，４℃の標準リン酸緩衝液中におけるＤＭＡ！、Ｌ）ＭＣお よびＣ２ＳＭＳエステルＩＱＧ抱合体の比軟女定性データのグラフである。 １％７図はｐＨ＆ｏ、４℃の標準リン酸緩衝液中におけるｕＭＮ、ｎＭｃおよび Ｃ，ＮＭＳエステルＩＱＧ抱合体の比較安定性データのグラフである。 第８図はｐＨ６，３，４℃の標準リン酸緩衝液中におけるＤＭＮ、ＤＭＣおよび Ｃ１８ＭＳエステルＩＱＧ抱合坏−ヒツジＩＱＧを含まない−の比較安定性デー タのグラフである。 第９図はｐＨ７，３，４℃の標準リン酸緩衝液中におけるυＭＮ、ＤＭＣおよび ＣよＩＩＨＳエステルＩＱＧ抱合体−ヒツジＩＱＧを含まない−の比較安定性デ ータのグラフである。 第１θ図はｐＢＦ！、０，４℃の標準リン酸緩衝液中におＩｒ’ｊ６ＤＭＮ、Ｄ ＭＣお！びＣ，ＮＢＳ工ｘ−７ｙｖ１ｇＧ　抱合体−ヒツジＩ、Ｇを含まない− の比較安定性データのグラフである。 第１１図はｐＨ６，３，４℃の像準すン酸緩衝絨中におけるＤ　ｈＩ　Ｎ％ＤＭ ＣおよびＣ，ＮＨＳエステルＩｇＧ抱合体−ヒツジＩＱＧｆ含ます、０．１　Ｘ クシ血清アルブミンを含む（ヒト血清アルブミンの代わりに）−一の工戦安定性 データのグラフである。 第１２図を工ｐｔｉ　？、３．４℃の標準リン酸緩衝欣中におけるり、冒Ｎ％Ｌ ）ＡｉＣおよびＣ，ＮＭＳエステルＩＱＧ抱合体−ヒツジＩＱＧＩ、（含まず、 ０．１％Ｘクシ血清アルブミン含む〔ヒト！清アルブミンの代わワに〕−一−の 比較安定性データのグラフである。 萬１３図はｐＨ８，０，４℃の標準リン散緩＠液中におけるＤＭＮ、ＤＭＣおよ びＣ２ＳＭＳエステルＩｇＧ抱合体□ヒツジＩｇを含まず、０．１　’Ｘウシ血 清アルブミンを含む（ヒト血清アルブミンの代わりに）−の比較安定性データの グラフである。 第１４図は宣温におけるｐＨ６，３，７，３およびａＯの標準リン酸緩衝液中の Ｃ１ＮＨＳエステルＩＱＧ抱合体の比較安定性データのグラフである。 ！１５図＋を室温ＶＣおＷるｐＨ６，３，７，３、オヨヒ８．０の標準リン酸緩 衝液中のＤＭＮ−ＩＱＧ抱合体の比較安定性データのグラフである。 第１６は室温におけるｐＨ６，３，７，３および＆０の標準リン酸緩ｔａ中のＤ ＭＣ−１ｇＧ抱合体の比較安定性データのグラフである。 第１７図は３７℃におけるｐＨ６，３，７，３および＆０の憚準すン酸緩衝液中 ＱＣ，ＮＨＳエステルＺＱＧ抱合体の比較安定性データのグラフである。 ｘｉｓ図は３７℃におけるｐＨ６，３，７，３およびａＯの碑準すン酸緩＠欲中 のＩＪＭＣ−１ｇＧ抱合体の比較安定性データのグラフである。 第１９図１１３７℃におけるｐＨ６，３，７，３および＆Ｑの憚準リン酸緩衝液 中のＤＭＮ−ＩＱＧ抱合体（２０倍モル過剰標識により調製）の比較安定性デー タのグラフである。 第２０図は３７℃ニオケるｐＨ６，３，７３およびａＯの標準リン酸緩衝液中の ＤＭＮ−ＩＱＧ抱合体（５倍モル過剰標識によりｖ４製）の比較安定性データの グラフである。 第２１図はｐＨ６，９，３７℃におけるアジド緩衝液中のＤＭＮ、ＤＭＣおよび Ｃ，ＮＨＳエステルｌＩＧ　抱合体の比較安定性データ０グラフである。 第２２図はｐＨ７，０，３７℃におけるアジド緩＠液中のＤＭＮ％ＤＭＣおよび Ｃ，８ＢＳエステルＩＱＧ抱合体の比較安定性データのグラフである。 第２３図はｐＨ７，３，３７℃におけるアジド緩衝液中のＤＭＮ％ＤＭＣおよび Ｃ，Ｎｌｌ５エステルＩＱＧ抱合体の比較安定性データのグラフである。 第２４図はｐｇａｏ、３７℃におけるアジド緩衝液中のＤＭＮ％ＤＭＣおよびＣ ’、ＮＢＳエステルＩＱＧ抱合体の比較安定性データのグラフである。 第２５図はｐＨ６，３，３７℃におけるアジド緩衝液中のＤＭＮ％ＤＭＣおよび Ｃ！ＮＭＳエステルＩＱＧ抱合体の比較安定性データのグラフである。 第２６図はｐＨ５，９０呈温および４℃におけるアジド緩衝液中のＤＭＮおよび ｃ１ｓｇｓエステル！ｇＧ抱合体の比較安定性データのグラフである。 第２７図はｐＨ６，３，３５℃におけるリン酸緩衝液中のフェニル−、（２，６ −ジメチル）フェニル−および（２Ｉ６−シメチルー４−二トロ）７エ＝ルーＮ −メチル−アクリダンエステルの比較安定性データのグラフである。 萬２８図はｐＨ６，３，４５℃におけるリン酸緩衝液中のフェニル−１（２，６ −ジメチル）フェニル−および（２，６−シメチルー４−二ドｏ）フェニル−Ｎ −メチル−アクリダンエステルのグラフである。 第２９図は’ＪＩＢＦＬＯ１３５℃におけるリン＃ｆｆｌ衝液中の７工−ルーｗ （２＋６−ジメチル）フェニル−および（２，６−ジメテルー４−二トロ）フェ ニル−Ｎ−メチル−アクリダンエステルのグラフである。 第３０図はｐＨ８，０，４５℃におけるリン酸緩衝液中のフェニル−１（２，６ −ジメチル）フェニル−および（２，６−ジメチル−４−二トロ）フェニル−Ｎ −メチル−アクリダンエステルのグラフである。 第３１図は（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル−へ゛−メ チルーアクリタンー９−エトキシ−９−カルボキンレートの／ＪＶ−Ｖｉａスペ クトルである。 第３２図は（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル−Δ′−メ チルーアクリダンー９−エト午クシ−９カルボキシ１／−トの高速原子衝撃型質 量スペクトル（ｆｃＬｓｔ　ａｔｏｒ＊　ｂｏｍｂａｒｃｔｖｎｍｎｔ　ｍａａ ａ　ａｐａｃｇｒｓｍ）である。 第３３図１１（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）７エ二ルーＮ−メ チル−アクリダン−９−メトキシ−９−カルボキシレートの３００Ｍ＆ｇ７”ロ トンＮＭＲスペクトルである。 第３４図は（２，６−シメチルー３−りＩ：１１−１スルホニル）フェニル−Ｎ −メチル−アクリダン−９−カルボキンレートの３００５１１：１１１７”−ト ンＮＭＲスペクトルである。 第３５可工（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）７ｘニル−Ｎ−、メ チル−アクリダン−９−エトキク−９〜カルボキシレートを標識として用いたＴ ＳＢ基準のアラ七イのグラフである。 第３６図ｔｔｐＨｃ＋、６．２５℃の炭酸水素塩緩衝液（０，１Ｍ炭酸水素塩、 ０．０００２５嶌チメロサール、０．１％ウシ血清アルブミン）中におけるＤＭ ＣおよびＤ　＋４ｆ　Ｅの比較安定性データのグラフである。 第３７図はｐＨ６，０，２５℃のＴＳＢ抗体希釈用緩衝液（１００ｓＡｆすｙ酸 塩、１５０　ｍＭ−ＮａＣ１，０，００１Ｘテメロサール、０．４％ウシ血清ア ルブミン、０．１ｍｇ／！ＩＪネズミｒ−グロブリン、０．１１９７αヤギγ− グロブリン）中のＤＭＣおよびＤ・υＥ−ＴＳＢ宕合体の比較安定性データのグ ラフである。 第３８　ｏｉｚ　ｐＨ６，Ｃ１３０”Ｃｆ）ｒＳＩｌ　ｆ１体ａ釈用ａｍ液中の Ｌ）ＭＣおよびｌ）ＭＥ−ＴＳＢ抱合体の比較安定性データのグラフである。 第３９図はｐＨ６，０，３５℃のＴＳＨ抗体希釈用緩衝液中のＤＭＣおよびＤＭ Ｅ−ＴＳＢ指合体の比較安定性データのグラフである。 第４０図はフェニル−１，３−ジメチル−Ｎ−メチル−アクリジン−９−メトキ シ−９−カルボキンレートの３００＃Ｈｇ　プロトンＮＭＲスペクトルである。 好ましい形態および別形態の匝明 本発明の化学ルミネセント部分トエ下記２種の模式的禽造式のいずれかをもつ。 ■。 上記各式において、Ｌと表示した区−の四角はエステル、デオエステルまたはア ミド１結合（Ａｓｎｋａｇａ）”を含み。 これは“ｑ”と表示した円および“Ｒ３”と表示した実線の四角により表わされ る２桝の置侠された環または環系の間にある。結合りがエステル、デオエステル またはアミドのいずれであるかはＲ４が−Ｕ−１−Ｓ−またＥニー＜ｓｏ、ｃｒ 、）−それぞれであることにより決定される。 好ヱしくはこの結合１工エステル結合である。 ＱＩＳ複＾穢または環系であり、これに複素環または穏糸円の炭ｌＡ原子におい てエステル、デオエステルまたはアミド結合りが結合しており、この炭ＸＪＫ子 は（ＩＪ　ＳＰ″またはＳＰｓ混成形成形り、かつ＋２ｆ　過板化物または分子 状酸素による攻撃を受けやすく、その結果、減良して化学ルミネセンスを発する 中間体を形成する。炭素原子がこのような攻ｓ？受げｆすいか否かは複Ｘ墳また は環系内の異種原子の酸化状態により決定される。上記結合が結合している炭Ｘ 原子がＳＰ２混成である場合、異種原子は正の酸化状態になければならない（す なわち正の電荷、たとえばＮ−アルキル化またはＮ−酸化により得られるものな もつ）。上記結合が結合している炭素原子がＳＰ１混成である場合、異種原子は 中性の酸化状態になければならない（すなわち帯電していない）。異種原子が窒 素原子である場合、適正な酸化状ｍは窒素原子がアルキル（官能基を含む）、ア リール基（官能基を含む）、−０−（窒素原子が正の酸化状態にある）または− ｕｓ　ｃｏｘぷ子が中性の酸化状態にある場合）により置換された場合にのみ得 られる。異ｗｉ子がこれらの１過圧な”酸化状態にある場合、上記炭Ｘぷ子は過 酸化物または分子状酸素による攻撃を受けや丁（、その結果化学ルミネセント中 間体を生成する。 異ａ原子が正の酸化状態にある一１１素８または環系には下記のものが含まれる が、これらに限定されない。アクリジニウム、ベンゾＣｅ）アクリジニウム、ベ ンゾ〔６〕アクリジニウム、ベンズ（Ｃ）アクリジニウム、１．２．４−トリア ゾールカチオン、インオキサゾールカチオン、インチアゾールカチオン、１．２ −アゾールカチオン、イミダゾールカブオン、ベンゾイミダゾールカチオン、キ ノリニウム、インキノリニウム、キノリジニウム、環状置換キノリニウム、ピリ ジニウム、ピリミジニウム、ビリダジニウム、ピラジニウム、フエナントリジニ ウムおよびキノキサｌＪ＝ウム。異種原子が中性の酸化状態にある壇または環系 には上記のものの還元形が含まれる。 これらのｆｉｌまたは環系は下記の環または環系から誘導される。 アクリジン系　アゾール系 アクリジン　１，２．４−トリアゾールベンズ（ｃ）アクリジン ベンズイミダゾール キノリン系 キノリン イソキノリン キノリジニウムカブオン 環状Ｃ３，Ｃ４，Ｃ５−置換キノリン ピリジン／ピリミジン系　その他 複素ｆｊｌまたは環基は模式的構造式に示され工いない任意の置換基を含まなく てもよい。あるいは複素環または環系は異種原子を含めたいずれかの位置で、模 式的構造式に示されていない基により置換されていてもよい。これらの壌および 環基は、この徨の任意置換基によりｍ換されているかこれらを含まないかにかか わらず、ここでシス１ｖ１累榎または環系”の意味に含まれるものと考える。 可能な任意置換基は官能性または非官能性のいずれであってもよい。官能性１ｉ 換基には結合りの周囲にベリ相互作用を生じ、上記部分の溶解度を高め、かつ好 ましくは上記部分を蛋白質その他の物質に結合させるためのものが含まれる。上 記部分を蛋白質その他の物質に結合させるために有用な基には所望により官能化 されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アルキルアミノ、オキソアルキル、 デオアルキルもしくはアルキルオキシヵルボニルａＣ分枝または非分枝）または 所望により官能化されたアリール基が含まれるが、これらに限定されない。 アリール基は複素環または環系にアルキル、アルケニル、アル中ニル、アルキル アミノ、オキソアルキル、チオアル中ルまたはアルキルオキソカルボニル鎖によ り結合していてもよい。上記のほか、池の連鎖も当技術分野で周知である。任意 の官能基には下記のいずれかが言まれるが、これらに限定されないニ ーＣ’０．Ｒ，Ｒ−水１８ぶ子、アルキル％Ｌ＜はアリ−（ＪＲ −Ｎ（ＣＨ，）（、ＣＭ、　）、、Ｃｌ　、鵠−１以上−Ｎ、　および池の光不 女定官能基 −ＮＨ。 またはイオン、ｍ類、ポリアミドおよびポリオキシ化合物（たとえばポリオキシ エテレン、ポリオキシブプレンなど）。本発明化合物を蛋白質に結合させるため に有用な池の連鎖、基および官能基はジ（Ｊ（）、＠２官能性試薬１、Ｍａｔｈ 、Ｅｎｓｉｍｏｌｏｇｙ　９１　：　５８０（１９８３）　Ｋｍじられており、 これをここに参考として引用する。これらの結合用基な蛋白質その他の物質に結 合させる方法は、共有結合および弱い化学力の双方γ用い、当技術分野で周知で ある。 ヘリ相互作用を生じうるペリ置換基には、エステル、チオエステルもしくはアミ ド結合が結合している炭素原子、および／またはエステル、チオエステルまたは アミド結合内の炭Ｘ１子に対して立体障害を及ぼしつるいずれかの基が含まれる 。好ましいべ９１換基には短鎖アルキル基（たとえばメチル、エチル）およびア リール基（たとえばフェニル）が含まれる。ペリ置換基が存在する場合、これら はエステル、チオエステルまたＩエアミド結合が結合している炭Ｘ原子に＠隣接 する”、複素環または環系内の炭′Ｒ原子上に存在する。分子部分は２ｇＡ以上 のベリ置換基？含みつる。たとえばペリ置換基を下記の位置に配置することがで きる： ［ｃｌ　アクリジニウムおよびアクリダン中：Ｃ１およびＣ８上； ｔｂＪ　７エナントリジニウムおよび還元７エナントリジニウム中二〇７上； ならびに （ｃ）　キノリニウムおよび還元キノリニウム中：Ｃ３上。 Ｒ３により表わされるアリール環または】糸は少なくと４１個のｔＩＬ侠６貢虐 馨含む。エステル、アミドまたＩエチオエステル結合はこれらの６員環に直結し ている。Ｒ３にｉ１フェニル、ナフタリンおよびアントラセン糸など下記構造ン もつものが含まれるが、これらに限定されない。 ナフタリン アントラセン Ｒ３は下記の７’＜ｌ、Ｒ２およびＲ２′に関する置換基を含めていずれかの位 置において置換されているが、これらに限定されない。８１％Ｒ２およびＲ２” を含めて置換基は上記部分を蛋白質その池の物質に結合させるためにも用いられ る。この目的に通した基は先に述べた。 Ｒ２およびＲ２’は、Ｒ３上に、Ｒ３と″Ｕ累環または環系Ｑど０間の結合りの 加水分解に立体障害を与えるべく配置された嵩高な基である。々子ましくは、Ｒ ３がフェニル基であつ、エステル結合が１位に結合している場合、Ｒ２？よびＡ ２’は２および６（オルト）位に配置される。Ｒ２とＲ２′は同一であってもよ く、互いに異なっていてもよく、下記のいずれか乞含むことができる：アルキル または任意に官能化さｒ、たアルキル基アリールまたは任意に官能化されたアリ ール基−ＯＲ，Ｒ−アルキルまたはアリール −ＮＲ，、Ｒ−アルキルまたはアリール−１！Ｒ３，Ｒ−アルキルまたはアリー ル−ＣＯＯ− −ＣＣ）ＯＨ −ＣＯＯＲ，Ｒ−アルキルまたはアリール−ＣＯＲ，Ｒ−アルキルまたはアリー ル（Ｃ１１）％ＣＦＳ　、ｙｓ　−０〜ｌＯＣＮ −ＮＢ。 −ＮＯ。 −Ｎ（”ｍ　）ｍ −５Ｒ，Ｒ−アルキルまたはアリール −５Ｒ，、Ｒ−アルキルまたはアリール−５ｔ）！Ｒ，Ｒ−アルキルまたはアリ ールハロゲン。 要求される立体障害は、エステル結合が結合している６＾墳に”隣接”する、多 環Ｒ３内の池の壊によっても与えられる。たとえばＲ３−ナフタリンであり、エ ステル結合が１位にある場合、Ａ２は２位のメチル基であり、ｆ（ｚｆは次Ｘ原 子７〜ｌＯ個？含む”隣接”環である。このような場合、このＡ接環はここでは 上記結合の加水分解に立体障害を与える［１換基（Ｒ３内の６員環上にある）と みなされる。 Ｒ１はＲ３上のいかなる電子吸引基であってもよいが、好ましくは−ＮＯ，、− ｓｏ、ｃｔ、、−βｒ、　−Ｎ　（ＣＨ，）、および−Ｈから選ばれる。本明細 書および饋求の範囲全体？通して、′電子吸引基”とはシブ１２１０．０以上？ もついずれかの基を意原する。各種の基に関するシグマｐ１１の聚はハンシエ（ Ｍａｎｚｃｈ　）ら、Ｊ、Ｍｇｄ、Ｃｈａ鴨、１６（１１）：１２０９−１２１ ３（１９７７）ならびにノーンシュおよびレオ（Ｌｅｅ　）　”　Ｓｍｂａｌｉ ｔｓａ％ｇ　Ｃｏ％５ｔａｎｔｓ　ｆｏｒｃｏｒｒａｔａｔｉｏｎ　Ａｎａｘｙ ｓｉａ　ｉｎ　ｃ入−ｍｉａｔｒｙ　αｎｄＢｉｏｌｏｇｙ’　＋Ｃｈ、Ｇ　Ｊ 　ｐｐ、４９−５２　（ジョンΦワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、１ ９７９年）にあり、これら両者をここに参考として引用する。 若干の分子部分においては、　Ｒ１，ならびにＲ２およびＲ２’の一方または双 方が電子吸引基である（これらは同一であっても、互い（異なってもよい）。Ｒ １％Ｒ２およびＲ２′のうち２個以上が電子吸引基である場合、電子吸引基であ る基のみの加算シグマ、値（すなわちシグマ。 （［（０，０の基を除く）は約１．０以下であることが好ましい。加算シグマｐ １１が１．０より大きい若干の部分（工不安定である。 不発明の分子部分はＲ３上のＩｌｌ換基により蛋白質その他の物質に結合させる こともできる。ある種の電子吸引基は結合の手段として用いることができる。好 ましい電子吸引基のうち　−Ｓυ、ＣＥが蛋白質その池の物質に分子部分を結合 させるために用いられる。あるいは先に複素環または環系への結合に関して挙げ たいずれかの基をＲ３への１１１換基として結合させることができれば、これら も用いられる。これらの結合用基を蛋白質その他の物質に結合させる方法１工共 有結合および弱い化学力を共に利用するものであり、当技術分野で周知である。 前記の模式的構造式■において、２はエステル、チオエステルまたはアミド結合 が結合している炭Ｘ原子に、この炭素原子がＳＰ３混成である場合く結合する第 ２置換基である。２には下記のものが含まれるが、これらに限定されない。 Ｈ ハロゲン ＣＮ −〇Ｒ −Ｎ　Ｒ。 一＃　Ｒ。 ５Ｋ −５Ｒ。 −Ｓ、Ｒ −Ｎ　ＲＣ（Ｊ、Ｒ ＮＨＯＲ −ＣＲ（ＣＵＲ）！ −（、’Ｒ，ＮＯ。 −Ｇ”二〇〇Ｒ 一般に水素原子およびハロクンのほか、Ｚは一般式、／＜？ＬＸ　の核基のいず れかであってもよく、式中、ｘ−〇、Ｎ％ＳまたはＣ（Ｘの原子価の変化を収容 する適宜なｎの変化を伴う）、、およびＲ−いずれかの置換基（好ましくはアル キル、アリール、アミノ識または棚、置換されていてもよい）、および複翼の基 Ｒが所望により環構造を形成してもよい（たとえば下記のＺ基Ｒ１％およびＲｎ Ｘは薬物またはステロイド分子（またはそれらから誘導されたもの）であっても よい。 Ｚ　−Ｒｎ）−である化合物において、２はエステル、チオエステルまたはアミ ド結合の加水分解を阻止または防止する１フロノキング″部分として作用し、こ れによりこれらの化合物が不安定となる傾向を減少させる。ブロッキング対果は 下記により生じるＨ（ｌｌ　ＲｎＸ基の立体的嵩高す；これ；寡エステル、チオ エステルまたはアミド結合の加水分解を誘発または増大する化字種（たとえばア クリジニウム化合物の炭素９において偽似塩基を形成すると思われる化学種）に よる攻撃な物理的にブロックする：および１２１　炭素１ぷ子がＳｒからＳＰ３ 混成に変化したことにより生じる電子効果（これによってエステル、チオエステ ルまたはアミド結合はより胎訪族のエステル、チオエステルまたはアミド様の挙 ＳＶ示す）。Ｒｄ基を含む化合物を化学ルミネセンス誘発すべく始動させる際に は、これらはまずＲｎＸ基を脱離する酸で処理しなげればならない。これによっ て、過酸化物、塩基その他の開始剤を添加した際に化学ルミネセント反応が誘導 される（２−−Ｂまたはハロゲンである化合物には酸処理が不必要である）。Ｒ ａ基の特性および構造ｉ裏２因子のみにより限定されるＨ　（ＩＪ　ＲｎＸ基の 大きさは、この基な本発明化合物に後記の方法または他の合成法により合成する 際に株加しつるものでなければならない（すなわち、合成に際してＲｎＸ基が誘 導されるＲｎＸｆｉ種が太き丁き′て、立体効果のためこのｆｆｚＸ基をもつ本 発明化合物の合成が不可能になるほどであってはならない）、および（２１Ｒｎ Ｘ基は化学ルミネセント反応が開始する前に酸によって分子から脱離しつる立体 的および化学的性７７ｉｆｔもつものでなげればならない）。 本発明の他の分子部分は下記の模式的構造式をもつ：■。 式中、Ｑ％Ｚ、ＬおよびＲ４は前記のとおりであり、Ｒ５はいずれかの脱離基で ある。Ｒ５−Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ２’＋Ｒ３（模式的構造式■について先に述べたと おり）である分子部分のほかに、好ましい分子部分にはＲ５が置換または非ｌ！ 換アリール環または環基である分子部分が含まれる。これらの分子部分も前記の ようにベリ＃Ｌ換基な含むことができる。次式のフェニル−Ｎ−メチル−１゜３ −ジメチル−アクリダン−９−メトキン−９−カルボＣＭ。 は好ましい分子部分であり、これはＺ　／　ＲｎＸ基（Ｃ９上ｖ）ＣＨ，０−） を含み、ベリ置換基（ｃ’１上のＣＦＩｍ−）ｗ含み、非置換フェニルエステル である。 不発明の池の一群の分子部分は下記の模式的構造式をもつ。 ■。 式中、５０．−Ｒ”−Ｙ　は脱離基であり、Ｑ、２！：、ＬおよびＲ４は前記の とおりであり、ＲｒおよびＲ“はアルキル、アルキレン、アリール、任意に置換 されたアルキル、任意に置換されたアルキレン、任意に置換されたアリール、ア ルキルオキシ、アリールオキシ、ハロ、所望により保護されたアミノ、置換され たアミノヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、オキシ、チオ、イミノ、所望によ り置換されたメルカプト、複素環およびヘテロアリール基よりなる群から選ばれ 、Ｙは水素ぶ子、カルボキク、カルボニルハライド、スルホニルハライド、カル ボアルコキシ、カルボキシアミド、カルボアリールオキシ、シアン、カルボキシ イミド、インシアナト、イソチオシアネート、スルホ、Ｎ−スクシンイミジルカ ルボキシおよびＮ−７１／インイミドよりなる群から選ばれる。これらの分子部 分は前記のようにペリ置換基を冨むこともできる。 本発明のさらに他の一群の分子部分は下記の模式的構造式？もつ： 式中、　Ｖ−Ｒ”’は脱離基であり、Ｑ、ＺおよびＬは前記のとおりであり、ｒ は脂肪族または芳香族残基であり、Ｒ″′はこの分子部分を蛋白質その他の特異 的結合パートナ−に結合させるために有用な愚である（前記のとおり）。 これらの分子部分は前記のようにペリ置換基を含むこともできる。 本発明のさらに他の一群の分子部分は下記１７．）模式的構造式？もつ： ■。 式中、Ｑ％ＺおよびＬは前記のとおりであり、Ｗは脱離基であり、５ｒ１ｚスル ホンアミドまたはスルホカルボニル基である。これらの分子部分は＠紀のように ベリ置換基を含むこともできる。 上記の改良された化学ルミネセント部分は試料中の被分析体の存在に関する広範 な特異的結合アッセイに有用である。１存伍”とはここでは被分析体の定性的お よび／または定量的検出を意味する。これらのアッセイ法は、これらの改良され た化学ルミネセント部分を特異的結合反応と組合わせて用いることによって検出 しうるいかなる被分析体をも対象とする。これらのアッセイ法に蚤゛エイムノア ツセイ、蛋白質結合アッセイおよび核酸Ｉ・イブリダイゼーションアツセイが含 まれるが、これらに限定されない。 一般的なイムノアッセイ法においては、被分析体は免疫反応性であワ、試料中に おけるその存在が、それとアッセイ試薬との免疫反応によって判定される。一般 的な蛋白質結合アッセイ法においては、試料中の被分析体の存在が被分析体とア ッセイ試薬の特異的結合性によって判定され、この場合反応性は免疫反応性以外 のものである。これの例には酵素−基質認識、およびビオチンに対するアビジン の結合親和性が含まれる。一般的な核酸ハイブリダイモーションアッセイ法にお いては、試料中の被分析体の存在が被分析体とアッセイ試薬のハイブリダイゼー ション反応によって判定される。被分析体である核ＩＩＣ通常は二本鎖ＤＮＡま たはＲＮＡとして存在する）は通常まず一本鯖状に変えられ、キャリヤー（たと えばニトロセルロース紙ン上に固定される。あるいは被分析体である核酸ＩＸゲ ルマトリックス中に電気泳動される。 次いでこの固定化された被分析体が桟板の相補的配列によってハイブリダイズさ れる（すなわち特異的結合する）。 以上の特異的結合アッセイ法は多種多様なアッセイ形態で行うことができる。こ れらのアッセイ形態は大まかに２カテプリーに属する。第１カテゴリーの場合、 アッセイには特異的結合物質に結合した上記の改良された化学ルミネセント部分 からなる化学ルミネセント抱合体を用いる。“特異的結合物質”とは、ここでは この物質が限られた種類の生物字種、生化字種または化学種と特異的に反応する 免疫反応、蛋白質結合反応、孤酸ハイブリダイゼーション反応その他の反応によ って特異的に結合するいずれかの物質を意味する。このカテゴリーのアッセイ法 において１１、化学ルミネセント抱合体が特異的結合反応に関与し、試料中の被 分析体の存ａは化学ルミネセント抱合体を含む特異的結合反応生成物Ｉｆｆまた は２種以上の生成に比例する。このアッセイ法は要求される特異的結合反応を適 切な反応条件下で行わせることによって実施される。化学ルミネセント抱合体を 含む特異的結合反応生５ｙ、′＠の生成は、化学ルミネセント抱合体を含むこれ らの生成物の化学ルミネセンスを測定することにより、またはこれらの生成物中 に含有されない未反応の、もしくは部分的に反応した化学ルミネセント抱合体の 化学ルミネセンスを測定することにより測定される。 この第１カテゴリーのアッセイ形態はたとえばサンドイッチアッセイ、競合アッ セイ、表面Ｍ、原アツ七イ、逐次飽和アッセイ、競合置換アッセイおよびケンテ ングアツセイである。 サンドイッチ形態においては、化学ルミネセント部分が結合している特異的結合 物質は被分析体と特異的結合することができる。このアッセイ法はさらに、被分 析体と特異的に結合して反応体−被分析体−化学ルミネセント抱合体複合体を形 成しうる反応体を用いる。反応体は一相に結合させることができ、これにはディ ツプスティック、ビーズ、テニーブ、祇またはポリマーシートが含まれるが、こ れらに限定されない。この場合、試料中の被分析体の存在は特異的結合反応が終 了したのちの固相の化学ルミネセンスに比例するであろう。この種０アッセイ形 態についてはさらに米国特許第４，６５２，５３３．４．３８３，０３１，４， ３８０，５８０．および４，２２６．９９３号明細書に論じられており、これら なここに参考として引用する。 競合形態においては、被分析体と特異的に反応して被分析体−反応体複合体を形 成し、また化学ルミネセント部分が結合している特異的結合物質と結合して化学 ルミネセント抱合体−反応体複合体を形成しつる反応体をアッセイに用いる。反 応体は面相に結合していてもよく、あるいは反応体な含む反応生成物を第２抗体 の使用により、または他の既卸の方法でｖｃ殿させてもよい。この競合形態の場 合、被分析体の存在は面相または沈殿の化学ルミネセンスに°比例”すなわち反 比例する。このアッセイ形態についての考察はさらに上記の米国特許明細書にあ る。 他のアッセイ形態の場合、被分析体は比較的大形の生物字種、生化学種または化 学棟上に、またはこれらに結合した状態で生じるであろう。この種類の形態（ま たとえば表面抗原アッセイ法である。この形態においては、特異的結合物質は被 分析体と特異的に結合することができ、被分析体の存在は反応生成物として形成 される被分析体−化学ルミネセント抱合体複合体に比例する。これはたとえば細 胞上１７）表面抗原に特異的な抗体への化学ルミネセント部分の結合である。細 胞表面抗原の存在は反応終了後の細胞の化学ルミネセンスにより示される。細胞 自体を濾過システムと併用して、細胞表面に形成された被分析体−化学ルミネセ ント抱合体複合体を未反応の化学ルミネセント抱合体から分離することができる 。これについてはさらに米国特許第４．６５２．５３３号明細書に論じられてい る。 改良された化学ルミネセント部分は当技術分野で知られている池のアッセイ形態 に用いることもでき、これには逐次飽和法および競合置換法が含まれるが、これ らに限定されない。これらＩ家両者ともｔｌ＋　上記の分子部分が結合している 特異的結合物質、および（２）　被分析体、の双方が反応体と特異的に結合する 。逐次飽和法の場合、被分析体がまず反応体と反応し、次いで化学ルミネセント 宿合体が残存する未反応の反応体と反応する。競合置換法の場合、既に反応体に 結合している被分析体を化学ルミネセント抱合体が競合＋１換する。 ケンチング形態の場合、このアッセイ法は被分析体と特異的に結合して被分析体 −反応体複合体を形成し、かつ化学ルミネセント部分が結合している特異的結合 物質と結合して化学ルミネセント抱合体−反応体複合体を形成しうる反応体を用 いる。クンチング部分は反応体に結合している。ケンチング部分は、化学ルミネ セント部分に接近させると化学ルミネセント部分の化学ルミネセンスを消光する 。このケンチング形態においては、被分析体の存在は化学ルミネセント部分の化 学ルミネ七スに比例する。この形態についての考察はさらに米国特許第４．２２ ０．４５０および４，２７７．４３７号明細書に記載されており、これらをここ に参考として引用する。 以上に述べた各アッセイ形態および以下に述べる形態において、アッセイ試薬を 添加および反応させる順序は当技術分野で周知のとおり広範に変更しうる。たと えばサンドイッチアッセイ法の場合、固相に結合した反応体を試料中に含有され る被分析体と反応させ、この反応ののち、複合体形成した被分析体を含む固相を 残りの試料から分離する。この分離工程後に化学ルミネセント抱合体な固相上の 複合体と反応させることができる。あるいは固相、試料および化学ルミネセント 抱合体を同時に添加し、反応させたのち分離することもできる。さらにまた、こ れより好ましくはないが、試料中の被分析体と化学ルミネセント抱合体を反応さ せたのち、固相上の反応体１に：Ｉ！Ａ加することもできる。ｆａ合アッ七イ形 態および当技術分野で知られている他の形態についても、混合および反応工程に おける同様な変更が可能である。特異的結合反応生成物ｔ″通切な条件下で夾質 的に生成させる１ことは、ここではアッセイ試薬の添加および反応の順序につい ての多数の異なる変法を含む。 第２カテゴリーのアッセイ形態の場合、アッセイには抱合体を形成していない改 良された化学ルミネセント部分を用いる。試料中の被分析体の存在は、１種また は２種以上の特異的結合反応生成物（それら自体は化学ルミネセント部分を含ま ない）の生成に比例する。代わりに化学ルミネセント部分がこれらの反応生成物 の生成に比例して化学ルミネセンスを発する。 この第２カテゴリーのアッセイの−５においては、被分析体と結合して被分析体 −反応体複合体？形成し、これが化学ルミネセント部分に化学ルミネセンスを発 生させうる反応体をアッセイに用いる。これはたとえば被分析体が基質グルコー スであり、反応体が＃素グルコースオキシダーゼである単純な＃素−基質アッセ イ法である。 酵素−基質複合体の生成により化学ルミネセント部分が始動する。グルコースに 関するこの狸の酵素−基質アッセイ法は米国特許第３．９６４，８７０および４ ，４２７．７７０号明細書に示されており、これら両者をここに参考として引用 する。この酵素−基質アッセイ法は、抗原が抗体に結合するのと週とんと同じ様 式で基質が酵素の活性部位に特異的に結合するという重体で、特異的結合アッセ イ法である。このアッセイ法においては、＃累が基質と％異的に結合し５その結 果過緻化物が産生され、これが化学ルミネセント部分に化学ルミネセンスを発生 させる。 同様に第２カテゴリーのアッセイ法に含まれるものは、反応生成物の生成によっ て、よりＬｌ［接的でない様式で化学ルミネセント部分による化学ルミネセンス が促進または阻害されるアッセイ法である。このアッセイ法においては、被分析 体と父叉反応性である第１反応体を酵素、たとえばグル；−スオキシダーゼの反 応部位付近に結合させる。被分析体および免役反応性物質の双方に対し特異的で ある第２反応体を、基質（すなわちグルコース）の存在下で試料および上記の変 化した酵素に添加する。 酵素上の活性部位付近に位置する第１反応体に第２反応体が結合すると、第２反 応体は活性部位をブロックし、これにより基質は酵素の活性部位に結合すること ができず、または活性部位への基質の結合が有意に低下する。 こうして＃素をブロックしている第２反応体は酵素が過酸化物を産生ずるのを阻 害する。これは化学ルミネセント部分を始動させるはずのものである。しかし試 料中の被分析体は第２反応体と結合し、従って第２反応体が過酸化物の産生を阻 害するのを妨げる。被分析体の存在は上記分子部分の化学ルミネセンスに比例す るであろう。 以上２カテゴリーのアッセイ形態に包含されるアッセイ法は不均質または均質で ある。不均質アッセイ法の場合、灰石生成−一その生成は試料中の被分析体の存 在に比例する−を反応の他の物質から分離する。分離は一過、ミクロフィルトレ ージョン、二重抗体ｖｃ殿法、遠心分離、サイズエクスクル−ジョンクロマドグ ｙフィー、試料溶液からの固相（たとえばディツプスティック）の取出し、また は電気泳動により固相から液相を分離することを含めたいずれかの手段により行 われるが、これらに限定されない。たとえばサンドインチアッセイ法の場合、反 応体−被分析体−化学ルミネセントｍ合体複合体を未反応の化学ルミネセント抱 合体から分離する。表面抗原アッセイ法の場合、被分析体−化学ルミネセント抱 合体を未反応の化学ルミネ七ント抱合体から分［る。 競合アッセイ法の場合、反応体−化学ルミネセント抱合体複合体を未反応の化学 ルミネセント抱合体から分離する。逐次飽和アッセイ法および競合１換アツセイ 法の場合、反応体−化学ルミネ七ント抱合体を未反応の化学ルミネセント抱合体 から分離する。あるいは均質アッセイ法においては、反応生成物は分離されない 。アッセイ反応体を反応させたのち、混合物が溶液状であるか、同相であるか、 またはディツプスティックその他の固形支持体の種々の膜層間に分布しているか に関係なく、アッセイ混合物全体から化学ルミネセンスを測定する。グルコース オキ７ダーゼおよび化学ルミネセント部分ケ用いるグルコースアッセイ法は、分 離′％：要しない簡単な均質アッセイ法の一例である。ケンチングアツセイ法は 分離を要しない均質アッセイ法の、より複、４なアッセイ法の一例である。いず れかのカテゴリー（’）アッセイ形態も不均質またＩ工均誓いずれの形Ｂｔも生 じうると考えられる。 最後に、１化学ルミネセンスを測定する”ことには、試料中の被分析体の存在に 比例して生成する特異的結合反応生成物を反応の他の物質から分離する作業が関 与する場合、これ１＋、含まれる。また、（１）化学ルミネセント部分を酸で処 理してこの部分からＺＣ，−’！なわちＲｎＸ　）を開裂させる作業、および／ または（ｌＩｊ　反応生成物の生成目体が化学ルミネセント部分を始動させない アッセイ形態の場合は、化学ルミネセント部分を化学ルミネセンス発光すべく始 動させる作業が関与する場合、これらをも含む。 発光基の合成 以下の実施例）１本発明のある化学発光基の合成を示し本発明の好ましい化学発 光基は、以下の化学式な有する（２Ｉ６−ジメチシトロ−二トロ）フェニル−３ −（３−サクシニミジル−オキ７カルボニル）プロピルオキシル−Ｎ−メチル− アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホン＠（あるいを工塩素、 ３７）化酢酸塩、硫１１ｉ！塩などのその他の対イオン）である。 （２，６−ジメテルー４−二トロ）７エ＝ルー３−（３−サクタニミジルーオキ シカルボニル）プロピルオキシに−Ｎ−メナルーアクリジニウムー９−カルボ中 シレートフルオロスルホン散ハ以下の模式図にしたがって合成される。 Ｃ０ＮＴ！ＮＵＥＤ　ＮＥＸｒ　ＰＡＧＥ（ｌＯ） イサチン（１）とレゾルシノール（２）との給金により３−ヒドロキシアクリジ ン−９−カルボン酸（３）が生ずる。ベンジル−４−ブロモＷＩＡ１１との反応 により、エーテル化された３−ヒドロキシル基な持つエステル（４）を生ずる。 酸加水分解は両方のベンジル基を遊離し、その結果ジカルボン酸（５）が生ずる 。プロピロキシル基のカルボキシル基の選択的な再ベンジル基置換は９−カルボ ン酸（６）を与える。 ２．６−シメチルー４−＝）ｅｌフェノールのエステル化とアクリジンの窒素の メチル化は、（８）を与える。Ｅ　Ｂ　Ｆを用いたカルボキシル基の脱保護とＤ ＣＣによるＮ−ヒドロキシサクシンイミドとの縮合により、（２，６−シメチル ー４−二トロ）フェニル−３−（３−サクシニミジル−オキシカルボニル）フロ ビロキシルーＮ−）ｆルーアルリシ二つムー９−カルボキシレート７Ｊ％／オロ スルホン酸が得られる。これらの反応は以下に更に詳細に運べらｎている。 ４−ブロモ塩化ｋｓＨ（１３，８ｆ　、　７５　ｍｖａｏｌｅ）をＺｏ。 嶋の丸底フラスコにいれた。このフラスコをドライアイス／四塩化炭素浴な用い て一２０℃に冷やした。Ｎ−メチルモル７オリン（７，５８Ｆ、７５嘱懸６Ｊ＃ 　、　８．２１Ｌｌ）含む酢酸エチル（５０−）を注意深く加えた。ロートを用 い、ベンジルアルコール（６，９７９，６，６７１ｊ、６．６４ｔｓｍｏＥａ） を滴下した。銑加後、浴を除き、混合液を２時間攪拌した。産物は酢酸エチル（ ５０μ）を用いて分離用ロートに移し、炭酸ナトリウム（１０％）で１（ロ）洗 い、次に水で２回洗い、無水ａｍナトリウムで乾燥した。 溶媒を蒸発させることにより、油状のベンジル−４−プロ毫−酪酸な与える（収 率＝９１％）。 イサチン（１１（１，８８ｆ　）は、水（３，５１Ｌｔ）に溶解した水成化カリ ウム（５，０７ＩＰ　、０．０９　ｓ＋ｅＪ＊）溶液に緩やかに加えた。反応を 行なうフラスコな油浴中で約５０℃に加熱した。約ＩＱＷＬｔの水を更に滴下し た。レゾルシナ−Ｊｙ（２）（１０ｆ　、　０．０８９ｓｏ！＊　）を加え、攪 拌を続けながら温度を１００℃に上げ、その結果溶解混合物の形成を見た。更に イサチン（１１（１，８８？　）な県加した。反応フラスコ（３つ百の丸底）を 窒素ガス吸入口にと９つけ、窒素ガス流によって水蒸気を除いた。混合液を１２ ５℃で４時間攪拌した。水（７０ｗＬｔ）を加え、内容智を攪拌を続けることに より溶解した。混合物をアーレンメイヤーフラスコに移した後、水で容量を２０ ０１に合わせた。νＢを濃塩酸により２．０にＴＡ！ｉｔ、た。濾過し、固形物 な水で洗うことにより、粗アクリジン酸が与えられた。 次にとｎを２　ＮＮａ０Ｅ　（１００１１４）　Ｋ溶解し、この溶液をセライト でＦ遇した。セライト床を２００−の１ＮＮａＯＢで洗った。Ｐａａは濃塩酸で ｐＨ２，０の酸性に合わせた。２−ヒドロ井７−アクリジンー９−カルボン＠（ （支）の沈澱を一過し、水で洗い、ｐｔｏ、上で真壁乾燥した（収率＝４２％） 。 ３−ヒドロキシ−９−アクリジンカルボン２（３）（４ｔ。 ０、Ｏ１７ｅｅｌｇ　）、　ベンジル−４−ブロモ酪ｆｆ１（１４，ｓ？　、　 ０．０５７　ｍＤ！ｓ）および炭酸セシウム（２２，１６Ｌ０．０６８倶Ｏ！＃ ）を２５０１容の丸底フラスコ中のＤＭＳＯ（１２５１Ｌｔ）に溶解した。フラ スコな油浴中で約５０℃に加温した。この温度で１時間混合液を攪拌した後、こ の混合液を水（１リツトル）に加えた。木場の懸濁液を炭酸ナトリウムで酸性に した後、沈澱した産物をクロロホルムで抽出した。礼煉し、クロロホルムを蒸発 させることＫより、３−（３−ベンジルオキシカルボニル）−プロピルオキシ− ９−（３−ベンジルオキシ−カルボニル−プロピル）アクリジンカルボン酸塩（ ４）を与え、これはクロロホルムを溶媒として用いたシリカゲルカラムでクロマ トグラフィーを行なった口ＣＢＣち／ＥｔＯＡａ、９／１を用〜・た薄層クロマ トグラフィーにおけるＲ１値０，３６の両分を取った。溶媒は蒸発乾固した（収 率＝５５％）。 ３−（３−ベンジルオキシカルボニル）−フロビルオキシ−９−（３−ベンジル オキシ−カルボ；ループロピｐｖ）７り’）シンカｙｙｙ：ｙｇ１１塩（４Ｊ　 （４，９３ｔ　、　８．３ｔｗＬｓ）は２Ｎ　Ｎｏ０Ａ　（３００鮎）とメタノ ール（３００ｄ）の混合液に加えらｎた。この混合欣を室温で４８時間攪拌した 。メタノールを回転乾固装置で除き、浴液を濃塩酸によりｐＨ６，ＯＫ、ｎＭし た。沈澱した固体な濾過し水で洗い、酢販エチルに溶解した。この溶液を乾固し 、溶媒を蒸発乾固することＫより３−（３−カルボキシ）プロピルオキシ−アク リジン−９−カルボン酸（５）が与えられる（収率＝９２．８％）。 ３−（３−カルボキシ）プロピルオキシ−アクリジン−９−カルボン酸ｆ５１（ １，５？　、　４．６鵡懸・ｉｍ）をＤＭＡＰ（ｇＱｉｌ、１．３−ジメチル− ３，４，５，６−チトラヒドコ２（ｌＢ）ピリミドン）中に暖めながら溶解した 。 ベンジルアルコール（０，５ａｔ、　０．５２９　、４．８ｍｔｒ＋ｏ１ｍ）、 １．３−ジクロロへキシルカルボジイミド（１，０４ｆ。 ５．０ｍｎ５ｏに−）およびＮ、Ｎ−ジメチルアミノビリジン（０，２ｆ　、　 １．６　ｖｐｈｍｏｌｍ）を、ドライアイス７ｃ　ｃ　７　、浴中で予め冷やし １おいた反応液に加えた。この混合液を室温で、窒素ガスを流入させながら１５ 時間攪拌した。この混合液な飽和塩化ナトリウム（３２ｏｗＬｔ）に加えた。３ −（３−ベンジルオキシカルボエル）プロピルオキシ−アクリジン−９−カルボ ン駿（６）を−過し、少量の水で洗った。Ｍ＠は、ＣＢＣも／ＭａＯＢ、　９５ 　／　５を溶媒として用いたシリカゲルカラムでクロマトグラフィーな行なった （収率＝２６％）。 ３−（３−ベンジルオキシカルボニル）プロピルオキシ−アクリジン−９−カル ボン酸（６）（０，５？　、　１．２惰鵡０！＃）およびｐ−トルエン塩化スル ホン識（０，４６Ｆ。 ２．４＋ｓｍｏＬｍ）をピリジン（２０１ｕ）に溶解した。この溶液をドライア イス／（”Ｃ１４浴で１５分間冷却した。２゜６−シメチルー４−二トロフェノ ール（０，２■、１．２湧ｍ＋ｅＪｓ）を沈え、冷却浴を除き、混合液を室温で １５時間攪拌した。これを水（４ｓｏａ４）に加え、瀝塩酸によつｐＨを２．０ に調整した。産物を濾過し、水で洗った後真空乾燥した。粗産物はクロロホルム を溶媒として用いたシリカゲルカラムでクロマトグラフィーした。ＣＥＣ１ａ／ ＥｇＯＡａ、　１　：　１を用いた薄層クロマトグラフィーにおけるＲ１値０． ８の画分な取った。溶媒を蒸発乾固するとトに！’）、（２、６−シメチルー４ −二トロ）フェニル−３−（３−ベンジルオキシカルボニル）−フロビルオキシ −アクリジン−９−カルボン酸塩（力を与えた。（収率＝４７％）。 アクリジン（り（０，３２ｆ’、０．５６惟鴇ｏ１φ）は無水塩化メチ１／ン（ ４１）に溶解し、メチルフッ化スルホン酸塩（０，２７ｄ　、　３．３６ｔｈｍ ｏ１ｍ、　６モル当量）を加えた。混合液を室温で１５時Ｎ］僕押した。無水エ ーテル（２０１Ｌｇ）を龜加した。（２，６−ジメチ／ｌ／−４−二トロ）フェ ニル−３−（３−ベンジルオキシカルボニル）プロピルオキシ−アクリジニウム −９−カルボキシレートフルオロスルホン酸（８１は濾過され、エーテル（ｓｏ ｍａ）で洗われた口収早は定型的であった。 ベンジル基で保護されたアクリジニウムエステル（８）（２５０ｎｆ）を３０％ Ｂ　Ｂ　ｒ　／酢散（３ｍ１）により５５℃２時間処坤した。産物を沈澱させる ために、無水エーテル（２ＯＮ）を加えた。固形物をテ遇し、ニー・チルで洗う ことにより（２，６−ジメテルー４−二トロ）フェニル−３−（３−カルボキシ ル）プロピルオキシ−アクリジニウム−９−カルボキシレートフｙオロスルホン 識塩（９）が与えられた。アセトニトリルからの結晶化により純粋な化合物が与 えられた（収単＝８０％）。 ５０−容の２首の丸底フラスコに加えた、脱保護化されたアクリジニウム（９） 　（６７〜−０，１３Ｍ鴨・１ｍ）を無水のアセトニトリル（１０Ｍ）に溶解し た。ジシクロへキシルカルボシイきド（ＤＣＣ、３３ｗＩｇ、　０．１６ｓ集・ Ｉｇ）を加え、この混合液を室温で４５分間攪拌した。 Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（１７■＝　０．１５ｓｖ＋ｎ！＊）を添加し、 反応を２．５時間続けた。叉にＤＣＣ（１４■）とＮ−ヒドロキシサクシンイミ ド（８１１９）を添加し、１．５時間後に等量さらに添加した。最後に添加して から１．５時間後、過剰のＤＣＣを除くために氷酢酸（１，７’Ｊツトル）を添 加した。溶媒は真空乾燥して除いた。 粗産物を午！４製用Ｃ，，−ダイナマックスＥＰＬＣカラム（ライニン機器有限 会社、ウォバーン、マサテ二−七ツツ州より市販されている）で、ＣＭ、ＣＮ／ Ｈ，０（０，１％トリフルオロ酢駿）　６０／４０を用い、１．８１Ｌｊ／’Ｐ ａ＜ｓの流速で、検出には３６０％ＩＩ６を用いることにより精製された。保持 時間９．４分の画分を集め、真空中で溶媒を除いた。（２，６−ジメテルー４− 二トロ）フェニル−３−（３−サクシニミジル−オキシカルボニル）プロピロル オキシル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホン酸塩（ｌＯ ）は、ホスホラスベントキシドを宮むデシケータ−中、減圧下で乾燥させた（収 率＝３３％）ＭＳ”、ＦＡＢ、チオグリセロール担体、５８６　ＣＭ＋九ＥＰＬ Ｃ：ライニン’ＩＩダイナマックス（１０■×２５絽）、ＣＭ、ＣＮ／Ｅ、Ｏ（ ０，１％トリフルオロ酢酸八へ６０：４０１流速１．８ｄ／講ｉ、保持時間９． ４分、検出は３６０％鶴で行なった。 実施例２゜ 本発明のもう一つの好ましい基は、以下の化学式を画する（２．６−シメトキシ ー３−クロロスルフォニル）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カル ボキシレートフルオロスルホン酸塩である。 （２，６−シメトキシー３−クロロスルフォニル）フェニル−Ｎ−メチル−アク リジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホン酸塩は、以下の模式図にし たがって合成される。アクリジン−９−カルボン！！（１１）を２．６−シメト キシフエノール（１２）により、酸塩化物を経てエステル化することＫよりエス テル（１３）が得られる。アクリジンの音素をメチＡ／　７　／Ｌ／オロスルホ ン酸塩でメチル化し、次に塩化スルホン酸により塩化スルホン化することにより （１５）を与える。これらの反応は以下でさらに詳細に述べられる。 ２５０１容の丸底フラスコ中のアクリジン−９−カルボン酸（１１）　（６，１ ０？　、　０．０２　’７ａ＊！ａｓ）にチオニルクロリド（１３０１１７）を 混合し、この混合液を攪拌しながら２時間還流した。過剰量のチオニルクロリド は、回転蒸発乾固装置で除いた。浅さをベンゼン（７５ｍ）で処理し、この溶媒 を減圧下で除き、残存するチオニルクロリドを除去した。アクリジン−９−カル ボニルクロリド（１１）の残さな、ピリジン（１３Ｑｍ）および２．６−シメト キシフエノール（１２）（４，１６ｆ、０．０２７ｍｏｌｅｓ）と混合した。こ の混合液を（約６０℃の）湯浴で加温し、固形物をすべて溶解した。室温で１５ 時間攪拌した後、この混合液を１リツトルの水に注いだ。この懸濁液を濃塩酸を 用いてｐＨ２，０に調整した。固形物をＰ）ＩＩＬ、　水で洗浄し、クロロホル ムＫＭ濁した。（無水硫酸ナトリウムを用いて）乾燥し、クロロホルムを蒸発乾 固すると（２＃６−ジメトキシ）フェニル−アクリジン−９−カルボン＆（１３ ）が得られた。これは、　ＣＥＣ１゜／ＥｔＯＡａ、　９８　：　２を溶媒とし て用いたシリカゲルカラムでクロマトグラフィーされた。おなし溶媒を用いた薄 層クロマトグラフィーにおけるＲｆ値０．１９の画分を取り、溶媒を蒸発乾固す ることにより純粋なエステル（１３）が得られた。（収単＝３０％）。 （２，６−ジメトキシ）フェニル−アクリジン−９−カルボキシレー）　（１３ ）（２，１０ｆ　、　５．６ｗｍｏ！ｓ）を、２５０−容の丸底フラスコ中のジ クロロメタン（１１０−９無水智）に溶解した。メチルフルオロスルホン陵（４ ，６３ｙ　、　６．４８　ｔｍｍｏＸａｓ　）を仄え、この混合液を室温で１５ 時間攪拌した。無水エーテル（ｌｏｏＩＬｔ）を添加し、０．５時間と濁液を攪 拌した後、沈澱した明黄色の固形物を一過した。この固形物をエーテル（約１０ ０ｍ７）でよく洗い、次にペンタン（５Ｑｄ）で良く洗浄した。 アクリジニウムはアセトニトリルから再結晶化し％２＋６−シメトキシーフエニ ルーアクリジニウムー９−カルボキシレートフルオロスルホン酸（１４）（収率 ＝８１％）。 乾燥した２百の２５１容の丸底フラスコ中に、（２゜６−ジメトキシ）７エ二ル ーアクリジニウムー９−カルボキシレートフルオロ−スルホン酸（１４）（１０ １，７〜。 ０．２１５ｍｗｈｏ１ｍ）および磁気攪拌子、無水ＣＥ、１４．　（５−）ない れた。この懸濁液を攪拌し、ＣＣＪ４／今°ライアイス浴中で一２０℃に冷やし た。塩化スルホン＠（７２リツトル、　０．１２５　ｆ　、　１．０７ｓｍｏ＆ ｓ）を添加し、−２０℃で３０分間攪拌を続けた。次に、この反応液を徐々に室 温に戻し、さらに２時間攪拌した。反応フラスコに無水エーテル（５−）を添加 することにより明黄色の沈澱が生じた。これを−過し、エーテルで先金に洗った 。減圧下で乾燥することにより、（２Ｉ６−シメトキシー３−クロロスルフォニ ル）フェニルーアクリシニ？、−９−カルボキシレートフルオロ−スルホン酸（ １５）が与えられた（収率＝９３．４％）。ＭＳ：ＦＡＢ。ジチオスレイトール ／ジチオエリスリトール担体、４７２ＣＭ　）。 実施例３゜ 本発明のもう一つの好ましい基は、以下の化学式を有する（２．６−シメチルー ４−ブロモ）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフ ルオロスルホン酸塩である。 （２，６−シメチルー４−ブロモ）フェニル−Ｎ−メチルーアクリシニウムー９ −カルボキシレートフルオロスルホン酸塩は、（２，６−シメトキシー３−クロ ロスルフォニル）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレー トフルオロスルホン酸塩で用いられた直換されたフェノールに対し、２＃６−シ メチルー４−ブロモ）フェノールを置換したもので、（２，６−シメトキシー３ −クロロスルフオニルノフェニルーＮ−メｆルーアクリジニウムー９−カルボキ シレートンルオロスルホン酸塩と同様なエステル化によって合成された。 実施例４゜ 本発明のもう一つの好ましい基は、以下の化学式を有−ｊる（２．６−シメチル ー３−クロロスルフォニル）フ二二ルーＮ−メチル−７クリジニクムー９−カル ボキシレートフルオロスルホン酸塩である。 （２，６−ジメチ、Ｉ＋／−３−クロロスルフォニル）７エ二ルーＮ−メチル− アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホン酸塩は、エステル化段 階において２．６−シメトキシフエノールに対して２．６−シメチルフエノール を置換することにより、（２，６−シメトキシー３−クロロスルフォニル）フェ ニル−Ｎ−メｆルーアクリジニウムー９−カルボキシレートフルオロスルホン醸 塩と同様な方法によって合成された。 実施例５゜ 本発明のも５一つの好ま１−い基は、以下の化学式を有スル（２＋　６−シメチ ルー４−ニトロンフェニル−３−（３−スクシンイミジルオキシカルボニル）プ ロピルオキシ−９，１０−ジヒドロ−Ｎ−メチル−アクリダン−９−カルボン徹 塩である。 ＣＭ。 （２，６−シメチルー４−ニトロ）フェニル−３−（３−スクシンイミジルオキ シカルボニル）プロピルオキシ−９，１０−ジヒドロ−Ｎ−メチル−アクリダン −９−カルボン酸塩は、アクリジニウム酸（９）から合成された。 酸（９）をソデイウムシアノボロヒドリドで還元すると、アクリダンを与え、こ ｔは次に無水物混合法（ζよりＮＦＳエステルに転換される。これらの反応は以 下でさらに詳細に述べられている。 アクリジニウム酸ｔ９Ｂ２１０■、０．３７％想６１ｍ）はアセトニトリルと０ ．１ＭリンａＳＳ液、ｐＥ　５．２　（６０１’　）の１一１混合液に溶解され た。ソデイウムシアノボロヒドリド（１９０〜）のアセトニトリル（５−）溶液 を、この７クリジニウム浴液ＶＣ滴下した。この結果溶液の黄色が退色する。攪 拌は１５分間継続された。アセトニトリル（１００１１７）をみ加し、溶媒を回 転蒸発乾固装置で除いた。水に懸濁した状態の残さを酢酸エチルで抽出する。有 機膚な水で洗い、乾燥させた。溶媒を除くことＫより（２，６−シメチルー４− 二トロ）フェニル−３−（３−カルボキシル）プロピルオキシ−９，１０−ジヒ ドローアクリダン−９−カルボン酸塩が得られた（収率＝９０％）。 アクリダン（１２５Ｒ９，０，２５５ｔｈｆｉｏ１ｍ’）およびＮ−メチルモル フォリン（２８リツトル）を無水アセトニトリル（１５ａｊ）に溶解した。この 混合液を窒素ガス下、ＣＣｔＪドライアイス浴中で冷却した。イソブチル塩化蟻 酸塩（３５リツトル）を添加し、この混合管を３分間攪拌し、アセトニトリル（ ２１）に溶解したＮ−ヒドロキシサクシンイミド（３５■）を添加した。−２０ ℃で１５分間攪拌した後、ＣＣ１，／ドライアイス浴を除き、反応液を室温に戻 した。２時間後溶媒を蒸発乾固させ、残さな酢酸エチルで抽出した。不溶性のＮ −メチルモルフォリン塩識塩を濾過により除去した。ｐ液を濃縮し、ヘキサン（ ２１７）を加えた。これを冷却することＫより（２＃６−ジメチ／Ｉ／−４−二 トロ）フェニル−３−（３−サクシンイミジルオキシーカルポキシル）プルピル オキシ−９，ｌＯ−ジヒドロ−Ｎ−メチル−アクリダン−９−カルボン翫塩の結 晶が生ずる。この結晶は最終的に濾過され、ヘキサンで洗われた（収率＝７０％ ）。ＭＳ：　Ｆ７４Ｂ、ジチオスレイトール／ジテオエリスリトール担体、５８ Ｂ（Ｍ＋１）。ＨＰＬＣ：クオーターズ’１１ツバパック（３，９絽ｘ１５ｍ） （ミリポア・コーポレーション、ウオーターズクロマトグラフイ一部、ミルフォ ード、マサチューセッツ州から市販されている）、ＣＭ、ＣＮ／Ｅ、０　（０， １％トリフルオロ酢酸）６０：４０、流速は１．０Ｍ／鵡ｉで保持時間は６．３ ４分で、２８０％鶴で検出した。 冥九例６゜ 本発明のもう一つの好ましい基は、以下の化学式を有する（２．６−シメチルー ４−二トロ）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレート− ３−オクソープチルイミデートクロリド、塩酸塩である。 （２，６−シメチルー４−二トロ）７エ二ルーＮ−メチル−アクリジニウム−９ −カルボキシレート−３−オフソーブチルイミデートクロリド、塩酸塩は、以下 の模式図にしたがって合成される。 Ｘ″″ ３−ヒドロキシ−９−アクリジンカルボン酸（１６）と４−ブロモブチロニトリ ルとの反［Ｋよりエステル（１７）”が生ずる。このエステルの加水分解と２， ６−ジメテルー４−二トロフェノールによる再エステル化により（１９）が生ず る。メチルフルオロ硫酸によるメチル化と、塩酸ガスとメタノールを用いたシア ノ基のイミデートエステルへノ転換は、（２，６−シメチルー４−二トロ）７エ 二ルーＮ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレート−３−オフソーブチ ルイミデートクロリド、塩酸塩（２１）を与える。これらの反応は、以下でさら に詳細く述べられ

【いる。 ３−ヒドロキシ−９−アクリジンカルボン酸（１６）（２ｆ、８．４営ｍ、ｏ　 ｌ　ｅ　）、４−ブロモブチロニトリル（５，８７ｉｕ　、　８．７４　ｆ　、 　３．４　ｍｔｈｏｌｍ）および炭諏セシウム（１ｘ、ｏｓｆ、３４鴨惧ｏ１ｍ ）を１００１容の丸底フラスコ中の無水ｎＭｓｏ　（ｓ　ｏＩＬｔ）に溶解した 。この混合液は撹拌しながら水浴中で幻５０℃に加温された。３時間後、この混 合液を水（６０Ｑａ／）に注いだ。固形物を濾過し、クロロホルム甲に溶解した 。溶媒を蒸発乾固することにより、３−（３−シアノ）プロポキシルーアクリジ ン−９−カルボン酸−（３−シアノ）プロピルエステル（１７）が得られた。次 にこれをトル工ｙ（ｓｏｉｔｇ）Ｋ溶解し、シクロヘキサン（１ｓｏｄ）を加え た。純粋な産＃ａ（１７）が分離され、濾過して乾燥を行った。乾燥された産物 は乳酸エチルを移動相とした薄層クロマトグラフイーによって精製した（Ｒ７＝ ｏ、５ｓ）（収率＝７８．６％）。 シアノプロピルエステル（１７）（３，７３Ｆ、１０ｍ５！ｓ）を０．５ＮＮａ ＯＢ（９０Ｍ）とメｐノール（９Ｑａｊ）の混合液に溶解し、還流冷却器を用い て６０”Ｃの湯浴中で２．５時間攪拌した。メタノールを回転蒸発乾固装置で除 き、水海を濃塩酸で酸性に―整した後、産物を酢酸エチルで抽出した。溶媒を蒸 発乾固すると３−（３−シアノ）プロポキシルーアクリジン−９−カルボンＩＩ （１ｇ）を与える（収率＝８０％）。 カルボン酸（１８）（４，６２９、１０惰惧・１ｍ）をピリジン（ｘ３ｏｄ）に 溶解し、この溶液なＣＣｔａ　／ドライアイス浴中で冷却した。アートルエンス ルホン酸クロリド（５，８ｔ　、　３０．ｓｍｃ＋！＊）を添加し、浴を除いた 。室温で１５分間攪拌した後、２，６−シメチルー４−二トロフェノール（２， ８ｆ　、　１６．８ｍ悔・ｊｓ）を加えた。室温で１８時間おいた後、水（１０ １ｊ）を加え、溶媒を減圧して除いた。浅さをクロロホルム（２００１Ｌｔ）に 俗解シ、有機相を飽和炭酸ナトリウム（２Ｘ１００１Ｌｔ）、水（２Ｘ１００１ １Ｊ）、ＩＮＢＣ７（ｌｘｘｏｏＩＬｔ）ならびに最後に水（２Ｘ１００鯰）で 洗った。 溶媒を蒸散乾燥させて祷られた（２．６−シメチルー４−二トロ）・フェニル− ３−（３−シフ／）７”ｗボ＊シル−アクリジン−９−カルボン酸エステル（（ ２，６−ｄｉｎｈａｔｋｙ＆　−４−ｓ＜＄ｒｏ　）　ｐｋｍ＊ｙｉ　−３−（ ３−ａｙａｓｏ　）ｐｒｏｐｏｓａｌ　−ａ＠ｒ４ｄｓｓ＊　−９−ｃａｒｂｏ ｚｙｌａｔｅ　）　（１９）　を酢酸エチル／ヘキサン（７：３）を溶媒として シリカゲルカラムクロマトグラフィーに展開した。（収率７４．５％） そのエステル（１９）　（１，６ｔ　、　３．５２　ｍｍｏ！ｇ）を無水塩化メ チレン（５Ｑｄ）に溶解し窒素気下でフッ化硫醗メチル（１，６ｄ　、　１７． ６　ｍ＋ｓｏ！ｇ）を加えた。その溶液を室温で２０時間攪拌した。無水エーテ ル（１００１１１７）を加え、沈殿した（２．６−シメチルー４−二トロ）フェ ニル−３−（３−シアン）プロポキシルーアクリジニウム−９−カルボン酸エス テルフッ化スルホン酸塩（（２＊　６−　ｄ４ｍａｔｈｙｌ−４−ｓｉｔｒｏ　 ）ｐＡｓｓｙ＆−３−（３−ｇｙａｓｏ　）　ｐｒｏｐｏｚｙト−ａｇｒｉｄｉ ＊４ｍｓ　−９−ａａｒｂｏ　−ｔｙＸａｇａ　／Ｊｓｏｒｏａ＊げｏｓａｓｓ 　）　（２０）を−過し、エーテルで洗浄後、真空乾燥１−た。（収率８４．７ ％）得られたアクリジニウムエステル（２０）（４■。７．４Ｘ　１０　”ｓｍ ｏｋｅ）を５１の双百フラスコ中のメタノール（ｏ、ｓｍ）に溶解した。無水塩 酸ガスを注意深く、１０分間通気させた。無水エーテル（３１Ｌｔ）を加えた。 沈殿した（２，６−シメチルー４−二トロ）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニ ウム−９−カルボキシレート−３−オキシー塩化プチリミデート塩酸塩（（２＋ 　６−　ｄｉｗｈａｔ−Ａｙ！−４−ｎｉｔｒｏ）ｐに一＊ｙｌ　−Ｎ−ｍａｔ ｈｙに−ａｇｒ４ｄｊ＊＜５ｖｘ−９−ｃａｒｈｏｚｙｌａｇａ　−３−ｏｍｏ 　−ｂｓｔｙｒｉｖｓ＋ｉｄａｔｍ　ａルｒｏ−ｒｉｄａ＋　ｈｙｄｒｏｃｈｌ ｏｒｉｄａ　）　（２１）を集め、エーテルで洗浄した。固体を真空乾燥し、五 酸化リンを入れたデシケータ−中に保存した。 本発明による他の一例は、（２，６−シメチルー４−二トロ）フェニル−Ｎ−メ チルーフエナン）ｌＪシウムー６−カルボン識エステル　フッ化スルホン酸塩（ （２，６−ｄｉｍａｔλｙＬ−４−ｓ４ｔｒｓ）ｐ五＊ｓｙｌ　−Ｎ−ｍｅｔｈ ｙｌ　−ｆａｓａｓｔｌｙｔｄｉｓｍ−６−ｃａｒｂｏｚｙＥａｔｅ　ｆｌｓｏ ｒｏａｓげｏｓ−ａｔａ　）であり、構造式を以下に示す。 （２，６−シメチルー４−二トロ）フェニル−Ｎ−メチルーフエナントリジウム −６−カルボンばエステルフッ化スルホン酸塩は以下のれ路で合成した。 ２−アミノビフエ＝ＡＩ（１６，９ｔ　、　０．１　ｖａｅｊ）を無水ピリジン （３０１１７）Ｋ溶解し、無水酢［Ｒ（１０，５社。 ０．１１ｍ・に）を加えた。混合液を短時間撹拌し、１５時間靜１して室温まで 冷却した。水（５Ｑ′ＩＬｔ）を加えた後、Ｎ−アセチル−２−アミノビフェニ ル＋Ｎ−ａａａｔｙｇ−２−ａｖｘｆｏ＆ｉｐ＆＊＊ｙＪ　）　（２２）を−過 し、エタノール水溶液から再結晶により１９．６ｆの白い針状結晶を得た。（収 率９３％） Ｎ−アセチル−２−アミノビフェニル（ｚｚ）（ｘ９ｒ。 ０．０９ｍ５りをｇ［シフ蒸留した塩化ホスホリル（４５′ＩＬｌ。 ０．４９　ｍｏｌ　）と共に８０分間靜かに還流させた。その溶液を水中で冷却 し、生じた沈＃（６−メチルフエナントリジン塩酸塩）を濾過し、水に溶解し、 アンモニア水でアルカリ化した。その溶液をエーテルで抽出（７５ｍｘ４回）し た。抽出物を硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、エーテルを真空中で除去した。 生じた重色の油液な沸騰中のシクロヘキサン（４θＯＭ）Ｋ溶解し、冷却して６ −メチルフエナントリジン（６−悔ａｔｋｙｌ　ｐｈ−％ａ％ｌデ１−ｄｉ％− ）（２３）の白い針状結晶を得た。（２３）（収率６３％） ６−（２−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチルエチルンー７エナントリジン％　 ６−　（２−Ａｙｄｒｏｇｙ　−１−ｈｙｄｒｏ　−ｚｙｒｎａｇｈｙ１ｍｔｈ ｙ！　）　−ｐｈａ＊ａ＊ｇｈｒｉｄｉｓａ　）　（２４）は、参照文献として 挙げたモーガンとウォールス（Ｍ、デ１■ａｓｄｌ／ａ１ｇａ）Ｊ、Ｃｋａｖｓ 、Ｓｏｃ　３４：４４７（１９３１）の方法に従い、６−メチルフエナントリジ ン（２３）をホルムアルデヒドで処理して得た。この方法で６−（２−ヒドロキ シ−１−ヒドロキシメチルエチル）−フエナントリジン（６−（２−ｊｙｄｒｏ ｚｙ　−１−ｋｙｄｒｏｓｙ　−ｍａｔんｌａｔλｙ！　）　−ｐｈｇｎａｓｔ ｋｒｉｄｉ＊ａ　）　（２４）が白い針状結晶として得られた。（収率５７％） ６−（２−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチルエチル）−フエナントリジン（２ ４）（６？　、３１鴨制御０）と十分に粉末状にした二数化セレニウム（３，８ ｒ。 ３４鴨講ｏ！ｓａ　）の混合物を酢酸エチル（１２５ｍ１）中で１０時間遠流し た。深紅色の溶液を高温のうちにセライトで濾過し、蒸発乾燥した。得られた固 体を温塩醗（１２５ｄ）で温没後、−過し、重炭酸ナトリウムで部分中和した。 初めの赤い沈殿をＦ通して除き、溶液を完全に中和した。生じた白黄色の固体を ＦｉｌｉＬ、アセトン／石油エーテル中で栴結晶させ、２．７ｔの６−ホルミル フエナントリジン（６−１０ｒｉｙ＆　ｐｈｉ％ａ％−ｔｈデ１ｄｉｓｖ　ｌを 得た。（収率４２％）６−カルポキシフエナントリジン（６−ｅａｒｂｏｇｙｐ 入ｍ５ａｎｔｈｒｔｄｉ＊ａ　ｌ　（２５）はａｈ文献としたモーガンとウオー ルス（Ｍｏｒｇａｓ　ａ％ｄ　Ｗａｇ　Ｋｍ　）１１／、　Ｃｈａｎｔ。 ５ｏｅ、３４：２４４７（１９３１）の方法により６−ホルミルフエナントリジ ンをクロム酸酸化して得た。産物（２５）は白色粉末として得られた。（収率６ ０％）６−カルポキシフエナントリジン（２５）　（６６２１１９゜３＊ｍｏｊ ＊ａ）と無水ピリジン（１４ｄ）ｉｃ溶解し、０℃Ｋ１１ｌした。、−）ルエン ー塩化スルホニル（１，１５Ｆ。 ６淋鶴ｏ１ｍａ）Ｋ続き、２，６−シメチルー４−二トロフェノール（５０１■ １３講摸ｏ１ａｍ　）を加え、混合物を４℃で一晩装置した。得られた褐色の液 体を氷冷した水中に入れ、攪拌した。沈ＩＲを濾過し、クロロホルム／ヘキサン （ｉ：１）を溶媒としたシリカゲルカラムクロマトグラフィーに展開し、（２， ６−シメチルー４−二トロ）フェニルーフエナントリシンー６−カルポン酸エス テル１　（２＊　６−ｄｔｖａｍｔｋｌｌ−４−＊ｔｔｒａ）ｐｈａｗｙｌ−ｐ ｈｍ＊ａｎ　−ｇｈｒｉｄｉｍｍ　−６−ｃａｒｂｏｚｙｌａｔａ　）（２６） を得た。（収率６０％） １ｉｉ、燥した２５’ｌＬＬ双百九底フラスコに侍らｊ、たエステル（２６）　 （３６９Ｎ９　、１　ｖｈｗｃｏｉａ）を入れ、無水塩化メチレン（５ｍ１ｊ） Ｋ懸濁した。懸濁液を窒素気下でドライアイス／四塩化炭素を用い、冷却した。 塩化スルホン酸（３４２７，６愼愼ｏ１ｍ）を加え、−２０℃で３０分間攪拌し 続けた。混合物をゆっくりと室温まで温め、さらに２時間攪拌した。無水エーテ ル（２０１Ｌｔ）を加え、沈殿を戸遇し、エーテルで洗浄した。乾燥して（２， ６−シメチルー４−二トロ）フェニル−Ｎ−メチルーフエナントリジウムー６− カルボン酸エステルフッ化スルホン識ｔｉＡ（２７）を得た。（収率９０％）実 施例８゜ 本発明の他の一例は（２，６−シメチルー４−二トロ）フェニル−５，６−シヒ ドローＮ−メチルーフエナントリジウム−６−カルボン酸エステル　フッ化スル ホン類＋（２＊　６−ｄｉｔｙｈａｔｈｙｇ−４−ｓｉｔｒｏ）ｐ五＊ｓｙ！− ５＋６−ｄｉｈｙｄｒｏ　−Ｎ−ｍａｔｈｌｌ　−ｐｈｍｎａｎｔｈｒｉｄｉｓ 愼−６−ｃａｒ−ｂｏｚｙｌａｔｍ　ｆｉｓｏｒｏａｕげｏｎａｔａ　）で以下 に構造式を示す。 （２，６−シメチルー４−二トロ）フェニル−５，６−シヒドローＮ−メチルー フエナントリジウム−６−カルボン散エステルフッ化スルホン酸塩は非還元フエ ナントリジウム類似化合物（２７）より合成した。フエナントリジウム（２７） 　（３９８■、０．８鵡鴻ｏｌｄ）をアセトニトリルと０．１．１リン酸玖衝液 、ｐＨ５，２を１＝１に混合した溶Ｑ（８ＯＮ）に溶解した。アセトニトリル（ ｘｏｄ）に溶解したホク化水素シアンナトリウム（４１Ｏ〜）をフエナントリジ ウム溶液に滴下した。この操作により、溶液の重色が漂白された。１５分間攪拌 した。アセトニトリル（１００１Ｌｇ）を加え、溶媒を旋回型のＡ散装置で除去 した。残渣を水に懸濁し、酢酸エチルで抽出した。 有機層を水で洗浄し、乾燥した。溶媒を除去して（２゜６−ジメｆルー４−ニト ロ）フェニル−５，６−シヒドローＮ−メチルーフエナントリジウム−６−カル ボン醗エステルフッ化スルホン酸塩を得た。（収率９０％）本発明による池の一 例は（２，６−ジメトキシ−３−クロロスルホニル−フェニル）−２−フェニル −Ｎ−メチル−キノリニウム−４−カルボン酸エステルフッ化スルホン酸塩１　 （２＊　６−　ｄｉｍｍｔｈｏｚｌ　−３−ｃｋｌｏｒｏｓｓｌ−１０ｓｙＪ− ｐｈａｎｙｌ　）　−２−ｐｈｍｔｓｙｌ　−Ｎ　−ｍｅｔｈＶｌ　−ｑｓｉｎ ｏｘｉｎｉｍ　−４−ｃａｒｂｏＨｘａｇｍ　１ｘｍｏｒｏ　ａｓｉｌｃｎ＊ａ ｔａ　ｌであり、以下にその構造式を示す。 （２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル−フェニル）−２−フェニル−Ｎ −メチル−キノリニウム−４−カルボン酸エステル７フ化スルホン酸塩は以下の 図式に従って合成された。 アセトフェノン（・ａ＊ｔｏｐｈｍｍ・ｓ＊）（２９）（１２Ｏｆ−ト１ｊｓ） とイサチン（ｉｍｍｔｉｓ　）　（３０）　（１４７ｆ。 ｉｓ・１−）を水散化カリウム１７ｆを含む水とエタノールの混合液中で１０時 間還流した。２−フェニル−キノリン−４−カルボンＩＩ　（２−ｐｈｍｓｙｌ 　−ｑｓｓｓｏｌｉｓａｃａｒｂｏｚｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｌ　（３１）がエタ ノールから白い針状結晶として得られた。（収＄　８４　”Ａ　）２−フェニル −キノリンカルボン酸（３１）　（７３５３１９，３鵡鴨ｏ１ａｓ）を無水ピリ ジン（１４ｍ）に溶解し、氷水中で冷却した。ｐ−）ルエン塩化スルホニル（１ ，１５，Ｆ、６　ｍｍｍｍ６ｌ　）を加え、混合液を１５分間撹拌した。２，６ −シメトキシフエノール（４６２〜、３悔惰ｏｘｍａ）ヲｍえ、混合物を室温で １５時間撹拌した。その溶液を氷水（３０（１４）に注ぎ込み、（２，６−ジメ トキシ）７エ二ルー２−フェニル−キノリン−４−カルボン酸エステルＩ　（２ ＋　６−　ｄｉｍａｔｋｏｚｙ）　ｐｋｍｎｙｌ　−２−ｐｋａｎｙｌ　−ｇｓ ｉｙｓｏｌｉｎａ　−４−ｃａｒｂｏｘｙＸａｔａ　ｌ　（３２）Ｙ濾過した。 実施例１０゜ 本発明による池の一例は（２，６−ジメテルー４−ブロモ）フェニル−２−フェ ニル−１＋４−ジヒドロ−Ｎ−メテルーギノリンー４−カルボン酸エステルｌ（ ２，６−ｄｉｚｅｔｈｙｌ　−４−ｂｒｏｍｏ　）　ｐｈａｎｙＬ　−２−ｐｈ ｅｎｏｌ　−１＃　４　−　ｄｉｈｙｄｒｏ−Ｎ　−ｍｅｔｈＶｌ−ｑｓｉｒｓ ｏｌｉｎａ　−４−Ｃαデｂｏｚｙｌａｇｍ　ｌであり％構造式を以下に示す。 （２，６−ジノデル−４−ブロモ）フェニル−２−フェニル−１，４−ジヒドロ −Ｎ−メチル−キノリン−４−カルボン酸エステルは（２，６−ジメテルー４− ブロモ）フェニル−２−フェニル−Ｎ−メゾルーキノリニウム−４−カルボン酸 エステルｔ（２，６−ｄｓ惰−１ｋｙＫ　−４−ｂｒｏｍｏ）　ｐｈａｎｙｌ　 −２−ｐｋ＋＋ｎｙｊ　−Ｎ−ｍａｔλνｌ−ｑｓｉｎｏＬｉｎｔｕｍ　−４− ｃａｒｂｏｚｙＸａｔｍ　ｌ　ｔホウ化水素シアンナトリウムを用いて還元する ことにより合成した。未還元キノリニウムは前述の（２，６−シメチルー４−ブ ロモ）フェニルアクリジニウムと同様な方法で、アクリ９７０代わ９にキノリン を用いて得た。 キノリニウムエステル（５００１ｎ９．０．９鵡鴨０Ｖａ）をアセトニトリルと Ｏ，ｌ　Ｍ　’）ン散緩衝液のｌ：ｌ混合液（８０社）に溶解した。アセトニト リルと緩衝液の混合液（１０ａ）に溶解したホウ化水素シアンナトリウム（５６ ■、０．９ｍｍｏＬａ）を加えた。２分間撹拌した後、混合ｇをｐＨ２０に酸性 化し、アセトニトリル（１００Ｒｊ）を加えた。溶媒を施回型の蒸散装置で除去 した。残玉を水にＷ＆濁し、酢酸エチルで抽出した。水を除き、酢酸エチルを蒸 散させ、（２，６−ジメテルー４−ブロモ）フェニル−２−フ二二ルー１．４− ジヒドローＮ−メゾルーキノリン−４−カルボン酸エステルを得た。（Ｉ又率７ ０′Ａ）固体を乾燥し、クロロホルム／ヘキサン（Ｍｌ）を用いたシリカゲルカ ラムで梢製した。（収率５０％）このエステル（３２）（３８１ｊ１．、ｌ鴨鴨 ｏｐｓ）を無水塩化メチレン（３１１ｔ）に溶解し、フッ化嘘酸メチル（４９２ １，０，６９Ｆ、６ｍｍｏ！ａｓ）を加えた。ｆｆｌ素気下、Ｎ温で１５時間撹 拌した後、無水エーテル（２Ｑｙ、ｊ）を加えた。（２，６−ジメトキシ）フェ ニル−２−フェニル−キノリン−４−カルボン酸エステル−Ｎ−メチルフッ化ス ルホン酸塩（（２、ｆｉ　−ｄｉｍａ＊ｈｏｚｙ）ｐルａｎｙ＆　−２−ｐｈａ ｎｙｌ　−ｑｓｉｎｏＬｉｎｅ　−４−ｃａｒｂｏｚｙｌａｔｍ　−Ｎ　−５ａ ｔλ７１ｆ１ｍｏｒｏ　ａｓＸｆｏｎａｃｇｌ　（３３）を濾過し、エーテルで 況浄後、乾燥した。（収率９５％） このエステル（３３）　（２００ａ１９．０．４ミリモル）を乾いた２５１Ｊ双 首丸底フラスコに入れ、無水塩化メチレン（５μ）に懸濁した。Ｍ濁液を鴛素気 下でドライアイス／四塩化炭素で冷却した。塩化スルホンｒＩＲ（１４４Ｊ。 ２ミリモル）を加え、−２０℃で０．５時間撹拌し続けた。 混合欣なゆつ（ワと室！２！まで温め、さらに２時間撹拌した。無水エーテル（ ２０５１７）を加え１．殿した（２．６−シ／トキシー３−クロロスルホニル） フェニル−２−７ｘニル−ＩＶ−メチル−キノリニウム−４−カルボン酸エステ ルフッ化スルホン酸塩１　（２＋　６−　ｄｓｍｓｔ五ｏｚｙ−３−ｃｈｉ　ｏ ｒｏｓｓｄｆｏｎｙ　）　ｐｋａｎｙｔ　−２−ｐｈｓｎｙＬ　−Ｎ　−ｔｐｈ ａ　ｔｈｙｌ−ｇｕｉｎｏＫｉｎｉｓｔｎ−４−ｃａｑｐｂｏｚｙｌａｔａ　ｆ ｌｓｏデｏｓｓげ眞α１１（３４）’ａ’瀘過し、エーテルで洗浄し、乾燥した 。（収率本発明による他の一例は（２，６−シメチルー４−ブロモ）フェニル− ２−フェニル−１，２，３，４−テトラハイドロ−ｈ−メチル−キノリン−４− カルボン酸エステル（（２＊　６−　ｄｉｎｓｍｔｈｙｌ　−４−ｂｒｏｍｏ） ｐｈｍｎｙｌ　−２−ｐｈａｎｌＫ−１ｒ２＋３．４−ｔ−Ｉｃｋｙｄｒｏ　− Ｎ　−ｙｎｍｔｈｙｌ　−ｑｕｔｎｏｌｉｎｅ　−４−ｃｖｒｂｏ：ｔｙＬαｔ ｅｌであり、構造式を以下に示す。 （２，６−シメチルー４−ブロモ）フェニル−２−フェニル−１１２、３、４− テ）７／’４　）”ローＮ−）チル−−？ノリノー４−カルボン酸エステルは（ ２，６−ジメテルー４−ブロモ）フェニル−２−フェニル−Ｎ−メチル−午ノリ ニウムー４−カルボン酸エステル（（２，６−α１ｎｃａｔｋｙＬ−４−ｂｒｏ ｒｎｏ　）ｐｈａｎｌＫ　−２−ｐｈａｎｌＫ　−、’Ｗ−へ１１ν１−　ｑｍ ｉｎｏｔｉｎｉｓｍ−４−ｃａｒｂｏｚｙｌａｔｍ　ｌをホウ化水素シアンナト リウムを用い″Ｃ還元することにより合成した。未還元上ノリニウムは０述の（ ２，Ｓ−ジメチル−４−ブロモ）フェニルアクリジニウムと同様な方法で、アク リジンの代わりにキノリンを用いて得た。 キノリニウムエステル（５００〜、０゜９ｍｍＯ１ｍ）をアセトニトリルと０． １　Ｍリン酸緩衝液ｐＥ５．２の１８１混合液（８０ｄ）に溶解した。アセ）　 二ｌ−リルと緩衝液の混合液（２０，ＩＪ）Ｋ溶解したホウ化水素シアンナトリ ウム（５６０”？　、　９．０　ｓｍｏｇｓ）を加えた。３０分攪拌後、混合液 を０．１＃塩酸を用いてｐＨ２，０に酸性化し、さらに５分間攪拌した。アセト ニトリル（１００１１７）を加え、旋回屋蒸散装置で溶媒を除去した。残渣を水 に懸濁し、酢酸エチルで抽出した。水を除き、酢酸エチルを蒸散させ、（２，６ −シメチルー４−ブロモ）フェニル−２−フェニル−１，２，３，４−テトラハ イドロ−Ｎ−メチル−キノリン−４−カルボン酸エステルを得た。（収率８０％ ） 爽施例１２゜ 本創案による他の一例は（２，６−ジメテルー４−トリメチルアンモニオ）フェ ニル−Ｎ−メチルーアグリジニウム−９−カルボン酸エステルニフフ化スルホン 散塩＋　（２，６−ｄｉｍｍｔｋｙｌ　−４−ｔｒｉｔｐｈｍｔｋｙｌａｍ鴨ｏ ｎｔｏ　）　ｐｈａ−ｓｙｊ　−Ｎ−ｖａａｔｈｙｌ　−ａｃｒｉｄｉ＊ｉｕｍ −９−ｃａｒｂｏｚｌｌａｔａｄ４ｆｔｓｏｒｏｓ％げＯ％ｔａ）　であり、以 下に構造式を示す。 （２，６−シメチルー４−トリメチルアンモニオ）フェニル−Ｎ−メチル−アク リジ−ラム−９−カルボン酸エステル　二フッ化スルホン酸塩は以下の図式に従 って合成された。 （２，６−シメチルー４−トリメチルアンモニオ）フェニル−Ｎ−メ５−ルーア クリジニウムー９−カルボン酸エステルはアクリジン−９−カルボン酸ｉ　ａｃ ｒｓｄｉ％＃−９−ｃａｒｈｏｇｙｌｉａ　ａｃｉｄ　）　（３５）　と２，６ −シメチルー４−ニドａ７ｘノーｋｉ２＊　６−ｄｉｒａａｔｋｙｌ−４−＠ｉ ｌ−プリｈ＃％・ｊ）（３６）のエステル化により得た。産物（３７）を亜鉛に より（２，６−シメチルー４−アミン）フェニル−アクリジン−９−カルボン酸 エステル（（２，６−ｄｉｍａｔｈｊ　−４−ａｓｊｓｏ　）　ｐｈｍｓｙｌ　 −ａｅｒｉｄｉｓｍ　−９−＃ａゾロ＠ｇｙｊｓｌ＊　）　（３８）　まで還元 した。ヨウ化メチル処理により、２つのメチル基なアミノ基に導入した。四基化 及びアクリジニウム形成はフッ化硫識メチルを用いて行った。これらの反応は以 下に詳ＭＫ示す。 アクリジン−９−カルボン１ｌ（３ｓ）　（３，０５ｙ　。 ０．０１４ノｍｏ１ｍａ）を２５０１１７の丸底フラスコに入れ、塩化チオニル （６５ｍ）と混合し、混合液を攪拌しながら２時間還流した。過剰の塩化チオニ ルを旋回型蒸散装置で除去した。残渣なベンゼン（７５ｗＬｔ）で処理し、塩化 チオニルを先金に除去するため真空中で溶媒を除いた。 残渣のアクリジン−９−カルボニルクロライドをピリジン（６５１１ｊ）と適合 し、２．６−シメチルー４−二トロフェノール（３６）（２，２５Ｆ、０．０１ ４倶・１−１）を加えた。混合液をクォーターバスを用いて約６０’Ｃに温ため 、すべての面体を溶解した。室温で１５時間攪拌した後、混合液を１ノの水に注 ぎ込んだ。懸濁液を濃塩酸を用いてｐＥ２．０に散性化した。固体の産物を一過 し、水で洗浄し、クロロホルムに溶解した。無水（ｉｔ＃Ｒナトリウムで水を除 去し、クロロホルムを蒸散させて未精製のエステルを得た。 未精製エステルをクロロホルム／エタノール酢！Ｉ！９８＝２を溶媒としてシリ カゲルカラムクロマトグラフィーに展開した。ＴＬＣでＲｆ値が０．６のフラク ションを溶媒と共に回収し、溶媒を蒸散させ、純粋な（２，６−シメチルー４− 二トロ）フェニル−アクリジン−９−カルボン酸エステル（２＋　６−ｄｉｖｐ ｈａｔｈｙＫ−４−ｓｉｔｒｅ　）　ｐｈｅ−ｓｙｊ　−ｍｅｒｉｄｉａｎ　− ９−ｅａｒｈｏｚｙｌａｔｍ　）（３７）　を得た。 （収＄３０％） ；ｔの（２，６−シメチルー４−二トロ）フェニルエステル（３７）　（１，１ ６ｔ　、　３．１　ｍｗｓｅｌｍ）をオイルバスで約６５℃に温ためてＦｎ酸（ ５０工ｔ）に溶解した。塩化第一スズ（１，５１）を績ｔＩＡ識（１０Ｋｇ）に 溶解し、エステルの浴液に加えた。混合液を４５分間攪拌し、水（７５〇−）に 注ぎ込んだ。クロロホルム（２００ｄＸ３回）で抽出し、未反応の（２，６−ジ メテルー４−二トロ）フェニルエステルを除去した。木場を重炭酸ナトリウムで 塩基性ＫＬ、クロロホルム（２００ｄｘ４回）で抽出した。水を除き、クロロホ ルムを蒸散させ、（２，６−シメチルー４−アミン）フェニル−アクリジン−９ −カルボン酸エステル（（２，６−ｄｓｍｓｔＡｊ−４−ａｍｓｓａ）ｐｈｍ負 ｙｌ　−ａｃｒｉｄｉ％ｅ　−９−ｅａｒｂｏｚｙｌａｔａ　ｌ　（３８）　を 得た。（収率２５％） アミンエステル（３Ｂ）　（６４”？　、０．１８　ｍｍｏｌａ）’ｌニトロメ タン（５紅）に溶解させた。ヨウ化メチル（１−）とピリジン（０，１ｄ）を仄 えた。混合物を室温で１５時間かく拌し、メタノール（２紅）を加え、さらにそ れから２時間かく拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を水（１０１ｊ）で処理し、 その後溶液を塩基性にしてクロロホルム（４Ｘ２０Ｂｇ）で抽出した。乾燥させ 、クロロホルムを蒸発させて（２，６−ジメテルー４−ジメチルアミノ）フェニ ルアクリジン−９−カルボキシラード（３９）を倚た。（収率＝５０％）　ジメ チルアミノエステル（３９）（１５４■、０．４１情惟・１−）を塩化メチレン （２紅）に溶解した。フルオロ恢醸メチル（２６５１、３，２８ｍｖ＋ａｏｊ） を加え、混合物を室温で１５時間かく拌した。 無水エーテル（１５１１７）を那え、沈殿した固体な濾過し、エーテルで洗った 。乾燥させて（２，６−シメチルー４−　）　１，１メチルアンモニオ）フェニ ル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシラー）　（４０）を侍た。（ 収率＝５０％） ＭＳ：ＦＡＢ、チオグリセロールマトリックス鵠／−４００（Ｍ”） 化学ルミネセンス基によるタンパク質及び他の物質の標識 実施例１３゜ 本発明の抱合体は（２，６−シメトキシー３−クロロスルフォニル）フェニル− Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシラード−６−フルオロスルフオナ ートのβ−Ｄ−チオグルコース付加体く結合したプロゲステロンからなる。（２ ，６−シメトキシー３−クロロスルフォニル）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジ ニウム−９カルボキシラートフルオロスルフオナートのβ−Ｄ−チオグリフース 付加体は以下の式で示される。 ＣＭ。 プロゲステロン抱合体は以下の計画に従って合成される。 ３．５−ジメトキシ−４−ヒドロキシベンズアミド（３＋　５−ｄｉｍｅｔｋｏ ｚｙ−４＋五ｙｄｒｏｚｙ　ｈａｓｇａｍｉｄａ　）（３５）　（３，Ｏｆ　、 　１５．２　ｍｍｏ！ｇ）を無水ピリジン（Ｘ５直Ａ）Ｋ溶解し、ドライアイス ／ＣＣノ、バス中で冷却した。 アセチルクロライド（ａｃｓｔｙｊ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ）＜　１．４１１７　＋ １．５４　ｔ　、　１９．７　ｍｍｍ１ｍ）を加え、混合物を室温で２時間かく 拌し続けた。メタノール（１１）と水（５−）を加え、溶媒を減圧下で除いた。 残舊物を希塩酸で酸性にした水（５ＱＭｌ）で処理し酢酸エチル（Ｉにｙｊａｅ ａｇａ−ｉｇ）で抽出した。水で洗浄し、乾燥し、酢酸エチルを蒸発させて、酢 酸エチルから栴結晶した２、６−シメトキシー４−カルボザミドーフェニルアセ テー）（２，６−ｄｉｗｈａｔｈｏａｃｙ　−４−ｃａデｂｏｚａｍｉｄｏ　− ｐｈａ＊ｙＬ　ａｅａｔａｔｍ　）（３６）　（２，２９）　Ｙ得た。（収率６ ０％）フェニルアセテ−）（３６）（１，２７１，５，３３嘱情−１−）を無水 テトラヒドロフラン（１２５１ｄ）に溶解した。 ＴＥＦを′Ｆ＆謀とするジボラン浴ｇ（１，０Ｍ　、　１０．９ｍ（。 １０．９　ｔＩＩＩｍｏｉａｍ）を加え、混合物を４時間、還流した。 室温まで冷却後水（２勧）と塩＠（１，ＯＡ’　、　５．ｄ）を加えた。３０分 か（拌した後、溶媒を真壁中で除いた。浅怪物をクロロホルムで抽出した。クロ ロホルムはその後乾燥させ、真空中で除いた。２．６−ジメトキシ−４〜アミノ メチルフエノール（２ｒ　６−　ｄｉｍａｔｈｏｚｌ　−４−ａｍｉｎａｍｍｔ ｋｙｌ　ｐｈｅｎｏｌ　）　（３７）をこれ以上精製はせず、次の段階に使用し た。無水ピリジンに溶けたこの粗抽出したアミン溶液に、ペンジルクロロホルメ ー）（＆＊ｓｇ−ｙｌｅｈｌｏｒｏｆｏｒｖｐｈａｔａ）　（１，０５Ｑｍ、１ ．２　５　ｆ　＋　７．３ｍ集・１−）を加え混合物を室温で３時間かく拌した 。水（５−）を加え、溶媒を真空中で蒸散させた。残留物に、水（３０１ｇ）を 加え、混合物を希薄なりＣ７で酸性にした。 酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、乾燥し、溶媒を蒸散させて２．６−シメトキ シー４−（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチルフェノール（３８）を油分 として得た。（収率＝７０％）全体とし【アクリジン−９−カルボン酸（Ａｃｒ ｉｄｉｓａ　−９−ｇａｒｂｏｚｙｌｉａ　ａｃｉｄ　）　（７５４■、３．３ ８憫愼ＯＶｍ）を無水ピリジン（１４１７）Ｋ溶解した。塩化スルホニル、−） ルエン（ｐ−ｔｏｌｓａｓａ　ａ％１−／ｓ％ｙ！　ｅｈｌ＊ｖｉｄｍ　）（１ ，２８ｔ　、　６．７６　ｇｈｍｏｉｇ）を加え混合物を室温で３０分間かく拌 した。 ２．６−シメトキシー４−（ベンジロキシカルボニルアミノ）メチルフェノール （３８）　（１，１８？　、　３．７６ｓｓａａ！＊）を加え、１合物を室温で １５時間かく拌した。水（１０１１７）を加え、溶媒を真空中で除いた。残留物 をクロロホルムに溶解し、クロロホルム層を水、０．１ＮＥＣノ、炭酸水素ナト ＩＪウム浴液の順に用いて洗浄した。乾燥させ、クロロホルムを蒸発させて、　 ＣＥＣ１，／酢酸エチルを１＝１に混合した溶媒を用い℃シリカゲルカラムクロ マトグラフィーで分離した粗製のエステルを得た。 溶媒を集めた画分より蒸発させて、（２，６−シメトキシー４−（ベンジルオキ シカルボニルアミノ）メチル〕フェニルーアクリジン−９−カルボキシラード（ ３９）を得た。（収率＝２２％） このアクリジン（３９）（２９６！。０．５７ｗｍｏｊｓ）を無水塩化メチレン に溶解した。フルオロ硫酸メチル（Ｍｅｔｈｙｌ　ｆｌｓｏｒｏａｓげａｔｅ　 ）　（２７７１、３，４ｍｍｏ！ｓ）を加え混合物を室温で５時間かく拌した。 無水エーテル（２５ｉｕ）を加え、沈殿した〔２．６−シメトキシー４−（ベン ジルオキシカルボニルアミノ）メチル〕フェニルーアクリジニウム−９−カルボ キシラードフルオロスルフアート（（２＋　６−　ｄｉｔｎａｔｈｏｚｙ　−４ −（６＊ｓｇｙｌｏｇｙｅａｒｈｏｓｙｌ　ａｖｅｒｉｎｇ　）ｍａｔｋｌｌ　 ”ｉ　ｐＡｓｓｙＪ　−ａａｒｉｄｉ＊ｔｓｂｔｘ−９−ｓａデｂ・す１ａｔｅ 　ｆｌｓｏｒｏａｓげ６ｖｓａｇａ　）を濾過しエーテルで洗い乾燥した。（収 率＝９９％）このアクリジニウム（４０）（１０７ｍ１９．０．１６９ｍｗｏｊ ｓ）を無水塩化メチレン（２１１Ｊ）Ｋ＠濁した。クロロスルホン１ｌｌ（５３ Ｊ、９２〜。０．７９７集嘗ｅＩｍ）を、フラスコをドライアイス／ＣＣｌ４バ ス中で冷却した後加えた。それを３０分かく拌し、バスを除いた。さらに室温で １．５時間かく押抜無水エーテル（２０１１ｊ）を加えた。 沈殿生成物を濾過し真空中で乾燥した。（２，６−シメトキシー４−７ミノメチ ルー３−クロロスルホニル）フェニル−アクリジニウム−９−カルボキシラード フルオロスルフア−ト（（２＊　６−　ｄｉｍａｔｈｅｘｌ　−４−ａｍｉｓｏ −ｍｓｔＡｙｊ　−３−ｃｋｌｏｒｏａｕげｏｓｙＪ　）　ｐｋ−リ！　−ａｃ ｒｉｄｉ＊ｉ　−ｍｗｈ　−９−ｃａｒｂｏｚｙｌａｔａ　ｆｌｓｏｒｏａｓげ ｏ＊ａｔｓ）（４１）を次の反応ＫＷＬ接使用した。塩化スルホニル（４１）（ １２９ｍｐ）をメタノール（１２，５ｄ）と水（１２，５１１ｊ）中室温で３時 間かく拌し、た。アセトニトリル（３５ｍ）を加え溶媒を蒸発させた。 生成物をＣ４ダイナマックス　セミ−プレツブカラム（Ｄｙｎａｍａｃ　Ｓａｍ ｊ−ｐプリ　ｅｏｌｔｍｓ）　（１０ｔｌＸ２　５　９ｍ（レーニンインストラ メントＣ６１１＊　ｃ　−ａ　ウオーバン１マサテユセツツ（（Ｒａｒｓｆｓ　 Ｉ＊ｓｔｒｓｍａｓｔ　Ｃｏ、ｅ　７％１．ＩＷｏｈｓｒｓ　Ｍａｓｓａｃｈｌ ｅｔｔｓ　）　）より購入可能）流速２．７５１／愼ｉにおいてＣＢ、ＣＮ／Ｈ ，０（０，１％トリフルオロ酢酸）、５５／４５比の移動相を用いて、ＨＰＬＣ で精製した。保持時間６分にあられれるピークを集めた。溶媒を蒸発させ抱合体 （４３）を傅だ。（収率＝４３％）ＭＳ：ＦＡＢ、チオグリセロールマトリック ス８９５（Ｍ＋逆蒐荷をもつイオンなしの条件下）ＣＢｓＣＮ（１１ＬＬ）とＢ 、０（２００１）の混合液中のプロゲステロン抱合体（４３）（１，１〜）を水 （７：ｌ）に溶解した溶液状急の７ｌ−Ｄ−チオグルコースで処理した。 １０分後浴媒な先金に真空下で蒸発させて、前述のＩ−Ｄ−チオグルコース付加 体を与えた。 実　施　偽　１４゜ 次に示すタンパク質への付着方法は通常本発明品の基に適用可能である。 マウｙ、　Ｉ　ｇ　Ｇ　（Ｓｉｇｍａ＋　１ｍｇ）を０．９　ｒＬｌのリン酸駿 衝液（１００悔Ｍ、ｐＨ８，０，１５０悔Ｍ）に溶解した。溶液をその後３等分 ０．３３〜１０．３紅（０，００２２愼Ｑ１＄）に分注した。１５１ＤＭＦ中０ ．０２２鴨ｏ１ｍ成分が侍られるよう本発明の約０．３〜分を約０．４ｍＤＭＦ Ｋ溶解した。 本発明の化合物０．０２２　ｖｉｏｌａｓをＩｒｔＧ　Ｏ，００２２鴨・ｌ−と プラスチック微量遠心チューブ中で混合した。 １５分後さらＫ　Ｏ，０２２ｍｏｌｅの化合物を微量遠心チューブに加えた。（ 化合物のタンパク質に対するモル比は２０ニアであった）さらにそれから１５分 後、本発明の過剰量の化合物を、リジンＥＣ１溶液（１０ｉ　１００、ＭＰｉバ ッファーｐＨ８，０中）を用いて１５分間で不活化した。また、０．００５５　 ｍａＪ−量の本発明の化合物を０．２２ｖａｏ１ｍのかわりに用いた。（化合物 のタンパク質に対するモル比は５：１であった。） バイオランド（Ｂｉｏｒａｄ　）ガラスカラム（１ｃｍＸ　５０２　）（バイオ ランド（Ｂｓｏｒａｄ　）、化学部、リッチモンド、カリフォルニア（Ｒｉｔｈ ｍｏ％ｄ＋　ＣａＨｆｏｒ＊ｓａ　より購入可能）にリン酸バッファー（１００ 講Ｍ、ｐＨ６，３，１５０５ＭＮａＣ１，０，００１％ＴＭＳ）中のあらかじめ Ｗｅ１５４させ脱気したセファデックスＧ−５０−８０を静置して４５−までつ めた。反応液を０．３　０．４ｍ／ｍｉｓの流速でカラムＫかけた。０．５紅ず つ画分を集めた。標識されたタンパク質画分は各区分より２０μ！とり１ｗＬｔ Ｋ希釈し、その３０μｌから生じる化学ルミネッセンスの６１１定により検出し た。標識された画分はその後貯えた。 貯えられた抱合体画分は、免役反応性のある抱合体の純度を上げるため透析した 。貯えられた画分は５００Ｉ、Ｅ６．３ｆ）リン酸ハフ　７７−（１００ｗ＋Ｍ 　、ｐＨ６，３゜１５０　ｍＭ　ＮｏＣｌ　Ｏ，００１％ＴＭＳ）Ｋ対して３回 バッファーを交換して２４時間以上透析した。 実施例１５゜ 非還元屋のへテロ環式環あるいは環状組織を含む部分はタンパク質や他の物質Ｋ Ｍ合し１、等価な還元型に転換させることができる。このことは、シアノ水素化 ホウ素ナトリウムのような還元剤を使用して完成することができる。 アクリジニウム／Ｉ、Ｇ複合体の還元方法は以下に記述する。同様の方法が他の 複合体の還元にも適用可能である。リン酸バッファー（４００ｊ）（ＦＢ６．０ ．１００ｍＡ　、１５０ｍＭ　、ＮｏＣｌ−０，００１％テメロザル（１’ｋｉ ｍａｒｅａａＬ　）　）中で代六的アクリジニウム（１００９）で惺繊したＩ、 Ｇを、新たＫｇ整した、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１０−’　ｍｏｊｓｓ ）　を含む溶液（１０４）で処理した。２時間室温でインキエペートすると、抗 体を裸慮しているアクリジニウムのアクリダンへ転換は完了し、そのことはＵＶ −Ｖｉｍスペクトルで２８０ｍｍのバンドの出現、３６０５ｍ５のバンドが消失 を示すことから認めることができる。この還元型は免疫特性をすべて保持してい る。 アッセイプロトコール 実施例１６゜ Ａ）標識抗体（Ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ａ＊ｔｉｂｏｄｙ）　（共役）＝（２，６− シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム− ９−カルホ゛キシレートフルオロスルホネートに共役したアフイニテイ精製つサ ギ抗プロラクチン。貯蔵緩衝液：ｌｏ鵠Ｊ／リン＠緩衝液、１００　ｔｈＭ　Ｎ ａＣ１ｐＥ　６．０．　０．００１％ｆ）ｉ＊４ｊｋ（Ｔｈｉｎｈｍｒｏａａｌ 　）、０．４％ＢＳＡ０Ｂ）捕捉抗体：ヌンク管（Ｎｓｎｃ　ｔｕｈａ　）　（ ミツドランドサイエンティフィック（Ａｆｊｄ！ａｓｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｔｇ 　）　（ミネソタ州ローズビル）から商取引で入手可能〕上の固相どしてのウサ ギ抗プロラクデン（ｓｒ／ｍ’）Ｃ）固相Ｔｉ後管二乾燥ヌンク管は次のように 用意した＝ｌ）ｌ’Ｂｓ嶽衝液（リン酸駿衝生墳的食塩水１．Ｅ７．２〜７．４ ．１０精λりン１１に塩、１００集、ＭＡ必Ｃ４、ｌＯ鵠ＭＮ請、）中６２／１ の捕捉抗体０，３紅／管をヌンク管にピペットで入ｎる。 ２）管を１８〜２４時間インキュベー１−　した。 幻　管をＰＢＳ緩衝液で２旦洗浄した。 ４）管をＰＢＳｔＲ＠液甲２．０％ＢＳＡでブロックし、室温において５４時間 インキュベートした。 ５）管をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。 ６）管を室温で乾燥した。 ７）管をプラスチックフリーザーバッグに入れて、４℃で保存した。 Ｄ）標準：ウマ血清０．５．３０．１００．２００％ｙ／ｍｌ／ＢＩ！中に調製 ２、アッセイプロトコール １）サンプルまたは標準２５１を抗体被徨管にピペットで入れた。 ２）標識抗体１００１を加えた。 ３）管をおだやかに旋回した。 ４）管をローター上で室温において１時間インキュベートした。 ５）管を脱イオン水で３回洗浄した。 ６）化学発光を２時間計数した〔ポンプ１：０．１＃Ｂ八０．＋０．２５％Ｅ、 ０．　；ポンプ２　：　０．２５　Ｎ　Ｎａ０Ｂ＋０．１２５％（ＴＡＣ〕、ル マタグ（ＬｓｒｎａＴａｅ）分析装置〔ロンドン　ディアグノステカ（ＬＯ％ｄ ｏｇ＆Ｄｉ−６ｇ％ｏａｃｓｇａ）ミネソタ州エデンブライリーから商取引で入 手可能〕中〕 Ａ）（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル−八−メテルーア クリシニクムー９−カルボキシレートフルオロスルホネートのβ−Ｄ−チオグル コースアダクツのプロゲステロン共役体ニリン駿酸衝液（ｐＨ６，０，１００渇 Ｍリン醗塩、１５０ｓＪｆ　ＮａＣ１，０，１％ヒト血清アルブミン、０．００ １％チメロサル）中プロゲステロン共役体２０　ｐｔ／ｙｄＢ）第１抗体ニリン 酸緩衝液〔ｐＨ６，ｏ。２００１１％Ｍリン酸塩、　１５０　ｓＭ　ＮａＣ１， ０，１％ヒト血清アルブミン、０．０１％ＣＢＡＰＳ、ダナゾール（Ｄａｓａｓ ｏｌ　）５ｆ）中のウサギ抗プロゲステロン〔ケンブリッジメジカル　ディアグ ノスチツクス（ＣａｍｂｒｉｄｇｔｒＭａｄｉｃ８Ｌ　Ｌ）ｉａｇｎｏａｔｉａ ａ　）　〕Ｃ）同相被飯管：ヤギ抗ウサギ／ｅ２．５ｓ’で被覆し、０、５０． ｏＢ　５．４でブロックした乾燥ヌンク管、管は次のように準備した： １）管を室温において２．５ｆ／１１７ヤギ抗ウサギ／６（５０（１）と共に１ 時間インキュベートした。 ２）管を蒸笛水で３回洗浄した。 ３）管を室温においてＯ０５％ＢＳＡ（ｓｏｏｌ）と共に直ちに３時間インキュ ベートした。 ４）管を蒸餉水によって３回洗浄した。 ５）管を室温、相対１度４０％において一晩乾燥した。 ６）管をプラスチックフリーザーバッグに入れて４℃において保存した。 Ｄ）血清マトリックス：アンチックステア（Ａｎｔａｅｈａｇａｍｒ　）血清 Ｅ）標準：０．０．１３．０．３８．１．３１．７．３１．１６６．３７．０％ ｆ／ｗ１ ２、　アッセイプロトコール ｌ）サンプルまたは標準５０１を抗体被榎管にピペットで入れた。 ２）共役体緩衝液１００／を加えた。 ３）第１抗体ｌ１価液１００７を加えた。 ４）管をおだやかに旋回した。 ５）管を３７℃において２時間インキュベートした。 ６）管をデカントし、０．１％ツイーン（Ｔ替−鴨）中１５０ｍＭ　ＮｏＣｌ　 （１ｗＪ　）で洗浄し、蒸留水で３回洗浄した。 ７）管を逆さＫして、排水させた。 ８）化学発光を２秒間計測した〔ポンプ１　：　０．Ｉ　Ｎ　ＥＮＯ。 ＋０．２５％ＥｔＯオニポンプ２：０．２５ＮＮＧＯＢ＋０．１２５％（、’Ｔ ＡＣｌルマメグー分析装置Ｃロンドンディアグノスチツクス、ミ浄ンタ州エデン ブライリーから商取引によって入手可能）中〕 実施例Ｘ８゜ 】、成分 Ａ）　’４１ＡＲ抗体：（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニ ル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネート に共役したアフイニテイ８１製ヤギ抗ＴＳＥ Ｂ）貯ｉＩＩＬＭ＆２１ｉＪ液＝１００憤Ｍリン酸塩、０．１４５ｊｌＮ、Ｃ４ ，０，００１％チメロサル、０．４％ＢＳＡ。 ｏ、ｘｗ９／ｕマウス−グロブリンおよび０．１■／−ヤギグセプリン、ｐＨ６ ，０ Ｃ）捕従抗体：ヌンク管上の固相としてのモノクローナル抗ＴＳＥＣ２１／ｌ１ ｌ）、 固相ヌンク管の準備手順： １）ＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝生理的食塩水１．Ｅ７．２〜７．４．１０嘱Ｍリ ン酸塩、１００　ｍＭ　ＮａＣ４゜１０愼ＭＮＧＮ、）中２ｔ／鯰において捕捉 抗体０．４ｄを各管に加えた。 ２）管を１８〜２４時間インキュベートした。 ３）管をＦＢＳｌ＆衝液で３回洗浄した。 りし、室温におい″′Ｃ≦４時間インキュベートした。 ５）管をＰＥ５ＩＩｋ衝液によって３回洗浄した。 ６）管を室温において乾燥した。 ７）管をプラスチックフリーザーバッグに入れ、４℃において保存した。 Ｄ）標準：つｉ血清０．０．５．２．５．１Ｏ１２５，１００ｉｖ７ａｔ中で勇 入 ２．アッセイブロトコール １）サンプル２００１を被後管にピペットで入れた。 ２）標識抗体１００７な加えた。 ３）管をおだやかＫＩＮ回した。 ４）管を振とう装ｆｉｌ　（５ｈａｋｅｒ）上、室温におい１２時間インキュベ ートした。 ５）管をパイオドミック　ウオッシャ−（Ｂｊｏｊ＞鶴ｔａＩＦａｘｋｍｒ）　 （オーシャンサイエンティフィック社（Ｏｅｓａ％ｓｅイ＃％ｔｉｆｉｅムＣ６ ）カリフォルニア州ガーデングローブが商取引で入手可能〕を用いて洗浄した。 ６）化学発光を２秒間計測した〔ポンプ１　：　０．Ｉ　ＮＥＮＯ。 十０．２５％Ｈ，Ｏ，：ポンプ２　：、　０．２５Ａ’　ＮａＯＨ＋０．１２５ ％ＣＴＡＣ１，ルマタグ分析装置（ロンドンディアグノスチックス、ミネソタ州 エデンプライリーから商取引で入手可能）中〕 実施例１９゜ Ａ）標識抗体：（２，６−シメチルー４−二トロ）７エ二ルーＮ−メチル−アク リジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートに共役したアフィニテ イ精羨つサギ抗プロラクチン貯蔵叡衝’ｉ：１０ｍＭ’）７ａｌｋ駿ａ液、１０ ０　ｍＭ　ＮａＣ１ｐＨ６，０。 ０．００１％？／ｌ１ｆｆｔル、０．４％ＢＳＡＢ）捕捉抗体：ヌンク管上の固 相としてのクサギ抗プロラクチン（６ｆ／ｕ） ｃ’）固相被榎管：乾燥ヌンク管を次のように準備した：１）ＰＢＳ緩衝液（リ ン＃ＲＩ＆衝生理的食塩水、２Ｂ７．２〜？、４　：　１０ｍＭリンｍ’１Ｊｉ −１００ｓｊｆ　ＮａＣ１，１０ｓ　ＭＮａＮ、　）　をヌンクｔＫピペットで 入れた。 ２）管を１８〜２４時間インキュベートした。 ３）管をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した。 ４）管をＰＢＳ玖衝液中２．０％ＢＳＡによってブロックし、室温において≦４ 時間インキュベートした。 ５）管をＰＢＳｌｌ！を衝液で３回洗浄した。 ６）管を室温で乾燥した。 ７）管！プラスチックフリーザーバッグに入れて４℃で保存した。 Ｄ）標準二ウマ血清０．５．３０．１００．２００す／ｄ／―中に調製。 ２、アッセイプロトコール ｌ）サンプルまたは標準２５ノを抗体被後管にピペットで入れた。 ２）標識抗体１００Ｊを加えた。 ３）管をおだやかに旋回した。 ４）管をローター上、室温において１時間インキュベートした。 ５）管を脱イオン水で３回洗浄した。 旬　化学発光を２秒間計辿ｊした〔ポンプ１０．　Ｉ　Ｍ　ＥＮＯ。 十０．２５％Ｂ、υ、二ポンプ２　：　０．２５　Ｎ　Ｎａ０Ｅ　十〇、１２５ ％ＣＴＡＣＩ、ルマタグ分析装［（ロンドンディアグノスチツクス、ミネソタ州 エデンブライリーから商取引で入手可能〕 安定性試験 下記の安定性試験によると、不発明の成分（ｍｏｉｓ！１）と共役体は約６．５ 〜約７，５のアＨにおいて貯蔵し、アッセイに使用するのが好ましい。本発明の 成分と共役体は他のＰＩｉにおいてもある一定の条件下では高い安定性を示すが 、安定性増加は好ましいｐＥｋＦＢ３では条件依存性ではない。 成分がその化学発光の５０％を失う日数（１％）を比較することによって、比較 安定性を測定した。タン／ずり質または他の物質に結合していないある一定成分 の安定性を室温および４℃において監視した。成分はＩＩ衝液（ｐＨ６，０；　 ５０　ｍＭ　ｐｈ、　０．１％ＢＳＡ）中に保存した。 （２，６−シメチルー４−ニドｅ２）フェニル−３−（３−スクシンイミジルオ キシカルボニル）プロピルオキシ−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキ シレートフルオロスルホネートは室温と４℃の両方において９８日後にカウント の明白な低下を示さなかった。（２，６−インブロビルー４−二トロ）フェニル −３−（３−スクシンイミジル−オキシカルボニル）プロピルオキシ−Ｎ−メチ ル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートは室温と４℃ の両方において３１２日後にカウントの明白な低下を示さなかった。（２，６− ジメチ、Ａ／−４−）リメチルアンモニオ）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニ ウム−９−カルボキシレートジスルホネートでは’Ｍは室温において１０５日間 であり、４℃では１０５日後Ｋｇ！Ａに遅さなかった。（２，６−シメトキシー ３−クロロスルホニル）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキ シレートフルオロスルホネートでは、ｔｈは室温において５０日間であり、４℃ では１３０日間後も秦りに遅さなかった。（２，６−シメトキシー３−クロロス ルホニル−４−プロパノイック）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９− カルボキシレートフルオロスルホネートでは、ｔＨは室温において２４日間であ り、４℃においては９５日間であった。（２，６−ジメチル）フェニル−Ｎ−メ チル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートでは、ｔ３ ，４は室温においては５０日間であった。これに比べて、本発明の成分の置換基 を有さない成分は室温において８日間未満の平均’！Ａ−’℃においては約３２ 日間の１３Ａを有した。 実施例２１゜ フェニル−９（２，６−ジメチル）フェニル−と（２＋　６−　ジメトキシ−３ −クロロスルホニル）フェニル−＋（２ｅ６−シメチルー４−トリメチルアンモ ニオ）・フェニル−および（２，６−シメチルー４−ブロモ）フェニル−Ｎ−メ チル−７クリジニウムエステルの比較安定性を３５℃と４５℃においてインキュ ベートしながら、ｐＨ６，３およびｐＨ８，０のリン酸緩衝液（１００％＆　ｐ ｉ。 １５０　ｓ、Ｍ　ＮａＣ１、０，００１％チメロサルー０．００５％ヒト血清ア ルブミン）中で観察した。３５℃と４５℃におけるｐＨ６，３でのこれらの化合 物の安定性データを第１図と第２図にそれぞれ示す。３５℃と４５℃におけるｐ Ｈ８，０でのこれらの化合物の安定性データはそれぞれ第３図と第４図に示す。 置換フェニル化合物の全ては、（２，６−ジメチル）フェニル化合物を例外とし て、非置換化合物（％ａｋｍｄ　ａｏｍｐｏ％％ｄ）に比べて安定性上昇を示し た。（２，６−ジメチル）フェニル化合物は３５℃、ｐＨ６，３ｔ／Ｃおいて非 置換フェニル化合物よりも低安定性であったが、３５℃ではｐＨ８，０において 、４５℃では両ｐＢにおいて安定性上昇を示した。 実施例２２゜ （２，６−シメチルー４−二トロ）フェニル−３−（３−スクシンイミジルオキ シカルボニル）プロピルオキシ−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシ レートフルオロスルホネートと（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル） フェニル−Ｎ−）チル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホ ネートのマウスＩ、Ｇ共役体の種々な温度と、Ｈにおける安定性を試鋏し、４− （２−スクシンイミジルカルボキシエチル）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニ ウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネー）ＩＩＧ共役共役安定性に比較 した。４−（２−スクシンイミジルカルボキシエチル）フェニル−Ｎ−メチルア クリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートは次式を有する：４ −（２−スクシンイミジルカルボキシエチル）フェニル−Ｎ−メチルアクリジニ ウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートは本発明の化合物とは、電子 求引基またはフェニル環上の２．６−ｆｉ１換を有さない点で異ナル。４−（２ −スクシンイミジルカルボキシエチル）フェニル−Ｎ−メチルアクリジニウム− ９−カルボキシレートフルオロスルホネートは文献に発表されており、化学発光 用途に広く用いられている。 以下に述べるよ５に、ある一定共役体のカウントの低下は化学発光ラベルのエス テル結合の加水分解く帰因する。それ故、標識化合物の安定性が低下すると、共 役体のカウント低下率は減少する。 （２，６−シメチルー４−二トロ）フェニル−３−（３−スクシンイミジルオキ シカルボニル）プロピルオキシ−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシ レートフルオロスルホネー１−１（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル ）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスル ホネートおよび４−（２−スクシンイミジルカルボキシエチル）フェニル−Ｎ− メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートのマウスＩ 、Ｇ　共役体は４℃において貯蔵した。共役体は、Ｅ　６．３．７．３および８ ．０の３棟類の酸１Ｆ２溶液中に貯蔵した。 第１１１衝液は１００ｗｊｆｐイ、　１５０　％＃　ＮａＣ１。 ０．００１％チメロサル、０．１％ヒト血清アルブミン、２０■／ｊヒツジ！ｇ Ｇを含有した（標準リン酸緩衝液）。 、Ｂ　６．３．７．３および＆０の標準緩衝液中の安定性データをそれぞれ第５ 図、第６図、第７図に示す。 第２緩衝液はヒツジＩＱＧを含まない標準リン酸緩衝液であった。ｐＨ６，３， ７，３および＆０の第２緩衝液中の安定性データはそれぞれ第８図、第９図、第 １Ｏ図に示した。 第３緩衝液はヒツジＩＱＧを含まず、ヒト血清アルブミンの代りに０．１　ｘク シ血清アルブミンを含む標準リン酸緩衝液であった。ｐＨ６，３，７，３および ＆０の第３緩衝液中の安定性データはそれぞれ第１１図、第１２図、第１３図に 示す。 各ｐＨの各緩衝液において、（２，６−シメチルー４−ニドＨ）フェニル−３− （３−スクシンイミジルオキ７カルボニル）プロピルオキシ−Ｎ−メチル−アク リジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートト（２，６−ジメト午 シー３−クロロスルホニル）フェニル−Ｎ−メテルーアクリジニクムー９−カル ボキクンートフルオロスルホネートのＩＱＧ共役共役、４−（２−スクシンイミ ジルカルボキシエチル）フェニル−Ｎ−メチルアクリジニウム−９−カルボキシ レートフルオロスルホネートのＩＱＧ共役共役比べた場合に、安定性上昇を示し た。 （２，６−シメチルー４−３トｅ＋）フェニル−３−（３−スクシンイミジルオ キシカルボエル）プロピルオキシ−Ｎ−メゾルーアクリジニウム−９−カルボキ シレートフルオロスルホネー）、（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル ）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスル ホネートおよび４−（２−スクシンイミジルカルボキンエチル）フェニル−Ｎ− メゾルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートのマウスＩ ＱＧ共役体は室温（約２３℃）（ＲＴ）と３７℃において貯蔵した。共役体はｐ Ｈ６，３，７，３および＆０Ｉ７）標準リン散緩衝液中に貯蔵した。 ４−（２−スクシンイミジルカルボキシエデル〕７エ二ルーＮ−メチルアクリジ ニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネート％　（２＊　６−　シｊ　 テ）’　−４−二）ｅｌ）フェニル−３−（３−スクシンイミジルオキシカルボ エル）ブービルオキクーＮ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフ ルオロスルホネートおよび（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）７エ 二ルーＮ〜メナルーアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネー トのＩＱＧ共役共役３種類のｐＨすべてにおける呈はでの安全性データはそれぞ れ第１４図、第１５図および第１６図に示す。４−（２−スクシンイミジルカル ボキシエテル）フェニル−Ｎ−メチルアクリジニクムー９−カルボキクレートフ ルオロスルホネートと（２，６−シメトキシー３−りｏｏスルホニル）７エ二ル ーＮ−メチルアクリジニウム−９−カルボキシ１／−トフルオロスルホネートｉ ＱＧ共役体の３ｐＨすべてにおける３７℃での安定性データはそれぞれ第１７図 と第１８図に示す。第１９図と第２０図は（２，６−ジメテルー４−ニトロ）フ ェニル−３−（３−スクシンイミジル−オキシカルボニル）プロピルオキシ−Ｎ −メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートＩＯＧ 共役体の３ｐＨ丁べてにおける３７℃での安定性データな要約する。第１９図と 第２０図は共役プロトコールに２０Ｘ七ル過剰な（２，６−シメチルー４−ニド ｃ１）フェニル−３−（３−スクシンイミジルオキシカルボエル）プロピルオキ シ−Ｎ−メチルアクリジニウム−９−カルボ中７レートフルオロスルホネートと ５Ｘモル過剰す（２、６−シフデシトロ−二トロ）フェニル−３−（３−Ｘクシ ンイミジルーオキ７カルボニル）プロビルオキクーＮ−メチル−アクリジニウム −９−カルボキシレートフルオロスルホネートをそれぞれ用いて製造した（２， ６−ジメテルー４−二トロ）フェニル−３−（３−スクシンイミジル−オキシカ ルボニル）プロピルオキシ−Ｎ−メチル共役体リジニウム−９−カルボキシレー トフルオロスルホネート共役体のデータを示す。 各ｐＨおよび室温と３７℃において、（２，６−シメチルー４−二トロ）フェニ ル−３−（３−スクシンイミジルオキ７カルボニル）プロピルオキシ−Ｎ−メチ ル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートおよび（２， ６−シメトキシー３−クロロスルホール）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウ ム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートのＩｇＧ共役共役、４−（２− スクシンイミジルカルボキンエチル）フェニル−Ｎ−メチルアクリジニウム−９ −カルボキシレートフルオロスルホネートＩｇＧ共役体と比べた場合に、安定性 上昇を示した。 （２，６−シメチルー４−二トロ）フェニル−３−（３−スクシンイミジル−オ キシカルボニル）プロピルオキ７−Ａ’−メゾルーアクリジニウム−９−カルボ キシレートフルオロスルホネートや　（２，６−シメトキシー３−クロロスルホ ニル）フェニル−Ｎ−）デル−アクリジニウム−９−カルボキシレー１−フルオ ロスルホネートおよび４−（２−スクシンイミジルカルボキシエチル）フェニル −Ｎ−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートのＩ ＱＧ共役共役、ｐＨ６，９，７，０，７，３、＆０のアジド緩衛液（５０ｖｎＭ ｐｉ、１００ｔｎ　Ｍ　ＮａＣ１、０，１％ウシ血清アルブミン−１０ｙａＡ（ アジドナトリウム）中に３７℃において貯蔵した。ｐＨ６，９，７，０％７．３ および＆０のアジド緩衝液中での安定性データはそれぞれ第２１図、第２２図、 第２３図および第２４図に示す。 ７３より大きいｐＨでは、（２，６−シメチルー４−二トロ）フェニル−３−（ ３−スクシンイミジル−オキシカルボニル）プロピルオキシ−Ｎ−メチル−アク リジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートと（２，５−ジメ）中 シー３−クロロスルホニル）７エ二ルーＮ−メチル−アクリジ−タム−９−カル ボキンレートフルオロスルホネートＩＱＧ共役体の両方は、４−（２−スクシン イミジルカルボキシエチル）フェニル−Ｎ−メチルアクリジニウム−９−カルボ キシレートフルオロスルホネートＩｇＧ共役体と比較した場合に、安定性上昇を 示した。ｐＨ６，９と７．０では、、（２，６−ジメテルー４−二トロ）フェニ ル−３−（３−スクシンイミジルオキシカルボニル）プロピルオキシ−Ｎ−メチ ル−アクリジニウムー９−カルボキシレートフルオロスルホネートのＩＱＧ共役 体のみが安定性上昇を示した。（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル） フェニル−Ｎ−）’テルアクリジニクムー９−カルボキシレートフルオロスルホ ネー）　ＩＱＧ共役体はｐＨ６，９と７．０において、４−（２−スクシンイミ ジルカルボキシエチル）フェニル−Ｎ−メチルアクリジニウム−９−カルボキシ レートフルオロスルホネー）　！ＱＧ共役体よりも有意に安定性ではなかった。 （２，６−ジメテルー４−二トロ）フェニル−３−（３−ｘｙシンイミジル−オ キシカルボニル）プロビルオキシーＮ−メチルーアクリジニウム−９−カルボキ シレートフルオロスルホネート、（２，６−ジメトΦシー３−クロロスルホニル ）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスル ホネートおよヒ４−　（２−スクシンイミジルカルボキシエチル）フェニル−Ｎ −メチルアクリジ二りムー９−カルボキシレートフルオロスルホネートのＩＱＧ 共役体はｐＨ６，３のアジド緩衝液中に３７℃において貯蔵した。（２，６−ジ メテルー４−二トロ）フェニル−３−（３−スクシンイミジルオキシカルボニル ）プロピルオキシ−Ｎ−メチルアクリジニウム−９−カルボキシノートフルオロ スルホネ−）、（２，６−シメトキシー３−クロースルホニル）フェニル−Ｎ− メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートおよび４− （２−スクシンイミジルカルボキシエチル）フェニル−Ｎ−’ｆ−ルアクリジニ ウムー９−カルボキシレートフルオロスルホネートのＩＱＧ共役体の３７℃にお けるｐＨ６，３のアジド緩衝液中の安定性データは＠２５図く示す。 （２，６−シメチルー４−ニドｅ！〕フェニル−３−（３−スクシンイミジル− オキ７カルボニル）プロピルオキシ−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボ キシレートと４−（２−スクシンイミジルカルボキシエチル）フェニル−Ｎ−） チルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートのＩＱＧ共役 体は室温と４℃においてｐＨ５，９のアジド緩衝液中に貯蔵した。（２，６−シ メチルー４−二）ａ）フェニル−３−（３−スクシンイミジル−オキシカルボニ ル）フロビルオキシ−Ｎ−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオ ロスルホネートと４−（２−スクシンイミジルカルボキシ　□ｘｆル）７ｘ＝ル ーＮ−）エチル７り’）ジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネート のＩｙ（４℃役体のｐＨ５，９のアジド浴液中での安定性データは第２６図に示 す。 ３７℃における６３未満のｐＨでは、（２，６−シメチルー４−二トロ）フェニ ル−３−（３−スクシンイミジルオキシカルボニル）プロビルオギシーＮ−メチ ルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートと（２，６−ジ メトー＃７−３−ククロスルホニル）フェニル−Ｎ−メチルアクリジニクムー９ −カルボキシレートフルオロスルホネートのＩＱＧ共役体の両方は％　４−（２ −スクシンイミジルカルボオキシニブル）フェニル−Ｎ−メゾルアクリジニウム −９−カルボキシレートフルオロスルホネ−１−ＩＱＧ共役体と比べた場合に、 安定性低下を示した。室温および４℃のｐＨ５，９において。 （２，６−シメチルー４−二トロ）フェニル−３−（３−スクシンイミジルオキ シカルボニル）プロピルオキ７−Ｎ−メゾルーアクリジニウム−９−カルボキシ レート！ｇＧ共役体ｔＸ、４−（２−スクシンイミジルカルボキシエチル）フェ ニル−Ｎ−メチルアクリジニウム−９−カルボ中シレートフルオロスルホネート ＩｇＧ共役体と比較した場合に、安定性低下な示した。 実施例２３゜ フェニル−１（２，６−ジメチル）フェニル−おヨヒ（２，６−シメチルー４− 二トロ）フェニル−Ｎ−メゾルーアクリダンエステルの比較安定性を、３５℃と ４５℃においてインキュベートしながら、ｐＨ６，３とｐＨａｏのリン酸緩衝液 （ｌＯＱｗａＡｆ　ｐｉ、　１５０ｍＡｆ　ＮａＣｌ１．０．００１％チメロサ ル、ｏ、ｏｏｓｘヒト血渭アルブミン）中で観察した。３５℃と４５℃における ｐＨ６，３での３化合物の安定性データは、それぞれ舅２７区と第２８図に示す 。３５℃と４５℃におけるｐＨａｏでのこれらの化合物の安定性データは第２９ 図と第３０図に示す。 （２，６−ジメチル）フェニル−化合物と（２，６−シメチルー４−二トロ）フ ェニル−化合物は非置換７エ二ル化合物と比べて安定性の増加を示した。 エステル結合が付着した炭素にＲｎＸ基を有する不発明の好ましい化学発光性成 分は、次式？有する（２．６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル− Ｓ−メチルアクリダン−９−エトキシ−９−カルボキシレートである： （２，６−ジフト中シー３−クロロスルホニル）フェニル−Ｎ−メゾルーアクリ ダン−９−エトキク−９−カルボ＊’：ｙＶ−）ＩＬ　（２、６−シメトキシー ３−クロロスルホニル）フェニル−Ｎ−メテルーアクリシニウＡ−９−カルボキ シレートは下記の２種類の方法を用いて合成’ｔａ　カラム〔ライニン（Ｒａ１ ｎｉｓ　）ｓダイナマックス（Ｄｙｎａｍａｚ）　６０　Ａ、　２５０ｓｕＸ　 １０ｘ　：ｌを、約Ｏ，ＯＳ３の第３アミン（例えばトリエチルアミン）を含む エタノール／アセトニトリル（１０％まで）の混合物によって平衡化した。（２ ，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニ ウム−９−カルボキシレートを移動相に溶解し、カラムに注入した。 ２８Ｅ論において最大吸光度を示し１溶出する主要フラクションを流速度２．０ 〜２．５１１ｊ／分で回収した。溶媒を直ちに完全に減圧除去した。次に残渣を 少量のベンゼンと反応させて、痕跡量のアルコールを除去し、ｉ＆終生成物１’ アル（２、６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル−Ｎ−メチル−ア クリダン−９−エトキシ−９−カルボキシレートから水分を除去した。このＨＰ ＬＣ法は非常に純粋な生成物を生ずるので、好ましい合成法である。しかし、Ｅ ＰＬＣ法はある一定の核化合物には適当でないと考えられる。ＭＰＬＣ法が適当 でない場合には、以下に述べる核鴎イオン方法を用いることかできる。 ２　求執心イオンによる出発化合物の処理（２，６−ジメト＊シー３−クロロス ルホニル）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシ１／−１（ ０，Ｏｘ３鴨鴨ｏ１ｍ、７５■）を窒素下で無水エタノール（３１ｊ）に溶解し た。無水エタノール中カリウムーブトキシド溶液（２ダ／ｌ１ｌＩｊ）を、激し く撹拌した（２．６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル−Ｎ−メチ ル−アクリジニウム−９−カルボキシレート溶液に、溶液の黄色が完全に消失す るまで、温顔した（気密な注射器を用いて）。次にエタノールを完全に減圧除去 した。 残渣を無水エーテル（２紅）と約ｌｐの無水硫酸ナトリウムによって処理した。 エーテル溶液の分離と溶媒の蒸発によって、（２，６−ジフト中シー３−クロロ スルホニル）フェニル−Ｎ−メチル−アクリダン−９−エト中シー９−カルボキ シレートが白色固体（２，５ａｌｊ）として得られた。 （２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）７エ二ルーＮ−メチル−アクリ ダン−９−メトキシ−９−カルボキシレートをＨＰＬＣ法と核漬イオン合成法の 両方を用いて、（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル−Ｎ− メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートから製造した。（２，６−ジメ テルー３−クロースルホニル）フェニル−Ｎ−’チル−７り！Ｊ　９”ノー９− メト中フシ−−カルボキシレートを（２，６−シメチルー３−クロロスルホニル ）フェニル−Ｎ−メチル−アクリジニウム−９−カルボキシレートかう請求核陰 イオン合成法を用いて製造した。 ３、　その他の合成 上述の両合成法な用いて、Ｒ，χ基な有する本発明の化合物のいずれも合成する ことができる。エタノール以外の核試薬がＲｎＸ基を与える場合には、エタノー ルの代りに好ましい核試薬を合成法に用いる。異なるアクリジニウム、フエナン トリジニウム等が望ましい場合には、ＲｎＸ基を付加する化合物？上記合成法に おいて（２，６−ジメト＋７−３−１０ロスルホ二ル）フェニル−Ｎ−メチル− アクリジニウム−９−カルボキシレートの代りに用いることができる。大ていの 場合に請求伍試渠の変更は溶媒の変化をも必要とする（例えば、メタノールが望 ましい核試薬である場合には、エタノール以外加を競合するために溶媒として用 いることができない）。このような場合には、新たな核試薬を過当ならば代替溶 媒どして用いるかまたは非求核性、非プロトン性溶媒（例えばＴＢＦ）を代用す ることができる。 限定するわけではなく請求核性溶媒による処理を含めて他の合成方法を用いて、 Ｒａ基を含む成分を製造することができる。 実施例２５゜ 例２４に述べた合成法の有効性な実征するために、生成物をＵＶ　−Ｖｉ、スペ クトロスコピー、迅速原子ボンバード質量スペクトロスコピーおよび３００Ａｆ ＨｇプロトンＮＭＨによって分析した。 第３１図は（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル−Ｎ−メチ ル−アクリダン−９−エトキシ−９−カルボキシレートのＩＪＶ−〆（８スペク トル（溶媒クロロホルム）である。第３２図は（２，６−シメトキシー３−クロ ロスルホニル）フェニル−Ｎ−ｆｉｆメゾルーアクリダン−エトキシ−９−カル ボキシレートノ迅速原子ボンバード質量スペクトル（ｖｓ／　ａ　＝　４７２． １　：Ｍ　−０ＣＲ，ＣＭ、　）　テする。スルホニルクロリド成分の結合（ｉ ％ｔすｒｉｔｙ）は４７２＋２−４７４における同位体存在度ピークによって確 認する。 第３３図は（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル−ｙ−メチ ル−アクリダン−９−メトキシ−９−カルボキシレートの３００Ａ７Ｈｇプロト ンＮＭＲスペクトル（溶＠　：　ＣＬ）ＣＬ、）である。 第３４図は（２，６−シメチルー３−クロロスルホニル）フェニル−Ｎ−メチル −アクリダン−９−メトキン−９−カルボキシラードの３００　Ｍｌｂプロトン ＮＭＲスペクトル（溶媒５ＣＤＣら）である。 実施例２６゜ ＴＳＭ５Ｍアラセル識として、（２，６−ジメトキシ−３−フ０−スルホニル） フェニル−Ｎ−メテルーアクリグンー９−エトキシ−９−カルボキシレートを次 のように用いた： １、成分 Ａ）標識抗体：１フイニテイ精製ヤギ抗ＴＳＨｌ　（２，６−ジメ）キシ−３− ／ロロスルホニル）フェニル−Ｎ−メチル−アクリダン−９−エトキシ−９−カ ルボキシレートに次のように結合させた：炭酸水素塩緩衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ ９，５）中の抗ＴＳＢ抗体（約１００μＦ）の溶液をＤＭＦ溶液としての２５モ ル過剰な（２，６−シメトキシー３−クロロスルホニル）フェニル−Ｎ−メチル −アクリダン−９−エトキシ−９−カルボキシレートによって処理した。反応混 合物１に：ＨＰＬＣ系を用いて高速セファデックス（Ｓｍｐｈａｄａｍ　）　Ｇ 　２５　（微粒）カラム〔ファルマシア（Ｐｈａｒｖ＊ａｃｉｃＬ）　）で精製 した。約２０％エタノールを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）の移動相を用いて 、タンパク質ピークを約０．７５Ｍ／分の流速度で回収した。緩衝液交換後に、 標識抗体組成物を貯屓緩衝液で希釈して、１：１０希釈後にルマタグ分析装置（ ロンドン　ディアグノスチック、ミネソタ州エデンプライリーから商取引で大手 町ｗり内で約Ｚｏｏ、０００カウント／１００μ２が得られた。 Ｂ）貯蔵緩衝液：　Ｚｏｏ％Ａリンは塩、、０．１４５ＡｆＮａＣ１，０，００ １Ｘチメロサル、Ｑ、　４　％　ＢＳＡ、　０．１　＃／Ｎマウスグロブりン、 および０．１■／１ヤギグロブリン、ｐＨ６，０ リ　捕捉抗体：　ヌンク管上の固相としてのモノクローナル抗ＴＳＢ（２μＰ／ Ｎ＞、同相ヌンク管の準備手順；ｌ）　ＰＢＳ　（リン酸緩衝生理的食塩水、ｐ Ｈ７，２〜７．４．１０鶴Ｍ　リン酸塩、１００講ＭＳαｃｚ、ｌｏ鴨ＭＮａＮ ＠　）中２μｙ／ｍｌの捕捉抗体０゜４ａｔを６管に加えた。 ２）管を１８〜２４時間インキュベートした。 ３）管をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。 ４）管をＰＢＳ緩衝液中２．０％Ｈ５Ａによってブロックし、室温において４時 間インキュベートした。 ５）管をＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。 ６）管を室温で乾燥した。 ７）管をプラスチックフリーザーバッグに入れて４℃で保存した。 Ｄ）標準：　ウマ血？１ｉｆｏ、０，０５．０．１．０．５．２．５．１Ｏ１２ ５，５０μＩＵ／紅中に調製 Ｅ）洗浄溶液：　ＢＳＡｆ含む生理的食塩水緩衝液２、　アッセイプロトコール ｌ）サンプル２００μＪ？：被覆管にピペットで入れへ２）標識抗体Ｚｏｏμｔ Ｖ加えた。 ３）管をおだやかに旋回した。 ４）管ｔｔ振どう装置上、室温において２時間インキュベートした。 ５）６管に洗浄溶液１　ｍｌを加えた。 ６）管をパイオドミック洗浄装置〔オーシャンΦサイエンティフィック、カリフ ォルニア州ガーデングローブから商取引で入手可能〕を用いて洗浄した。 ７）化学発光を２秒間計測した〔ポンプｌ：　ｏ、　ｌ　ＮＨＮＯｓ＋０．２５ ％Ｈ１’！　ｅポンプ２　Ｎ　０．２５　Ｎ　ＮａＣ）Ｈ＋０．１２５％ＣＴＡ ＣＩ、ルマタグ分析装置（ロンドンディアグノステック、ミネソタ州エデンブラ イリーから商取引で入手可能）中〕 標識抗体を含むアッセイ混合物へＨＮＯ，を添加してＣ９エトキシ基をアクリジ ニウム分子から切除させてから、Ｎα０Ｈ（Ｉ’ｍ加によって化学発光反応を誘 導する。このアッセイの標準曲線は第３５図に示す。 実施ガ２７゜ （２＋　６−　ジメトキシ−３−クロロスルフォニル）フェニル−Ｎ−）１チル −アクリジニウム−９−カルボキシラード（″１１ＭＣジと（２，６−ジメトキ シ−３−クロロスルフォニル）フェニル−Ｎ−メチル−アクリタン−９−エト中 ７−９−カルポキシラー）　（＠ＤＭＥ”）の比較上の安定性をｐＨ９，６２５ ℃で比較した。化合物をＤＭＦに溶解した。（およそ０．５ダ／１）その後溶液 １０μｉｔ炭酸水素塩バツフアー（０，１Ａｆ炭酸水素塩、０．０００２５％チ メロザールＯ０１％牛血清アルブミン）ｌ紅に加えた。 溶液をｌＯμｊ中およそ３００．０００カウントになるまでさらに希釈した安定 性の研究データは第３６図に示されている。 Ｌ）ＭＥはＤ　Ｍ　Ｃに比べて、時間に対して安定性が高いことが示された。Ｄ ＭＣ−標識ＴＳＨ複合体とＤＭＥ−標識ＴＳＨ複合体の比較安定ａ？：ｐＨ６， ０，２５℃、３０”Ｃ１及び３５℃で比較した。安定性の研究データは第３７図 −３９図に示されている。ＩＪＭＥ−標識ＴＳＨｖＬ合体は時間に対して安定性 が高いことが示された。 実施（へ）２ａ エステル結合にかかわる畿累がＲｎＸグループにあり、べり置換基をもつ５本発 明の望ましい化学ルミネッセンス基は、フェニル−Ｎ−メチル−１，３−ジメチ ル−アクリダン−９−メトキシ−９−カルボキシラードであり、以下の式で示さ れる。 ＣＭ。 フェニル−Ｎ−メチル−１，３−ジメチル−アクリダン−９−メトキン−９−カ ルボキフラートはフェニル−Ｎ−メチル−１，３−ジメチル−アクリジニウム− ９−カルボキシラードよつ、前述したＨＰＬＣに従って合成された。 フェニル−Ｎ−メチル−１，３−ジメチル−アクリジニウム−９−カルボキシラ ードを生成するには、３．５−シメデルアニリントフロモベンゼンをウルマン（ Ｕ踊ａｎｔｓ　）反応の拡張した条件下で反応しＮ−フェニル−＃−（３，５− ジメチル）フェニルアミンを得た。 Ｎ−フ二二ルー＆−（３，５−ジメチル）フェニルアミンをオキサリルクロリド （ｏｇｌｙＪ　ｃｋｌｏｑｉｄａ　）と反応して、反応中間体ｙ−フェニルージ メチルイサチン（１ａａｔｉ％）を得た。 残留物を五酸化ニリン（亜リン酸五酸化物　）上で真空中で乾燥した。（２，６ −シメトキシー４−７ミノメチルー３−オキソスルホニル）フェニル−アクリジ ニウム−９−カルボキシラートフルオロスルホナ−）（４２）は次の反応に直接 利用した。 プロゲステロン、ヘミスクシナート（ｈａｍｉａｓｃｃｉｎαｇ＃）（９０１１ ９，０，２０９ｍｙｘｏＪｓ　）とＮ−メチルモルホリン（２２！、２０９　ｍ ５ｏｊ＊　）ｔｔ無水ＤＭＦ（２ＬＬｔ）ＶＣ溶解した。 溶液をドライアイス／　ＣＣｅ、浴中で深冷し、インブテルクａａホｈマー　） 　（ｉｓｏｂｓｔｙｌｅｋＸｏｖｏｆｏｒｍｔａ）　（３０！、０．２２９ｓ寓 ｏ１ｍ）を加えた。２分波Ｎ−メチルモルホリン（３，１４１，０，２８ｑｙｖ ｓｏｌｅ）％：含ひジメチルスルホキシド（ｄｉｖｍｍｔｋｙｌａｓｌｆｏｓｉ ｄａ　）　（２１Ｌｊ　）のこのアクリジニウム（４２）（１０１１９，０，１ ４３ｍｍｏｌｍ　）を加えた。−２０℃で１０分間か（拌ｔつづけ冷却浴をのぞ いた。室温で７時間か（押抜、水を３滴加えた。溶媒を真空中で除き、酢酸エチ ルを残留物に加えた。油性沈殿物を酢酸エチルでくり返し洗った。アセトニトリ ル（２ｊｌｊ）とともに粉砕し油分を固体として分離した。 塩基性条件下で環化な行い、１．３−ジメチル−アクリジン−９−カルボン域が 生成された。アクリジンエステルニル ニルエステルは前述した様に７エノールとのエステル結合反応より生成された。 フェニル−メチル−１，３−ジメチル−アクリジニウム−９−カルボキシラード は前述した様にアクリジンエステルより生成された。 この芙九的に記述されている合成方法の操作性を確実なものにするために、生成 物を３００　ＭｔｈプロトンＮＭＲで解析した。スペクトル蚤１第４０図に示す 。 上述のことから、当業者にとって、上記の合成物及び方法の様々な修正を発明の 意図及び目的からそれることなしに行うことができることは明白であろう。従っ て、本発明は、その意図あるいは必須の特色をそこなわず、他の明確な形で急様 化されることも可能であると予想される。つまり本態様は丁ぺての点で例証であ り、限足的なものではないとみなれるべきであり、発明の目的は上述よりむしろ 龜えられている請求の範囲によって示され℃おつ従って請求の意味と範囲が同等 であるような変更はこの点に取りいれるつｔっである。 Ｆｉｇ、　３ Ｆｉｇ、　４ Ｆｉｇ、　１７ Ｆｉｇ、　１８ Ｆｉｇ、　１９　、 Ｆｉｇ、　２０ Ｆｉｇ、　２１ Ｆｉｇ、　２４ ＡＺＩＤＥＣ２，ＤＭＮ　＆　ＤＭＣ（３７Ｃ）Ｆｉｇ、　２６ 田 Ｆｉｇ、　２８ Ｆｉｇ、　３０ Ｆｉｇ、　２９ 吟問 ｌ７　ＤＥＣ８！３　１ｓ：５５　Ｖ、　３．９ＰＲＯＴＯＣＯＬ　Ｎｏ、：　 ２　ＮＡＭＥ　：　ＴＳＩ−１８５ＴＤＳＧａＪ凋、園π　：πＨ尋 ｓｍ匡　は−ｕ　ｚα 阿込Ｎ　３８９２８　２．５［３Ｇ　７．９ＳＴＤ　Ｓ　ｌ　：３７：ＩＩ：ｌ ：ｌ　５ｃ３．Ｇ［ｌｉ９　ＡＩＪＴＯ５Ｍ０ＯＴＨＩＮＣＦＡＣＴＯＲ９ＳＴ Ｄ　８２　３７１０４９　５９．９９Ｇ呂三ＡＮ　３７２１９１　５ｆ３．Ｇ（ ３Ｇ　９．４Ｆｉｇ、　３６　． ９．６　２５ 時間 手続補正書 平成　２年・・月　ぐ謂幹

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（Ｉ）特異的結合物質に結合した化学発光部分からなる化学発光複合体を使 用し、そして （ＩＩ）サンプル中の被分析物の存在は該化学発光複合体を含む特異的結合反応 生成物−もしくはそれ以上の形成に比例する、 サンプル中の被分析物の存在の特異的結合アツセイであり、 適当な条件下において、該化学発光複合体を含む該特異的結合反応生成物−もし くはそれ以上の実質的形成を生ぜしめ；そして （Ｉ）該化学発光複合体を含む該特異的反応生成物−もしくはそれ以上または、 （ＩＩ）該特異的結合反応生成物中に含まれていない化学発光複合体、 の化学発光を測定することからなるアツセイにおいて、化学発光部分として、エ ステル、チオエステルまたはアミドを選択し、そしてそのエステル、チオエステ ルまたはアミド結合（リンケージ）は、 該結合（リンケージ）が結合する炭素原子を含む複素環または環系（該複素環ま たは環系中のヘテロ原子は酸化状態にあの、そのために該炭素原子はペルオキシ ドまたは分子状酸素の攻撃を受けて、さらに分解して化学発光を発生する中間体 を形成できる）と； アリール環又は環系（該アリール環または環系は少なくとも一つの置換された６ 員環を含み、該置換された６員環は２またはそれ以上の置換基を含み、該２また はそれ以上の置換基の少なくとも二つは該結合（リンケージ）の加水分解を立体 的に障害する）、との間に存在し、そして更に 該結合（リンクージ）が結合する炭素原子は第二の置換基：ＲｎＸ−（式中、Ｘ はＯ、Ｎ、ＳおよびＣからなる群から選択され、Ｒは任意の基であり、そしてｎ はＸに適正な価を持たせる数である）を有する、ことを特徴とする上記特異的結 合アツセイ。 ２．該特異的結合物質は被分析物に特異的に結合する能力を有し、そして該−ま たはそれ以上の特異的結合反応生成物は被分析物−化学発光複合体のコンプレツ クスであり、該アツセイがさらに、 適当な条件下で該被分析物−化学発光複合体コンプレツクスを実質的に形成させ 、そして （１）該被分析物−化学発光複合体コンプレツクスの、または （ｉｉ）該被分析物−化学発光複合体コンプレツクスに含まれていない化学発光 複合体の化学発光を測定することを含む、請求項１記載の特異的結合アツセイ。 ３．該アツセイがさらに、（ｉ）該被分析物と特異的に結合して被分析物−反応 体コンプレツクスを形成し、且つ（ｉｉ）該特異的結合物質と特異的に結合して 化学発光−複合体−反応体コンプレツクスを形放する、ことのできる反応体を使 用し、そして該特異的結合反応生成物の−つもしくはそれ以上が該化学発光複合 体−反応体コンプレツクスであり、該アツセイがさらに、適当な条件下で該被分 析物−反応体コンプレツクスおよび該化学発光複合体−反応体コンプレツクスの 実質的形成を行わせ、そして （ｉ）該化学発光複合体−反応体コンプレツクスまたは卿該化学発光複合体−反 応体コンプレツクス中に含まれない化学発光複合体、の化学発光を測定すること を含む、請求項１記載の特異的結合アツセイ。 ４．該特異的結合物質が該被分析物に特異的に結合する能力を有し、そして該ア ツセイがさらに該被分析物に特異的に結合して反応体−被分析物−化学発光複合 体コンプレツクスを形成することのできる反応体を使用し、そして該−もしくは それ以上の特異的結合反応生成物が該反応体−被分析物−化学発光複合体コンプ レツクスであり、該アツセイがさらに、 適当な条件下で該反応体−被分析物−化学発光複合体コンプレツクスの実質的形 成を行い、そして（ｉ）該反応体−被分析物−化学発光複合体ロンプレツクスま たは （ｉｉ）該反応体−被分析物−化学発光複合体コンプレツクスに含まれない化学 発光複合体の化学発光を測定することを含む、請求項１記載の特異的結合アツセ イ。 ５．（ｉ）化学発光部分を使用し、そして（ｉｉ）サンプル中の被分析物の存在 は該化学発光部分を含まない特異的結合反応生成物−もしくはそれ以上の形成に 比例し、そして該化学発光部分は該特異的結合反応生成物−もしくはそれ以上の 形成に比例して化学発光を生じる、 サンプル中の被分析物の存在の特異的結合アツセイであり、 適当な条件下において、該特異的反応生成物−もしくはそれ以上の実質的形成を 生ぜしめ；そして該特異的反応生成物−もしくはそれ以上の形成に起因する該化 学発光部分の化学発光を測定することからなるアツセイにおいて、 化学発光部分として、エステル、チオエステルまたはアミドを選択し、そしてそ のエステル、チオエステルまたはアミド結合（リンケージ）は、 該結合（リンクージ）が結合する炭素原子を含む複素環または環糸（該複素環ま たは環系中のヘテロ原子は酸化状態にあり、そのために該炭素原子はペルオキシ ドまたは分子状酸素の攻撃を受けて、さらに分解して化学発光を発生する中間体 を形成できる）と； アリール環又は環系（該アリール環または環系は少なくとも一つの置換された６ 員環み、置換された６員環は２またはそれ以上の置換基を含み、該２またはそれ 以上の置換基の少なくとも二つは該結合（リンケージ）の加水分解を立体的に障 害する）、との間に存在し、そして更に 該結合（リンケージ）が結合する炭素原子は第二の置換基：ＲｎＸ−（式中、Ｘ はＯ．Ｎ、ＳおよびＣからなる群から選択され、Ｒは任意の基であり、そしてｎ はＸに適正な価を持たせる数である）を有する、ことを特徴とする上記特異的結 合アツセイ。 ６．該アツセイが、さらに該被分析物と結合して被分析物−反応体複合体を形成 する能力を有する反応体を使用し、そして該化学発光部分が該被分析物−反応体 複合体の形成に比例して化学発光を生じる、請求項５記載の特異的結合アツセイ 。 ７．該第二の置換基が、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋、−ＳＲ、−Ｓ Ｒ２＋、−Ｓ２Ｒ、−ＮＲＣＯ２Ｒ、−ＮＨＮＲ２、−ＮＲＮＲ２、−ＮＨＯＲ 、−ＯＮＲ２、−ＣＲ（ＣＮ）２、−ＣＲ（ＣＯＲ）２、−ＣＲ２ＮＯ２、−Ｃ ≡ＣＯＲ、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼か らなる群から選択される、請求項１または５記載の特異的結合アツーセイ。 ８．該結合（リンケージ）の加水分解を立体的に生害する該置換基の各々が、− ＣＨ３、−ＯＣＨ３および：−プロピルからなる群から選択される、請求項７記 載の特異的結合アツセイ。 ９．該結合（リンケージ）の加水分解を立体的に障害する該少なくとも一つの置 換基が、電子吸引性の基である、請求項７記載の特異的結合アツセイ。 ｌ０．該置換された６員環が、該結合（リンクージ）の加水分解を立体的に障害 する該置換基の他に、少なくとも一つの付加的置換基を有し、該付加的置換基が 電子吸引性の基である、請求項７記載の特異的結合アツセイ。 １１．該少なくとも一つの付加的置換基が、−ＮＯ２、−ＳＯ２Ｃｌ、−Ｂｒ、 −Ｎ（ＣＨ３）３＋および−Ｈからなる群から選択される、請求項１０記載の特 異的結合アツセイ。 １２．該電子吸引性の基が−Ｈである、請求項１１記載の特異的結合アツセイ。 １３．該アリール環または環系が、フエニル、ナフタレンおよびアントラセンか らなる群から選択される、請求項７記載の特異的結合アツセイ。 １４．該アリール環または環糸がフエニルである、請求項１３記載の特異的結合 アツセイ。 １５．該フエニル上の電子吸引性の基である全置換基のシグマｐの値の合計が約 １．０に等しいかそれ以下である、請求項１４記載の特異的結合アツセイ。 １６．複素環または環糸が、アクリジニウム、ベンズ〔ａ〕アクリジニウム、ベ ンズ〔ｂ〕アクリジニウム、ベンズ〔ｃ〕アクリジニウム、１，２，４−トリア ノールカチオン、イソオキサゾールカチオン、イソチオアゾールカチオン、１， ２−アゾールカチオン、イミダゾールカチオン、ベンズイミダゾールカチオン、 キノリニウム、インキノリニウム、キノリジニウム、環状置換キノリニウム、ピ リジニウム、ピリミジニウム、ピリダジニウム、ピラジニウム、フエナントリジ ニウムおよびキノキサリニウムからなる群から選択されるメンパーの還元型であ る、請求項７記載の特異的結合アツセイ。 １７．該複素環または環系が、アクリジニウム、キノリニウムまたはフエナント リジニウムの還元型である、請求項１６記載の特異的結合アツセイ。 １８．該第二の置換基が、−ＯＣＨ３および−ＯＣＨ２ＣＨ３からなる群から選 択される、請求項１７記載の特異的結合アツセイ。 １９．該化学発光部分が、（２，６−ジメトキシ−３−クロロスルホニル）フエ ニル−Ｎ−メチル−アクリダン−９−エトキシ−９−カルボキシレートである、 請求項１８記載の特異的結合アツセイ。 ２０．該化学発光部分が、（２，６−ジメトキシ−３−クロロスルホニル）フエ ニル−Ｎ−メチル−アクリダン−９−メトキツ−９−カルボキシレートである、 請求項１９記載の特異的結合アツセイ。 ２１．該化学発光部分が、（２，６−ジメチル−３−クロロスルホニル）フエニ ル−Ｎ−メチル−アクリダン−９−メトキツ−９−カルボキシレートである、請 求項１８記載の特異的結合アツセイ。 ２２．該複素環または環系が、該結合（リンケージ）が結合している炭素原子に ペリである少なくとも一つのペリ置換基を有する、請求項７記載の特異的結合ア ツセイ。 ２３．該少なくとも一つのペリ置換基がアルキルもしくはアリール基である、請 求項２２記載の特異的結合アツセイ。 ２４．該少なくとも一つのペリ置換基が−ＣＨ３である、請求項２３記載の特異 的結合アツセイ。 ２５．請求項１ないし２４のいずれか１項記載の化学発光部分を含む組成物。 ２６．特異的結合パートナーをさらに含む、請求項２５記載の組成物。 ２７．請求項２５または２６記載の組成物を少なくとも含むハイアルからなる特 異的結合アツセイキツト。 ２８．（ｉ）特異的結合物質に結合した化学発光部分からなる化学発光複合体を 使用し、そして （ｉｉ）サンプル中の被分析物の存在は該化学発光複合体を含む特異的結合反応 生成物−もしくはそれ以上の形成に比例する、 サンプル中の被分析物の存在の特異的結合アツセイであり、 適当な条件下において、該化学発光複合体を含む該特異的結合反応生成物−もし くはそれ以上の実質的形成を生ぜしめ；そして （ｉ）該化学発光複合体を含む該特異的反応生成物−もしくはそれ以上または、 （ｉｉ）該特異的結合反応生成物中に含まれていない化学発光複合体、 の化学発光を測定することからなるアツセイにおいて、化学発光部分として、エ ステル、チオエステルまたはアミドを選択し、そしてそのエステル、チオエステ ルまたはアミド結合（リンケージ）は、 該結合（リンケージ）が結合する炭素原子を含む複素環または環系（該複素環ま たは環系中のヘテロ原子は酸化状態にあり、そのために該炭素原子はべルオキシ ドまたは分子状酸素の攻撃を受けて、さらに分解して化学発光を発生する中間体 を形成できる）と； 易脱離基、 との間に存在し、そして更に 該結合（リンケージ）が結合する炭素原子は第二の置換基：ＲｎＸ−（式中、Ｘ はＯ、Ｎ、ＳおよびＣからなる群から選択され、Ｒは任意の基であり、そしてｎ はＸに適正な価を持たせる数である）を有する、ことを特徴とする上記特異的結 合アツセイ。 ２９．該特異的結合物質は被分析物に特異的に結合する能力を有し、そして該− またはそれ以上の特異的結合反応生成物は被分析物−化学発光複合体のコンプレ ツクスであり、該アツセイがさらに、 適当な条件下で該被分析物−化学発光複合体コンプレツクスを実質的に形成させ 、そして （ｉ）該被分析物−化学発光複合体コンプレツクスの、または （ｉｉ）該被分析物−化学発光複合体コンプレツクスに含まれていない化学発光 複合体の化学発光を測定することを含む、請求項２８記載の特異的結合アツセイ 。 ３０．該アツセイがさらに、（ｉ）該被分析物と特異的に結合して被分析物−反 応体コンプレツクスを形成し、且つ（ｉｉ）該特異的結合物質と特異的に結合し て化学発光−複合体−反応体コンプレツクスを形成する、ことのできる反応体を 使用し、そして該特異的結合反応生成物の一つもしくはそれ以上が該化学発光複 合体−反応体コンプレツクスであり、該アツセイかざらに、 適当な条件下で該被分析物−反応体コンプレツクスおよび該化学発光複合体−反 応体コンプレツクスの実質的形成を行わせ、そして （ｉ）該化学発光複合体−反応体コンプレツクスまたは（ｉｉ）該化学発光複合 体−反応体コンプレツクス中に含まれない化学発光複合体、の化学発光を測定す ることを含む、請求項２８記載の特異的結合アツセイ。 ３１．該特異的結合物質が該被分析物に特異的に結合する能力を有し、そして該 アツセイがさらに該被分析物に特異的に結合して反応体−被分析物−化学発光複 合体コンプレツクスを形成することのできる反応体を使用し、そして該−もしく はそれ以上の特異的結合反応生成物が該反応体−被分析物−化学発光複合体コン プレツクスであり、該アツセイがさらに、 適当な条件下で該反応体−被分析物−化学発光複合体コンプレツクスの実質的形 成を行、、そして（ｉ）該反応体−被分析物−化学発光複合体コンプレツクスま たは （ｉｉ）該反応体−被分析物−化学発光複合体コンプレツクスに含まれない化学 発光複合体の化学発光を測定することを含む、請求項２８記載の特異的結合アツ セイ。 ３２．（ｉ）化学発光部分を使用し、そして（ｉｉ）サンプル中の被分析物の存 在は該化学発光部分を含まない特異的結合反応生成物−もしくはそれ以上の形成 に比例し、そして該化学発光部分は該特異的結合反応生成物−もしくはそれ以上 の形成に比例して化学発光を生じる、 サンプル中の被分析物の存在の特異的結合アツセイであり、 適当な条件下において，該特異的反応生成物−もしくはそれ以上の実質的形成を 生ぜしめ；そして該特異的反応生成物−もしくはそれ以上の形成に起因する該化 学発光部分の化学発光を測定することからなるアツセイにおいて、 化学発光部分として、エステル、チオエステルまたはアミドを選択し、そしてそ のエステル、チオエステルまたはアミド結合（リンクージ）は、 該結合（リンケージ）が結合する炭素原子を含む複素環または環系（該複素環ま たは環系中のヘテロ原子は酸化状態にあり、そのために該炭素原子はペルオキシ ドまたは分子状酸素の攻撃を受けて、さらに分解して化学発光を発生する中間体 を形成できる）と； 易脱離基、 との間に存在し、そして更に 該結合（リンケージ）が結合する炭素原子は第二の置換基：ＲｎＸ−（式中、Ｘ はＯ、Ｎ、ＳおよびＣからなる群から選択され、Ｒは任意の基であり、そしてｎ はＸに適正な価を持たせる数である）を有する、ことを特徴とする上記特異的結 合アツセイ。 ３３．該アツセイが、さらに該被分析物と結合して被分析物−反応体複合体を形 成する能力を有する反応体を使用し、そして該化学発光部分が該被分析物−反応 体複合体の形成に比例して化学発光を生じる、請求項３２記載の特異的結合アツ セイ。 ３４．該第二の置換基が、−ＣＮ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋−ＳＲ、−Ｓ Ｒ２＋、−Ｓ２Ｒ、−ＮＲＣＯ２Ｒ、−ＮＨＮＲ２、−ＮＲＮＲ２、−ＮＨＯＲ 、−ＯＮＲ２、−ＣＲ（ＣＮ）２、−ＣＲ（ＣＯＲ）２、−ＣＲ２ＮＯ２、−Ｃ ＝ＣＯＲ、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼か らなる群から選択される、請求項２８または３２記載の特異的結合アツセイ ３５．該易脱離基がアリール環もしくはアリール環系である、請求項３４記載の 特異的結合アツセイ。 ３６．該アリール環もしくはアリール環系が、フエニル、ナフタレンおよびアン トラセンからなる群から選択される、請求項３５記載の特異的結合アツセイ。 ３７．該アリール環もしくはアリール環系が、フエニルである、請求項３６記載 の特異的結合アツセイ。 ３８．該フエニル環が未置換である、請求項３７記載の特異的結合アツセイ。 ３９．該化学発光部分がアミドであり、そして該易脱離基が式： ＮＲ′（ＳＯ２−Ｒ′′−Ｙ） （式中、Ｒ′およびＲ′′はアルキル、アルキレン、アリール、場合により置換 されにアルキル、場合により置換されたアルキレン、場合により置換されたアリ ール、アルキルオキシ、アリールオキシ、ハロ、場合により保護されたアミノ、 置換されたアミノヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、オキソ、チオ、イミノ、 場合により置換されたメルカプト、複素環、およびヘテロアルキル基からなる群 から選択され、そしてＹは水素原子、カルボキシ、カルボニルハライド、スルホ ニルハライド、カルボアルコキシ、カルボキサミド、カルボアリールオキシ、シ アノ、カルボキシイミド、イソシアナト、イソチオシアナト、スルホ、Ｎ−スク シニミジルカルボキシおよびＮ−マレイミドからなる群から選択される）の基で ある請求項３４記載の特異的結合アツセイ。 ４０．該化学発光部分がチオエステルであり、そして易脱離基が式： Ｖ−Ｒ′′′ （式中、Ｖは脂肪族または芳香族の基であり、Ｒ′′′は該部分を特異性結合パ ートナーに結合させるために適する基である）の基である、請求項３４記載の特 異的結合アツセイ。 ４１．該易脱離基がスルホンアミドまたはスルホカルボニル基である、請求項４ ０記載の特異的結合アツセイ。 ４２．複素環または環系が、アクリジニウム、ベンズ〔ａ〕アクリジニウム、ベ ンズ〔ｂ〕アクリジニウム、ベンズ〔ｃ〕アクリジニウム、１，２，４−トリア ゾールカチオン、イソオキサゾールカチオン、イソチオアゾールカチオン、１， ２−アゾールカチオン、イミダゾールカチオン、ベンズイミダゾールカチオン、 キノリニウム、インキノリニウム、キノリジニウム、環状置換キノリニウム、ピ リジニウム、ピリミジニウム、ピリダジニウム、ビラジニウム、フエナントリジ ニウムおよびキノキサリニウムからなる群から選択されるメンバーの還元型であ る、請求項３４記載の特異的結合アツセイ。 ４３．該複素環または環系が、アクリジニウム、キノリニウムまたはフエナント リジニウムの還元型である、請求項４２記載の特異的結合アツセイ。 ４４．該第二の置換基が、−ＯＣＨ３および−ＯＣＨ２からなる群から選択され る、請求項４３記載の特異的結合アツセイ。 ４５．該複素環または環系が、該結合（リンケージ）が結合している炭素原子に ペリである少なくとも一つのペリ置換基を有する、請求項４３記載の特異的結合 アツセイ。 ４６．該少なくとも一つのペリ置換基がアルキルもしくはアリール基である、請 求項４５記載の特異的結合アツセイ。 ４７．該少なくとも一つのペリ置換基が−ＣＨ３である、請求項４６記載の特異 的結合アツセイ。 ４８．該化学発光部分が、フエニル−Ｎ−メチル−１，３−ジメチル−アクリジ ニウム−９−メトキシ−９−カルボキシレートである、請求項４７記載の特異的 結合アツセイ。 ４９．請求項２８ないし４８のいずれか１項記載の化学発光部分および特異的結 合パートナーを含む組成物。 ５０．請求項４９記載の組成物を含む特異的結合アツセイキツト。 ５１．（ｉ）特異的結合物質に結合した化学発光部分からなる化学発光複合体を 使用し、そして （ｉｉ）サンプル中の被分析物の存在は該化学発光複合体を含な特異的結合反応 生成物−もしくはそれ以上の形成に比例する、 サンプル中の被分析物の存在の特異的結合アツセイであり。 適当な条件下において、該化学発光複合体を含む該特異的結合反応生成物−もし くはそれ以上の実質的形成を生ぜしめ；そして （ｉ）該化学発光複合体を含む該特異的反応生成物−もしくはそれ以上または、 （ｉｉ）該特異的結合反応生成物中に含まれていない化学発光複合体、 の化学発光を測定することからなるアツセイにおいて、化学発光部分として、エ ステル、チオエステルまたはアミドを選択し、そしてそのエステル、チオエステ ルまたはアミド結合（リンケージ）は、 該結合（リンケージ）が結合する炭素原子を含む複素環または環系（該複素環ま たは環系中のヘテロ原子は酸化状態にあり、そのために該炭素原子はべルオキツ ドまたは分子状酸素の攻撃を受けて、さらに分解して化学発光を発生する中間体 を形成できる）と； アリール環又は環系（該アリール環または環系は少なくとも一つの置換された６ 員環を含み、該置換された６員環は２またはそれ以上の置換基を含み、該２また はそれ以上の置換基の少なくとも二つは該結合（リンケージ）の加水分解を立体 的に障害する）、との間に存在する、 ことを特徴とする上記特異的結合アツセイ。 ５２．該特異的結合物質は被分析物に特異的に結合する能力を有し、そして該− またはそれ以上の特異的結合反応生成物は被分析物−化学発光複合体のコンプレ ツクスであり、該アツセイがさらに、 適当な条件下で該被分析物−化学発光複合体コンプレツクスを実質的に形成させ 、そして （ｉ）該被分析物−化学発光複合体コンプレツクスの、または （ｉｉ）該被分析物−化学発光複合体コンプレツクスに含まれていない化学発光 複合体の化学発光を測定することを含む、請求項５１記載の特異的結合アツセイ 。 ５３．該アツセイがさらに、（ｉ）該被分析物と特異的に結合して被分析物−反 応体コンプレツクスを形成し、且つ（ｉｉ）該特異的結合物質と特異的に結合し て化学発光−複合体−反応体コンプレツクスを形成する、ことのできる反応体を 使用し、そして該特異的結合反応生成物の一つもしくはそれ以上が該化学発光複 合体−反応体コンプレツクスであり、該アツセイがさらに、 適当な条件すで該被分析物−反応体コンプレツクスおよび該化学発光複合体−反 応体コンプレツクスの実質的形成を行わせ、そして （ｉ）該化学発光複合体−反応体コンプレツクスまたは（ｉｉ）該化学発光複合 体−反応体コンプレツクス中に含まれない化学発光複合体、の化学発光を測定す ることを含む、請求項５１記載の特異的結合アツセイ。 ５４．該特異的結合物質が該被分析物に特異的に結合する能力を有し、そして該 アツセイがさらに該被分析物に特異的に結合して反応体−被分析物−化学発光複 合体コンプレツクスを形成することのできる反応体を使用し、そして該−もしく はそれ以上の特異的結合反応生成物が該反応体−被分析物−化学発光複合体コン プレツクスであり、該アツセイがさらに、 適当な条件下で該反応体−被分析物−化学発光複合体コンプレツクスの実質的形 成を行い、そして（ｉ）該反応体−被分析物−化学発光複合体コンプレツクスま たは （ｉｉ）該反応体−被分析物−化学発光複合体コンプレツクスに含まれない化学 発光複合体の化学発光を測定することを含む、請求項５１記載の特異的結合アツ セイ。 ５５．（ｉ）化学発光部分を使用し、そして（ｉｉ）サンプル中の被分析物の存 在は該化学発光部分を含まない特異的結合反応生成物−もしくはそれ以上の形成 に比例し、そして該化学発光部分は該特異的結合反応生成物−もしくはそれ以上 の形成に比例して化学発光を生じる、 サンプル中の被分析物の存在の特異的結合アツセイであり、 適当な条件下において、該特異的反応生成物−もしくはそれ以上の実質的形成を 生ぜしめ；そして該特異的反応生成物−もしくはそれ以上の形成に起因する該化 学発光部分の化学発光を測定することからなるアツセイにおいて、 化学発光部分として、エステル、チオエステル、またはアミドを選択し、そして そのエステル、チオエステル、またはアミド結合（リンケージ）は、 該結合（リンクージ）が結合する炭素原子を含む複素環または環系（該複素環ま たは環系中のヘテロ原子は酸化状態にあり、そのために該炭素原子はペルオキシ ドまたは分子状酸素の攻撃を受けて、さらに分解して化学発光を発生する中間体 を形成できる）と； アリール環または環系（該アリール環または環系は少なくとも一つの置換された ６員環を含み、該置換された６員環は２またはそれ以上の置換基を含み、該２ま たはそれ以上の置換基の少なくとも二つは該結合（リンケージ）の加水分解を立 体的に障害する）、との間に存在することを特徴とする上記特異的アツセイ。 ５６．該アツセイは、該被分析物と結合して被分析物−反応体コンプレツクスを 形成することのできる反応体をさらに使用し、また該化学発光部分は該被分析物 −反応体コンプレツクスの形成に比例して化学発光する、請求項５５に記載の特 異的結合アツセイ。 ５７．該結合（リンクージ）の加水分解を立体的に遮蔽する各々の該置換基が− ＣＨ３、−ＯＣＨ３、およびイソプロピルよりなる群から選択される請求項５１ 乃至５５に記載の特異的結合アツセイ。 ５８．該結合（リンケージ）の加水分解を立体的に遮蔽するすくなくともひとつ の該置換基が、電子吸引基である請求項５１乃至５５に記載の特異的結合アツセ イ。 ５９．該置換６員環が、該結合（リンケージ）の加水分解を立体的に遮蔽する該 置換基に加えて、少なくともさらにひとつの置換基を有し、該付加的置換基が電 子吸引基である請求項５１乃至５５に記載の特異的結合アツセイ。 ６０．すくなくともひとつの該付加的置換基が−ＮＯ２、−ＳＯ２Ｃｌ、−Ｂｒ 、−Ｎ（ＣＨ３）３＋および−Ｈよりなる群から選択される請求項５９に記載の 特異的結合アツセイ。 ６１．電子吸引性が−Ｈである請求項６０に記載の特異的結合アツセイ。 ６２．該アリール環または環系が、フエニル、ナフタレン、およびアントラセン よのなる群から選択される請求項５１乃至５５に記載の特異的結合アツセイ。 ５３．該フリール環または環系がフエニルである請求項２８記載の特異的結合ア ツセイ。 ６４．電子吸引基である該フエニルのすべての置換基のシグマｐ（ｓｉｇｍａｐ ）の値の和が、１．０以すである請求項６３記載の特異的結合アツセイ。 ６５．該化学発光部分が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項６３に記載の特異的結合アツセイ。 ６６．該化学発光部分が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項６３に記載の特異的結合アツセイ。 ６７．該化学発光部分が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項６３に記載の特異的結合アツセイ。 ６８．該化学発光部分が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項６３に記載の特異的結合アツセイ。 ６９．該化学発光部分が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項６３に記載の特異的結合アツセイ。 ７０．該化学発光部分が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項６３に記載の特異的結合アツセイ。 ７１．該化学発光部分が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項６３に記載の特異的結合アツセイ。 ７２．該化学発光部分が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項６３に記載の特異的結合アツセイ。 ７３．該化学発光部分が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項６３に記載の特異的結合アツセイ。 ７４．該化学発光部分が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項３に記載の特異的結合アツセイ。 ７５．該化学発光部分が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項６３に記載の特異的結合アツセイ。 ７６．該化学発光部分が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項６３に記載の特異的結合アツセイ。 ７７．該複素環または環系が、アクリジニウム、ベンズ〔ａ〕アクリジニウム、 ベンズ〔ｂ〕アクリジニウム、ベンズ〔ｅ〕アクリジニウム、１，２，４−トリ アゾール　カチオン、インオキサゾール　カチオン、イソチオアゾール　カチオ ン、１，２−アゾール　カチオン、イミタダゾール　カチオン、ベンズイミダゾ ール　カチオン、キノリニウム、インキノリニウム、キノリジニウム、環状置換 キノリニウム、ピリジニウム、ピリミジニウム、ピリダジニウム、ピラジニウム 、フエナントリジニウム、およびキノオキサリニウムよりなる群から選択される 請求項５１または５５に記載の特異的結合アツセイ。 ７８．該複素環または環系が，アタリジニウム、キノリニウム、およびフエナン トリジニウムよのなる群から選択される請求項７７に記載の特異的結合アツセイ 。 ７９．該複素環または環系がアクリジニウムである請求項７８に記載の特異的結 合アツセイ。 ８０．該複素環または環系が、アクリジニウム、べンズ〔ａ〕アクリジニウム、 ベンズ〔ｂ〕アクリジニウム、ベンズ〔ｃ〕アクリジニウム、１，２，４−トリ アゾール　カチオン、イソオキサゾール　カチオン、イソチアゾールカチオン、 １，２−アゾール　カチオン、イミダゾールカチオン、ベンズイミダゾール　カ チオン、キノリニウム、インキノリニウム、キノリジニウム、環状置換キノリニ ウム、ピリジニウム、ピリミジニウム、ピリダジニウム、ビラジニウム、フエナ ントリジニウム、およびキノオキサリニウムよのなる群から選択される員の還元 型である請求項５１または５５に記載の特異的結合アツセイ。 ８１．該複素環または環系が、アクリジニウム、キノリニウム、またはフエナン トリニジウムの還元型である請求項８０に記載の特異的結合アツセイ。 ８２．該炭素原子が、−Ｈ、−ＣＮ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋ 、−ＳＲ、−ＳＲ２＋、および−Ｓ２Ｒ（Ｒはアルキル、アリール、アミノ酸、 または糖である）よりなる群から選択される置換基を有する請求項８０記載の特 異的結合アツセイ。 ８３．該複素体が 式： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する請求項８１記載の特異的結合アツセイ。 ８４．請求項５１または８３のいずれか１項に記載の化学発光部分よりなる組成 物。 ８５．さらに該部分に結合した特異的結合パートナーを含む請求項８４に記載の 組成物。 ８６．請求項８４または８５に記載の組成物をすくなくとも含むバイアルよりな る特異的結合アツセイキツト。