PL158090B1

PL158090B1 - Sposób przenoszenia genów u roslin PL

Info

Publication number: PL158090B1
Application number: PL1988273797A
Authority: PL
Inventors: Erwin Heberlebors; Rosa M Benitomoreno; Anna Aluen
Original assignee: Chemie Holding Ag
Priority date: 1987-07-21
Filing date: 1988-07-20
Publication date: 1992-08-31
Also published as: AU2073788A; AR245216A1; ZA885302B; EP0301316A2; RU2054482C1; JP2675114B2; JPH03501802A; CA1327173C; YU48600B; PL273797A1; MX26688A; EP0362293A1; CN1039031C; NZ225397A; DE3881977D1; YU139888A; DD274234A5; BR8807624A; ES2041286T3; EP0301316B1

Abstract

1. Sposób przenoszenia genów u roslin, znamienny tym, ze pobiera sie z precików niedoj- rzale ziarna pylku kwiatowego do podloza odzywczego i usuwa otaczajaca tkanke, prow adzi sie hodowle w yodrebnionych niedojrzalych ziaren pylku kwiatowego w podlozu odzywczym, prze- nosi sie obcy m aterial genowy do ziaren pylku kwiatowego w trakcie hodowli in vitro i dojrzewania, doprow adza sie in vitro ziarna transform ow anego pylku kwiatowego do pelnej dojrzalosci oraz zapyla sie ziarnam i transform ow anego pylku kwiatowego rosliny przyjm ujace i pozyskuje z nich nasiona. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób przenoszenia genów u roślin. Dokonuje się tego za pomocą wyodrębnionych, niedojrzałych i hodowanych in vitro ziaren pyłku kwiatowego. Wynalazek dotyczy też otrzymywania z nich ziarna siewnego i produktów ich rozmnażania.

Istnieją już rozmaite techniki przenoszenia genów u roślin. Każda z nich posiada swoje zalety i wady [Goddman i in., Science, 236, 48-53 (1987)]. Najczęściej stosowanym wektorem jest obecnie Agrobacterium tumefaciens. Ograniczony jest on jednak do pewnego określonego zakresu gospodarczego. Ciągle jeszcze zastosowanie A. tumefaciens jako wektora zależy od regeneracji hodowanych in vitro komórek somatycznych, jeśli chodzi o otrzymywanie roślin transgenicznych, zdolnych do tworzenia potomstwa transgenicznego. Przenoszenie bezpośrednie z zastosowaniem elektroporacji, liposomów, mikroiniekcji i innych metod fizyko-chemicznych zależy w znacznym stopniu od użycia protoplastów jako komórek docelowych. Jednakże, regeneracja protoplastów zachodzi z trudem, a nawet jest niemożliwa w przypadku wielu gatunków.

Jako metodę alternatywną w stosunku do wyżej wspomnianych metod przenoszenia genów zaproponowano metodę z użyciem innych komórek docelowych, a mianowicie ziaren pyłku kwiatowego. Według D. Hessa [Plenum Press, New York, 519-137 (1975)], dojrzały pyłek kwiatowy jest zdolny przyjąć obcy DNA i jako „superwektor przenieść ten obcy DNA do komórki jajowej za pomocą naturalnego zapylenia i zapłodnienia. Podobnie, naświetlony promieniami Roentgena pyłek miały być zdolny do przenoszenia do komórki jajowej fragmentów naświetlonego genomu [Pandey, Naturę, 256,310-313 (1975)]. DeWet (WO 85/01856) donosi, że pyłek kwiatowy kukurydzy potraktowany egzogennymi DNA przyjmuje te DNA w trakcie kiełkowania i po zapyleniu przenosi do komórki jajowej.

158 090

Mimo dużego potencjalnego znaczenia przenoszenia genów w pyłku kwiatowym i przez pyłek kwiatowy, jak dotychczas nie udało się w żadnym prypadku powtórzyć w innych laboratoriach wyników uzyskanych przez Hessa, Pandey'a i DeWeta. i tak np., Engvild [Theor. Appl. Genet.,69, 457-461 (1985)] nie zdołał powtórzyć doświadczeń Pandey'a. W przypadku doświadczeń Hessa (1975) i DeWeta, przyjęcie egzogennego DNA przez ziarna pyłku kwiatowego, jak również genetyczne i molekularne wykazanie przenoszonego DNA stanowi punkt krytyczny przeprowadzenia dowodu. Dowody fenotypowe i fizjologiczne nie wystarczają [Hess w: Genetic manipulation in plant breeding, de Gruyter, Berlin, New York, 803-811 (1986)]. Także i doświadczenia Sanforda i in. [Biotechnology and ecology of pollen (wyd. D. Mulcaby), Springer, Heidelberg, New York, 71-75 (1968)], wykazały, że wspólna hodowla dojrzałego pyłku kwiatowego Nicotiana langsdorfii z agrobakteriami nie prowadzi do przeniesienia genów do pyłku. W rozległych badaniach Negrutiu, Heberle-Borsa i Potrykusa [tamże, 65-70 (1986)] nie udało się przenieść genu fosfotransferazy neomycynowej, nadającego oporność przeciw kanamycynie [Shillito i in., Biotechnology, 3, 1099-1103 (1985)] do dojrzałego pyłku kwiatowego. Także metodami odpowiadającymi najnowszemu stanowi techniki nie udało się potwierdzić stanowiska Hessa i DeWeta. To, że wyniki Hessai DeWeta nie są powtarzalne, można wytłumaczyć tym, że dojrzałe ziarna pyłku kwiatowego gdy dostaną się do środowiska wodnego potrzebnego do przenoszenia genów, od razu rozpoczynają tworzenie łagiewki pyłkowej. Widocznie nie są one więcej zdolne do zapylenia, względnie za krótki jest czas stojący do dyspozycji, jeśli chodzi o przeniesienie genu.

Pareddy i in. opisują w Planta, 170,141-143 (1987) hodowlę i dojrzewanie niedojrzałych kitek kukurydzianych („tassels, męskie kwiatostany kukurydzy) in vitro. Dokonuje się zapylenia wyodrębnionym, dojrzałym pyłkiem kwiatowym i uzyskuje się nasiona od tak zapylonych roślin. Nie można było udowodnić przy zastosowaniu marketów genetycznych uwieńczonego powodzeniem zapłodnienia.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że możliwa jest hodowla niedojrzałych ziaren pyłku kwiatowego bez otaczjącej je naturalnej tkanki odżywczej, dalej, że do tych wyodrębnionych, niedojrzałych ziaren pyłku kwiatowego, w trakcie różnych stadiów dojrzewania, można wprowadzić obce geny oraz, że przy użyciu dojrzałych ziaren pyłku kwiatowego można doprowadzić rośliny do zapylenia, zapłodnienia, do normalnego tworzenia nasion, do kiełkowania i do rozmnażania się.

Sposób przenoszenia genów u roślin, polega według wynalazku na tym, że a/ pobiera się z pręcików niedojrzałe ziarna pyłku kwiatowego do podłoża odżywczego i usuwa się otaczającą tkankę, b/ prowadzi się hodowlę wyodrębnionych niedojrzałych ziaren pyłku kwiatowego, c/ przenosi się obcy materiał genowy do ziaren pyłku kwiatowego, w trakcie hodowli i dojrzewania in vitro, d/ doprowadza się in vitro do pełnej dojrzałości ziarna transformowanego pyłku kwiatowego, e/zapyla się ziarnami transformowanego pyłku kwiatowego rośliny przyjmujące i pozyskuje się z nich nasiona.

Dzięki przenoszeniu genów do wyodrębnionych niedojrzałych ziaren pyłku kwiatowego, dojrzewaniu in vitro i zastosowaniu pyłku kwiatowego jako uniwersalnego superwektora, otwiera się całkowicie nowa strategia przenoszenia genów do roślin. W porównaniu z innymi metodami sposób ten jest w istotnej mierze uproszczony, ponieważ zostaje bardzo skrócona faza hodowli komórek i odpada regeneracja z nieprzyjemnym ubocznym zjawiskiem wariacji somoklonalnej. Tym nowym sposobem można transformować także rośliny, które jak dotychczas nie były dostępne skutecznemu przenoszeniu genów. Dotyczy to np. wielu rodzajów roślin zbożowych, strączkowych i drzew, nie dających się regenerować z pojedynczych komórek lub protoplastów.

Potencjalna użyteczność techniki przenoszenia genów ma wielkie znaczenie gospodarcze, ekologiczne i społeczne. Dąży się do tego, by dokonać takich zmian genetycznych u roślin, aby uzyskać podwyższenie plonów, aby rośliny uzyskały oporność przeciw chorobom i szkodnikom, aby uzyskały tolerancję na zimno, upał, suszę, zasolenie i brak substancji odżywczych, aby uzyskały wyższą jakość odżywczą, aby stały się one producentami nowych surowców o znaczeniu przemysłowym, lub aby wiązały one na własny użytek azot, względnie w inny sposób stały się niezależne od nawozów.

Dla wynalazku jest rzeczą istotną, aby prowadzić hodowlę ziaren pyłku kwiatowego bez otaczającej je tkanki, a więc wyodrębnionych, przez co materiał genowy, który ma zostać przeniesiony w postaci sprzężonej z wektorem lub w nagłej formie, znajduje bezpośredni kontakt z ziarnem

158 090 pyłku kwiatowego. A mianowicie, gdy prowadzi się hodowlę całkowitego męskiego kwiatostanu, nie ma możliwości z powodu przeszkód czynionych przez rozległą otaczającą tkankę, przeniesienia genów za pomocą zwykłych metod (A. tumefaciens, elektroporacja, mikroiniekcja itp) do ziaren pyłku kwiatowego.

Dalszą istotną cechę znamienną wynalazku stanowi stosowanie niedojrzałych ziaren pyłku kwiatowego. Dzięki temu, do dyspozycji, jeśli chodzi o przeniesienie genów, stoi cały czas dojrzę^ wania in vitro. Przeniesienie do niedojrzałego ziarna pyłku kwiatowego odbywać się może w rozmaitych stadiach dojrzewania, zależnie od rodzaju rośliny. W szczególności, w przypadku przenoszenia genów z użyciem wektorów, chodzi o to, aby materiał genetyczny miał do pokonania możliwie najmniej ściany komórkowej, by dostać się do genomu jądra spory i stać się na drodze zapłodnienia częścią genomu zygoty. Korzystnie, przeniesienie zachodzi z wykorzystaniem jednojądrowych mikrospor, może także nastąpić w trakcie pierwszej mitozy pyłku kwiatowego, we wczesnym stadium dwujądrowym, tak długo, jak długo komórka generatywna przylega jeszcze do ściany pyłku kwiatowego, a także, dodatkowo, w przypadku takich roślin, które wykazują w stadium dojrzewania trójjądrowe ziarna pyłku kwiatowego (zboża), w stadium następującym krótko przed lub w czasie drugiej mitozy pyłku kwiatowego.

W szczególności, doświadczenie prowadzi się sposobem następującym, w którym jako układ modelowy stosuje się tytoń (Nicotiana tabacum). Układ nadaje się do stosowania wobec każdej rośliny zdolnej do rozmnażania się przez zapylenie, a zwłaszcza w przypadku jedno- i dwuliściennych roślin uprawnych, takich jak pszenica, kukurydza, ryż, strączkowe, oleiste, rośliny warzywne oraz rośliny owocodajne i leśne.

W doświadczeniu wstępnym określa się w zwykły sposób stadium rozwojowe pyłku kwiatowego żądanej rośliny, a mianowicie za pomocą wyodrębnienia pylników, otrzymania preparatu wytłaczanego i obserwacji mikroskopowej po dodaniu np. karminu-kwasu octowego.

Gdy pyłki kwiatowe osiągnęły pożądane stadium, wyodrębnia się ziarna pyłku kwiatowego w warunkach aseptycznych, po czym wytłacza się je z pylników do podłoża wzrostowego, przepuszcza przez sito, przemywa, odwirowuje i ponownie zawiesza.

Gęstość komórek, w przypadku ziaren pyłku kwiatowego we wcześniejszym stadium rozwojowym powinna być wyższa od gęstości ziaren pyłku kwiatowego w późniejszym stadium rozwojowym. W przypadku tytoniu o dwujądrowych ziarnach pyłku kwiatowego wynosi ona około 10⁵/ml, a w przypadku jednojądrowych mikrospor jest mniej więcej dwukrotnie wyższa.

Zastosowane podłoże odżywcze zawiera wszystkie substancje odżywcze i wzrostowe istotne dla hodowli i utrzymania zdolności do dojrzewania ziaren pyłku kwiatowego. Zależnie od rośliny, mogą przy tym wyniknąć odmiennie zestawione układy, tak że funkcja tkanki odżywczej (Tapetum) zostaje spełniona. Jako zasadnicze części składowe, podłoże odżywcze zawiera w tym przypadku cukier, substancje odżywcze, sole mineralne i witaminy, a jego pH wynosi około 6,5-7,5.

W przypadku mikrospor jednojądrowych, hodowla odbywa się aż do stadium dwujądrowego w podłożu w sposób istotny wzbogaconym cukrem, np. sacharozą i dalszymi substancjami odżywczymi. I tak np., dodatkowe substancje odżywcze mogą zostać wprowadzone w postaci płynu z orzecha kokosowego. Gdy ziarna pyłku kwiatowego osiągnęły stadium dwujądrowe, można je przenieść do podłoża uboższego w substancje odżywcze.

Po zakończeniu dojrzewania in vitro, odzyskuje się ziarna pyłku kwiatowego w celu zapylenia. W tym celu odwirowuje się je, przemywa i nanosi na kwiaty, z których poprzednio usunięto pylniki, w podłożu wodnym lub po wysuszeniu. Z roślin zapylonych doprowadzonymi in vitro do stanu dojrzałości ziarnami pyłku kwiatowego można ogólnie praktykowanym sposobem uzyskać nasiona zdolne do kiełkowania.

Dla uzyskania przeniesienia genów w trakcie hodowli in vitro, można wprowadzić do ziaren pyłku kwiatowego przeznaczony do przeniesienia obcy materiał genowy w połączeniu ze zwykłym wektorem, takim jak np. A. tumefaciens, lub jako nagi DNA, za pomocą bezpośredniego przeniesienia z wykorzystaniem elektroporacji, mikroiniekcji lub innych metod fizyko-chemicznych. Termin „obcy materiał genowy oznacza każdy materiał genowy utworzony poza obrębem przewidzianego do transformacji ziarna pyłku kwiatowego. Po osiągnięciu stadium dojrzałości otrzymuje się wyżej opisanym sposobem ziarna pyłku kwiatowego do zapylenia.

158 090

Jako dowód na uwieńczone powodzeniem doprowadzenie in vitro ziaren pyłku kwiatowego do stadium dojrzałości, prowadzi się dojrzewanie in vitro rośliny tytoniu z dwoma genami markerowymi (KANⁿ, NOS), po czym zapyla się tak otrzymanymi ziarnami pyłku kwiatowego normalne rośliny typu dzikiego. Otrzymane nasiona poddaje się sterylizacji i wprowadza do zawierającego kanamycynę podłoża do kiełkowania w celu ich skiełkowania. Mendlowską segregację genów markerowych wykazuje się za pomocą obliczenia zarodków w podłożu selektywnym. Zarodki, które wykielkowaly w podłożu bez kanamycyny wykazują również w próbie z nopaliną w wysokonapięciowej elektroforezie bibułowej segregację mendlowską genu NOS.

Jest to dowodem na to, że właśnie ziarna pyłku kwiatowego dojrzałe in vitro było tymi, które dokonywały zapłodnienia, a nie jakiekolwiek zanieczyszczające pyłki kwiatowe z innych roślin.

Jako dowód ekspresji obcego genu wprowadzonego na drodze transformacji w trakcie hodowli in vitro, potwierdza się w teście enzymatycznym obecność w homogenacie z transformowanych ziaren pyłku kwiatowego aktywność acetylotransferazy chloramfenikolowej (aktywność CAT).

Dodatkowo, oprócz genu CAT, zastosowany został także gen dający się wykazać cytochemicznie, a mianowicie gen /3-glukuronidazy (gen GUS). W związku z tym, agrobakterie, po wspólnej hodowli z pyłkiem kwiatowym, oddziela się lub dezaktywuje za pomocą całodziennego przemywania antybiotykiem pod nazwą Claforan. W teście cytochemicznym (niebieskie zabarwienie pyłku kwiatowego) można było stwierdzić obecność ponad 50% niebieskich dojrzałych in vitro pyłków kwiatowych, podczas gdy pyłki kwiatowe nie zakażone, względnie pyłki kwiatowe bez genu GUS lub z niefunkcjonalnym genem GUS, nie wykazywały po dodaniu substratu niebieskiego zabarwienia. Test fluorometryczny wykazał silną aktywność GUS w GUS-transformowanym pyłku kwiatowym, jak i w pyłku z roślin GUS-transformowanych służących jako kontrola dodatnia. Pyłki kwiatowe, które nie zostały zakażone, lub zostały zakażone agrobakteriami nie zawierającymi genu GUS, nie wykazywały aktywność GUS. Można z tego wywnioskować, że przeniesienie genu do pyłku kwiatowego z udziałem Agrobacterium tumefaciens zachodziło. Dalszą wskazówką co do skutecznego przeniesienia genu do pyłku kwiatowego jest rozpoznawalne przytwierdzenie agrobakterii na powierzchni pyłku kwiatowego z utworzeniem fibryli celulozowych (zdjęcia w mikroskopie elektronowym).

Przykład I. Określenie stadium wzrostowego pyłku kwiatowego.

Zbiera się kwiaty tytoniu o różnej długości i wyodrębnia się aseptycznie pylniki. Jeden z pięciu pylników nakłada się na szkiełko przedmiotowe wraz z kroplą karmin-kwasu octowego (4% Karmin w 45% kwasie octowym) i sporządza się preparat wytłaczany. Stadium rozwojowe ziaren pyłku kwiatowego określa się po upływie pół godziny za pomocą obserwacji mikroskopo wej.

Przykład II. Wyodrębnianie ziaren pyłku kwiatowego.

Wyodrębnia się ziarna pyłku kwiatowego, przy czym ostrożnie wytłacza się pylniki w warunkach aseptycznych do podłoża AMGLU (1), z użyciem pałeczki szklanej oraz sprzętu mikroskopowego i otrzymaną tak zawiesinę pyłku kwiatowego przypuszcza się przez 75μη\ sito, po czym dwukrotnie przemywa podłożem AMGLU. W końcu zawiesinę pyłku kwiatowego odwirowuje się przy 6500 obr/min w wirówce Eppendorfa.

Przykład III. Hodowla pyłku kwiatowego w celu doprowadzenia do dojrzałości wczesnych dwujądrowych ziaren pyłku kwiatowego.

Wyodrębnia się świeże dwujądrowe ziarna pyłku kwiatowego tytoniu i ustala się gęstość komórek w podłożu AMGLU na poziomie 10⁵/ml. Prowadzi się hodowlę 1 ml zawiesiny pyłku kwiatowego w 35 mm szalkach Petri'ego w temperaturze 25°C, w ciemności. Po upływie 2-5 dni, zależnie od ściśle określonego stadium rozwojowego ziaren pyłku kwatowego, ziarna pyłku kwiatowego były już dojrzałe i można je było zebrać.

Przykład. IV. Hodowla pyłku kwiatowego w celu prowadzenia do dojrzałości jednojądrowych mikrospor.

Prowadzi się hodowlę jednojądrowych mikrospor tytoniu, w podłożu MR24 (2), przy gęstości komórek wynoszącej 2· 10⁵/ml. Gdy tylko ziarna pyłku kwiatowego osiągnęły stadium dwujądrowe (po upływie 2-5 dni, zależnie od ściśle określonego wieku), odwirowuje się je i dalej hoduje w podłożu MIS (3), aż do zakończenia dojrzewania.

158 090

Bardzo dobre wyniki otrzymuje się także w przypadku hodowli w podłożu MR26 (2'). Tuż po osiągnięciu przez ziarna pyłku kwiatowego stadium dwujądrowego (po upływie 3 dni), dodaje się taką samą objętość podłoża M25. Po upływie dalszego dnia odwirowuje się ziarna pyłku kwiatowego i hoduje je w dalszym ciągu w podłożu M2S (3'), przy gęstości komórek wynoszącej 10⁵/ml, aż do zakończenia dojrzewania (1 dzień).

Przykład V. Zapylenie i wykazanie zapłodnienia.

Odwirowuje się ziarna pyłku kwiatowego tytoniu, przemywa w podłożu BK (Brewbaker i Kwack, 1963) i ustala gęstość hodowli na poziomie l,25-10⁶/ml. Z kwiatów, które właśnie otwierają się (czerwone korony kwiatów) i usuwa się jeszcze zamknięte pylniki. Gdy tylko kwiat się otworzył, nanosi się 4·μ/1 kroplę zawiesiny pyłku kwiatowego przy użyciu 20 μΐ pipety na znamię kwiatu tak, aby znamię całkowicie było pokryte zawiesiną pyłku kwiatowego. Operacje te prowadzi się w warunkach zabezpieczających przed ruchem powietrza i przed obecnością innych roślin tego samego gatunku. Gdy tylko kropla zostanie naniesiona na znamię, przykrywa się znamię i szyjkę słupka słomką długości 4 cm, aby przeszkodzić zapłodnieniu przez pyłek obcy. Następnie rośliny ponownie umieszcza się w szklarni.

Przykład VI. Zbiór nasion, kiełkowanie nasion i test genetyczny.

Jako dowód, że doprowadzone in vitro do stadium dojrzałości ziarna pyłku kwiatowego dokonały zapylenia i zapłodnienia, doprowadza się in vitro do stadium dojrzałości ziarna pyłku kwiatowego rośliny transgenicznej i zapyla się tymi ziarnami pyłku kwiatowego normalne rośliny typu dzikiego. Jako gen markerowy roślina transgeniczna zawiera gen fosfotransferazy neomycynowej (oporność na kanamycynę) i gen syntezy nopalinowej. Przeprowadzono także samozapłodnienie i wzajemne krzyżowanie z doprowadzonym in vitro do dojrzałości pyłkiem kwiatowym typu dzikiego.

Dojrzałe, otrzymane sposobem opisanym w powyższym przykładzie V, torebki nasienne (brązowe i suche) zbiera się i wyodrębnia się nasiona, po czym końce torebki odcina się i ziarnami nasion od razu napełnia się nasadkę Eppendorfa. Nasiona sterylizuje się powierzchniowo (w ciągu 5 minut, roztworem NaOCL (3% wolnego chloru), przemywa dwukrotnie jałową wodą i nakłada się podłoże do kiełkowania nasion z kanamycyną (4). Po upływie 4 tygodni oblicza się ilość kiełków Kan^R i Kan^s. W powyższym doświadczeniu (z krzyżowaniem) oba wzajemne krzyżowania dają segregację KanR-EKan^s = 1 : 1. Kiełki, które wyrosły bez kanamycyny wykazują według testu nopalinowego metodą wysokonapięciowej elektroforezy bibułowej segregację Nos+ 4- Nos” =1:1. Samozapłodnienie, z udziałem dojrzałych in vitro dzikich typów, dało, jak oczekiwano, segregację 0:1 dla obydwóch genów markerowych. Samozapłodnienie dojrzałych in vitro pyłków kwiatowych roślin transgenicznych dało segregację 3:1.

Przykład VII. Transekspresja genu CAT.

Inkubuje się wstępnie agrobakterie (A. tumefaciens bez genu nowotworowego, sprzężone z genem CAT przy promotorze 35S) w bulionie Lurii, w ciągu 1 dnia. Wyodrębnia się ziarna pyłku kwiatowego we wczesnym stadium dwujądrowym i prowadzi się ich hodowlę w podłożu AMGLU. Zawiesinę bakteryjną doprowadza się z użyciem podłoża AMGLU do wartości ODseo wynoszącej 0,2. Po dalszym rozcieńczeniu podłożem AMGLU 1:10 do 1ml zawiesiny ziaren pyłku kwiatowego dodaje się 20μ1 zawiesiny bakteryjnej. Po upływie 24 godzin wspólnej hodowli dodaje się do 1 ml hodowli 1 μΐ Claforanu (1 g/2 ml) w celu zdezaktywowania agrobakterii. Po upływie dalszych 2 dni zbiera się ziarna pyłku kwiatowego i otrzymuje się ekstrat. Przy tym, do 1 ml zawiesiny pyłku kwiatowego dodaje się 1,5 ml roztworu do przemywania zawierającego wapń (5), pH 5,6, po czym całość wiruje się przy 4000 obr/min w ciągu 5 minut i przemywa 0,25 M buforem Tris, pH 7,8. Po odwirowaniu zadaje się osad pyłku kwiatowego 200μΐ buforu Tris i homogenizuje 3 razy po 15 sekund z zastosowaniem ultradźwięków, na lodzie. Po upływie 10 minut przetrzymywania na lodzie przeprowadza się wirowanie i w temperaturze -20°C przechowuje się nadsącz.

Test CAT prowadzi się sposobem opisanym przez Sleigha [Anal. Biochem., 56, 251-256 (1986)]. 30/H ekstraktu miesza się z 20μ1 (8 mM) chloramfenikolu, 30μ1 buforu Tris i 20μ1 acetyloenzymu A znakowanego 1⁴C (5μΟ/ml w 0,5 mM zimnego acetylokoenzymu A). Po inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu godziny usuwa się zacetylowany chloramfenikol za pomocą dwukrotnego wytrząśnięcia ze 100μ1 octanu etylu i mierzy się promieniotwórczość w liczniku scyntylacyjnym.

158 090

Promieniotwórczość [impulsy/min] ekstraktów z pyłku kwiatowego po wspólnej hodowli z A. tumefaciens w teście CAT.

Impulsy/min

Pyłek kwiatowy w podłożu AMGLU 400

Pyłek z agrobakteriami w podłożu AMGLU 6000

Pyłek z agrobakteriami aktywowanymi z użyciem Acetosyringon (3', 5'-dimetoksy-4'-hydroksyacetofenon) w podłożu AMGLU 6000

Tylko agrobakterie w AMGLU 500

Tylko agrobakterie aktywowane z użyciem Acetosyringon w podłożu AMGLU 500

Silny sygnał promieniotwórczości pokazuje, że agrobakterie skutecznie zakaziły ziarna pyłku kwiatowego i że T-DNA, dla ekspresji (transkrypcji) musiał dostać się do jądra komórkowego wzrastającej komórki. Dalszym sprawdzianem wykazującym, że agrobakterie same z siebie nie miały aktywności CAT, było to, że hodowla agrobakterii w bulionie Lurii w ciągu całkowitego cyklu rozwojowego nie wykazywała aktywności CAT.

Przykład VIII. Ekspresja genu GUS w pyłku kwiatowym tytoniu.

Prowadzi się wstępną hodowlę agrobakterii szczepu LBA 4404 [A. tumefaciens, disarmed, z genem β-glukuronidazy (GUS), sprzężonym z promotorem 35S i terminatorem] [Matzke i Matzke w: Plant Molecular Biology, 7, 357-365 (1986)], w bulionie Lurri, w ciągu 1 dnia. Ziarna pyłku kwiatowego w późniejszym stadium jednojądrowym wyodrębnia się i doprowadza w podłożu MR26 do ODseo 0,2. Po dalszym rozcieńczeniu podłożem MR26 do 1:10 do 1 ml zawiesiny ziaren pyłku kwiatowego dodaje się 20μ1 zawiesiny bakteryjnej. Po upływie 14-20 godzin wspólnej hodowli przeprowadza się wirowanie i przemywa pyłek kwiatowy podłożem MR26 zawierającym Claforan (1 g/2 ml), po czym hodowlę prowadzi się dalej. Aż do uzyskania przez pyłek kwiatowy dojrzałości, każdego dnia wymienia się zawierające Claforan podłoże. 40/1 ostatniego podłoża (M2S z Claforanem) dodaje się do bulionu Lurii Nie wystąpił wzrost bakterii.

Dojrzałe pyłki kwiatowe odwirowuje się i pobiera część podłoża MR26. Po dodaniu X-Glu (5-bromo-4-chloro-3-indoliloglukuronid) do stężenia końcowego 1 mM i przeprowadzeniu inkubacji w temperaturze 37°C wciągu 4-12 godzin [Jefferson w: Plant Molecular Biology Reporter, t. 5, nr 4, 387-405 (1987)], można było stwierdzić, pod mikroskopem optycznym na zasdzie powstawania niebieskiego zabarwienia pyłku kwiatowego tworzenie indyga (produkt /3-glukuronidazy z X-Glu). Ponad 50% żywych dojrzałych pyłków kwiatowych wykazywało niebieskie zabarwienie.

Drugą część wspólnie hodowanego i dojrzałego in vitro pyłku kwiatowego doprowadza się do skiełkowania w podłożu GK (takie jak podłoże BK, ale o dwukrotnie wyższym stężeniu kwasu borowego. W woreczkach pyłkowych dojrzałych pyłków można było także stwierdzić obecność aktywności GUS.

W doświadczeniu kontrolnym zakaża się pyłek kwiatowy szczepem agrobakterii LBA4404, który w swoim T-DNA zawiera gen GUS bez promotora (Oddany do dyspozycji przez dr Matzke'go z Salzburga). Te pyłki kwiatowe po dodaniu X-Glu nie wykazują niebieskiego zabarwienia. Także agrobakterie, które nie zawierają genu GUS, nie wykazują niebieskiego zabarwienia po wspólnej hodowli z pyłkiem kwiatowym i dodaniu X-Glu. Także i pyłki kwiatowe, które nie są zakażone agrobakteriami, nie wykazują po dodaniu X-Glu niebieskiego zabarwienia.

Z trzeciej części pyłku otrzymuje się ekstrat. W tym przypadku odwirowuje się 4 · 10⁵ pyłków i wprowadza do buforu do ekstrakcji (6). Pyłek rozbija się z użyciem kulek szklanych a jednocześnie działaniem ultradźwięków. Test fluorometryczny GUS prowadzi się w sposób opisany przez Jeffersona. 50 μΐ ekstraktu dopełnia się do 1ml buforem do ekstrakcji, po czym zadaje MUG (4-metyloumbeniferylo-glukuronid) do stężenia końcowego 1 mM. Co 10 lub 30 sekund pobiera się 200pl próbki i reakcję enzymatyczną zatrzymuje się stosując 800μιη Na2Co3 (0,2 M). Mierzy się ekstrakcję z użyciem fluorometru przy 455 nm po wzbudzeniu przy 365 nm i oblicza jako stężenie (w μΜ/Ml) z wykorzystaniem roztworów standardowych w stosunku do MUG.

Aktywność enzymatyczna B-glukuronidazy z ekstraktów pyłku kwiatowego po wspólnej hodowli z A. tumefaciens zmierzono fluorometrycznie: Standard ΙμΜ/ml; Standard 2 Ο,ΙμΜ/ml; Pyłek kwiatowy wspólnie hodowany z agrobakteriami GUS35S; Pyłek kwiatowy wspólnie hodowany z agrobakteriami KAN35S; Pyłek kwiatowy z transgenicznej rośliny GUS+.

Podłoże hodowlane:

δ

158 090 (1) podłoże AMGLU: Makrosole (Miller); Mikrosole MS; Sacharoza (0,25 M); Glutamina (440 mg/ml); pH 7.

(2) Podłoże MR-24; Makrosole MS; Mikrosole MS; Sacharoza (0,5 M); Glutamina (440 mg/litr); Płyn z orzecha kokosowego (2% obj.); Hydrolizat laktoalbuminy (200 mg/litr); Inozytol (100 mg/litr); pH 7.

(2') Podłoże MR-26. Jak podłoże MR 24, ale z zastosowaniem hydrolizatu laktoalbuminy (Ig/Iitr) (3) Podłoże MIS: Makrosole (Miller), Mikrosole MS, Wersenian żelaza (10 ⁴ M); Sacharoza (0,25 M); pH 7.

(3') Podłoże M2S. Sole Kyo i Harada [w: Planta, 186, 427-432 (1986)]: Sacharoza (0,25 M); pH 7.

(4) Podłoże do kiełkowania nasion: Makrosole MS; Mikrosole MS; Wersenian żelaza (10^_4 M); Sacharoza (1% wag); Agar (0,8% wag); Siarczan kanamycyny (50 mg/litr); pH 5,5.

(5) Roztwór do przemywania zawierający wapń: CaCl2‘2 H2O (0,16 M); Bufor MES (0,5% wag); pH 5,6.

(6) Bufor do ekstrakcji: NaPC4 (50 mM, pH 7); 2-Merkaproetanol (10 mM); Wersenian disodowy (lCmM); Sól sodowa laurylosarkozyny (0,1%); Triton Χ-100 (0,1%).

Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 5000 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób przenoszenia genów u roślin, znamienny tym, że pobiera się z pręcików niedojrzałe ziarna pyłku kwiatowego do podłoża odżywczego i usuwa otaczającą tkankę, prowadzi się hodowlę wyodrębnionych niedojrzałych ziaren pyłku kwiatowego w podłożu odżywczym, przenosi się obcy materiał genowy do ziaren pyłku kwiatowego w trakcie hodowli in vitro i dojrzewania, doprowadza się in vitro ziarna transformowanego pyłku kwiatowego do pełnej dojrzałości oraz zapyla się ziarnami transformowanego pyłku kwiatowego rośliny przyjmujące i pozyskuje z nich nasiona.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeniesienia obcego materiału genowego dokonuje się w stadium jednojądrowych mikrospor.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeniesienia obcego materiału genowego dokonuje się w stadium pierwszej mitozy pyłku kwiatowego.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeniesienia dokonuje się we wczesnym stadium dwujądrowym, jak długo tylko komórka generatywna przylega jeszcze do ściany pyłku kwiatowego.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeniesienia obce materiału genowego dokonuje się tuż przed, lub w trakcie drugiej mitozy pyłku kwiatowego.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się podłoże odżywcze zawierające wszystkie substancje odżywcze i wzrostowe istotne dla hodowli i utrzymania zdolności do dojrzewania ziaren pyłku kwiatowego.
7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że przeniesienia genu dokonuje się w stadium jednojądrowych mikrospor w podłożu wzbogaconym cukrem i dalszymi substancjami odżywczymi.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeniesienia obcego materiału genowego dokonuje się przez wspólną hodowlę w Agrobacterium tumefaciens.