JPH03501856A - 新規なソマトトロピン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なソマトトロピン この発明はソマトトロピン（成長ホルモン）に間し、特に安定性が高められたソ マトトロピンの変異体に関する。

１且立１１ ソマトトロピンは動物により産生されるタンパク質（以下、タンパクという）で あって、動物の成長への効果のゆえに一般に「成長ホルモン」と称されている。

歴史的には、成長ホルモン（ソマトトロピン）は脳下蚕体抽出物から回収され精 製されてきた。今では、組換えＤＮＡ技術の出現に伴いソマトトロピンは他の天 然起源のクンバク質がいかほどの量も混ざらずに産生できる。

ンは一般にホストセルのサイトプラスム中の不溶性の耐菌性体中に蓄積する。こ のソマトトロピンを活性な状態で回収するには、そのクンバクを可溶化し、折畳 み（ｆｏｌｄ）、酸化してその天然の形態にするという、再生が必要である。

再生プロセスの例はヨーロッパ特許（以下、ＥＰという）出願公開１１４．５０ ６Ａ及び１９２．６２９Ａ号に詳細に記載されている。これらのプロセス及び続 く精製プロセスは通常高いｐＨで実施される。ソマトトロピンこれらの条件では 不安定また温度が、４℃（通常のプロセス温度）より悪（なことがある室温に依 存することであるが、もし安定性の間層がなければ、室温操作は処理の観点から は好ましい。

今回、これらの条件下におけるソマトトロピンの２つの主な分解生成物が以下の （１）、（２）であることが分った。

（１）タンパク鎖の中程（９５−１０１位（ｐｏｓ　ｉ　ｔ　ｉ　ｏｎ））に位 置するアスパラギンから形成されるベータ結合アスパラギン酸を伴ったソマトト ロピンの異（ｉｓｏ）型（ｆｏｒｍ（２）そのタンパクの中程、即ち９５−１０ １位に位置するアスパラギンで起こるポリペプチド鎖の切断に起因する分子の２ 本鎖型、である。

切断はこのアスパラギンがスクシニミジルモイエテイに転換した結果である。こ れらのフオームはしばしばプロセス中に離脱して収率を減らしてしまう。

λ豆二ｌ刀 今回哨乳類のソマトトロピンの変異型が発見された。その型においては、９５− １０１位の間に位置するアスパラギンがグルタミンに入替わり、高いｐＨで高温 における高い安定性を示し、かつ変異していないソマトトロピンに匹敵する生物 学的活性を維持している。

哨乳類のソマトトロピンであればなんでも多分、本発明に従い、９５−１０１領 域に位置するアスパラギンをグルタミンに入れ賛えることにより変異させること ができよう、９５−１０１領域に実質的に対応するアミノ酸のシーケンスを持っ ている唖乳類のソマトトロピンであればなんでも大抵、この領域でアスパラギン をグルタミンに転換することによって安定化しようトトロビン、ブタソマトトロ ピン、ヒツジソマトトロピン、ウマソマトトロピン、ラットソマトトロピンそし てモンキーソマトトロピンである。

□　の詳細な！ 嗜乳類のソマトトロピンは相同であると認識されているのであるから、晴乳類の ソマトトロピンはなんでもこの発明の実施に適している。公知のソマトトロピン アミノ酸シーケンスの例としては、ＥＰ出願１９２，６２９号、１９８６年８月 ２７日出＠　：　Ｓ　ｅ　ｅ　ｂ　ｕ　ｒ　ｇら、ＤＮＡ、ｖｏｌ、２．Ｎｏ、 １．　ｐ、３７−４５．１９８３；そしてＡｂｄｅ　１−Ｍｅｑｕｉ　ｄら、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、ｖｏｌ、８４．ｐｐ、６４３ ４−６４３７．１９８７年９月を参照されたい、シーケンスはここに参考文献と して編入される。この発明のソマトトロピンとしてはウシ及びブタソマトトロピ ンが好ましい。

この発明の変異ソマトトロピンの目的の領域のアミノ酸シーケンスを表示した例 を表１に示す、アンダーラインをしたグルタミンは、変異していないソマトトロ ピンにおいてはアスパラギンである０番号は、フェニルアラニンである表示のホ ルモンの番号ｌのポジションにアミノ酸があるクンバクのアミノ末端から数えた アミノ酸のポジションを表わす、略号は、ウシソマトトロピン（Ｂ’ＧＨ）：ブ タソマトトロピン（ＰＧＨ）：ヒツジソマトトロビン（ＯＧＨ）：ウマソマトト ロビン（ＥＧＨ）：ラットソマトトロビン（ＲＧＨ）：ヒトソマトトロビン（Ｈ ＧＨ）：そしてモンキーソマトトロピン（ＭＧＨ）である。

目的領域のアミノ酸シーケンス 毀　蝕　紅　匹　柱　亜　血 この発明の変異体、即ちクンバクであってその９５−１０１領域においてアスパ ラギンがグルタミンに転換されたものは。

天然のソマトトロピンに限定されるものではな（相同体、変異体、（即ち別のア ミノ酸を９５−１０１領域のアスパラギン以外に含むソマトトロピン）対立遺伝 子型、及びその他のソマトトピンの延長や欠失を含む変異体で、その変異体が、 この発明の変異により与えられた、ソマトトロピンの生物学的活性を示し、加え て、高いｐＨ及び温度での高い安定性が示されるものを含む０例えば、満足すべ き変異体には、ロイシン１２６がバリンに入れ替えられたＢＧ）（及びＰＧＨの 対立遺伝子型が含まれる。

この発明のソマトトロピンは化学合成で調製できる。しかし、ソマトトロピン分 子のサイズが大きいのでそれを組換えＤＮＡ技術で調製することが好ましい、こ れは通常の手段で９５−１０１領域にアスパラギンの替りにグルタミンを持つ所 望の変異ソマトトロピンをエンコードする遺伝子を作成することによって実施で きる。変異ソマトトロピン遺伝子を作成する便利な方法は、通常の、出発遺伝子 のオリゴヌクレオチド−指示（ｄｓｉｓ）による。

変異した遺伝子はついで適当なベクター中にクローン化導入（ｃｌｏｎｅｄ　１ ｎｔｏ）され、そのベクターは次に適切な発現ホスト、例えば細菌（例えば、Ｅ 、Ｃｏ１１又はシュードモナス）、イースト（例えば、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓａｅ ）、ｆｆｉ！ｉ乳類細胞（例えば、Ｃ１２７又はｃＨｏ）などを形質転換するの に使用される。変異したソマトトロピンがそして発現し通常の方法で回収される 。

本発明の１つの実施態様は、晴乳類のソマトトロピンをコードする新規なりＮＡ シーケンスを目的とし、そこではもともとの嗜乳類ソマトトロピンの９５−１０ １位の間に位置するアスパラギンのためのコドンがグルタミンのためのコドン、 即ちＣＡＡ又はＣＡＧに入り替わっている。

このＤＮＡシーケンスは通常の化学的方法又は酵素の手段、例えば、遺伝子機械 による合成又はソマトトロピン遺伝子＋７）、２クレオチド−指示、サイト特異 性変異誘発により調製される。

この発明の別の実施態様は哺乳動物の成長を促進する方法であって、牛と豚に好 ましく、その方法はこの発明の嗜乳類ソマトトロピンの効果的な量による哨乳動 物の処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を含む。

この発明の他の実施態様はメスの哺乳動物の、例えば授乳期の雌動物体好ましく は酪農乳牛の乳の出を良（する方法であって、この方法はこの発明のソマトトロ ピンの効果的な量の投与を含む。

この発明のソマトトロピンは実質的に対応するアスパラギン含有ソマトトロピン と同じ効能を示す、したがって、この発明のソマトトロピンのための効果的な投 与の量と方式は、公知の成長ホルモンのためのものと同様である。しかし実際は 内因性のソマトトロピンを、源種の哺乳動物の治療のために使用することが好ま しい。

一般に効果的な用量の幅は１動物体１日当たり１か６２００ｍｇである。効能は 動物のサイズ及び成熟の程度、投与されたソマトトロピンの量及び使用された投 与システムのタイプにより変動する。典型的には、与えられるソマトトロピンの 量が大きいと成長、餌料効率、やせ−太り比、乳汁分泌、又は乳房組繊細胞増殖 が増大する結果となる。好ましくは用量は１動物体１日当たり１０から５０ｍｇ の間で変動させるべきである。

この発明のソマトトロピンは、動物に対する所望の用量を投与するために効果的 な公知の技術で投与できる。これらには乳房内、筋肉内、又は皮下注射投与、又 はコントロールされたリリース（ｒｅｌｅａｓｅ）移植組織片の使用による投与 が含まれる。この発明のソマトトロピンは公知のソマトトロピンと同じ方法で調 剤できる。このような調剤物には通常緩衝剤及び不活性な担体が含まれる。

ましい　態　のｔ 来Ｊ１１上 ＢＧＨび　ＰＧＨＧＬＮの　１ ！１」Ｕ１王 ＢＧＨ及びＰＧＨ構造遺伝子（Ｓｅｅｂｕｒｇ、Ｐ、Ｈ，ら、１９８３、ＤＮＡ 　２：３７−４５に記載）の９８位にあるアスパラギン残基をオリゴヌクレオチ ド−指示、サイト特異性変異誘発によりグルタミンに転換する。オリゴヌクレオ チド遺伝子変異のプライマはアプライドバイオシステム（ＡｐｐｌｉＣＡ）アプ ライドバイオシステムＤＮＡ合成装置により、製造元の手引き書に添って合成す る。変異誘発プライマのシーケンＧＡＣＴＣＴ−３゜ ＰＧＨ５°−ＡＧＧＧＴＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴ−３’ 下線は野生型のアスパラギンをグルタミンに転換するコドンを示す。

テンプレート（鋳型）ＤＮＡとして使用されるＢＧＭ遺伝子は、Ｓｅｅｂｕｒｇ らに記載されたＢＧＭ遺伝子からなり、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片として 、Ｍ１３ｍｐ１８ベクター（Ｂｅｔｈｓｅｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中にクローン化導入される。や はり鋳型として使用するＢＧＭ遺伝子は、Ｎ−アラニル、バリン（１２６）ＢＧ Ｈ遺伝子で（ＥＰ出廓１９３．５１５号、１９８６年９月３日公開）、ＥｃｏＲ Ｉ／ＨｉｎｄＩＩｌ断片として、Ｍｌ　３ｍｐ　１８中にクローン化導入される 。鋳型ＤＮＡとして使用されるＰＧＨ遺伝子はＥＰ出１ｉ１９３．５１５号に記 載されたＮ−アラニルＰＧ）（遺伝子で、Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｈｉｎｄｎｌ 断片として、Ｍｌ　３ｍｐ　１９ベクター（ＢＲＬ）にクローン化導入される。

この、９８位のＮ−アラニルＰＧＨ遺伝子を変異誘発する前に、後の発現プラス ミドへのサブクローニングを容易にするために、その遺伝子の５°端を変異して ＮｃＯエサイトを作成する。この変異誘発のために使用されるプライマは上記の ように合成されたが、以下の構造を有している。

５°−ＣＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣ−３゜ このＮｃｏＩサイト付加のための変異誘発手順は、Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２．４２２−４９９　（１９８５）に記 載されている。全ての制限酵素及び修飾酵素（Ｔ、ＤＮＡリガーゼ及びポリヌク レオチドキナーゼ）はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｂｅｖｅｒ ｌｙ、ＭＡ）から購入し製造元の指示書に従って使用した。

変異誘発は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ） オリゴヌクレオチド−指示インビトロ変異誘発システムを使用して製造元の指示 通りに実施した。変異誘発に続いて、正の（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）変異遺伝子を、 米国Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃ１ｅａｖｅ　ｌ　ａ ｎｄ、Ｏｈ　ｉ　ｏ）のＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭＤＮＡシーケンスシステムによ り製造元の指示に従ってＤＮＡシーケンス分析することにより同定した。

変異した遺伝子は次いでＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＴ断片として、ＢＧＨ及びＮ −アラニルＢＧＨ遺伝子についてはＥ、ｃｏｌｉ発現ペククーｐＭＯＮ２５３４ 中に、又Ｎ−アラニルＰＧＨ遺伝子については、ｐ　Ｍ　ＯＮ　５５８５中に、 クローン化導入される。プラスミドｐＭＯＮ５５８５は、双頚の１ａｃＵＶ５ブ ロモークが転写ターミネータとしてｐ　Ｂ　Ｇ　Ｈ−−−＋のＨｉｎｄＩＨサイ トに挿入されたｐ　Ｂ　Ｇ　Ｈ＊　−＋誘導体である。

ＥｃｏＲＩ断片としての双ＥｉｌａｃＵＶ５プロモークのシーケンスは、Ｂｏｇ ｏｓｉａｎらによるＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１５．７１ ８５に記載されている。そのＥｃｏＲＩ断片は、そのＥｃｏＲＩのオーバハング に充填しＨｉｎｄＩＩｌリンカ−を付着させることによりＨｉｎｄＩＩＩ断片に 転換される。

これらの操作により、Ｈｉｎｄｍ断片の端に見られるシーケンスを作り出す、上 手の端では、充填されたＥｃｏＲＩの端に結合したＨ　ｉ　ｎｃｉＩｎリンカ− （ＡＡＧＣＴＴ）はシーケンスＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＣＴ、、、を作り：１１お よび１２位にあるこのＣＴはもともとの１ａｃＵＶ５プロモータからのＡｌｕエ サイトの右半分を表わす、下手の端では、できたシーケンスは１．、、ＡＧＡＡ ＴＴＡＡＧＣＴＴであってニー１１位および一１２位にあるこのＡＧはもともと のｌ　ａｃｔＪＶ５ブロモークからのＡｌｕＩサイトの左半分を表わす。

それに加えてｐＭＯＮ２５３４はｐ　Ｂ　Ｇ　Ｈ−ｘ−＋のｐｔｒｐ断片の５° 末端にあるＥｃｏＲＩを及び双頭１ａｃＬＪＶ５プロモ一タ／オペレータ断片の ３°末端にＨｉｎｄｌＩ＋サイトを有し。

それらは、Ｓ１ヌクレアーゼを使用してオーバハングＥｃｏＲ■及びＨｉ　ｎ　 ｄ　ＩＩＩ　Ｍを消化することにより除去され、またＴ４ＤＮＡリガーゼにより プラント末端化される。

ブ５２ミ）’ｐＭＯＮ５５８５は、ＥＰ出１１２４１．４４６号（１９８７年１ ０月１４日公開）に記載のように、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｒｅｃＡプロモータ、ＧＩＯ Ｌシーケンス、及び丁フ転写終結シーケンスを含むｐＢＲ３２７ブラスミドであ る。

それぞれの発現プラスミドにクローン化導入された、変異体のＢＧ）（、Ｎ−ア ラニルＢＧＨ及びＮ−アラニルＰＧＨ遺伝子は、それぞれ、ｐＭＯＮ３０５０． ｐＭＯＮ３０６６及びｐＭＯＮ３２９９と称する。このｐＭＯＮ３０５０とｐＭ ＯＮ３０６６プラスミドはＥ、ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０　（ＡＴＣ（、：３９９３ ６）に挿入される。ｐＭＯＮ３２９９は、ｆｈｕＡ遺伝子の欠失により修飾され たＥ、ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０に挿入される。その修飾はｍ準法（Ｍａｎｉａｔｉ ｓら、ｅｄｓ、１９８２、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔ　ｏ　ｒ　Ｍ　ａ　ｎ　ｕ　ａユ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ）による。

１１亘ユ ＢＧＨびＰＧＨＧＬＮの 支ｌ久ヱムｌ ｐＭＯＮ３０５０．ｐＭＯＮ３０６Ｂ又はＰＭＯＮ３２９９発現プラスミドを持 っているＥ、ｃｏｌｉ細胞は、変異したＢＧＨ又はＰＧＨをコードするシーケン スを発現させる条件下で培養され、従って形質転換されたＥ、ｃｏｌｉにより、 変異したＢＧＭ又はＰＧＨタンパクが産生される。Ｅ、ｃｏｌｉのための成長培 地及びアンピリジン耐性（ａｍｐ’）マーカを含む細菌細胞の選択の条件はＭａ ｎｉａｔｉｓら、（１９８２）に記載されている。Ｅ、ｃｏｌｉは、クンバク発 現に使用されるとＬｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ　（ＬＢ）又はＭ９最少培地（Ｍａｎ ｉａｔｉｓら、１９８２）に１００μｇ　／　ｍ　１のアンピリジンを添加した ものの中で成長する。

ｐＭＯＮ３２９９中のｒｅｃＡプロモータからの転写の誘導を以下のように行な った。

発現プラスミドを持つＥ、ｃｏｌｉホスト細胞を１晩培養したものを、０．２５ ％（Ｗ／Ｖ）グルコース及び１％（ｗ／ｖ）ＣａＳアミノ酸及び０．２５％μｇ 　／　ｍ　１チアミンを添加したＭ９最少培地中で２Ｏ−２５Ｋｌｅｔｔユニツ ト（Ｋ　１　ｅ　ｔｔ−Ｓｕｍｍｅｒｓｏｎメータにより、グリーンフィルタを 用いて測定する、Ｋｌｅｔｔ　Ｍｆｇ、Ｃｏ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ）に希釈し、細胞密度１５０−１８０Ｋｌｅｔｔにまで成長させる。これ らの細胞は次いでナリジキシン酸を成長培地に添加することにより、最終濃度を ５０μｇ／ｍ１まで誘導される。成長を３７℃で数時間続行させ、非対応タンパ クの分析のための誘導の２又は３時間後にアリコートを採取する。成長の間を通 じて所望の遺伝子産生物の産生な最大にする目的で通気のレベルを高く維持する 。ｐＭＯＮ３０５０及びｐＭＯＮ３０６６中のｐｔｒｐブロモークからの転写の 誘導はＳｅｅｂｕｒｇた、１９８３及びＣａ１ｃｏｔｔら、１９８８、Ｄｅｖｅ ｌｏ　ｍｅｎｔｓ　ｉｎＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　２９．２ ５７−２６６に記載の通りである。

Ｅ、ｃｏｌｉ中の産主に続いて、変異体ＢＧＭ及びＰＧＨタンパクは、断りのな い限りＳ　ｉ　ｇｍａ社（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ）から購入される試薬により以下のように精製される０組換えＥ、ｃｏｌｉ 細胞が、Ｕｌ　ｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ　（Ｔｅｋｍａｒ　ＣＯ，、Ｃ１ｎｃｉｎ ｎａｔｉ、ＯＨ）を使用してホモジナイズされる。細胞は、次いで予備冷却され たＭａｎｔ。

ｎ　ｇａｕｌｉｎ（ＡＰＶ　Ｇａｕｌｉｎ、Ｅｖｅｒｅｔｔ。

ＭＡ）の経路に、２５８．２６３−３３２，０５３二ニートン／ｒｒｆで３回通 すことにより溶解され、４℃で２５．０００ｒｐｍで２０分間遠心される。

単離されたベレットは洗浄され、前記と同様にホモジナイズされ、尿素を添加し 、最終濃度４．５Ｍ尿素とする。

ＰＧＨ混合物はまた９０ｍＭのトリス塩基を含む、ＰＨはそれからＮａＯＨで１ １．３に調整され、ＢＧＭ及びＰＧＨタンパクは４℃で撹拌しながら約２１７２ 日間折畳まれ（ｆ　Ｏｌ　ｄ）る、その混合物は、４℃で３０分間遠心され残留 するいかなる沈殿をも除去される。そのＢＧＨ及びＰＧＨタンパクは次いで、Ｄ Ｅ−５２クロマトグラフを使用してＥ、ｃｏｌｉ汚染物から分離される。そのＧ Ｈタンパクは塩酸伝導率勾配３５０及び１０００μＳ　ｅ　ｍ　ｅ　ｎ　ｓ　／ 　ｃ　ｍ間でカラムから溶離される。精製された変異ＢＧＨ及びＰＧＨクンバク （ＨＰＬＣ，Ａｌ　１　ｔｅｃｈ　Ａｓ５ｏｃ、、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬに より同定され、０．１％［ｖ／ｖ］ＴＦＡを含む勾配５０−６５％のアセトニト リルで溶離される）を含む断片は、貯蔵され、撹拌されているセル装置（Ａｍｉ 　ｃｏｎ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）中のＹＭｌｏｌｉを通して８１給される。

二〇ＢＧＨＧｉｎ変異タンパクは２５　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ、ｐＨ１０を ４回取り賛＾、次いで水を４回取り替えて透析され、Ｖｉｒｔｉｓ　Ｆｒｅｅｚ ｅｍｏｂｉｌｅ　２４（Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ）で凍結乾燥される。

このＰＧＨＧｉｎ変異クンバクは５ｍＭＮａＨＣＯ−１ｐＨＩＯを４回取り替え て透析された後凍結乾燥される。２１１結乾燥されたクンバクは分析まで一２０ ℃で貯蔵される。

分析は、特Ｌ　Ｈａ　ｒＯら、Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、 ３８．１０９−１１６　（１９８４）（７）方法を使用するインビトロ肝臓ラジ オレセブクアッセイによる。そしてインシュリン刺激されたＣ１４−グルコース の脂質への組み込み阻害を測定するためのＧｌｅｎｎら、Ｊ、Ｃｅｌ　１．Ｂｉ ｏｃｈ。

ｅｍ、３７．３７１−３８３　（１９８Ｂ）の方法によるインビトロアッセイは 、この発明のこのＧ１ｎ９８ソマトトロピンが、対応する変異していないソマト トロピンに実質的に匹敵する生物学的活性を呈することを示している。

ラットにおける重量増加アッセイを使用するインビトロ試験でも、この発明のこ のＧ１ｎ９８ソマトトロピンについて、実施的に同等の生物学的活性を呈してい る。

１１皿ユ Ｇｌｎ−１クンバクの ソマトトロピンの溶液安定性が３日間と７日間との期間についてｐＨ１０とｐＨ ＩＩとにおいて評価される。試料は、試験ソマトトロピン２ｍｇ／ｍｌを２２℃ で所定のｐＨの５ｍＭＮａＨＣＯ−中に溶解して調製する。ｐＨは２５ｍｏｌａ ｒ　ＮａＯＨを添加して１０又は１１に調整する。試料を２２℃に保ち、サンプ ルを、初めと３日後と７日後に、逆相高性能液体クロマトグラフで分析する。ｐ Ｈ１０及びｐＨ１１で得られたデータをそれぞれ表２及び３に示す、データは面 積パーセントで報告されている。検出不能の量はｎｄで示される。ビーク１はア スパラギン９８で切断されたソマトトロピンの２本鎖型の量を示す、ビーク２は 残基９８におけるベータ結合したアスパラギン酸ソマトトロピンの量を示す、ビ ーク３は不明の化合物を示す、ＢＧＨ及びＢＧＨ−Ｇ１ｎ９８ソマトトロピンは いずれも一１位にメチオニンを有している。ＰＧ）！及びＰＧＨ−Ｇ　Ｉｎ９８ ソマトトロピンはいずれも一１位にアラニンを有Ｌ　ティる。

艮ス ｐＨ１０での安定性 ＢＣ；ＨＯｎｄ　ｎｄ　ｎｄ 表］。

ｐＨ１ｌでの安定性 一！−ビーク１　ビーク２　ビーク３ （日）　３　剋　旦 データは、正常なソマトトロピンは、高ｐＨにおいて著しい量の２本鎖及びベー タ結合の副生成物を経時的に形成して、不安定であり、これに対し、このＧ１ｎ ９８ソマトトロピンは２本鎖又はベータ結合のいずれの副生成物も、検出できる 量を形成せず、安定であることを示す。

この発明を典型的な例により説明したが、それはこれに限定されない、この発明 の開示の目的で選択された例は、この発明の精神及び範囲を離れないような変更 及び修飾を行なうことができる。

国際調査報告　８，８．。３６４゜

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．変異ソマトトロビンであって、哺乳類のソマトトロピンの９５−１０１位の 間に位置するアスパラギンがグルタミンに入れ替えられているソマトトロビン。
2. ２．請求項１に記載のソマトトロピンであって、ソマトトロピンがウシソマトト ロピンであるソマトトロピン。
3. ３．請求項２に記載のソマトトロピンであって、９８位にあるアスパラギンがグ ルタミンに入れ替えられているソマトトロピン。
4. ４．請求項３に記載のソマトトロピンであって、メチオニン及びフェニルアラニ ンをマイナス１位及び１位にそれぞれ有するソマトトロピン。
5. ５．請求項３に記載のソマトトロピンであって、アラニン及びフェニルアラニン をマイナス１位及び１位にそれぞれ有するソマトトロピン。
6. ６．請求項５に記載のソマトトロピンであって、バリンを１２６位に有するソマ トトロピン。
7. ７．請求項１に記載のソマトトロピンであって、ソマトトロピンがブタソマトト ロピンであるソマトトロビン。
8. ８．請求項７に記載のソマトトロピンであって、９８位のアスパラギンがグルタ ミンに入れ替えられているソマトトロピン。
9. ９．請求項８に記載のソマトトロピンであって、アラニン及びフェニルアラニン をマイナス１位及び１位にそれぞれ有するソマトトロピン。
10. １０．哺乳動物の成長を促進する方法であって、哺乳動物を、哺乳類のソマトト ロピンであってその９５−１０１位の間に位置するアスパラギンがグルタミンに 入れ替えられているソマトトロピンの有効量で処置することを含む方法。
11. １１．請求項１０に記載の方法であって、ソマトトロピンがブタソマトトロピン であり、哺乳動物がブタである方法。
12. １２．請求項１１に記載の方法であって、ソマトトロピンがウシソマトトロピン であり、哺乳動物がウシである方法。
13. １３．哺乳動物の乳産生を増加する方法であって、哺乳類のソマトトロピンであ ってその９５−１０１位の間に位置するアスパラギンがグルタミンに入れ替えら れているソマトトロピンの有効量を投与することを含む方法。
14. １４．請求項１３に記載の方法であって、ソマトトロピンがウシソマトトロピン であって哺乳動物が酪農乳牛である方法。
15. １５．哺乳類のソマトトロピンをコードするＤＮＡシーケンスであって、ソマト トロピンの９５−１０１位の間に位置するアスパラギンのためのコドンがグルタ ミンのためのコドンに入れ替えられているＤＮＡシーケンス。
16. １６．請求項１５に記載のＤＮＡシーケンスであって、ソマトトロピンがウシソ マトトロピンであるＤＮＡシーケンス。
17. １７．請求項１６に記載のＤＮＡシーケンスであって、９８位においてグルタミ ンをコードするＤＮＡシーケンス。
18. １８．請求項１７に記載のＤＮＡシーケンスであって、メチオニン及びフェニル アラニンをそれぞれマイナス１位及び１位においてコードするＤＮＡシーケンス 。
19. １９．請求項１８に記載のＤＮＡシーケンスであって、アラニン及びをフェニル アラニンをそれぞれマイナス１位及び１位においてコードするＤＮＡシーケンス 。
20. ２０．請求項１９に記載のＤＮＡシーケンスであって、バリンを１２６位におい てコードするＤＮＡシーケンス。
21. ２１．請求項１５に記載のＤＮＡシーケンスであって、ソマトトロピンがブタソ マトトロピンであるＤＮＡシーケンス。
22. ２２．請求項２１に記載のＤＮＡシーケンスであって、グルタミンを９８位にお いてコードするＤＮＡシーケンス。
23. ２３．請求項２２に記載のＤＮＡシーケンスであって、アラニン及びフェニルア ラニンをそれぞれマイナス１位及び１位においてコードするＤＮＡシーケンス。
24. ２４．請求項１５に記載のＤＮＡシーケンスであって、グルタミンをコードする コドンがＣＡＡであるＤＮＡシーケンス。
25. ２５．請求項１５に記載のＤＮＡシーケンスであって、グルタミンをコードする コドンがＣＡＧであるＤＮＡシーケンス。