JPH03501855A - ヒト／ウシ塩基性線維芽細胞成長因子の新規誘導体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヒト／ウシ塩基性線維芽細胞成長因子の新規誘導体本発明は、組換えＤＮＡ技術 により製造するための塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ）の新規の分 子物質誘導体、関連する発現プラスミド及びＤＮＡコード配列に関する。本発明 の新規分子ｂＦＧＦ変形体は、血管形成過程（Ｂｎｇｉｏｇｅｎｉｃｐｒｏｃｅ ｓｓ　）において野生型分子の拮抗物質及び／又は超作働物質（Ｓυｐｅｒａｇ ｏｎｉｓ１ｇ）として作用し得る。これらの新規分子及び野生型ｂＦＧＦの製造 に関する本発明の明細書中に開示される方法は、ヒト及びウシｂＦＧＦ並びにそ れらの誘導体をコード毛細血管形成は、多数の重要な生物学的過程、例えば器官 発生及び創傷治癒のような生理学的過程あるいは腫瘍成長のような病理学的過程 において起こる（Ｄｅｎｅｋａｍｐ　Ｊ　：腫瘍内で攻撃され易い要素としての 血管内皮、　ＡｃＬａ　Ｒａｄｉｏｌ、　（ｏｎｃｏｌ）　２３　ｐ、２１？− ２２５，１９８４；Ｈｏｂｓｏｎ　ＢとＤｅｎｅｋａｍｐ　Ｊ：腫瘍及び正常組 織内の内皮増殖：連続的標識研究、　Ｂｔ、１Ｃａｎｃｅｒ　４９　ｐ、４０５ −４１３．　１９８４；Ｆｏｌｋｍａｎ　］　：腫瘍血管形成、　Ａｄｖ、Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｕ、４３　ｐ、１７５−２０３゜１９８５）。

血管新生に導く事象の順序は形態学的に特徴が明らかにされているが、一方この 過程が生じる分子機構は依然としてよく分かっていない。毛細血管内皮における 成長の制御は、通常これらの細胞が血管形成過程で増殖を引き金とする静止性単 層（ｃｔａＮｃ　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成するために、非常に厳重なもので あると思われる（Ｆｏｌｋｔｎａｎ　］：腫瘍血管形成、Ａｄｖ、Ｃａｎｃｅｒ 　Ｒｅｓ。

４３　Ｌ　１７５−２０３．　１９８５　；　Ｊｏｓｅｐｈ−３ｉｌｖｔ口ｊｅ ｉｎ　］、とＲｉｆｋｉｎ　Ｂ。

Ｄ、：内皮細胞成長因子と血管壁、　Ｓｅｍ１ｎａｔｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂ、 　ａｎｄ）１．ｅ＋ｎｏＮ、１３　ｐ、５１４−５１３．　１９１１７）。

内皮細胞の常態的静止性は、血漿中に内皮細胞因子が明らかに欠如していること によって部分的に説明し得る。事実、主な内皮細胞のミトゲン（有糸分裂促進物 質）は血漿中に見出されないが、それらのミトゲンは調べたほとんどすべての組 織の抽出物中、並びに多数の正常及び腫瘍細胞系中に存在する（ｊｏｓｅｐｂ− ８ｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ　Ｊ、とＲ１１ｋｉｎ　Ｂ、Ｄ、：内皮細胞成長因子と 血管壁、　５ｕｎｉｎｓ＋ｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｕ＋ｂ、ａｎｄ　Ｈｅｍｏｓｔ、　 ｕｐ、５［１４−５１３゜１９８７；Ｆｏｌｋｍａｎ　Ｊ　；と旧ａｇＳｂｒｎ ｎ　Ｍ、　二面管形成因子、　５ｃｉｅｎｃｅ。

２３５　ｐ、４４２−４４７．　１９８７）。

したがって、急速な内皮細胞増殖の限局性誘発は、環境刺激に反応して細胞から 内皮細胞ミトゲンを放出することを伴う可能性がある。

内皮細胞ミトゲンを最もよく特徴づけるものは、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ 　Ｆ　Ｇ　Ｆ）を含むポリペプチド成長因子のファミリーであって、これらはヘ パリンに対する高い親和性のためにヘパリン結合成長因子として公知である（Ｔ ｈｏｍａｓＫ、：線維芽細胞成長因子、　ＦＡＳＥＢ　］、＋　１　ｐ、４３４ −４４０．　１９８７；Ｇｏ＋ｐｏｄａｒｏｗｉｃｘ　Ｄ、、　Ｎｅｕｆｅｌｄ 　Ｇ、及びＳｃｈｗｅｉｇｕ！＋　Ｌ、、線維芽細胞成長因子：構造的及び生物 学的性質、　ｌｃ！１１．Ｐｂｙｌｉｏｌ、、５ｐ、　１５−２６．　’１９８ ７）。

塩基性ＦＧＦは、大半は、中胚葉又は神経外胚葉から誘導された組織又は細胞か ら精製されてきた。構造研究から、ｂＦＧＦは１４６個のアミノ酸から成る一本 鎖ボリペプチドであって、最初の１０〜２０個のアミノ酸を欠いたＮＨ２末端切 頭形態（Ｎｌ２−１ｅｒｍｉｎ＋＋Ｉｌｙ　ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　Ｉｏ＋ｎｏ） で存在し得る。切頭形態のＦＧＦは、放射標識レセプターの結合及び生物学的ア ッセイによって立証されるように、無傷のｂＦＧＦと同様の効力を有する（ＧＯ ｓｐｏｄａｒｏｖｉｃ２Ｄ、、　Ｎｅｕｆｅｌｄ　Ｇ、及びＳｃｈｗｃｉｇｅ＋ ｅ＋　Ｌ、　：線維芽細胞成長因子、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｅｎｄｏｃｔｉｎ、 ４６　ｐ、ｌ８７−２０６．１９８６；Ｇｏｓｐｏｄａ＋ｏｖｉｃｘ　Ｄ、、　 Ｎｅｕｌｅｌｄ　Ｇ、及びＳｃｈｖｅｉｇｃ＋ｅ＋　Ｌ、：線維芽細胞成長因子 の分子的及び生物学的特徴：中胚葉及び神経外胚葉誘導細胞の増殖と分化をも調 節する血管形成因子、　Ｃｅ１ｌ。

Ｄｉｆｆｅｒ、ユ９　Ｌ　１−１７．１９８６；　Ｔｈｏｍａｓ　Ｋ、とＧｉｍ ｅｎｅｘ−ＧａｌｌｅＨｏ　Ｇ、　：線維芽細胞成長因子二強力な血管形成活性 をもつ広範なスペクトルのミトゲン、Ｔｒｅｎ＋］ｓ　Ｂｉｏｃｈｃｍ、Ｓｃｉ 、ＩＩ　ｐ、８１−８４．　１９８６）。

さらに、プロテアーゼ阻害剤を包含させたホモジナイズされた組織からの抽出物 を酸性から中性に置換して精製プロトコルを変更すると、より長い１５４残基の 形態のものが生じた（ｌＪ！ｎ。

Ｎ、、Ｂａ１ｅｄ　Ａ、、Ｅａｃｈ　Ｆ、、Ｌｉｎｇ　Ｎ、及びＧｕｉｌｌｅｍ ｉｎ　Ｒ，：塩基性線維芽細胞成長因子のアミノ末端伸長型の単離、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ。

Ｂｉｏｐｈ）ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍｕｎ、、１３８　ｐ、５８０−５８８．　１ ９８６；　ＳｔｏＴｙＭ、Ｔ、Ｅｓｃｈ。

Ｆ、、Ｓｈｉｍａｓａｋｉ　Ｓ、、５ａｓｓｅ　Ｊ、、Ｊａｃｏｂｓ　Ｓ、Ｃ， 及びＬ＋ｗｓｏｎ　Ｒ，Ｋ、　：ヒト前立腺肥大組織から単離された大きい型の 塩基性線維芽細胞成長因子のアミノ末端配列、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈ７ ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

ユ４２．　ｐ、７０２−７０９．　１９８７　；　Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ　Ｍ、、 ＳｍＨｈ　Ｓ、、　５ｕｌｌｉｖａｎＲ，、Ｓ）Ｉｉｎｇ　Ｙ、、　Ｄｍｖｉｄ ｃｏｎ　Ｓ、、　Ｓｍ１ｔｈ　Ｊ、Ａ、及び５ａｓｓｅ　Ｊ、　：多型塩基性線 維芽細胞成長因子：腫瘍細胞及び脳細胞から誘導された酸性プロテアーゼによる アミノ末端開裂、　Ｐ＋ｏｃ、Ｎａ１１．Ａｅａｄ。

Ｓｅｉ、υＳＡ　８４　ｐ、］８３９−１８４３．　１９８７）。

観察されたＦＧＦの微小不均質性（ｍｉｃ＋ｏｂｅｊｕｏｇｅｎｅｉｌｙ）は、 少なくとも一部は、ｉｎ　ｖｉｖｏで又は精製中に起こるアミノ末端付近の部分 的蛋白質分解によるものと思われる。しかしながら、種々の型は同等に活性であ ると思われるため、微小不均質性はおそらく生理学的には無関係であると考えら れる。

塩基性ＦＧＦは、進化によって非常によく保存されてきた。

例えば、ウシ及びヒトｂＦＧＦは、その１４６個のアミノ酸のうち２つだけが異 なり、９８．７％の全アミノ酸配列相同性を示す（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｅ！ Ｄ、、　Ｎｅｕｆｃｌｄ　Ｇ、及びＳｃｔｖｃｉｇｅｒｅｒ　Ｌ、　：線維芽細 胞成長因子の分子的及び生物学的特徴：中胚葉及び神経外胚葉誘導細胞の増殖と 分化をも調節する血管形成因子、Ｃｅ１ｌ。

Ｄｉｆｆｅｒ、、１９　ｐ、１−１７．　１９８６）。

ｂＦＧＦに関連するものは酸性ＦＧＦ　（ａＦＧＦ）であるが、これはｂＦＧＦ と５５％の全配列相同性を共有する。酸性ＦＧＦは、最初の６個のアミノ酸を欠 いたＮＨ２末端切頭形態でも存在し得る　１４０個のアミノ酸からなるポリペプ チドである（Ｇｉｍｃｎｅｘ−Ｇａｌｌｅｇｏ　Ｇ、、　Ｃｏｎｎ　Ｇ、、　） ｌａｊｃｈｅｒ　Ｖ、Ｂ、及びＴｈｏｍａｓＫ、Ａ、：ヒト脳誘導酸性線維芽細 胞成長因子の完全アミノ酸配列。

Ｂｉｏｃｈｕｎ、　Ｂｉｏｐｂｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｎｎ、ユ３８．　ｐ 、６１１−６１７．　１９８６）。

塩基性ＦＧＦ及び酸性ＦＧＦは、ヘパリンに対する２つの可能な結合ドメインを 有するが、その一方はＮ　Ｈ２末端付近に、他方はＣ０ＯＨ末端付近に位置する 。両ドメインとも、ヘパリンに対するＦＧＦの強い親和性と関係している（Ｇｏ ｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｘｆＪ、、　Ｎｅｕｌｅｌｄ　Ｇ、及びＳｃｈｗｅｉｇｅ ｒｅｒ　Ｌ、　：線維芽細胞成長因子。

Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｅｎｄｏｃｔｉｎ、　４６　ｐ、　１８７−２０６．　 １９８６　；　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｖｉｃｘ　Ｄ、。

Ｎｅｕｆｅｌｄ　Ｇ、及びＳｃｈｖｅｉｇ！＋ｅｒ　Ｌ、　：線維芽細胞成長因 子の分子的及び生物学的特徴：中胚葉及び神経外胚葉誘導細胞の増殖と分化をも 調節する血管形成因子、　Ｃｅ１１．Ｄｉｌｔｅｒ、、１９　ｐ、１−１７，１ ９８６；Ｂａ１ｒｄ　Ａ、、５ｃｈｕｂｅ＋ｊ　Ｄ、、　Ｌｉｎｇ　Ｎ、、及び Ｇｕｌｌｃｍｉｎ　Ｒ，、塩基性線維芽細胞成長因子のレセプター−及びヘパリ ン−結合ドメイン、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８５ ．　ｐ、２３２４−２３２８．　１９８８）。

ａＦＧＦとｂＦＧＦとの間の高い相同性は、それらが単一祖先の遺伝子に由来す ることを示唆している。近年、ＦＧＦ遺伝子がクローン化され、ｂＦＧＦ及びａ ＦＧＦの両方の相補性ＤＮＡ配列が決定された（Ａｂｒａｈａｍ　Ｊ、Ａ、　Ｗ ｈａｎｇ　Ｊ、Ｌ、　Ｔｕｍｏｌｏ　Ａ、。

Ｍｅｒｇｉａ　Ａ、、　Ｆｒｉ！ｄｍ２ｎ　Ｊ、、　Ｇｏｓｐｏｄａ＋ｏｖｉｃ ｘ　Ｄ、及びＦｉｄｄ！ｓ　Ｊ、Ｃ，：ヒト塩基性線維芽細胞成長因子：ヌクレ オチド配列とゲノム構成、　ＥＭＢＯＪ、、５　ｐ、２５２３−２５２８．１９ ８６；　Ａｂ＋ａｈａｍ　Ｊ、Ａ、、　Ｍｅ＋ｇｉａＡ、、　Ｗｂａｎｇ　Ｊ、 Ｌ、ＴＩＩＩＩＩＯｌＯＡ、、Ｆ＋ｉｅｄｍａｎ　Ｊ、、Ｈｊｅｒｒｉｌｄ　Ｋ 、Ａ、。

Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｘ　Ｄ、及びＦｉｄｄｅｓ　Ｊ、Ｃ１：血管形成タン パク質塩基性線維芽細胞成長因子をコードするウシクローンのヌクレオチド配列 、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３．　ｐ、５４５−５４８．　１９８６；　Ｊａｙｅ 　Ｍ、、　Ｈｏｖｋ　Ｒ，。

Ｂｕｒｇｅｓｓ　Ｇ、Ａ、、　Ｒｉｃｃａ　Ｗ、、　Ｃｈｉｕ　１．Ｍ、、　Ｒ ａｖｅｒａ　Ｍ、Ｗ、、　Ｏ’Ｂ＋１ｅｎＳ、Ｊ、、　Ｍｏｄｉ　Ｗ、Ｓ、、　 Ｍａｅｉａｇ　Ｔ、及びＤｒｏｌｉａｎ　Ｗ、Ｎ、：ヒト内皮細胞成長因子：ク ローニング、ヌクレオチド配列及び染色体上の位置、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３ ．　ｐ、５４１−５４５．　１９８６）。

ヒト及びウシｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列の分析から、塩基性ＦＧＦに 関する一次翻訳物質が１５５個のアミノ酸から成ることが示唆される。しかしな がら、近年、Ｓｕ＋ｍｕらは、ＮＨ２末端に２個の余分なアミノ酸を有する新規 の１５７個のアミノ酸からなる型（１５７アミノ酸型）のヒト塩基性ＦＧＦを単 離した（Ｓｏｍｍｅｒ　Ａ、、Ｂｒｅｗｅｒ　Ｍ、Ｔ、、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ｒ ，Ｃ，、Ｍｏ５ｃａｔｅｌｌｉＤ、、　Ｐｒｅｓｊａ　Ｍ、及びＲｉｆｋｉｎ　 Ｄ、Ｂ、　：伸長されたアミノ末端をもつ型のヒト線維芽細胞成長因子、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ　Ｅｉｏｐｂｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、、　１４４　Ｌ５４３−５５０．　１Ｈ７）。

興味深いことに、これら２つのアミノ酸は、前記のヒトｃＤＮＡクローンにおい て判明したコドンに対応する。第１図は、今日までに単離された、もしくはｃＤ ＮＡ配列により推定された種々の型の塩基性ＦＧＦを要約して示している。第２ 図は、１５５アミノ酸型の一次構造を示す。

上述のように、本発明はヒト塩基性ＦＧＦの分子変形体に関する。これまで天然 で見出されたことのないこれら新規分子物質は、１５５アミノ酸型をコードする 遺伝子の特定部位の突然変異誘発によって得られた。

しかしながら、塩基性ＦＧＦのアミノ末端の微小不均質性とそれが生理学的関係 をもたないこととは、１５５アミノ酸型に関して本発明に開示し且つ記載した変 更が、おそらくは他の型のＦＧＦに関して得られる同一の変更と等しいことを示 す（以下参照）。

発明の背景 すでに指摘した通り、血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、それが充実性 腫瘍（ｓｏｌｉｄ　ｔｕｍｏｒ）の発症に関与する病理学的意味を仮定し得る厳 密に制御された過程である。血管形成におけるｂＦＧＦの重要な役割に顧みて、 一方では生物学的に不活性である、内因性ＦＧＦと競合できるこの分子の変形体 は、抗癌療法における有用な道具となり得る。

一方、新しい毛細血管成長は再生、成長及び発達の基礎となる正常な恒常性機構 を根拠にしている。その結果として、生物学的活性が増大したｂＦＧＦの類似体 は、火傷、創傷（角膜を含む）、及び外科的切開の治癒；褥癒を含む皮膚潰瘍の 治療；損傷組織の血管再生による、心臓発作後の血流再開；並びにある種の骨格 筋損傷の治療のような多くの可能な適用が広範に考えられる。

したがって、本発明の目的は、改変された生物学的活性を有する塩基性ＦＧＦＯ 組換え類似体の設計及び製造である。塩基性ＦＧＦのアミノ酸配列の変化がその 機能特性に影響を及ぼし得ることを理解するために、塩基性ＦＧＦと非常に高い 相同性を有する多数の関連蛋白質を考えることができる。このファミリーの蛋白 質としては、酸性ＦＧＦ、並びに最近発見された２つの腫瘍遺伝子産物であるｈ Ｓｔ及び１ｎｔ−２が挙げられる（Ｙｏｓｂｉｄａ　Ｔ、、　Ｍｉｙａｇ＠ｖａ 　Ｋ、、　Ｏｄｘｇｉ＋ｉ　Ｈ，、Ｓａｋａｍｏｌｏ　Ｈ，、ＬｉＮ１ｅＰ、Ｆ 、Ｒｏ、　Ｔｅｒａｄａ　Ｍ、及びＳｕｇｉｍｕｒａ　Ｔ、：　ｈ　ｓ　ｔのゲ ノム配列、線維芽細胞成長因子に相同なタンパク質をコードする形質転換遺伝子 、およびｉｎ＋−２をコードするタンパク質、　Ｐｒｏｅ、ＮＮｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４　ｐ、７３０５−７３０９．　１９８７　；　 Ｄｅｌｌｉ　Ｂｏｖｉ　Ｐ、。

Ｃｕ＋ａｊｏｌａ　Ａ、Ｍ、、Ｋｃｒｎ　Ｆ、Ｇ、、Ｇｒ！ｃｏ　Ａ、、ｌｔｔ ｍｘｎｎ　Ｍ、及びＢａ５ｉｌｉｃｏ　Ｃ９：カボジ肉腫ＤＮＡのトランスフェ クションにより単離された腫瘍遺伝子はＦＧＦファミリーの一員である成長因子 をコードする。　Ｃａ１ｌ　５０　ｐ、７２９１３７．　１９８７）。

ｂＦＧＦを含むこれらの分子は全て、細胞の成長及び調節に関与する因子のファ ミリーを構成する。これらの蛋白質の一次構造を第３図で比較する。

これらの蛋白質間の相同性を考慮した場合、−次構造中に高度に保存された領域 が観察される。このようなドメインの保存は、これら蛋白質間の構造的相同性の みならず何らかの機能的相同性をも意味する。

事実、これらの蛋白質は全て、ヘパリンに対する強力な親和性を共有しており、 おそらくは腫瘍発症を支持する新しい毛細血管増殖を含むものと思われる血管形 成過程において重要な役割を演じると考えられる。

保存領域がこれらの蛋白質の共通の特性に関与している場合には、非常に多種類 の配列がこれらの因子の異なる生物学的役割を説明し得る。その結果、これらの 領域の何れかにおける変化は、塩基性ＦＧＦの生物学的活性に劇的に影響する。

これらを考慮して、本発明の発明者らは、遺伝子操作技術により、ヒト及びウシ 塩基性ＦＧＦの新規誘導体を構築したが、これらは、ある場合にはｂＦＧＦ分子 の異なる領域内でアミノ酸配列を喪失し、またある場合には特定位置でアミノ酸 置換が生じていた。その改変は、いくつかの公知の成長因子間の相同性及び差異 に従って選択した。突然変異体の分子特性を以下に記す。類似体は、選択された 発現系中で組換え蛋白質として得ることができる。

所望の変化は、適切な生物内での発現に先立って、ｂＦＧＦ遺伝子を遺伝子工学 技術により改変して達成し得る。ｂＦＧＦ遺伝子というのは、ＣＤＮＡライブラ リーからクローニングすることにより、又は合成オリゴヌクレオチドを組合せる ことによって得られるＤＮＡ配列を意味する（Ｍａｎｉｘｊｉｓ　Ｔ、、　Ｆ＋ １ｓｃｂＥ、　Ｆ、及びＳａｍｂ＋ｏｏｋ　］、：分子クローニング／実験室指 針、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａ＋ｂｏｕ＋　ＬａｂｏｒａｔｏＢ、Ｃｏ１ｄ 　ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ、１９８２）。

本発明はまた、ｂＦＧＦ及びその誘導体を製造するための組換えＤＮＡ法にも関 する。

員然変異体の分子特性 本発明においては、「類似体」、「突然変異体」、又は「誘導体」という用語は 、変化したアミノ酸配列を有するｂＦＧＦ分子を意味する。これまでに単離され 且つ緒言に記載されている天然型のｂＦＧＦは全て、等価な類似体を得るために 変えることができる。好ましい類似体は、１５５アミノ酸からなる型の突然変異 体である。ヒト及びウシの配列はともに、本発明において改変された。新規のｂ ＦＧＦ誘導体は、特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発により構築された。

特に、オリゴヌクレオチドは、ヒト及びウシｂＦＧＦ遺伝子内のコード領域の欠 失を引き起こすために、設計し合成された。

突然変異体を得るために用いる突然変異誘発法は、「方法」の項に記載する。

次に、突然変異させた遺伝子を、新規のｂ！ＦＧＦ誘導体の合成に導くことが可 能なＥ、ｃｏｌｉ発現ベクター内に挿入する。次に組換え分子を精製し、特性を 決定し、最後に大量に製造する。

本発明の目的の１つである新規のｂＦＧＦ誘導体については、詳細に後述するが 、第４図にその概略を図示した。アミノ酸番号は１５５アミノ酸型に対応してお り、メチオニンは残基番号１であり、セリンは残基番号１５５である。しかしな がら、記載した全ての型のｂＦＧＦは、同−欠損体を得るために変化させること が可能である。さらに、ウシ型及びヒト型の両方が突然変異体の構築に使用し得 る。好ましいｂＦＧＦ誘導体として以下のものが挙げられる： Ｍｌ−ｂＦＧＦはアミノ酸配列の残基２７〜３２　（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−？ｏ−Ｌ ｙａ−ＡＨ−Ｌｅｕ）を欠いたｂＦＧＦ誘導体である；Ｍ２−ｂＦＧＦはアミノ 酸配列の残基５４〜５８（Ｇ１℃−ＩＴｓ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ）を欠いた ｂＦＧＦ誘導体である；Ｍ３−ｂＦＧＦはアミノ酸配列の残基７０〜７５　（Ｇ Ｉ７−Ｖａｌ−Ｖａｌ−３ｅｒ−ｌｉｅ−Ｌ７ｓ）を欠いたｂＦＧＦ誘導体であ る；Ｍ４−ｂＦＧＦはアミノ酸配列の残基７８−８３　（Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｓ ｎ−Ａ＋ｇ−Ｔｙｒ−Ｌｅａ）を欠いたｂＦＧＦ誘導体である；Ｍ５−ｂＦＧＦ はアミノ酸配列の残基１１０〜１２０　（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−＾ｓｎ−Ｔ ｈｒ−Ｔ７ｒ−Ａｒｇ−５ｅｒ−ＡＢ−Ｌｙｓ−Ｔｙ＋）を欠いたｂＦＧＦ誘導 体である； Ｍ　６　ａ　−ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆはそれぞれ１２８位及び１２９位のりシン及びア ルギニン残基がグルタミン残基によって置換されたｂＦＧＦ誘導体である； Ｍ６ｂ−ｂＦＧＦは１１９位及び１２８位のりシン残基、並びに１１８位及び１ ２９位のアルギニン残基が全てグルタミン残基によって置換されたｂＦＧＦ誘導 体である。

突然変異体の詳細なアミノ酸配列を第５図に示す。

さらに別のアミノ酸残基をＮＨ２末端か又はＣ０ＯＨ末端、あるいはその両方に 付加したポリペプチドは、本発明に含まれるものとする。このような伸長は、組 換えＤＮＡ技術による突然変異体の発現においては、技術的理由のために必要で ある（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　Ｍ、、ｌ１ｌａｔ　Ｓ、、　Ｔｅ５ｓｉｅｒ　Ｌ、Ｈ ，Ｂｅｎａｖｅｎｔｅ　Ａ、及びＣｒｙｓｔａｌ　Ｒ，Ｇ、　：気層及び血栓症 の治療を可能とするアルファル（ａｌｌａｌ　）−抗トリプシン変形体の、Ｅ、 　ｃｏｌｉ内での合成。

タンパク質分解によるβ−グロビンの生成、　ＮａＬｏｒｅ、３０９．　ｐ。

８１０−８１２．　１９８４）。

或いは、さらに別の残基を用いて、例えば血漿中の突然変異体の循環半減期を延 長することにより、突然変異体の薬理学的効能を増強してもよい。

突然変異体製造のために開発された手法の詳細新規のｂＦＧＦ誘導体を効率よく 製造するために、異なる分子の生物学的及び臨床的評価のための必要量の、実験 室及びパイロットスケールでの製剤を供給する組換えＤＮＡ法を開発した。

この手法は、遺伝子工学技術により高レベルで突然変異遺伝る。

製造方法の詳細を以下に示す： １）ｂＦＧＦ用の合成りＮＡ配列の構築野生型塩基性ＦＧＦ及びその誘導体の発 現のために用いた配列は全て合成により構築した。これは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏＢＮｅｍＩｎｃ、　３８０Ｂモデルのような自動ＤＮＡシンセサイザー上で 重複配列をもつオリゴヌクレオチドを合成することにより行った（Ｃａｕｔｈｅ ｒｘ　Ｍ、Ｈｌ：遺伝子合成機、ＤＮＡ化学とその用途。

５ｃｉｅｎｃｅ、２３０．　ｐ、２８１−２８５．１９８５）。

重複しているオリゴヌクレオチドを結合させて二本鎖ＤＮＡを形成し、そのギャ ップをＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４リガーゼを用いて充填した。

センス鎖内のＦＧＦコード配列の５′に直ちに、ＡＴＧ開始信号が付加された。

１５５アミノ酸型のｂＦＧＦの場合、最初の残基として自然に生起しているメチ オニンをコードするＡＴＧを開始コドンとして用い得ることができるので、発現 されるポリペプチドのＮ末端に余分のアミノ酸を付加することはない（Ａｂｒａ ｈａｍ　Ｊ、Ａ、、　Ｗｈａｎｇ　］、Ｌ、、　Ｔｕ＋ｎｏｌｏ　Ａ、、　Ｍｅ ｒｇｉａ　Ａ、、ＦｒｉｅｄｍａｎＬ、　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｘ　Ｄ、及 びＦｉ＋１ｌｅｓ　］、Ｃ，：ヒト塩基性線維芽細胞成長因子：ヌクレオチド配 列とゲノム構成、　ＥＭＢＯＪ、、５゜Ｌ２５２３−２５２８．　１９８６；　 Ａｂｒａｈａｍ　Ｊ、Ａ、、　Ｍｅｒｇｉａ　Ａ、、　Ｗｈａｎｇ　］、Ｌ、。

ＴｕｍｏｌＯ＾、、　Ｆｒｉｃｄｍａｎ　Ｊ、、　ＨｊｅｕｉＭ　Ｋ、Ａ、、　 Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｅｘ　Ｄ。

及びＦｉｄｄｅｓ　Ｊ、Ｃ，：血管形成タンパク質塩基性線維芽細胞成長因子を コードするウシクローンのヌクレオチド配列、５ｃｉｅｎｃｅの蛋白質の一次構 造を変えることなく、その５′一端配列を変えた。さらに、ヌクレオチド配列を 、第６図に示すと同様に数本発明に記載の突然変異体を得るために、野生型ｂＦ ＧＦ配列を変えて所望の欠失を達成した。これは、特定部位の突然変異誘発によ り遺伝子を改変して達成した（Ｎｏ＋＋ｉｓ　Ｋ、、　ｈｕｉｓＦ、、　Ｃｈｒ ｉｓｔｉａｎｓｅｎ　Ｌ、及びＦｉｉｌ　Ｎ、：　２個のプライマーの同時使用 による効率的な特定部位の突然変異誘発、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓｅ ａｒｃｈ、１１．　５１［−５１１２，１９８３）。

この方法の原理は、ファージベクターＭ１３のような、一本鎖型で得ることがで きるベクター中にｂＦＧＦ遺伝子をサブクローン化することである。組換え一本 鎖を、所望の変形体をコードする相補的合成オリゴデオキシリボヌクレオチドで アニールする。次にＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼを用いて新しい鎖を伸長し 、それを環状型に連結する。新に作製されたヘテロ二重鎮ＤＮＡを用いて、子孫 を複製し、産生じ得る細胞系を形質転換するが、この場合、野生型遺伝子又は所 望の欠失を有する遺伝子を保持するファージは２つの異なる分子種に分離する。

次に、出発突然変異誘発性オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて突然変異 遺伝子を認識することができる。特定部位の突然変異誘発法は、「方法」の項に 詳細に記載する。

特に、択一的にウシ又はヒト野生型ｂＦＧＦに対する合成配列をＭ１３ベクター 内に挿入し、得られた一本鎖を突然変異誘発鋳型として用いた（ｈｕｉｓ　Ｋ、 、　Ｎｏ＋山Ｆ、、　Ｃｈ山ｊｉａｎｕｎ　Ｌ。

及びＦｉｉｌ　Ｎ、：　２個のプラマーの同時使用による効率的な特定部位の突 然変異誘発、　Ｎｕ山ｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａ＋ｃｈ、１１，５１０３−５ １１２゜配列を発現させるために、これらの配列を、新規遺伝子の転写及び翻訳 に関与する配列を保有する発現プラスミドに挿入した。

より詳しくは、調節シグナルとして、Ｅ、ｃｏｌｉのドリフトファンプロモータ ー及びラムダＣ■蛋白質のリポソーム結合部位領域を用いた（ＨｅｎＪｒｉｘ　 Ｒ，Ｗ、、　Ｒｏｂｅ山Ｊ、Ｗ、、　５ｔａｂｌ　Ｆ、Ｗ、及びＷｃ１ｓｂｅＢ 　ＲｌＡ、ニラムダＩＩ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉＢ　Ｈａｒｂｏｕｒ、　Ｎ、Ｙ、　１９８３）。

プロモーターＰｔｒｐは、市販のプラスミドｐ　Ｄ　Ｒ７２０（Ｐｈａ＋ｍａｃ ｉａ）から得られた。Ｓｈｉｎｃ−Ｄａｌｇａｒｎｏ　ＣＩＩ配列は、公表され た配列に従って化学合成により得られた（Ｈｃｎ＋ｌ＋ｉｘ　Ｒ，Ｗ、。

Ｒｏｂｅｒｔｓ　Ｊ、Ｗ、、　５ｔａｈｌ　Ｆ、Ｗ、、及びＷｅｉｓｂｅｒｇ　 Ｒ，Ａ、ニラムダ■。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｊ＋ｕｙ、Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ、　Ｎ、Ｙ。

１９８３）。

野生型ｂＦＧＦ及びその誘導体用の典型的な発現ベクターを第７図に示す。より 詳しくは、それは、以下の断片を組合せて構築した： ａ）プラスミドｐＤｓ２０の大きなＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片（ＤｕｅＮｅｒ 　Ｇ、、Ｅｌｆｏ＋ｄ　Ｒ，Ｍ、及びＨｏｌｍｅｓ　Ｗ、Ｎ、：　ｇ　ａ　１− ｔｃ遺伝子への大腸菌ロイシルトランスファーＲＮＡ−Ｉプロモーターの融合／ 増殖速度依存性制御に必要な配列の分析、　Ｃｅ１ｆ　３０．　ｐ、８５５−９ ６４．　１９８２）　；ｂ））リプトフアンプロモーターを保持する、プラスミ ドｐＤＲ？２０　（Ｐｈｕｍａｃｉａ、スウェーデン）から得られるＥ　Ｃ０Ｒ Ｉ−３ｌｌＩ断片； ｃ）ｃＩＩリポソーム結合部位をコードする合成５ａｌＩ　−ＮｄｅＩオリゴヌ クレオチド； ｄ）ｂＦＧＦ及びその誘導体に対する野生型配列又は突然変異配列を保持する合 成Ｎｄ！Ｉ　−ＸｈｏｌＩ　（ＢａｍＨＩ−適合性）断片。

野生型ｂＦＧＦに対する好ましい配列を第６図に示す。ｂＦＧＦ類似体に対する 好ましい配列は、第５図に示した突然変異に従ってこの配列を改変したものであ る。

新規遺伝子の発現誘発、及び得られた組換え蛋白質の分析は、「方法」の項に記 載したようにして実施した。

４）組換え分子の精製及び生物学的アッセイ組換え突然変異体は、細菌溶解物か ら精製し、野生型ｂＦＧＦと比較してそれらの生物学的特性を調べることができ る。

典型的な精製方法は以下の通りである：細胞を超音波処理により破砕し、遠心分 離して、その上清をイオン交換Ｓ−セファロースカラムに載せる。蛋白質を塩化 ナトリウム勾配により溶出し、直接、ヘパリンーセファロースアフイニテイカラ ムに載せる。

蛋白質を塩化ナトリウム勾配により溶出し、ゲル濾過により脱塩し、凍結乾燥す る。精製類似体を、引き続いて、その生物学的活性に関して調べることができる 。

突然変異体の性質、その用途及び投与 本発明の新規分子は、野生型ｂＦＧＦ分子の拮抗薬及び／又は超作働薬として作 用し得る。

ｂＦＧＦ作働活性は、例えば？ｅｓｌａら（Ｍｏｌｐｃｕｌａｒ　ａｎｄＣｅｌ １℃ｆａｒ　Ｂｉｏｌ、６．　ｐ、４０６０．　１９８６）が記載したものと類 似の試験手順に従って、内皮細胞の増殖を増大させる能力に基づいて評価された 。ｂＦＧＦ拮抗活性は、例えばＢａ１ｅｄら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

ＡｃａＬＳｃｉ、ＵＳＡ、８５．　Ｌ２３２４．　１９８８）が記載したものと 類似の試験手順に従って、　１−ｂＦＧＦの結合阻害に基づいて評価された。

したがって、例えば略号Ｍ６ｂとして識別される本発明の化合物は、１　ｎｇ／ 　ｍｌの用量で内皮細胞増殖を５０％増大させることが判明したが、これは特に かなりのｂＦＧＦ作働活性を示す。

さらに、例えばＭ３−ｂＦＧＦ及びＭ５ａとして識別される本発明の化合物は、 ３０［１ｎｇ／ｍｌの突然変異体の存在下で、それぞれ約２０％及び約７０％の １２５１−　ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（３ｎｇ／　ｍｌ）結合阻害を生じさせることが 判明したが、これはｂＦＧＦ拮抗活性を示す。

ｂＦＧＦ超作働薬として、本発明の化合物は、血管形成、細胞成長、又は細胞生 存のプロモーターとして作用し得るし、したがって、例えば、組織修復、例えば 虚血及び心筋梗塞の間の組織修復を含む、創傷、火傷、骨折、外科的剥離、潰瘍 の治癒に適用できる。

ｂＦＧＦの拮抗薬として、本発明の化合物は血管形成阻害剤として作用し、した がって、血管新生が主因である疾患、例えば眼の網膜症；血管新生緑内障；例え ば乾痒、慢性炎症のような皮膚疾患；リュウマチ性関節炎の治療に、並びに既に 前記したように、ある種の腫瘍、特に血管形成新生物の治療に腫瘍性血管形成を 阻害するための有用な道具として用いてもよい。

本発明の化合物は、１種以上の医薬上許容可能な担体及び／又は希釈剤と組み合 わせて医薬組成物を形成して、ヒトを含む哺乳動物に投与し得る。

活性物質の必要投与量は、治療を受ける患者の年齢、体重、及び症状に応じて、 並びに投与経路、及び所望の治療の継続期間に応じて変わる。

例えば局所適用、点眼、経口投与、静注、皮下投与、又は筋注される医薬組成物 は、慣用の賦形剤を用いて、慣用的方法で製造し得る。例えばクリーム、ローシ ョン、又はペーストのような局所適用のための組成物は、例えば活性成分を慣用 の油性又は乳状化賦形剤と混合して製造することができる。局所適用ローション は、例えば１０■／　ｍｌ−１００■／　ｍｌの活性物質を含有してもよく、作 用部位に１日７回まで適用し得る。

緩衝液又は生理的食塩水、あるいはその他の適当な賦形剤に溶解した処方物は、 点眼用処方物として適している。

例えば錠剤又はカプセルのような経口投与用処方物は、活性化合物とともに、希 釈剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーン スターチ又はジャガイモデンプン；研磨剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン 酸、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、及び／又はポ リエチレングリコール；結合剤、例えばデンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メ チルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン；分解 剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギン酸塩又はナトリウムスターチグリコ レート；起泡混合物；染料；甘味料；レシチン、ポリソルベート、ラウリスルフ ェートのような湿潤剤；並びに一般に、医薬処方物中に用いられる無毒性及び薬 理学的に不活性な物質を含有してもよい。上記の医薬製剤は、例えば混合、顆粒 化、錠剤化、糖衣化又は薄膜被覆法のような公知の方法で製造してもよい。

筋注用の懸濁液又は溶液は、活性成分とともに、医薬上許容可能な担体、例えば 滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、例えばプロピレングリコールのような グリコール、及び所望により、適量の塩酸リドカインを含有してもよい。

静注又は注入用溶液は、担体として、例えば滅菌水を含有してもよいし、好まし くは、滅菌、水性、等張の食塩水溶液の形態であってもよい。

本発明の化合物は、医薬上許容可能な塩又は錯体の形態で投与してもよい。塩の 具体例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸及び燐酸のような無機酸、並びにマレイン酸 、クエン酸、酢酸、安息香酸、コハク酸、アスコルビン酸及び酒石酸のような有 機酸を用いた酸付加塩である。

錯体の具体例としては、例えば亜鉛又は鉄錯体がある。

自動ＤＮＡシンセサイザーＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｊｅｍ　３ＨＢモデル 上で重複配列（ｏｖｃｒｌａｐｐｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）を用いてオリゴ ヌクレオチドを合成することにより、合成りＮＡ断片を得た。断片をＭ１３ベク ター中にサブクローニングした後、？デオキシ法によりヌクレオチド配列を決定 した（Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｎＢｍｏｌ。

１０１、　ｐ、２０〜１８．　１９８３）。

制限酵素、リガーゼ及びポリメラーゼは、メーカーの指示通（Ｍａｎｉａｔｉｓ 　Ｔ、、　Ｆｒ１ｓｅｈ　Ｅ、Ｆ、及びＳａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、：分子クローニ ング／実験室指針、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒ７．　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ　１９Ｈ）。

２）突然変異誘発 ヒト又はウシ型の野生型ｂＦＧＦに対する合成配列を、Ｍ＋３ファージベクター 中でサブクローン化した。一本鎖型の組換えファージベクターを、公表された方 法に従って増殖させた（ＭｅｓｓｉＢ　Ｌ　：Ｍ！ｊｂｏｄｓ　Ｅｎｒｙｍｏｌ 、　１０１．　ｐ、２０〜７１１．１９８３）。

これらのＭ１３一本鎮ＤＮＡ５２ＯＢを１０ｍＭ　）リス−ＨｃｕｐＨ７、５， ０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０ｍＭ　ＮａＧ２中で９５℃で５分間加熱し、段階的 に室温まで冷却して好都合なオリゴヌクレオチドにアニールした。引き続いて、 以下の成分：最終濃度０．４ｍＭとなるようにＡＴＰを；　０．１２ｍＭとなる ようにｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを；　ｒＪ、　０４ｍＭとなるようにｄＡ ＴＰを；　Ｅ、　ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片１単位及び Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ０．５単位（Ｂｏｅｂｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ） を加えた。最終容量は、３５ｍＭ　’ｐリスーＨＣｊ！　ＰＨ７，５，０，１ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ　、　６ｄ　ＭｇＣＲ２、（１，００６ｍＭ　ＤＴＴ中５中成０成 った。　３５ｍＭ　１５℃で１２時間インキュベーションした後、１０１細胞を トランスフェクションした（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、、　Ｆｒ１ｓｃｈＥ、　Ｆ 、及びＳａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ、：分子クローニング／実験室指針、　ＣｏｌｄＳ ｐｒｉｎｇ　Ｈｉｒｂｏ℃＋　ＬａｂｏｒｘｌｏＢ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ　１９８２）。

所望の突然変異を誘発するために用いられるオリゴヌクレオチドを、１０ｍＭ　 Ｍｇ０２２．５ｍＭ　ＤＴＴ及び１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有する７０ｍＭ　トリス−ＨＣｊ ！緩衝液ｐｉ（８に溶解した１５［１μＣｉ　（γ−３２Ｐ）　ＡＴＰ（Ｎ２ｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　ｈｃｌｃｘｒ、　６０００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の反応混合液 ５０成を用いて３７℃で３０分間インキュベーションして、放射標識した。次に 、標識オリゴヌクレオチドを用いて、突然変異誘発されるファージＤＮＡ５とプ ラークハイブリダイゼーションを行なった。

ハイブリダイゼーションは、３ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ。

１０Ｘ　Ｄｅｎｂａｒｄｊ及び０．２ｍｇ　／　ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有 する１０ｍＭ）リス−ＨＣｊ！　ｐＨ８中で６５℃で一晩進行させた。ニトロセ ルロースフィルターを、０．４ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中で６５℃で３０分間 洗浄するといくつかの変化が認められたが、これを−晩、Ｘ線フィルムに感光し た。陽性ハイブリダイゼーションを示すプラークは、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｍ１３ シーケンシングキットを用いて、Ｓａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド配列決定 のために選択した。

３）遺伝子発現の誘発及び分析 テトラサイクリン（３Ｒ／　ｍｌ　）を含むＬｕｒｉｘブロスを用いて、プラス ミド保持細胞を増殖させた。０．４％グルコース、０．４％カザミノ酸、及び１ ０■／ｍｌチアミンを補充したＭ９培地を用いて、トリプトファンプロモーター 存在下で遺伝子発現を誘発した。

トリプトファンを含まないＭ９倍地中で６時間増殖した後、遠心分離により細胞 を採取した。細菌培養物のアリコートをペレット化し、サンプルを入れた緩衝液 と一緒にして再懸濁し、Ｌａｅｍｍｌｉ　（Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｕ、に、　：バク テリオファージＴ４頭部のアッセンブリー間の構造タンパク質の開裂、Ｎａｔｕ ｒｅ　２２７．　Ｌ　６８０−６８５、　１９７０）に従って５ＤＳ−ＰＡＧＥ により分析した。

或いは、細胞をリゾチームを用いて、又は超音波処理により破壊し、遠心分離に より分離した可溶性画分及び不溶性画分を別々に分析した。電気泳動後、ゲルを Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルーで処理し全細胞蛋白質を染色した。

ｂＦＧＦ由来の配列を有する合成ペプチドに対するポリクローナルウサギ抗血清 で、ウェスタンブロッティングをプローブした。第二抗体としてビオチニル化ヤ ギ抗ウサギＩｇＧを含有するＶｅｃｌａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ＋ｉｃｔ、米国カリフォルニア州）は、メーカーの指示通 りに用いた。

図面の説明 第１図：これまでに単離された異なる天然型塩基性ＦＧＦの概略図。１５５アミ ノ酸型はｃＤＮＡヌクレオチド配列から推定された。

第２図：ヒト及びウシＦＧＦのアミノ酸配列を示す。２つの配列は１２１位及び １３７位で異なっている。ウシ型に対応するアミノ酸は下側の残基で示される。

第３図：この図面は既に公表済みである（Ｙｏｓｈｉｄａ　Ｔ、、　Ｍｉ７ａｇ ａＫ、、　Ｏｄａｇｉｒｉ　Ｈ，、Ｓａｋａｍｏｊｏ　Ｈ，、Ｌｉ目Ｉｅ　Ｐ、 　Ｆ、　Ｒ，、Ｔｅ＋ａｄａＭ、及びＳｕｇｉｍｕｒａ　Ｔ、：　ｈｓｊのゲノ ム配列、線維芽細胞成長因子に相同なタンパク質をコードする形質転換遺伝子、 及び１ｎｔ−２をコードするタンパク質、ＰＩＯＣｏｈｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、υＳＡ　８４　ｐ、７３０５−７３０９．　１９！１７）　。

ｈＳｔ蛋白質、ヒト塩基性ＦＧＦ　（ｈｂＦＧＦ）　、ヒト酸性ＦＧＦ　（ｈａ ＦＧＦ）　、及びマウス１ｎｔ−２蛋白質の全アミノ酸配列を並べ、比較してい る。ダッシュは最適配列のために挿入されるギャップを示す。ｈａｔ配列と等し い残基をボ・ンクスで囲んでいる。配列上の数字はｈｓｔ残基についてのもので ある。

第４図：塩基性ＦＧＦ誘導体の概略図。数字は１５５アミノ酸からなる型につい てのものである。黒く塗りつぶした領域は欠損アミノ酸配列を示す。黒点は単一 アミノ酸の置換を示す。

第５図：ヒトｂＦＧＦ及びその突然変異体の全アミノ酸配列を示す。ダッシュは 欠損アミノ酸を示す。星印は単一アミノ酸の置換を示す。

第６図：ヒト及びウシｂＦＧＦのヌクレオチド配列。この配列を合成により再構 築し、ｂＦＧＦ発現に用いた。星印で示した最初の２０個のアミノ酸に対するコ ドンは、対応するアミノ酸残基を変えずに改変された。ウシ配列において異なる ２つのアミノ酸をコードするコドンは下側に示した。

第７図：ｐＤＳ２εは、ｂＦＧＦ発現プラスミドの構築に用いられた通常のプラ スミドバックグラウンドを示す。ｇａｌ　Ｋ遺伝子のｂＦＧＦ遺伝子による置換 、並びにファージラムダからの発現信号Ｐｔｒｐ及びＳｈｉｎｅ−Ｉ）ａ１ｇａ ｒｎｏ配列ｒｃＩＩＪの挿入によりｐＦｃ８０を構築する。

考察及び結論 本発明は、塩基性ＦＧＦの新規の分子誘導体の単離ｊこ関する。

参照の塩基性ＦＧＦ分子は、ヒト又はウシ起源のものである。

組換えＤＮＡ技術によって得られるこれらの新規誘導体（ま、１５５アミノ酸型 のｂＦＧＦの欠損又は置換突然変異体である。

分の長さである異なる型として単離し得ること力く文献から公知である。特に＋ ２６アミノ酸型と同程度に短う）！、）ｂＦＧＦ、又（よ／１５７アミノ酸型と 同程度に長いｂＦＧＦは同等１こ活性であると思われる。

本発明の発明者らは、この異質のＮＨ２末端ドメインと（よ明らかに異なるｂＦ ＧＦ分子の領域で突然変異を起こした。本発明者らは、例えば１５５アミノ酸か らなる型を用（また。した力（つて、本発明の目的を示す改変は、ｂＦＧＦＯ別 の型、例え（ｆ１２６〜１５７アミノ酸からなる型のもので行うこともできる。

前述の通り、本発明の新規分子は、野生型ｂＦＧＦ分子の拮抗薬及び／又は超過 作動薬として作用し得る。前記既述の通り、ｂＦＧＦの拮抗薬は、特に、腫瘍性 血管形成阻害のための有用な道具である。ｂＦＧＦの超作働薬は、天然型の配夕 １］（こ比して、改良された薬理学的性質を示す。

本発明の化合物の生物学的活性の評価により、ｂＦＧＦの生物学的及び生化学的 性質に関して特に重要であると思われるｂＦＧＦ分子のいくつかの領域を区別す ることができた。

このような領域、特に誘導体Ｍｌ−ｂＦＧＦＳＭ２−ｂＦＧＦ及びＭ３−ｂＦＧ Ｆにおいて欠損している領域の確認は、同一領域におけるさらなる突然変異（置 換、欠損又は修飾）が治療上改良されたｂＦＧＦ誘導体を生じ得ることを示唆す る。

本発明は、これらのさらなる突然変異もその範囲内に含む。

上記の通り、本発明はまた、これらの新規分子物質の製造のための組換えＤＮＡ 法に関する。興味深いことに、この方法は、野生型ｂＦＧＦの製造にも首尾よく 適用できる。さらに、これらの考察は全て、ヒト及びウシ塩基性ＦＧＦ配列に対 して妥当である。

本発明の本文中に開示される組換えＤＮＡ法は、所望のＦＧＦ分子をコードする 遺伝子を保有するプラスミドＤＮＡで形質転換されたＥ、ｃｏｌｉ細菌株に基づ くものである。もちろん、本発明の発明者らは、他の組換えＤＮＡ法が既に開示 され、公表されているという事実を知っている（１ｗａｎｅ　Ｍ、、Ｋｕｒｏｋ ａｖａ　Ｔ、。

５ａｓａｄａ　Ｒ，、５ｅｎｏ　Ｍ、、　Ｎａｋａｇ２＋ｒａ　Ｓ、及びＩｇｕ ｘｓｂｉ　Ｋ、　：ヒト塩基性線維芽細胞成長因子をコードするｃＤＮＡのＥ、 ｃｏｌｉ内での発現、　Ｂｉｏｃｂｅｍ、Ｂｉｏｐｂｉｓ、Ｒｅｃ、Ｃｏｍｍｕ ｎ、１４６　ｐ、４Ｎ−４７７，１Ｈ７）。

しかしながら、本明細書に記載の手法は、以前に記載されたことのない組換えｂ ＦＧＦの新規性及び収量に特徴を示す。

この手法の主な特徴の１つは、塩基性ＦＧＦの製造のための宿主として使用する Ｅ、ｃｏｌｉ株の種類にある。実際、株の種類がＥ、ｃｏｌｉ内での異種遺伝子 発現に影響を及ぼす主要なバラメーの１つであることは公知である（Ｈａ＋ｒｉ ｓ　Ｔ、　］、　Ｒ，とＥｍｌａＢＬ、Ｓ、　：　Ｅ、ｃｏｌｉ内での異種遺伝 子の発現、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｃｇｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　３．　ｐ、　２８ −３１＋　１９Ｈ）。

本発明によれば、Ｂ型のＥ、ｃｏｌｉ株が、組換えｂＦＧＦ及びｂＦＧＦ誘導体 の産生のための非常に有効な宿主であることが判明している。事実、他のＥ、ｃ ｏｌｉ株（Ｋ　−１２型、Ｃ型等）に挿入した場合、同−ｂＦＧＦ発現ベクター は同量のｂＦＧＦを産生じない。

本手法の第２の特徴は、異なるｂＦＧＦ分子をコードする遺伝子内にいくつかの 、「最適なコドン」を導入することである。

本発明者らは、実際、発現レベルを増大するためには、同一アミノ酸配列を保持 しながら一定数のＤＮＡコドンを改変する必要があることを見出した。好ましい ＤＮＡコード配列は、本発明の明細書中に開示されている（第６図参照）。

これらの２つの特徴、即ち宿主として用いる株の種類と最適コドンは、ｂＦＧＦ 及びその突然変異体の製造のための木組換えＤＮＡ法の新規性の態様を構成する 。塩基性ＦＧＦに適用されるこれら２つの態様は、今日まで科学文献には記載も 公表もされていない。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ’Ｓｅｒ ＦＩＧ　、３ ＦＩ　Ｇ　、　４ ＮＨ２［００ＨＭ３−ｂＦＧＦ ）ＪＨ２Ｃ０ＯＨＭ４−ｂＦＧＦ Ｇｌｎ　１２８，１２９ Ｎ）１２　・・　Ｃ０ＯＨＭ６ａ−ｂＦＧＦＧｌｎ　１１８，１１９，１２Ｊ１ ２９１ＪＨ２・・・・　Ｃ０ＯＨＭ６ｂ−ｂＦＧＦＦＩＧ、６ ＧＡ（ＧＧＴ　ＧｃＴ　Ｔ（Ｔ　ＧＧＴ　ＧＣＴ　ｎ［：　（ＣＧ　ＣＣＣＧＧ ［ＣＡ〔ｎｃ　ＡＡ（ｉ　ＧＡＣｆｃｃ　ＭＧ　Ｃ６Ｇ　（ＴＧ　ＴＡＣＴＧＣ ＡＡＡ　ＡＡＣＧＧＧ　ＧＧＣＴＴＣＴＴ［ＣＴ（ｉ　（（ｉｃＡＴ（ＣＡＣＣ ＴＣＧＡＣＧＧＣ［：ＧＡ　ＧＴＴ　ＧＡＣＧＧＧ　ＧＴＣＣＧＧ　ＧＡＧ　Ａ ＡＧ　ＡＧ（ＧＡＣＣＣＴ　ＣＡＣＡＴ（ＡＡＧ　（ＴＡ　ＣＡＡ　Ｃｎ　［Ａ Ａ　（ｉｃＡ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＧＣＩＡＧｎ　ＧＴＧ　ＴＣＴ　ＡＴ ＣＡＭ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＡＡＣＣＧＴ　ＴＡ（（ＴＧ　ＧＣ ＴＡＴＧ　ＡＡＧ　（ｌＡＡ　ＧＡＴ　Ｇ（ｉＡ　ＡＧＡ　ＴＴＡ　ＣＴＧ　Ｇ ＣＴ　ＴＣＴ　黒　Ｔ（ｉＴ　（ｉＴＴ　ＭＧ（ＬＡＴ　ＩＩＪ（ｉ　Ｔ［ｌＴ 　ＴＴＣｍ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　［ＧＡ　ＴＴＧ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＡＡＴ　ＡＡ ＣＴＭ（（Ｔ　［）ＧＩＪ　［ＡＧ　ＡＡＡ　ＧＣＴ　ＡＴＡ　ＣＴＴ　ＴＴＴ 　ＣＴＴ　ＣＣＡ　ＡＴＧ　ＴＣＴ　Ｇ〔Ｔ　ＡＡＧＧＣ ＦＩＧ、７ 手続補正書動式） ％式％ ２、発明の名称　ヒト／ウシ塩基性線維芽細胞成長因子の新規誘導体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名　称　ファルミタリア・カル口・エルバ・エッセーエルレ・エルレ ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正命令の 日付　平成３年１月２２日６、補正により増加する請求項の数　な　しｍ暗調査 報告 １＋ｕｅｆｆｉ＋１１６１１ａｌ＾ｔｅｍｊｌｌ・１１−・ＰＣＴ／ＥＰε９１ ０１０７５

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．アミノ酸残基２７〜３２（【配列があります】）の欠損を特徴とするヒト又 はウシ塩基性線維芽細胞成長因子誘導体であって、上記アミノ酸残基の数字がヒ ト又はウシ塩基性ＦＧＦの１５５アミノ酸型に対応する誘導体。
2. ２．アミノ酸残基５４〜５８（【配列があります】）の欠損を特徴とするヒト又 はウシ塩基性線維芽細胞成長因子誘導体であって、上記アミノ酸残基の数字がヒ ト又はウシ塩基性ＦＧＦの１５５アミノ酸型に対応する誘導体。
3. ３．アミノ酸残基７０〜７５【配列があります】の欠損を特徴とするヒト又はウ シ塩基性線維芽細胞成長因子誘導体であって、上記アミノ酸残基の数字がヒト又 はウシ塩基性ＦＧＦの１５５アミノ酸型に対応する誘導体。
4. ４．アミノ酸残基７８〜８３（【配列があります】）の欠損を特徴とするヒト又 はウシ塩基性線維芽細胞成長因子誘導体であってる、上記アミノ酸残基の数字が ヒト又はウシ塩基性ＦＧＦの１５５アミノ酸型に対応す誘導体。
5. ５．アミノ酸残基１１０〜１２０（【配列があります】）の欠損を特徴とするヒ ト又はウシ塩基 性線維芽細胞成長因子誘導体であって、上記アミノ酸残基の数字がヒト又はウシ 塩基性ＦＧＦの１５５アミノ酸型に対応する誘導体。
6. ６．アミノ酸残基１２８（Ｌｙｓ）及び１２９（Ａｒｇ）をグルタミン（Ｇｌｎ ）残基で置換することを特徴とするヒト又はウシ塩基性線維芽細胞成長因子誘導 体であって、上記アミノ酸残基の数字がヒト又はウシ塩基性ＦＧＦの１５５アミ ノ酸型に対応する誘導体。
7. ７．アミノ酸残基１１８（Ａｒｇ）及び１１９（Ｌｙｓ）、１２８（Ｌｙｓ）及 び１２９（Ａｒｇ）の全てをグルタミン（Ｇｌｎ）残基で置換することを特徴と するヒト又はウシ塩基性線維芽細胞成長因子誘導体であって、上記アミノ酸残基 の数字がヒト又はウシ塩基性ＦＧＦの１５５アミノ酸型に対応する誘導体。
8. ８．請求項１〜７のいずれか一項に記載の突然変異を有するヒト又はウシｂＦＧ Ｆの任意の他の天然型から成るヒト又はウシ塩基性線維芽細胞成長因子誘導体。
9. ９．ＮＨ２及び／又はＣＯＯＨ末端に付加アミノ酸残基をさらに包含する請求項 １〜８のいずれか一項に記載のｂＦＧＦ誘導体。
10. １０．グリコシド側鎖を有するか又は有さない請求項１〜９のいずれか一項に記 載のｂＦＧＦ誘導体。
11. １１．ｂＦＧＦ超作働薬として使用するための請求項１〜１０のいずれか一項に 記載のｂＦＧＦ誘導体。
12. １２．ｂＦＧＦ拮抗薬として使用するための請求項１〜１１のいずれか一項に記 載のｂＦＧＦ誘導体。
13. １３．腫瘍血管形成を阻害するための請求項１２記載のｂＦＧＦ誘導体。
14. １４．請求項１〜１０ののいずれか一項に記載の塩基性線維芽細胞成長因子誘導 体の製造のための組換えＤＮＡ法。
15. １５．天然の又は改変されたヒト又はウシｂＦＧＦアミノ酸配列をコードするゲ ノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成遺伝子もしくは改変された遺伝子を発現するために 使用する発現プラスミドｐＦＣ８０。
16. １６．抗生物質又は任意の他の選択可能マーカーに対する耐性を授ける少なくと も１つの遺伝子を含む請求項１５記載の発現プラスミド。
17. １７．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の誘導体をコードする遺伝子を発現 するために用いる請求項１５又は請求項１６記載の発現プラスミド。
18. １８．ヒト又はウシｂＦＧＦの組換え誘導体の製造のためのＢ型Ｅ．ｃｏｌｉ株 の使用。
19. １９．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え誘導体の製造のためのＢ型 Ｅ．ｃｏｌｉ株の使用。
20. ２０．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の誘導体の製造のための、請求項１ ５又は１６に記載のプラスミドの使用、並びにＢ型Ｅ．ｃｏｌｉ株の使用。
21. ２１．第６図に示すと同様の配列をコードするＤＮＡ。
22. ２２．組換えヒト又はウシｂＦＧＦの製造のための、Ｂ型Ｅｃｏｌｉ株と第６図 に示すと同様のＤＮＡ配列との組合わせ使用。
23. ２３．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え誘導体の製造のための、Ｂ 型Ｅ．ｃｏｌｉ株と第６図に示したと同様のＤＮＡ配列との組合わせ使用。