JPH03501922A - リパーゼの固定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リパーゼの固定化方法 本発明は、リパーゼの固定化方法、固定化リパーゼ調製品および固定化リパーゼ の使用に関する。

〔背景技術〕

リパーゼの種々の固定化方法が知られている。すなわち、ＥＰ　１４０．５４２ 　（ノボ社）は弱アニオン交換樹脂にムコール（Ｍｕｃｏｒ）　リパーゼを固定 化することを開示しており、更にＤＫ８５／８７８（ノボ社）フェノール−ホル ムアルデヒド形の吸着樹脂に該リパーゼを固定化することを開示している。

木材等（Ｅｕｒ、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｂｎｏｌ、 　（１９８３）１７　：　１０７〜１１２）は、種々の官能性を有するフェノー ルホルムアルデヒド樹脂に吸着された固定化カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）リパー ゼを開示する。

〔発明の開示〕

本発明者らは、驚くべきことに以下の内容を見出した。すなわち、アクリル形の マクロポーラスな吸着剤樹脂にリパーゼを固定化すると、例えそのま−のリパー ゼが二種の方法で用いられた場合でも、従来方法よりもより高いエステル交換活 性を有する製品を与えるということである。この固定化方法は、１．３−特異性 および位置非特異性リパーゼを含めて、細菌、酵母または真菌由来の多種多様の 微生物リパーゼに通用できる。該方法で固定化された全てのこれらのリパーゼは 、そのま−のリパーゼに比較して良好なエステル交換活性および増強された熱安 定性を有する。

従って、本発明はアクリル形の粒状のマクロポーラスな吸ゼの固定化方法を提供 する。

本発明は、またリパーゼがアクリル形の粒状のマクロポーラス樹脂に吸着されて いる固定化リパーゼを提供する。

〔発明の詳細な説明〕

■−皿 本発明で用いられる典型的樹脂は、ポリ−（メタ）アクリル酸エステル、（例え ばジビニルベンゼンで架橋されたポリメチルメタアクリレート）からなる、それ らの樹脂は、マクロポーラスでありかつ典型的には、孔の平均半径約１００〜２ ００人を有しかつ全表面積２５〜１５０ｒｒｆ／ｇ（窒素吸着法による）を有す る。

固定床カラム中で連続的エステル交換に用いるためには、粒状物は好ましくは球 状でありかつ均一な径、好ましくは１００〜１０００−１例えば１００〜５００ ｉｎ＠であるべきである。

樹脂の例は、レヮチット（Ｌｅｗａｔｉｔ＠　）　Ｅ　２００１／８５　（バイ エル社、西ドイツ）、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ９　）χＡＤ−８（ ロームアンドハース社、アメリカ合衆国）である。

皿足上方法 固定化は、通常単にリパーゼの水性溶液を樹脂に接触させ、しかる後形成された 固定化リパーゼを水相がら分離し、次いで分離した固定化リパーゼを洗浄し更に 乾燥することを含んでなる。

適当な温度およびｐｕは、リパニゼの特徴に依存するであろうが、多くの場合室 温および中性に近いｐＨが好都合に用いられる。

接触時間は、通常本質的に完全な吸着に対して必要とされるような時間が選ばれ る。これは典型的には１〜２時間から２４時間である。

徽工豐ユバニ亙 固定化されるべきリパーゼは、好ましくは微生物である。

いくつかの好ましいリパーゼは、次の菌から由来するニームコール（Ｍｕｃｏｒ ）ｓｐ、　、特にＭ、マイヘイ（Ｍｅｉｈｅｉ）、リボザイム（Ｌｉｐｏｚｙｎ ＋ｅ＠　）　（ノボ社）がら入手可能、−カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ｓｐ、、 特にＣ，ルゴザ（ｒｕｇｏｓａ）　（名糖産業（日本）からリパーゼＯＦとして 入手可能）およびＣ。

アンタルクチ力（ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）、　ＰＣＴ／ＤＫ　８７１００１２７ （ノボ社）参照、 一プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏｎａｓ）　ｓｐ、　、特にＰｓ、セパシ ア（ｃｅｐａｃｉａ）、　ＤＫ　８７／３９９３　（ノボ社）参照、−ヒュミコ ーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）　ｓｐ、　、特にＨ，ラヌギノザ（ｌａｎｕｇｉｎｏ ｓａ）、特公昭５３−４５．３９４　（有馬）　、ＤＫ　４４９９／８７（ノボ 社）および特開昭６２−７９．７８２　（ユニチカ）。

リパーゼ　プロセス 本発明の固定化リパーゼは、エステル加水分解、エステル合成およびエステル交 換に用いることができる。後者の語句は、アシドリシス（エステルと酸の反応） 、アルコリシス（エステルとアルコールの反応）、およびエステル交換（エステ ルとエステルの反応）を含む、トリグリセリドの他に、他のエステルが、リパー ゼの基質特異性に依存して用いられる。

本発明の固定化リパーゼは、特に固定床カラム中での連続エステルに対して用い られる。

〔図面の簡単な説明〕

第１図は連続アシドリシスの結果を示す。詳しくは実施例２に示す。

本発明の例示的実施 （可溶性リパーゼの活性（ＬＵ）に対する分析）この方法は、ｐＨ−スタットを 用いたトリブチリンの加水分解に基づく。ＩＬＵ（リパーゼ単位）は、乳化剤と してアラビアゴムを用いｐＨ７，０で３０°Ｃで毎分１μｏ＋ｏｌの滴定可能な 酪酸を放出する酵素の量である。更に詳細は、ノボ分析法ＡＦ　９５１５（請求 により入手可能）に示される。

固体化リパーゼのアシドリシス活性（ＢＩＵ）溶剤と共に又は溶剤なしでパルミ チン酸とトリオレインを反応させることにより活性を測定する。パルミチン酸の 全法人を、ｌ・リグリセリドのＦＡＭＥ　−ＧＬＣにより測定する。

ＦＡＭＥ−ＧＬＣ（脂肪酸メチル−エステル−ガス液クロマトグラフィー）は、 アメリカンオイルケミスト　ソサイエティ（ＡＯＣ５）により発刊された、２種 の方法Ｃｅ　２−６６およびＣｅ　１−６２に従って行うことができる。

溶剤との反応の場合には、反応混合物は、０．６ｇのトリオレイン、０．１７４ ｇのパルミチン酸および８．０８３　ｇの石油エーテ”ルから成る。３．０ｇの トリオレインおよび０．８７ｇのパルミチン酸を用いる。いずれの場合において も、適当量の酵素は水和され、１〜４時間所定温度で上記反応混合物と共にイン キュベートされた。ろ液をアルミナカラムで精製し、次いでトリグリセリドをＦ ＡＭＥ−ＧＬＣにより分析する。

ＩＢＩＵ（バッチエステル交換単位）は、溶剤と共に又は溶剤なしで所定温度で パルミチン酸を初期速度１μｍｏｌｅ／分で導入する固定化リパーゼの量である 。

例ル バタイト（Ｌｅｗａｔｉｔ＠　）　Ｅ　２００１／８５に対するリパーゼの固定 化 一般に、所定量のリパーゼの水性溶液を、定まったｐＨでかつ室温で樹脂（この 場合、レバタイ）Ｅ　２００１／８５、バイエル社製）と共に回転混合させた０ 次いで、固定化リパーゼを有する樹脂を、ろ過して集め、次いで水で洗浄し、真 空乾燥した９吸着されたリパーゼの除去は、ろ液中に残った加水分解リパーゼ活 性から計算した（ＬＬＩ−分析）、固定化調製品のエステル交換活性を、溶剤を 用いず６０°ＣでＢＩＵ−分析により測定した。

データと結果を次表に掲げる。

マクロポーラスなフェノール樹脂についてのムーコール（Ｍｕｃｏｒ）　リパー ゼを用いて得られた典型的結果は、約３０　ＢＩＵ／ｇの活性について約３０Ｌ υ／■のロードである（ＥＰ　１４０．５４２参照）。

レバ　イト（Ｌｅｗａｔｉｔ　＠　Ｅ　２’００　８５この樹脂は、ポリアクリ レート形のアクロポーラスな非イオン性吸着剤樹脂である。平均な孔の半径は、 約１００人であり、全表面積は約８０ｒｙｆ／ｇである。

量　の！バーゼの　゛ ムコール　マイヘイ（Ｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）、１．３−特異性（ノボ社、 ＤＫ　４２３４／７７）参照 カンジ゛　アン　ルク　）、（Ｃａｎｄｔｄａ　ａ　ｔａｒｃｔｉｃａ）、非特 異性（ノボ社、ＤＫ　３９９３／８７） ブソイドモ　ス　セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅ　ａｃｉａ）、非特 異性（ノボ社、ＤＫ　３９９３／８７） ヒュミコーー　−ヌギノザ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｌａｕ　１ｎｏｓａ）、１，３ −特異性（ノボ社、ＤＫ　４４９９／８６）例２ ゛　・アシド１シス ４．５ｇの固定化ムコールリパーゼ（例１）を内径１．５　ｃｒ！ｉの水流ジャ ケット付カラムに挿入した。

環還熱水を有する水流ジャケットがカラムに備えられており、更に６０°Ｃに保 持された。水で飽和した樹脂（デュオライ）　（Ｄｕｏｌｉｔｅ）＠ＥＳ　５６ １）を含有するブリカラムを、酵素カラムの前に置き次いで同温度に保持した。

７１％の高度に精製された３％未満のパーオキシド値を有する大豆油および２９ ％の分析的等級のラウリン酸から成る基質はカラム内にポンプ導入された。酵素 カラムからの出口で、試料を分析用の採取し、次いで、ラウリン酸の導入をＧＬ Ｃによって測定した。１４％ｗ　／　ｗラウリン酸の導入を試み、次いで流速を 調整し変換率をその値に保持した。流速の測定は、実際の変換率は１４±１％の 場合に行われた。ブリカラムが乾燥するといつでも新しいカラムに取り換えた。

Ａ２□Ｏ２−カラムクロマトグラフィー法を用い、遊離脂肪酸およびモノ−およ びジグリセリドを除去することにより試料を分析し、しかる後、Ｎａ０ＣＨ，を 用いてトリグリセリドをメチル化し、最後にＧＬＣでメチルエステルを分析した 。

時間（時）対流速（トリグリセリド（ｇ）７時間／固定化酵素１ｇの自然対数と して第１図に示す結果は、６０°Ｃで約１８００時間の半減期を示す。

例３ ルシ＜　−４）　Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　＠　ＸＡＤ−８に・するリパーゼのｌＩ 上。

基本的には例１と同様に固定化を行った。データおよび結果を次表に掲げる。

アンバー−イト　Ａ＋ｎｂｅｒｌｉｔｅ）ＯＸＡＤ−８この樹脂は、ポリアクリ レート形のマクロポーラスな非イオン吸着剤である。平均の孔半径は、約１２０ 人であり、全表面は約１４０ｒｒｆ／　ｇである。

国際調査報告 ・＋＋６’＋ｖＮ４Ｍｌ＾−０ｔか−、ＰＣＴ／ＤｋＢＢ１００１５ε

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．アクリル形の粒状のマクロポーラスな吸着剤樹脂上にリパーゼを吸着させる ことを含んでなる、リパーゼの固定化方法。
2. ２．リパーゼの水性溶液を樹脂に接触させ、しかる後形成された固定化リパーゼ を水相から分離し、次いで分離した固定化リパーゼを洗浄し更に乾燥することを 含んでなる、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．　前記リパーゼが、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ） 、プソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍａｎｓ）又はヒューミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌ ａ）菌株、好ましくはＭ。マイヘイ（ｍｉｅｈｅｉ）、Ｃ．アンタルクチカ（ａ ｎｔａｒｃｔｉｃａ）、Ｐｓ．セパシア（ｃｅｐａｃｉａ）又はＨ．ラヌギノザ （ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）から由来する、請求の範囲第１項または第２項記載の 方法。
4. ４．請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の方法によって産生される固定 化リパーゼ。
5. ５．エステル交換、エステル合成またはエステル加水分解における請求の範囲第 ４項記載の固定化リパーゼの使用。
6. ６．連続エステル交換において、固定化リパーゼが固定床に保持されている、請 求の範囲第５項記載の使用。