JPH03501802A - 受粉により増殖し得る植物における遺伝子の転移方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物における遺伝子の転移方法 本発明は、試験管内で培養して分離した未熟な花粉体を用いての、植物における 遺伝子の転移方法及びこのものから作゛られた種子並びに増殖物に関する。

これまで既に植物における遺伝子の転移の種々の技術が存在している。それらは それぞれ利点と欠点を有する（　Ｇｏｏｄ−ｍａｎ等：雑誌”５ｃｉｅｎｃｅ” 　２３６．４８−５３．１９８７参照）。現在一般的なベクターはＡ　ｒｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　である。けれどもこれは特定の宿主 の範囲に限られている。このＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのベクターとしての 使用はいまだに、遺伝子転移した子孫を形成し得る遺伝子転移した各種植物を作 り出すためには、試験管内で培養された体細胞からの再生に依存している。エレ クトロポレーション、リポソーム類、マイクロインジェクション及び他の種々の 物理化学的方法による直接の遺伝子転移は更に、目的の細胞としてプロトプラス トを使用することに依存いている。しかしながらプロトプラストからの再生は困 難であってしかも多くの品種のものにおいて未だ不可能である。

これらの遺伝子転移方法に代って、他の目的細胞、すなわち花粉粒が提案されて いる。Ｈｅ５ｓ　Ｄ、：　Ｐｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　、ニューヨーク、５１９− ５３７　（１９７５）　によれば、成熟した花粉は異質ＤＮＡを取り入れて「ス ーパーベクター」としてこの異質ＤＮＡを自然の受粉と結実とによりその卵細胞 中に導入することが可能である。類似的態様で、Ｘ＆Ｉ照射した花粉は照射され たそのゲノムの断片の卵細胞中への移転を許容すると報告されている（　Ｐａｎ ｄｅｙ：雑誌”Ｎａｔｕｒｅ”　２５６．３１０−３１３゜１９７５）。ＤｅＷ ｅｔ　は外生的ＤＮＡで処理されたとうもろこし花粉がこのＤＮＡを発芽に際し て取り入わ、そして受粉の後゛に卵細胞中へ移転させると報告している（Ｗｏ　 ８５１０１８５６）。

花粉による、また花粉における遺伝子転移の極めて大きな重要性にもかかわらず 、いまだこれまで何れの場合にも上述したＨｅ５ｓ　、　Ｐａｎｄｅｙ　及びＤ ｅＷｅｔ　の得た結果を他の実験室において再現することには至フていない。す なわち例えばＥｎｇｖｉｌｄ　（”Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、” 　６９．４５７−４６１．１９８１）はＰａｎｄｅｙの実験を再現することがで きなかった。Ｈｅ５ｓ（１９７５）　及びＤｅＷｅｔ　の研究においては外生的 ＤＮＡを花粉核中に取り入れたこと及びその転移されたＤＮＡの遺伝学的及び分 子的検出が実証の決定的ポイントである。発現型特異的な検出及び生理学的検証 は不充分である（Ｈｅｓｓ：”ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ 　Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ”、　ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ、ベルリン、ニュ ーヨーク、８０３−８１１．１９８４）。　５ｔａｎｆｏｒｄ等の研究（”Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｐｏ１ｌｅｎ　（Ｍ ｕｌｃａｈｙ　Ｄ編集）　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ハイデルベルク、ニューヨーク； 　７１−７５゜１９６８）も成熟したＮ１ｃｏｔｉａｎａ旦邸シ１区Ｕ　の花粉 とアゲロバクチリアとの共培養によっては花粉中への遺伝子転移がもたらされな かったことを示している。　Ｎｅｇｒｕｔｉｕ、　Ｈｅｂｅｒｌｅ−Ｂｏｒｓ　 及びＰｏｔｒｉｋｕｓの広範囲な研究（同上、６５−７０゜１９８６）において カナマイシンに対する抵抗性を与える（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ等：　”Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ”旦、　１０９９−１１０３．１９８５）ネオマイシンホスホト ランスフェラーゼ遺伝子は成熟した花粉中に転移させることを達成できなかった 。またこの最も新しい技術水準に相当する種々の方法を用いても上記Ｈｅ５ｓ及 びＤｅＷｅｔの主張を確認することはできなかった。上記Ｈｅ５ｓ及゛びＤｅＷ ｅｔ　の得た結果が追認できないと言うことは、成熟した花粉粒が遺伝子転移に 必要な水性媒体中に到達するや直ちに花粉管の形成を開始すると言うことによっ て解明することができる。その場合にこれは明らかにもはや結実可能でなくなり 、又は遺伝子転移に利用できる時間が短か過ぎると言うことになる。

Ｐａｒｅｄｄｙ等は”Ｐｌａｎｔａ”　１７０．１４１−１４３　（１９８７） の中に、未熟とうもろこしの旗弁（いわゆる「ふさ」すなわち雄性花序）の試験 管中での培養を記述している。分離された成熟花粉を用いて受粉し、そしてその 受粉された各植物から種子が得られた。遺伝学的なマーキングによって行なわれ た結実の成功の証明は、これを得ることができなかった。

驚くべきことに、未熟でそれを取り囲む天然栄養＠織のない花粉粒の培養が可能 であること、それら分離された未熱な花粉粒の中に成熟の種々異なった段階にお いて異質の遺伝子を導入することができること、及びそれらの成熟した花粉粒を 用いて各植物に受粉させ、結実させ、そして正常な種子の形成、発芽及び増殖を もたらすことができることが見出された。

従って本発明の対象は種々の植物において遺伝子を転移させるための方法であり 、これは イ）おしべから未熟な花粉粒を栄養溶液中に取り入れてそれらの周りを取り囲む 組織を取り除き、口）この分離された未熟な花粉粒を栄養溶液中で培養し、ハ） それら花粉粒中に試験管中での培養及び成熟化の間に。

異質の遺伝子物質を移転させ、 二）それらの形質転換された花粉粒を試験管中で完全成熟させ、そして ホ）それら形質転換された花粉粒によって受容植物に受粉させ、そしてこれら植 物から種子を採取することを特徴とするものである。

この分離された未熟な花粉粒中への遺伝子の転移、試験管中での成熟化及びそれ ら花粉を汎用的なスーパーベクターとして用いることによって種々の植物におけ る遺伝子転移の全く新しい分野が開かれる。他の種々の方法と比較してこれは木 質的に単純であり、と言うのは細胞培養期間が大きく短縮され、そして不適切な 体質クローン性変異の同伴現象を伴う再生が省略されるからである。この新しい 方法によれば、これまで遺伝子転移の成功していなかった植物類も形質転換させ ることができる。すなわち例えば多くの種類の穀物、豆科植物及び樹木類は単一 細胞やプロトプラストから再生することは不可能である。

遺伝子転移技術の積極的な利用は経済的及び社会的に大きな価値がある。種々の 植物が疾病や害虫に対して抵抗性となり、植物が寒冷、高温、乾燥、塩害、栄養 物質欠乏等に対して抵抗性となり、植物が大きな栄養源供給能力を持つようにな り、また植物が種々の新しい工業原料を生産するようになり、或はまた植物が自 身で窒素固定能力を備えたり、又は他の手段によって施肥に依存しなくなるよう に各種植物を遺伝学的に変化させることが望まれている。

本発明にとって本質的なことは、花粉粒がそれを取り囲む組織を含むことなく、 すなわち分離された状態で、培養されることであり、それによってその転移され るべき遺伝子物質が、成るベクターと結合された形で、又は裸の形で直接に花を 培養した場合にそれを取り囲む広範囲な組織による妨害のために慣用の転移方法 （Ａ　、　ｔｕＩＤｅｆａｃｉｅｎｓ　の使用、エレクトロポレーション、マイ クロインジェクション等）によっては遺伝子を花粉粒中に転移させることは不可 能である。

本発明のもう一つの本質的特徴は、未成熟な花粉粒を使用することである。これ によって、その試験管中での成熟化の全期間を遺伝子転移のために利用すること ができるようになる。未成熟花粉粒中への移転は植物の種類に依存して種々の成 熟段階において行なうことができる。中でも種々のベクターを用いる遺伝子転移 に際してはその遺伝子物質は精核のゲノム中に到達して結実に際して接合体ゲノ ムの一部となるように、細胞壁を乗り越えることができるだけ少なくなければな らない。転移は好ましくは単核の小胞子中で行なわれるのがよいけれども、その 生殖細胞がまだ花粉壁に付着しているかぎり、最初の花粉有糸分裂の間か又は三 核の早期段階において、或はまた成熟段階において三核の花粉を有するような植 物の場合には更に、第二の花粉有糸分裂の間に、又はその僅か前の段階において 行なうことも可能である。

本発明の方法は詳細には次のように行なわれるが、その際典型的な系としてタバ コ（Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）　を用いた。

この系は受粉によって増殖する全ての植物に、中でも単子葉及び双子葉の、例え ば小麦、とうもろこし、稲、豆科植物、西洋あぶらな類、鑑賞植物、果物及び森 林植物に通用することができる。

一実験において所望の植物の花粉の発育段階は巧の分離、圧潰しプレパラートの 作製及び例えばカルミン酢酸の添加の後での顕微鏡による観察によって通常的に 決定する。

花粉が所望の段階に達したならば花粉粒を無菌の条件のもとで分離し、その際そ れら花粉は栄養培地中でその巧から圧潰し分離し、篩を通過させ、洗浄し、遠心 分離し、そして再び分散させる。

細胞濃度はより若い発育段階における花粉粒の方がより老齢の発育段階の花粉粒 よりも高いはずである。これは三核の花粉粒段階のタバコにおいては約１０５　 個／ｍｉ１．であるが、単核の小胞子についてはこれはその約２倍である。

用いる栄養培地は花粉粒の成熟可能性を保って培養するために必須の全ての栄養 物質及び成長物質を含んでいる。この場合にそれぞれの植物に従ってその栄養組 織（タベータム）の機能を満足させるように異なった組成を与えることができる 。この場合にこの培地は主要成分として糖、栄養物質、鉱物質塩類及びビタミン を含み、その際そのｐａｌ値は約６．５ないし７．５　である。

単核の小胞子の場合にはその培養は三核の段階まで例えば蔗糖等の糖分及びその 他の栄養物質に木質的に富んだ培地の中で行なわわる。例えばココナツ水の形の 追加的な栄養物質゛を供給することが可能である。花粉粒が三核の段階に達して しまったならばそれらを栄養物質のより少ない培地に移すことができる。

この試験管中での成熟化が終了した後にそれら花粉粒は受粉のために回収される 。このためにはそれら花粉粒を遠心分離し、洗浄し、そして水性媒体中で又は乾 燥状態で、予め弱の除かれた各種の花に受粉のために塗布する。この試験管中で 成熟させた花粉粒を受粉した植物から一般的に通常の技術で種子を得ることがで きるが、これらは発芽可能である。

この試験管内での培養の間における遺伝子転移のために、その転移されるべき異 質の遺伝子物質は例えば八、　ｔｕｍｅｆａ−的１凹のような通常のベクターと 結合させて、又は裸ＤＮＡとしてエレクトロポレーション、ミクロインジェクシ ョン又はその他の物理化学的な方法を用いる直接的転移によってそれら花粉粒中 に導入することができる。ここで「異質の遺伝子物質」の表現はその形質転換さ れるべき花粉粒の外部で生じた全ての遺伝子物質を意味する。成熟化が終了した 後でそれら花粉粒は上述した態様で受粉のために回収される。試験管内での成熟 化が成功したことの証明として２つのマーカ遺伝子（ＴＡＮ”、　ＮＯ５）を有 する成るタバコ植物を試験管中で成熟させてそれらの花粉粒によって正常な野生 型植物に受粉させた。得られた種子を殺菌してカナマイシン含有発芽培地中で発 芽させた。マーカ遺伝子のメンデル法則的分離が選択的培地中ての実生の計数に よって確認された。カナマイシンを含まない培地で発芽した実生は高電圧紙電気 泳動においてノーバリン検出によって同様にそのＮＯＳ遺伝子のメンデル法則に 従う分離を示した。

このことはそれが結実をもたらしてしかもいかなる他の植物の花粉混在にもさら されていない試験管内で成熟させた花粉粒であったことの証明である。

この試験管内での培養の間に形質転換によって導入された異質遺伝子の発現の証 明として酵素試験においてそれら形質転換された花粉粒のホモジェネート中での クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性（ＣＡＴ活性）を確認し た。

ＣＡＴ遺伝子に加えて、細胞化学的に検出し得る遺伝子、すなわちβ−グルクロ ニダーゼ遺伝子（ＧＬＩＳ遺伝子）も用いた。この場合にアゲロバクチリアはそ れら花粉と共培養した後で抗生物質クラホラン（Ｃ１ａｆｏｒａｎ）を用いて毎 日洗浄することによって除去又は死滅させた。細胞化学的試験（花粉の青色染色 ）において試験管内で成熟させた花粉の５０％以上の青色化したものを確認する ことができた。感染させなかった花粉、又はＧＵＳ遺伝子を含まないか又は作用 性のないＧＵＳ遺伝子を含むアグロバクテリに感染させた花粉は基質の添加の後 にも青色着色を全く示さなかった。蛍光分光的試験によれば、ＧＬＩＳで形質転 換された花粉において、積極的対照群として用いたＧＵＳで形質転換、された種 々の植物の花粉におけると同様に強いＧＵＳ活性が示された。ＧＬＩＳ遺伝子を 含まないアゲロバクチリアに感染させるか又はアゲロバクチリアに感染させなか った花粉はＧＵＳ＠性を全く示さなかった。また、感染させた遺伝子は含まない けれどもそのＴ−ＤＮＡ中に完全なＧＵＳ遺伝子を有するアゲロバクチリアに感 染させた場合にも、それら花粉におけるＧＬＩＳ活性（蛍光分光等の細胞化学的 手段で）は全くもたらされなかった。

このことから、Ａ　ｒｏｂａｋｔｅｒｊｕｍ　ｔｕｒｎｅｆａｃｉｅｎｓによフ てそれら花粉中で遺伝子転移が起ったと結論することができる。花粉中への遺伝 子転移が行なわれたことのもう一つの示唆は、アゲロバクチリアの花粉表面への セルローズフィブリルの形成を伴う付着を認めることができたことである（電子 顕微鏡写真による）。

医−ユ 花粉発育段階の決定 タバコの花を異なった種々の長さで採取し、巧を無菌的に分離し、４個の巧の１ 個を１滴のカルミン酢酸（４５％濃度の酢酸中の４％のカルミン）と−緒にステ ンドグラスの上に載せて圧潰しプレパラートを作った。花粉粒の発育段階を３０ 　分後に顕微鏡の下で決定した。

伍−ユ 花粉粒の分離 朽を無菌条件のもとにＡＭＧＬＵ培地（１）の中で注意深く顕微鏡観察鉢とガラ ス棒とを用いて圧潰し分離し、そして得られた花粉懸濁液を７５μｍの篩を通道 させ、そしてＡＭＧＬＬＪ培地中で２回洗浄した。最後に、その花粉懸濁液をエ ッペンドルフ遠心分離機中で６５００　ｒｐｍにおいて遠心分離した。

汽−に 核早期段階の花粉粒の成熟化の ための培養 三核早期のタバコ花粉粒を分離してＡＭＧＬＵ培地中１０５個／１ｎｌｌの細胞 濃度に調節した。この花粉懸濁液１ｍぶを暗所で２５℃において３５　ｍｍ　の ベトリ皿の中で培養した。

花粉粒の厳密な発育段階と無関係に２ないし５日間の後に花粉粒は成熟しており 、そして採集することができた。

仮−３ 単核小胞子の成熟化のための花粉 培養 単核のタバコ小胞子を２ｘｌＯ’　個／ｒｒ＋ｆｌの細胞濃度においてＭＲ２４ 培地（２）中で培養した。花粉粒が三核段階に達した（厳密な日齢に無関係に２ ないし５日間の後に）ならば直ちにそれらを遠心分離し、そしてＭＩＳ培地（３ ）中で成熟化が完結するまで更に培養した。

ＭＲ２６培地（２°）中での培養においても非常に良好な結果か得られた。花粉 粒が三核段階に達してしまった（３日間の後）ならば直ちに同容積のＭ２５培地 をそれに加えた。更にもう１日経過した後に花粉粒を遠心分離し、モしてＭ２５ 培地（３°）中で１０５　個／ｍｊＬの細胞濃度において成熟化が完結するまで （１日間）更に培養した。

医−１ 受粉と結実の検証 タバコ花粉粒を遠心分離し、Ｂに培地（Ｂｒｅｗｂａｋｅｒ及びＱｗａｃｋ　１ ９６３）中で洗浄し、そして１．２５　ｘ　１０６　個／ｎｕの細胞濃度に調節 した。開花したばかりの（赤い花先端）花から未だ閉じている巧を除去した。そ れらの花が開花してしまったならば直ちにその花の柱頭の上に２０μにとベット を用いて４μにの花粉懸濁液をこの柱頭が完全に花粉懸濁液で覆われてしまうよ うに塗布した。これらの操作は空気の動きがなく、そして同じ種類の他の植物を 除いた条件において行なった。液滴が柱頭の上に落ちたならば直ちに柱頭と花柱 とを４　ｃｍの長さのむぎわらで覆フて異質の結実を防止した。次にそれらの植 物を温室中に戻した。

仮−１ 種子収穫物、種子の発芽及び遺伝 学的試験 試験管中で成熟させた花粉粒で受粉及び結実がもたらされたことの証明として、 遺伝子転移させた植物の花粉粒を試験管中で成熟させ、そしてこの花粉粒を用い て正常な野生型植物に受粉させた。マーカ遺伝子どしてその遺伝子転移させた植 物にネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（カナマイシンに抵抗性を有 する）及びツバ−リン合成遺伝子を導入した。自家受精及び試験管中で成熟させ た野生型花粉との相反交雑も実施した。

例５に従い得られた成熟種嚢（褐色て乾燥している）を収穫して種子を分離し、 その際種嚢の先端を切断除去し、そして種子粉を直接エッペンドルフキャップ中 に詰め込んだ。そ表面殺菌し、無菌の水で２回洗浄し、そしてカナマイシンを含 む種子発芽培地（４）の上に置いた。４週間後にＭａｎ’実生及びＭａｎＳ実生 の数を数えた。上記の交雑実験において両相及交雑はにａｎＲ：　Ｍａｎ’　＝ １　：　１の分離を与えた。力→−マイシンを含まずに成長した実生は高電圧紙 電気泳動によるノーバリン試験によってＮ。ｓ”　：　Ｎ０ｓ−＝１　＋　１の 分離を示した。試験管中で成熟させた野生型による自家受精は予想通り両マーカ 遺伝子について１：１の分離を与えた。遺伝子転移させた植物の、試験管中で成 熟させた花粉による自家受精は３：１の分離を示した。

医−ユ ＣＡＴ遺伝子の遷移的発現 アゲロバクチリア（３５Ｓ−プロモータに結合させたＣＡＴ遺伝子を含み、腫瘍 遺伝子を含まない八、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　をシリアブイヨン中で１日 間予備培養した。二様早期段階の花粉粒を分離し、そしてＡＭＧＬＵ培地中で培 養した。このバクテリア懸濁液をＡＭＧＬＵ培地によって０Ｄ５８゜値０．２　 に調節した。ＡＭＧＬＵ培地で更に１：１０　に稀釈した後にそのバクテリア懸 濁液の２０μｋを１　ｍＪ２の花粉懸濁液に投入した。２４時間の共培養の後に 、アクロバクテリアを死滅させるために１１１１ＩＬ当り１μｍのクラホラン（ Ｉｇ／２ｍｉｔ）を加えた。更に２日経過した後に花粉粒を採取して抽出物を作 った。これに１　ｍｌの花粉懸濁液当り、ｐＨ値５．６　のカルシウム洗浄溶液 （５）１．５　ｎｕを加え、４００　ｒｐＩＩｌにおいて５分間遠心分離し、モ してトリス緩衝液（ｐＨ７，８，０，２５Ｍ）を用いて洗浄した。遠心分離の後 にその花粉ベレットに２００μ旦のトリス緩衝液を加え、そして超音波（３Ｘ１ ５　秒）によって氷の上で均一混合した。氷の上で１５分の後に遠心分離し、そ してその上澄液を一２０℃において貯蔵した。

ＣＡＴ試験はＳｌｅｉｇｈ　（”Ａｎａｌ、　Ｂｊｏｃｈｅｍ、”　５６．２５ １−２５６゜１９８６）によって記述されたと同様に行なった。　３０μにの抽 出液を２０μｌのクロラムフェニコール（８ミリモル）、３０μｌのトリス緩衝 液及び＋４（でマーキングされたアセチル−ＣｏＡ（冷たい０．５　ミリモルの アセチル−ＣｏＡ中１ρ当り５　ｕＣｉ／ｍＩｔ）　２０μにと混合した。３７ ℃において１時間培養した後にそのアセチル化されたクロラムフェニコールを酢 酸エチルによフて振盪分！１（２Ｘ１００　μｍ）し、そしてその放射能をレン チｌノージョンカウンタで測定した。

ＡＭＧＬＩＩ培地中の花粉　４００　ｃｐｍＡＭＧＬｔｌ培地中のアゲロバクチ リア含有花粉　６０００　／／ＡＭＧＬＵ培地中のアゲロバクチリアのみ　５０ ０　／／強い放射能信号はアゲロバクチリアの花粉粒への感染が行なわわたこと 、及びそのＴ−ＤＮＡが成長した細胞の細胞核中で発現（転写）するに至ったこ とを示す。

アゲロバクチリアがそれ自身ではＣＡＴ活性を有しなかフたことを示すための他 の参照例として、シリアブイヨン中でのアゲロバクチリアの１完全成長サイクル をカバーする培養はＣＡＴ活性を全く示さなかった。

九−Ａ タバコ花粉中のＧＵＳ遺伝子の発現 ＬＢＡ　４４０４　株のアゲロバクチリア　［Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、 ディスアームド、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）を含み、３５Ｓ −プロモータ及びターミネータに結合されている（　Ｍａｔｚｋｅ　及びＭａｔ ｚｋｅ：　”Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”　７゜３５７ −３６５　（１９８６）　）　］をルリアブイヨン中で１日間予備培養した。単 核後期段階の花粉粒を分離してＭＲ２６培地中で０Ｄ５８゜値０．２　に調節し た。ＭＲ２６培地で更に１：１０　に稀釈した後にそのバクテリア懸濁液２０μ ｌを１　ｒｐＩＩｌの花粉懸濁液に加えた。１４−２０時間の共培養の後に遠心 分離し、そして花粉をクラホラン含有（Ｉｇ／２ｍＪ２）のＭＲ２６培地で３回 洗浄し、そして更に培養した。花粉が成熟するまで毎日クラホラン含有培地を取 り換えた。最後の培地（クラホラン含有Ｍ２５）の４０μρをルリアブイヨンに 加えた。バクテリアの成長は全く生じなかった。

成熟した花粉を遠心分離し、そして一部をＭＲ２６培地中に取り入れた。Ｘ−Ｇ ｌｕ（ずなわち５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−グルクロニド）を１ ミリモルの最終濃度になるように加えて３７℃において４−１２時間培養（Ｊｅ ｆｆｅｒｓｏｎ：　”Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ］ｏｇｙ　Ｒｅ ｐｏｒｔｅｒ″、Ｖｏ］。

５、　Ｎｏ、　４．３８７−１１０５．　（１９８７）　）　Ｌ／た後にインジ ゴ（Ｘ−′Ｇｌｕからのβ−グルクロニダーゼの生成物）の形成を光学顕微鏡に おいて花粉の青色着色によって確認することができた。成熟した生きている花粉 の５０％以上が青色着色を示した。

その共培養して試験管中で成熟させた花粉の第二の部分をＧＫ培地（ＢＫ培地と 同様であるが、但し硼酸濃度が２倍になっている）の中で発芽させた。発芽した 花粉の花粉管中で同様にしてＧＬＩＳ活性を確認することができた。

対照実験において花粉にＬＢＡ−４４０４のアゲロバクチリア株を感染させたが 、この株はそのＴ−ＤＮＡ中にプロモータなしにＧＵＳ遺伝子を含んでいた（ザ ルツブルグのＭａｔｚｋｅ博士から入手した）。この花粉は試験管中での成熟化 及びＸ−Ｇ　１　ｕの添加の後になんらの青色着色を示さなかった。ＧＵＳ遺伝 子を含ますＫＡＮｓ５ｇ遺伝子を含んでいるアゲロバクチリアも花粉との共培養 及びＸ−Ｇｌｕの添加の後になんらの青色着色を示さなかった。アゲロバクチリ アで感染させなかった花粉もＸ−Ｇｌｕ添加の後になんらの青色着色を示さなか った。

積極的対照群として用いたＧ　Ｕ　Ｓ　３ＳＳで形質転換された植物（リーフデ ィスクによる）の花粉は青色着色を示した。Ｔ−ＤＮＡ中に作用性ＧＵＳ３ＳＳ 遺伝子を含んでいるけれどもその毒作用において阻害されているもう一つの別な アゲロバクチリア株（Ｔｉ−プラスミドを含まない両性ベクター）は花粉中でＧ ＬＩＳ活性を全く示さなかった。

花粉の第三の部分から抽出液を作った。このためにそれぞれ４Ｘ］０５個の花粉 を遠心分離し、そして抽出緩衝液（６）中に取り入れた。この花粉をガラスポー ルを用い且つ同時的な超音波処理によって破砕した。蛍光分光学的ＧＵＳ試験を Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎの記述した通りに行なった。５０μにの抽出液を抽出緩衝液 で１　田ｋに稀釈し、そしてこれに１ミリモルの最終濃度となるようにＭＵＧ（ すなわち４−メチルーウムベリフェリルグルクロニド）を加えた。　１０秒毎又 は３０秒毎に２００μｍを取り出してその酵素反応を８００μにのＮａ、Ｃｏ３ （０，２モル）によって停止させた。蛍光分光計中で３６５　ｎｍの波長で励起 した後の４５５　ｎｍにおける消衰を測定し、そしてＭＵＧの幾つかの標準溶液 を用いてμモル／ｆｆ１Ｉｌの濃度に換算した。

１０分後　２０分後　３０分後 標準１　１．０　１．０　１．０ 標準２　、　０．１　０．１　０．１ １０分後　２０分後　３０分後 使用培地の説明 （１）ＡＭＧＬＵ培地 ミラーのマクロザルツエ ＭＳミクロザルツェ 蔗糖　（０，２５モル） グルタミン　（４４０ｍｇ／ＩＬ） Ｈ７ （２）ＭＲ２４培地 ＭＳマクロザルツエ ＭＳミクロザルツェ 蔗糖　り０．５モル） グルタミン　（４４０ｍｇ／ｌ） ココナツ水　（２容積％） ラクトアルブミン加水分解物　（２００ｒｎｇ／ｌ　）イノシトール　（１００ ｒｎｇ／ｆｌ　）Ｈ７ （２“）ＭＲ２６培地：　ＭＲ２４培地と同様、但しラクトアルブミン加水分解 物（Ｉｇ／ｊ２）（３）Ｍｉｓ培地 ミラーのマクロザルツェ ＭＳミクロザルツェ ＦｅＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（１０−’モル）蔗糖　（０，２５モル） Ｈ７ （３’）Ｍ２５培地 キョー及びハラダ塩 じＰｌａｎｔａ”　１８６．４２７−４３２．　（１９８６）　）蔗糖　（０， ２５モル） Ｈ７ （４）種子発芽培地 ＭＳマクロザルツェ ＭＳミクロザルツェ ＦｅＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（１（ｒ’モル）蔗糖　（１重量％） 寒天　（０，８重量％） カナマイシン・５Ｏ４（５０ｒｎｇ／Ｉｔ　）ｐＨ５，５ （５）カルシウム洗浄溶液 ＣａＣｌ２・２Ｈ２０（０，］６６モルＭＥＳ緩衝ｉ（０，５重量％） ｐ）Ｉ　５．６ （６）抽出緩衝液 ＮａＰＯ４（５０ミリモル、ｐＨ７） ２−メルカプトエタノール　（１０ミリモル）Ｎａｚ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（１０ ミリモル）ナトリウムラウリルザルコシン　（０，１％）トリトンｘ１００　（ ０，１％　） 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年１月１９日

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．種々の植物において遺伝子を転移させる方法において、イ）おしべから未熟 な花粉粒を栄養溶液中に取り入れてそれらの周りを取り囲む組織を取り除き、ロ ）この分離された未熟な花粉粒を栄養溶液中で培養し、ハ）それら花粉粒中に試 験管中での培養及び成熟化の間に異質の遺伝子物質を移転させ、 ニ）それらの形質転換された花粉粒を試験管中で完全成熟させ、そして ホ）それら形質転換された花粉粒によって受容植物に受粉させ、そしてこれら植 物から種子を採取することを特徴とする方法。
2. ２．異質遺伝物質の転移を単核の小胞子の段階において行なうことを特徴とする 、請求項１記載の方法。
3. ３．異質遺伝物質の転移を第一の花粉有糸分裂の間に行なうことを特徴とする、 請求項１記載の方法。
4. ４．転移を、生殖細胞がなお花粉壁に付着しているかぎり、二核の早期段階にお いて行なうことを特徴とする、請求項１記載の方法。
5. ５．異質遺伝物質の転移を第二の花粉有糸分裂の間又はその僅か前に行なうこと を特徴とする、請求項１記載の方法。
6. ６．栄養溶液が花粉粒の成熟可能性の維持及び培養に必須の全ての栄養物質及び 成長物質を含むことを特徴とする、請求項１記載の方法。
7. ７．遺伝子転移を、糖及びその他の栄養物質の富化されている培地の中で単核の 小胞子の段階において行なうことを特徴とする、請求項２記載の方法。
8. ８．異質遺伝物質の転移を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅ ｎｓとの共培養によって行なうことを特徴とする、請求項１記載の方法。
9. ９．種々の植物において遺伝子転移を行なうための、イ）おしべから未熟な花粉 粒を栄養溶液中に取り入れてそれらの周りを取り囲む組織を取り除き、ロ）この 分離された未熟な花粉粒を栄養溶液中で培養し、ハ）それら花粉粒中に試験管中 での培養及び成熟化の間に異質の遺伝子物質を移転させ、そして ニ）それらの形質転換された花粉粒を試験管中で完全成熟させて回収する 方法で得られたことを特徴とする、遺伝子転移させた花粉。
10. １０．請求項１記載の方法により得られた遺伝子転移させた種子。
11. １１．請求項１０記載の遺伝子転移させた種子から得られた増殖物。