JPH03259092A - 蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、遺伝子工学的手法により、蛋白質を生産する
にあたり、生産量を一定にする方法に関する。 従来の技術 遺伝子組換え技術の確立によって、多（の有用蛋白質が
大腸菌を使用して生産されるようになり、天然には極く
微量にしか存在しない生理活性物質を比較的容易に供給
できるようになった。目的物質の構造遺伝子は通常プラ
スミド中でプロモーターの下流に挿入され、適切な宿主
大腸菌へ導入し、必要に応じて誘導発現させることによ
り目的物質を生産させることが出来る。しかし、その生
産性は、プラスミドやプロモーターの種類、発現プラス
ミドの構築や宿主の選択によって、著しい影響を受は目
的物質に応じて適切な発現系の確立か必要である。また
同じ組換え体を用いても、培地条件、培養条件１発現誘
導条件によってその生産能が左右され、不偏的な効率的
生産法は大腸菌の場合においても必ずしも十分確立され
ているとは云い難い。 発明が解決しようとする課題 大腸菌を用いて遺伝子組換え蛋白質を生産させる場合、
培地に混入してくる微量成分によって培養が著しい影響
を受け、安定な工業生産プロセスを確立することが困難
な場合がしばしば見受けられる。たとえば培養に使用す
る水、天然物由来窒素源、滅菌に使用する蒸気などによ
って菌の増殖および目的物である蛋白質の生産性か著し
い影響を受けることがある。 従って、蛋白質を安定にしかも著量蓄積させることがで
きれば、効率良い生産方法を確立することができる。 課題を解決するための手段 一般に、遺伝子工学的手法を用いて遺伝子産物を大量生
産する場合、宿主−ベクター系およびプロモーターの選
択は、重要な課題であり、大腸菌ｔｒｐ−プロモーター
を持つ発現系は蛋白質の生産にしばしば採用されてきた
。しかし得られる組換え体の培養は、培養のバッチによ
っては菌の増殖および蛋白質の生産性が著しく異なる場
合がある。 この培養を安定化させしかも高い生産性を維持すべく種
々検村を重ねた結果、蛋白質をコードする塩基配列およ
びその上流にトリプトファンプロモーターを含有するベ
クターを保持する大腸菌を培地に培養するに当り、その
培地に鉄イオン源を添加し、かつ大腸菌の対数増殖期に
インドリル−３−アクリル酸（ＪＡＡ）を共存させるこ
とにより、培養を安定化させ、しかも高い蛋白質生産性
を維持することかできることを見い出し、さらに研究し
た結果、本発明を完成した。 本発明は、蛋白質をコードする塩基配列およびその上流
にトリプトファンプロモーターを含有スるベクターを保
持する大腸菌を培地に培養することにより該蛋白質を製
造する方法において、当該培地に鉄イオン源を添加し、
かつ当該大腸菌の対数増殖期に当該培地にインドリル−
３−アクリル酸を共存させることを特徴とする該蛋白質
の製造法である。 本発明でいう蛋白質としては、インスリン、ヒト成長ホ
ルモン、ヒトβエンドルフィンなどのホルモン類、上皮
細胞成長因子（Ｅ　Ｇ　Ｆ　）、線維芽細胞成長因子（
Ｆ　Ｇ　Ｆ　）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、イ
ンスワン様成長因子（ＩＧＦ）、）ランスフォーミング
成長因子（ＴＧＦ）などの細胞成長因子類、インターロ
イキン−１〜８．リンホトキシン、コロニー形式刺激因
子、エリスロボエチン（ＥＰＯ）、腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）などのサイトカイン類、Ｂ型肝炎ウィルス抗原、イ
ンフルエンザ抗原１ロ蹄疫ウイルス抗原、マラリア原虫
抗原などの病原性微生物抗原蛋白質、ティシュプラスシ
／−ゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、リゾチームな
どの酵素類、ヒト血清アルブミン（Ｈ３Ａ）などの血中
基、白成分が挙げられる。 本発明の蛋白質としては、なかでも、ＦＧＦ蛋白質、Ｔ
Ｌ−２が好ましい。 上記ＦＧＦ蛋白質としては、塩基性のもの（以下、ｂＦ
ＧＦと略称することもある。）でもよく、酸性のもの（
以下、ａＦＧＦと略称することもある。 ）でもよい。特にｂＦ　Ｇ　Ｆが好ましい。 本発明においてＦＧＦ蛋白質としては、ＦＧＦ活性を有
するポリペプチドもしくは蛋白質が挙げられる。 該ＦＧＦ蛋白質は、哺乳動物由来のものが挙げられる。 該哺乳動物としては、ヒト、サル、ブタ。 ウシ、ヒツジ、ウマなどが挙げられる。 該ＦＧＦ蛋白質としては、脳や下垂体などの既にその存
在が明らかにされている各種臓器から抽出されるものが
挙げられる。 また、該ＦＧＦ蛋白質としては、組換えＤＮＡ技術によ
り得られるＦＧＦか挙げられる（ＰＣＴ国際公開Ｎｏ、
　Ｗ○／８７１０１７２８号公報：フエブス・レターズ
、第２１３巻、＋８９−１９４頁（１，９８７年）；ヨ
ーロッパ特許出願公開第２３７゜９６６号公報（特開昭
６３−２２６２８７号公報））。 特に組換え型ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　（以下、ｒｈｂＦ　Ｇ
　Ｆと略称することもある。）が好ましい。 該ＦＧＦ蛋白質としては、ムティンでもよい。 該ＦＧＦムティンとしては、たとえばヨーロッパ特許出
願公開第２８１，８２２号公報（特開平２−１９３号公
報）、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　　Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）第１５１巻第７
０１〜７０８頁（１９８８年）、ヨーロッパ特許出願公
開第３２６゜９０７号公報に記載のムティンが挙げられ
る。 たとえば、本発明におけるＦＧＦムティンとしては、本
来、元のペプチドあるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異
したものであり、したがって該変異としては、アミノ酸
の付加、構成アミノ酸の欠損、他のアミノ酸への置換が
挙げられる。 該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。 該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のＦＧ
Ｆ構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。 該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個のＦ
ＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。 ＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているムテ
ィンにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ペプ
チドを発現する際に用いられる開始コドンに基因するメ
チオニンや、シグナルペプチドは含まれないものである
。 付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。 さらに好ましくは、ＦＧＦと相同性（ホモロジー）が認
められており、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配
列の一部あるいはすべてが挙げられる。 ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が欠損し
ているムティンにおける欠損している構成アミノ酸の数
としては、ＦＧＦの有する特徴を失わない限り何個でも
よい。 該欠損している構成アミノ酸の例としては、ヒトｂＦＧ
Ｆのアミノ末端側１０残基：Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ−Ｇ１．ｕ−ＡｓｐＧ　ｌｙ　−Ｇ　
ｌｙ　−Ｓ　ｅｒ。 ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆのアミノ末端側１４残基：Ｍｅｔ−Ｐ
ｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａ、ｓｐ４ Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ
　ｌａ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｐ　ｒｏ。 ヒトｂＦＧＦのアミノ末端側４１残基。 ヒトｂＦＧＦのカルボキシル末端側６１残基：などが挙
げられる。 さらに、ＦＧＦムティンとして、ｂＦＧＦの凡のペプチ
ドあるいは蛋白質のカルボキシル末端側の７個〜４６個
の構成アミノ酸が欠損したものが挙げられる。 該欠損の好ましい例としては、 ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆの アミノ酸番号１０２以降のアミノ酸配列〃　　１０５　
　　　ｌｌ 〃　　１１５　　　　〃 〃　　１１９　　　　〃 〃　　１２４　　　　ｌｌ ！／１３０ツノ 〃　　１３８　　　　〃 が欠損したものが挙げられる。 ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が別のア
ミノ酸で置換されているムティンにおける置換される前
の少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸の数としては、
ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。 置換される前の構成アミノ酸の例としては、／スティン
、シスチンなどが挙げられるか、システィンか特に好ま
しい。置換される前の構成アミノ酸としてシスティン以
外のものとしては、アスパラギン酸、アルギニン、グリ
ンン、バリンなどが挙げられる。 置換される前の構成アミノ酸がシスティンである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリンン、バリンアラニン、ロイ／ン、イソロイ
ンン、チロシン　フェニルアラニン、ヒスチジン、トリ
プトファン、セリン。 スレオニン、メチオニンなどが挙げられる。特に、セリ
ン、スレオニンが好ましい。 置換される前の構成アミノ酸がシスティン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点で、
置換される前のアミノ酸とは異なる性！をもつものを選
ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパ
ラギン。 スレオニン、バリン、フェニルアラニン、アルキニンな
どが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好
ましい。 置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミンスレオニン、ロイ
ンンフェニルアラニン、アスパラギン酸が挙げられるが
、特にグルタミンか好ましい。 置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン、ロ
イシン、フェニルアラニン、セリン。 グルタミン酸、アルギニンなどが挙げられ、特にスレオ
ニンが好ましい。 置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン、アラ
ニン、ロイシン、システィン、グルタミン、アルギニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。 置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、ロインン
、プロリン、グリンン、リジン、アスパラギン酸などが
挙げられ、特にセリンが好ましい。 置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラギ
ン酸、アルギニン、グリシン、セリン、バリンが好まし
い。 置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン、グ
ルタミン、アルキニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロインンカ好マシい。 置換されたムティンの最も好ましいものとしては、構成
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたものが
挙げられる。 上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なって
もよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換され
るのが好ましい。 該ムティンは、上記した付加、欠損、置換の２つまたは
３つが組み合わさったものでもよい。 該ムティンとしては、少なくとも１個のヒト塩基性ＦＧ
Ｆ＊成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているムティ
ンが好ましい。特にヒトｂＦＧＦの６９位および８７位
のシスティンかそれぞれセリンに置換されたｒｈｂＦ　
Ｇ　ＦムティンＣ３２３か好ましい。なお、このヒトｂ
ＦＧＦのアミノ酸の位置は、第１図のアミノ酸配列にお
いてＮ末端のＭｅｔの下流の次のＰｒｏを第１番目とし
て数えるものとする。 該ＩＬ−２としては、ＩＬ−２と同様の活性を有する物
質、すなわち、Ｔ細胞をその機能を維持したまま継代維
持しうる作用を有する物質が挙げられる。具体的には、
例えば特開昭６１−７８７９９号公報の第１図に示され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｉ）（ヒト［Ｌ
−２）や、その生物学的もしくは免疫学的活性に必要な
一部分のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよい。 上記ポリペプチドとしては、例えばポリペプチド（１）
のアミノ末端から１個のアミノ酸（ＲＰＣ公開９１５３
９号公報）または４個のアミノ酸を欠くもの（特開昭６
０−１２６０８８号公報）やカルボキシル末端部の数個
のアミノ酸を欠くものなどが挙げられる。さらに該ポリ
ペプチド（

【）の構成アミ／酸の一部が欠損しているか
他のアミノ酸に置換されたもの、例えば１２５位のシス
ティン残基がセリン残基に置換されたもの［特開昭５９
−９３０９３号公報］が挙げられる。 とりわけ、特開昭６１−７８７９９号公報の第１図に示
されるアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−２を用いるのが
好ましく、この場合そのアミン末端にさらにメチオニン
残基（Ｍｅｔ）を有するものと有さないものとの混合物
［特開昭６０−１１５５２８号公報、特開昭６１−７８
７９９号公報］てあってもよく、またアミノ末端にＭｅ
ｔを有さずアラニン（Ａ　ｌａ）で始まるもの［特開昭
６１−７８７９９号公報］でもよい。 たとえば、上記ＦＧＦムティンやＩ　Ｌ−２ムテインを
製造するためには、特定部位指向性変異誘発技術（Ｓｉ
ｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　　ｌｌｌｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ）が採用される。該技術は周知であり、アール・エフ
・レイサー（Ｌａｔｈｅｒ、　Ｒ，Ｆ、　）及びジェイ
・ビーーレ：＋ツク（Ｌｅｃｏｑ、　Ｊ、　Ｐ、　）、
ジェネティック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　
　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミックプレス社（
１９８３年）第３１−５０頁、に示されている。オリゴ
ヌクレオチドに指示された変異銹発はエム・スミス（Ｓ
ａ＋ｉｔｈ、　　ｋｌ　）及びニス・ギラム（Ｇ１１ｌ
ａ＋ｕ、　Ｓ、　）、ジェネティック・エンジニアリン
グ；原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３巻
　１−３２頁に示されている。 該ムティンをコードする構造遺伝子を製造するためには
、たとえば、 （ａ）構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮＡを突然
変異株オリゴヌクレオチドブライマーと雑種形成させる
（この１本鎖で代替えすべきシスティン用コドン、又は
場合によりこのコドンと対合をつくるアンチセンス・ト
リブレットを包含する領域に対して上記ブライマーは相
補的なものである。但し、当該コドンの他のアミノ酸暗
号化用コドン、又は場合によりアンチセンス・トリプレ
ットとの不一致はこの限りでない。）、 （ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによりブライマーを伸長させ
、突然変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ
）を形成させる、及び （ｃ）この突然変異性へテロニ量体を複製する。 次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。 このようにして得られたプラスミドで適当な宿主を形質
転換し、得られた形質転換体を培地に培養することによ
り、ムティンを製造することができる。 上記構造遺伝子（ＤＮＡ）は翻訳開始コドンＡＴＧの下
流に存在するが、該遺伝子はＡＴＧに直結してその下流
に存在してもよく、またＡＴＧと該遺伝子の間に発現さ
れないスペーサーもしくは他の構造遺伝子が介在してい
てもよい。とりわけＡＴＧと構造遺伝子が直結している
のが好ましい。 本発明で用いられるトリプトファンプロモーターとして
は、たとえば大腸菌由来のトリプトファンオペロンのプ
ロモーター・オペレータ一部位（ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー１２１巻　１１３頁　１９７
８年）やネズミチフスｍ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙ
ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のトリプトファンオペロンの
プロモーターオペレータ一部位（ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・バイオロジー　１２１巻　１３９頁　１９
７８年）などが挙げられる。 これらトリプトファンオペロンの少なくともプロモータ
ーとオペレーター領域の塩基配列を有するＤＮＡ断片が
用いられ、構造遺伝子の上流に配置される。また、構造
遺伝子の下流には、必要に応じて大腸菌の系で作動し得
る転写ターミネータ−が配置される。 上記遺伝子およびプロモーター（およびターミネータ−
）は、通常ベクターに組込まれ発現ベクターとして使用
される。該ベクターの製造のためのプラスミドとして、
例えばＣｏ１Ｅ　１由来のｐＢＲ３２２〔ジーン、第２
巻、９５頁（１９７７））が最もよく利用されるが、そ
の他のプラスミドであっても、大腸菌内で複製保持され
るものであれば、いずれも用いることができる。その例
としては、ｐＢＲ３１３ｆ：ジーン、第２巻、７５頁（
１９７７））　。 ｐＢＲ３２４，ｐＢＲ３２５Ｃジーン、第４巻。 １２１頁（１９８７））、ｐＢＲ３２７，ｐＢＲ３２８
Ｃジーン、第９巻、２８７頁（１９８０））　、　ｐＫ
　Ｙ　２２８９〔ジーン、第３巻、１頁（１９８７））
　、　ｐＫ　Ｙ　２７００〔生化学、第５２巻、７７０
頁（１９８０）：ｌ　。 ｐＡｃＹｃ１７７およびｐＡｃＹｃ１８４［ジャーナル
・オブ・バタテリオロジー、第１３４巻、１１４１頁（
１９７８））　、　ｐＲＫ２４８．　ｐＲＫ６４６゜ｐ
ＤＦ４．ｌ［メソッズ・イン・エンジ−モロジー第６８
巻、２６８頁（１９７９）Ｅなどか挙げられる。 また、バタテリオファージ、たとえばλファージを使用
したλｇｔ系のλｇｔ・λＣ〔プロシージング　オブ　
ナンヨナル　アカデミ−オブ　サイエンス　ＵＳＡ、第
７１巻、４５７９頁（１９７４））λｇｔ・λＢ〔同誌
第７２巻、３４１６頁（１９７５））　。 λＤａｍ　［ジーン、第１巻、２５５頁（１９７７））
やシャロンヘクター〔サイエンス、第１９６１　１６１
頁（１９７７）　、ジャーナル・オブ・ピロロジー、第
２９巻、５５５頁（１９７９））　、繊維状ファージを
使用したベクターなども発現ベクターとして使用可能で
ある。 上記発現ベクターの構築は、公知の方法に従って行なえ
ばよい〔例えば、ネイチャー、第３０２巻、３０５頁（
１９８３）、　　ヌクレイツク・アシソズ・リサーチ、
第１１巻、４３０７頁（１９８３）、特開昭５７−７９
８９７号公報、特開昭５８−１８９１９７号公報〕。 蛋白質の構造遺伝子を組入れた発現プラスミドを導入す
る宿主菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　１
ａｃｏｌｉ＝Ｅ、　ｃｏｌｉ）が用いられるが、なかで
も大腸菌に一１２株由来のものが、取扱い、安全性の面
から特に好ましい。該大腸菌に一１２株由来のものとし
ては２９４株、Ｃ６００株、ＲＲ〜１株。 ＤＨ−１株などが有利に用いられる。 ２９４株は公知菌株であり〔プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ＵＳＡ　
　第７３巻、４１７４頁（１９７６）’］　、又財団法
人発酵研究所にＩＦ○−１４１７１として寄託もされて
いる。 Ｃ６００株はＡｐｐｌｅｙａｒｄによって誘導された株
（ジエネテイクス　３９巻　４４．０−４５２．１９５
４年）でバックマン（バクテリオロジカル・レビュー　
３６巻　５２５−５５７．１９７２年）にも記載されて
いる公知菌株である。 Ｒ，Ｒ，−］株はジーン、第２巻、７５頁（１９７７）
に、Ｄ　Ｈ−１株はネイチャー　第２１７巻、１１１０
頁（１９６ｇ）に、それぞれ記載されている。 本発明で使用する大腸菌は、宿主大腸菌を蛋白質の構造
遺伝子発現ベクターで形質転換することにより製造でき
、形質転換は、例えばジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジー、第５３巻１５９　頁（１９７０）、メ
ソノズ・イン・エンジモロジー、第６８巻、２５３頁（
１，９７９）、　　ジーン、第３巻。 ２７９　頁（１９７８）、プロシージング・オブ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ＵＳＡ第６９
巻、２１１０頁（１９７２）などに記載されている手段
によって行うことができる。 該大腸菌を培養する際、培養に使用される培地としては
液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育
に必要な炭素源、窒素源１無機物その他が含有せしめら
れる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキスト
リン、可溶性澱粉ショ糖など、窒素源としては、たとえ
ばアンモニアガス、アンモニウム塩Ｌ　硝酸ｉ類、　　
コーンスチーブ・リカー、ペプトン　カゼイン　カザミ
ノ酸、肉エキス、大豆軸、バレイショ抽出液などの無機
または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウ
ム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネンウムなどが
あげられる。また、酵母エキスビタミン類、生長促進因
子などを添加してもよい。 培地のｐＨは約６〜８が望ましい。 本発明において、上記大腸菌を鉄イオン源を添加した培
地で培養する。鉄イオン源とは、溶液にしたときに鉄イ
オンとなる物質あるいは鉄イオンの形で利用される物質
をいい、例えば鉄の塩が挙げられる。好ましくは２価も
しくは３価の鉄の無機塩（例、塩化第１鉄、塩化第２鉄
、硫酸第１鉄。 硫酸第２鉄、リン酸第２鉄、硝酸第２鉄など）であり、
とりわけ３価の鉄の鉱酸塩（例、塩化第２鉄、硫酸第２
鉄など）が好ましい。 ｄイオン源は水溶液として添加するのが望ましいが、そ
の濃度は１０−”−１０−”モル、好ましくは３Ｘ１０
−＠〜５Ｘ１０−’モルの量を添加するのがよい。 上記大腸菌の培養のため、天然物由来の窒素源を培地に
添加するのが良い。たとえば、公知の基礎培地に、カザ
ミノ酸、ペプトン、イーストエキス、麦芽エキスなど天
然物から得られる窒素源を添加するのが良い。これら本
発明に用いられる培地の組成の一例を第１表に例示する
。 また、宿主菌が栄養要求性を示す場合には、たとえば要
求するアミノ酸（例、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ
−メチオニン　し−ロイシン　Ｌ−７’０！７／、Ｌ−
インロインン、Ｌ−バ＋）７．Ｌ−トリプトファンなど
）を約１０ないし１１０００１Ｉ／ｅの割合で適宜添加
することか好ましい。 さらに、組換え大腸菌を選択的に増殖させるために、プ
ラスミド中に保持されている薬剤耐性等の遺伝子に応じ
て、耐性を示す薬剤（アンピンリン、テトラサイクリン
など）を添加してもよい。 第１表 使用される培地の例 ＮａＪＰＯ＋ ＫＨ，ＰＯ。 ａＣＩ Ｈ４Ｃ１ Ｈ４Ｃ１１ｌＩ・７Ｈ，０ ６ｇ／ｇ ３ｇ＃ ０、５ｇ＃ １ｇ／Ｉ２ ０、３４ｇ／Ｑ ３ｇ／ｆ２ ３ｇ／ｌ！ ０、５ｇ＃ Ｉｇ／ｆ！ ０、３４ｇ＃！ 本発明においては、培地中にインドリル−３アクリル酸
（ＩＡＡ）を共存させる。ＩＡＡは、次式 培地にｒＡＡを共存させるには、ＩＡＡを培地に添加し
てもよいし、その塩たとえばナトリウム塩、カリウム塩
、アンモニウム塩などにして添加し上式で表わされる化
合物として存在するようにしてもよい。 インドリル−３−アクリル酸（Ｉ　ＡＡ）を共存させる
時期は、対数増殖期であればいつでもよいが、対数増殖
期の初期ないし中期が好ましく、さらに培養開始後５〜
１０時間の間に共存させるようにするのが好ましい。Ｉ
ＡＡの共存させる量としては約５Ｘ　１０−”Ｍ　〜５
Ｘ　１０−’Ｍ、　　より好マシ＜は約５Ｘ　１０−’
Ｍ−ＩＸ　Ｉ　Ｏ−”Ｍが挙げられる。 さらに培養途中必要に応じて、グルコースやカザミノ酸
などの成分を追加することも可能である。 上記した鉄イオン源は、通常本培養の培地にあらかじめ
所定の濃度で添加するが、種培養の培地にも添加するこ
とかできる。また主発酵の途中でその一部を添加するこ
ともできる。 培養は通常的１５〜４５℃より好ましくは約２０〜３７
°Ｃで行われる。特に生育開始からその半ばまでを約３
０〜３７℃に保ち、増殖するにつれて温度を下げ約２０
〜３０℃に保つことにより高い生産性を得ることができ
る。また培養は、通常、通気撹拌培養によって行われる
。培地中の酸素濃度を飽和酸素濃度の約５％（ｖ／ｖ）
以上になるように保ちつつ培養を行なうと、目的とする
蛋白質の生産量が増大されるので有利である。このため
に、培養途中に純酸素を空気と混合して通気することも
効果的である。 また、上記ＩＡＡの代わりに、インドリル−３プロピオ
ン酸を当該培地に共存させても、インドリル−３−アク
リル酸と同様に用いることができると考えられる。 上記培養物より目的とする蛋白質を得るためには、まず
培養後、公知の方法で菌体を集め、グラスビーズによる
破砕、フレンチプレス、超音波処理、リゾチームおよび
（または）凍結融解処理などによって抽出する。 とりわけ、グラスビーズで破砕する方法が好ましい。か
（して得られた破砕物を遠心分離等に付し、蛋白質を含
む上澄液を得る。 上記上澄液から蛋白質を分離、精製するには、自体公知
の分離、精製法を適切に組み合わせて行なうことができ
る。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒
沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過
法、ゲルろ過法および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、
イオン交換クロマトグラフィーなとの荷電の差を利用す
る方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異
的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフ
ィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動
法などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。 この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥を行い、乾
燥粉末とすることもできる。さらに、担体として血清ア
ルブミンなどを添加して保存することは、標品の容器へ
の吸着を防ぐことができ好適である。 また、精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤の
共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤と
してはβ−メルカプトエタノール。 ジチオスレイトール、グルタチオンなどが挙げられる。 このようにして得られた蛋白質は、それぞれ天然の蛋白
質など公知の蛋白質と同様の生理活性を有し、同様の目
的に同様の方法で医薬品などとして用いることができる
。 上記の方法により得られた蛋白質のなかでもＦＧＦ蛋白
質は線維芽細胞の増殖を促進させる作用。 血管内皮細胞の増殖を促進させる作用、血管を新生させ
る作用を有し、安定性が高く、毒性は低いので火傷、創
傷、術後組織などの治癒促進剤、あるいは血管新生作用
による血栓症や動脈硬化症などの治療薬として用いるこ
とができる。また、細胞培養を促進させるための試薬と
して用いることができ＝、特に、構成システィンのうち
少なくとも一つがセブンに置換されたムティンは、安定
性が高いので好ましい。 該ＦＧＦ蛋白質を医薬として用いるには、そのまま粉末
として、または他の薬理学的に許容されうる担体、賦形
剤、希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤１錠剤、カ
プセル剤、液剤、軟膏）として、温血動物（例、ヒト、
マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、犬、ネコ）に対
して非紅口的または経口的に安全に投与することができ
る。 注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖や
その他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行な
われる。錠剤、カプセル剤等の医薬組成物も常法に従っ
て調製しうる。 該ＦＧＦ蛋白質を上記した医薬として用いる場合には、
たとえば上記した温血動物に、投与ルート、症状などを
考慮して、１日量約１ｎｇないし１００μｇ／　ｋｇの
中から適当量を選んで投与される。 また、該ＦＧＦ蛋白質を細胞培養を促進させるための試
薬として用いる場合、培地１ｇあたり約０．０１〜１０
ａｇ、さらに好ましくは約０．１〜１０μｇとなるよう
に培地に加えることが好ましい。 本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、　Ｉ　ＵＰＡＣ−Ｉ　Ｕ　Ｂ　
　Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌＮ　ｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは
当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例
を下記する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありう
る場合は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする
。 ＮＡ ＤＮＡ ＮＡ ＡＴＰ ＴＴＰ ＧＴＰ ＣＴＰ ＴＰ ｄｒ ＥＤＴΔ ＤＳ ：デオキンリボ核酸 ：相補的デオキシリボ核酸 ：アデニン ：チミン ：グアニン ：シトシン ：リボ核酸 ：デオキシアデノシン三リン酸 ：デオキシチミジン三リン酸 ：デオキシグアノシン三リン酸 ：デオキシンチジン三リン酸 ：アデノシン三リン酸 ：チミジン ：エチレンジアミン四酢酸 ニドデシル硫酸ナトリウム ｌｙ ｌａ ａｌ ｅｕ ｉｅ ｅｒ ｈｒ ｙｓ ｅｔ ｌｕ ｓｐ Ｌ’ｌＳ ｒｇ ｉｓ ｈｅ ｙｒ ｒｐ Ｐｒ。 ｓｎ ｉｎ ニゲリシン アラニン ：バリン ロイシン インロイシン ：セリン スレオニン ゛システィン メチオニン ：グルタミン酸 ：アスパラギン酸 ：リジン ：アルギニン ：ヒスチジン ：フェニールアラニン ：チロシン コトリブトファン コブロリン ：アスパラギン ：グルタミン 後述の実施例で用いられる形質転換体は、財団法人発酵
研究所（ＩＦ○）および通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所（ＦＲＩ）に寄託されている。それらの受
託番号および受託臼を次の第２表に示す。なお、該形質
転換体は当初国内寄託かなされＦＥＲＭ　　Ｐ番号で示
される受託番号が付され、該寄託はブダペスト条約に基
づく寄託に切換えられて、ＦＥＲＭ　　ＢＰ番号で示さ
れる受託番号が付され、同研究所（ＦＲＩ）に保管され
ている。 （以　下　余　白） 実施例 以下に実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明は、これらによってなんら限定されるものでは
ない。 実施例１ 日本特許出願公開平成２年第］、　９３号公報（ヨーロ
ッパ特許出願公開第２８１，８２２号に対応）に記載の
方法で製造されたｈｂＦ　Ｇ　Ｆの６９位および８７位
のシスティンがそれぞれセリンに置換された組換え型ｈ
ｂＦＧＦムティンＣ３２３をコードする塩基配列および
その上流にトリプトファンプロモーターを含有するベク
ターｐＴ　Ｂ　７６２を保持する大腸菌ＭＭ２９４／ｐ
ＴＢ７６２（Ｉ　ＦＯ１４６１３、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
１６４５）を、ＬＢ培地（バクトドリブトン１０ｇ／＋
２．バクトイ−ストエキス５ｇ／ｆｆ、食塩５ｇ／１２
）に塩酸テトラサイクリン１０ｍｇ／ρを添加した培地
３０−に１白金耳接種し、３７℃にて一夜振盪培養した
。この培養液をＭ−９培地（Ｎａ＝ＨＰＯ４・１２Ｈｔ
Ｏ１６，８ｇ／（１，ＫＨ，Ｐｏ、　　３ｇｚＱ、ＮＨ
，Ｃ（１１ｇ／Ｑ、食塩０．５ｇ／ｆｆ、Ｍｇ５Ｏ，・
７Ｈ，００，２４６ｇ／ｌりにグルコース１５ｇ／１２
．　カザミノ酸１５ｇ／１２．塩酸チアミン１　ｍｇ／
　（１，塩酸テトラサイクリン１０ｍｇ／１２を添加し
た培地３０＃Ｉｌ！へ、１．５−移植し、鉄イオンを添
加する場合は、Ｆｅ５Ｑ、−７８，Ｏを２０ｍｇ／ｆｆ
（７，２Ｘ　１０−５Ｍ）の量を添加し、３５°Ｃにて
振盪培養した。培養途中濁度２００クレット単位になっ
た時点でインドリル−３−アクリル酸（ＩＡＡ）を１０
０　ｔａｇ／　ｇ（５。 ３　Ｘ　１．０−’Ｍ）になるように添加して、その後
３時間振盪培養を続けた。遠心分離により菌体を集め、
−２０℃にて保存した。菌体に７Ｍ塩酸グアニジンを添
加し、菌体をよく懸濁したのち１時間放置し、遠心分離
で抽出液を得た。抽出液を希釈したのちＥＬ　Ｉ　ＳＡ
法によりｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆムティンｃｓ２３量を算出し
た。その結果を第３表に示す。 第３表 生育、生産共ロッｌ−Ａ、、無添加の場合を１，００と
する。 注二ロットＡはデイフコ社（米国）製のカザミノ酸を添
加した場合を示す。 ロットＢ、ロットＣは、シェフイールドプロダクツ社（
米国）製のカザミノ酸であって、異なるロフトの製品を
添加した場合を示す。 この第３表に示すように、無添加では増殖およびｈｂＦ
ＧＦムティンＣＳ２３生産性がカザミノ酸の口、トによ
って著しく変動した。これに鉄イオン源を添加すると生
育はいずれも著しく向上し、一定となったがｈｂＦ　Ｇ
　ＦムティンＣ８２３の生産性は著しく低下した。一方
、ＩＡＡのみを添加した場合には生産性の向上が認めら
れたが、カザミノ酸ロフトによるバラツキか認められた
。これに対し、鉄イオン源とＩＡＡを添加した場合には
、カザミノ酸ロットに関係なく著しく生産性が向上した
。 実施例２ ＬＢ培地に塩酸テトラサイタリン１０ｍｇ／Ｒを添加し
た培地】ρニ、大腸ｆＪＭＭ２９４／ｐＴ　Ｂ７６２（
ＩＦＯ１４，６１３，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６４、５’
）のマスターセル０．５−を接種し、３０°Ｃ１−晩振
盪培養した。その全量を５０ρ培養槽に仕込んだ２０ρ
の発酵培地（Ｍ−９培地にＣａＣｌｙ　・２　Ｈｔｏ　
　１０　ｍｇ／　（２，グルコース１５ｇ／Ｑ、　　カ
ザミノ酸１５ｇ／Ｑ、　　ビタミンＢ＋　　５ｍｇ／ｐ
添加）に５　ｍｇ／　Ｑの量のＦｅＳＯ４・７ＨｔＯ（
１、，８Ｘ１０−５Ｍ）を添加又は無添加の培地へ移植
し、ｐＨ６，８，通気量２０Ｑ／分撹拌４５０　ｒｐｍ
内圧１　、０　ｋｇ／　ｃｍ’、温度３５°Ｃて培養を
開始した。 生育が約４００クレツト単位になった時点でＩＡＡを１
１００Ｉ１／Ｑになるように添加して、さらに培養を続
け、約２０００クレ／トになった時点て、温度を３５°
Ｃから２５°Ｃに下げ、グルコース２　カザミノ酸を１
５ｇ／（ｌになるように添加して、−晩培養を続けた。 その結果を第４表に示す。 第４表に示すように、無添加の時に比べ、鉄イオン源と
ＴＡＡの添加により、生産量が３倍以上増加した。 添加物　　生育　生産 無添加　　　　　　１．００　　　　１．００生育、生
産井無添加の場合を１．ＯＯとする。 実施例３ 実施例２で得られた培養液をシャープレス遠心分離機に
かけて湿菌体を得、−８０℃に凍結保存した。凍結囲体
１ｋｇを２５ρＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）＋０．１
−ＭＡＰＭＳＦ（ｐ−アミジノフェニルメタンスルフォ
ニルフルオロライド塩酸塩）十２謹Ｍ　ＤＴＴ（ジチオ
スレイトール）抽出用緩衝液４１２中に懸濁した。４ｅ
のガラスピーズを用いて５ａ容量のダイノミル（Ｋ　Ｄ
　−Ｓ型、ライＬＪ　−バッフオフエン社１　スイス）
で、水冷下５サイクル破砕した。約５Ｃの抽出用緩衝液
を用いてガラスピーズを洗浄し、洗液は抽出液と合せた
。この合せた抽出成約１０ρをＩ　Ｏ、００Ｏｒｐｍ、
　　６０分間遠心分離（２１型、ベックマン社、米国）
し、得られた上澄液を硫酸化セルファインＣ（生化学工
業）のカラム（２５，２ｃｍｌＤＸ　５０　ｃｍ＞に注
ぎ込んだ。 吸着後、カラムは２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
＋Ｑ、５Ｍ塩化ナトリウム２５ρで洗浄した。次いて２
５＋ｎＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）＋１Ｍ塩化ナトリ
ウム３０Ｑを用いて溶出を行った。溶出液は限外濾過装
置（ベリコン力セワトシスチム、ミリポア社、米国）を
用いて２８０　ｎｍにおける吸光度が３〜４になるまで
濃縮を行った。この濃縮液２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６，０）約６Ｏｆ２に対して一晩透析した。透析内液は
４　、２０　Ｏｒｐｍ、　　３０分間遠心分離（ベック
マン社、米国）した後、上澄液をｓｐ−トヨバール６５
０Ｍ（東ソー）のカラム（１７，０ｃｏ＋ＩＤｘ　３３
．Ｏｃｍ）に注ぎ込んだ。カラムは２５ＩＩＩＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）＋２００ｍＭ塩化ナトリウム７ｇ
で洗浄し、２５ａ＋Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）＋５
００ｍＭ塩化ナトリウム１０Ｃを用いて溶出を行った。 溶出液を高速液体クロマトグラフィー装置（ギルソン社
、フランス）を用いて、硫酸化セルロファイン（生化学
工業）のカラム（１５，０ｃｍ１ＤＸ　５０．Ｏｃｍ）
に注ぎ込んだ。次いで、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）２０Ｃと５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）＋２Ｍ塩化ナトリウム３０＆との間で、直線濃度勾配
をかけて溶出を行った。主要溶出画分を集め、伝導度が
２０＋ａｍｈｏ以下になるように、１０１Ｍクエン酸緩
衝液（ｐＨ６，０）で希釈した。この液をｓｐ−トヨパ
ール６５０Ｍ（東ソー）のカラム（１４，０ｃｍＩＤＸ
　３９゜Ｏｃｍ）に注ぎ込んだ。カラムは２５１１ＩＭ
クエン酸緩衝液（ｐＨ６，０）１０ｆｆで洗浄後、２５
朧Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，０）＋Ｑ、５Ｍ塩化ナト
リウム１０Ｑで溶出を行った。溶出液はトヨパールＨＷ
５０Ｆ（東７−）ツカラム（１４，０ｃｍ１ＤＸ９０．
０ｃｆｆｉ）に注ぎ込み、５０ｍＭクエン酸緩衝Ｈ＜ｐ
Ｈ７，０）を用いて展開した。主要溶出画分を集め、ミ
リバック−２０（ミリポア社、米国）を用いて除菌濾過
し、ｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣＳ２３精製標品１２ｇ
を得た。得られた標品の理化学的性質は、従来の培養法
で得た標品と全く一致した。またその生物活性も同一で
あった。 発明の効果 本発明方法により、遺伝子工学的手法により蛋白質を一
定量製造することかできるので、本発明方法は蛋白質の
工業的生産に有利に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で用いられた、ｒｈｂＦ　Ｇ　Ｆム
ティンＣ５２３をコードする塩基配列とそれから推定さ
れるｒｈｂＦ　Ｇ　ＦムティンＣ５２３のアミノ酸配列
を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 蛋白質をコードする塩基配列およびその上流にトリプト
   ファンプロモーターを含有するベクターを保持する大腸
   菌を培地に培養することにより該蛋白質を製造する方法
   において、当該培地に鉄イオン源を添加し、かつ当該大
   腸菌の対数増殖期に当該培地にインドリル−３−アクリ
   ル酸を共存させることを特徴とする該蛋白質の製造法。