JPH03501927A - ＩｇＥ産出性Ｂリンパ球上の独特な抗原決定基 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３６、１ｇＢ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞には結合しない抗体に よって特定される抗原決定基と事実上等価なアミノ酸配列を有するペプチド。

３７、前記抗原決定基がＥＩＯＩ−１，ＥＩＯ−１２−５５，Ｅ８−５−３．　 ＥＩＯ−２１−１５、Ｅｌｏ−８−１２０及びＥｌｌ−４−ＴＯより成る群から 選択される抗体によって特定される請求の範囲第３６項記載のペプチド。

３８、混合された白血球群内のＩｇＢ産出性の８０７８球の識別方法であって、 白血球の試料とＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞には結合しな い抗１ｇＢ抗体とを接触させる段階と、どの細胞に前記抗体が結合したかを測定 する段階とを有し、前記抗体と結合したものがＩｇＢ産出性のＢ細胞と認定され る方法。

３９．８細胞の膜に結合された免疫グロブリンに対して特異的に結合するがこの 免疫グロブリンの分泌型には結合しない抗体の調製。

４０、前記免疫グロブリンがヒトＩｇＥである請求の範囲第３９項記載の抗体の 調製。

４１、前記抗体がモノクローナルである請求の範囲第３９項記載の抗体の調製。

４２、免疫グロブリン鎖の膜結合領域の細胞外のセグメントに特異的に結合する 抗体の調製。

４３、前記免疫グロブリンがヒトＩｇＢである請求の範囲第４２項記載の抗体の 調製。

４４、前記抗体がモノクローナルである請求の範囲第４２項記載の抗体の調製。

４５、Ｂ細胞の表面のヒトＩｇｇに結合するが好塩基性細胞の表面のヒトＩｇＢ には結合せず、かつ分泌された可溶性のＩｇＢにも結合しないモノクローナル抗 体。

４６、マウスＩｇＧ２Ａ、ヒトＩｇＧ１　又はＩｇＧ３サブクラス抗体である請 求の範囲第４５項記載のモノクローナル抗体。

４７、キメラ性の抗体である請求の範囲第４５項記載のモノクローナル抗体。

４８、Ｂ細胞の表面のヒトＩｇＨに特異的に結合するが好塩基性細胞の表面のＩ ｇＥには結合せず、かつ分泌された可溶性のＩｇＥにも結合しないキメラ性の抗 体であって、前記抗体がネズミ抗原結合領域及びヒトのガンマｌ又はガンマ３の Ｈ鎖不変領域を有するキメラ性の抗体。

４９．８細胞の表面のヒＨｇεに特異的に結合するが好塩基性細胞の表面のヒト ＩｇＥには結合せず、かつ分泌された可溶性のＩｇＥにも結合しないモノクロー ナル抗体を産生ずる連続かつ安定な株化細胞。

５０、ハイブリドーマである請求の範囲第４９項記載の株化細胞。

５１、ネズミハイブリドーマである請求の範囲第５０項記載の株化細胞。

５２、１ｇＢ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可溶性 のＩｇＨには結合しない抗体のＬＭ又はＨ鎖の可変領域を機能上コードしている ように再配列された遺伝子を含む単離ＤＮＡ　。

５３、ヒトのし鎖又は■鎖の不変領域をコードし、ているＤＮＡに結合された請 求の範囲第５２項記載のＤＮＡを含むＤＮＡ構成物。

５４、前記Ｈ鎖の不変領域がガンマ１又はガンマ３タイプである請求の範囲第５ ３項記載のＤＮＡ構成物。

５５、請求の範囲第５４項記載のＤＮＡ構成物でトランスフエクトされたミエロ ーマ細胞であって、キメラ性の抗体を分泌するミエローマ細胞。

５６、　ＩｇｌＥに媒介されるアレルギの治療又は予防の方法であって、ＩｇＥ 産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可溶性のｉｇＢには 結合Ｉ−ない抗体を患者に投与する段階を有する方法。

５７、前記抗体がネズミ由来の抗原結合領域及びヒト由来の不変領域を有するキ メラ性のネズミ／ヒト抗体である請求の範囲第５６項記載の方法。

５８、前記不変領域がＩｇＧ１又は１ｇＧ３タイプである請求の範囲第５７項記 載の方法。

５９、前記抗体の投与とともに従来の脱感作免疫療法が行われる請求の範囲第５ ６項記載の方法。

６０、前記抗体が抗体依存の細胞毒性を向上させる因子とともに投与される請求 の範囲第５６項記載の方法。

６１、前記因子がＧ１．１−ＣＳＦ、　Ｍ−Ｃ３Ｆ及びマクロファージ活性因子 より成る群から選択される請求の範囲第６０項記載の方法。

６２、　ＩｇＨに媒介されたアレルギの治療又は予防方法であって、ＩｇＨに媒 介されたアレルギ症の患者に対して、Ｂ細胞表面のＩｇＨの細胞外膜結合領域に 特異的に結合するモノクローナル抗体を投与する段階を有する方法。

６３、前記アレルギが直接型の超過敏症である請求の範囲第６２項記載の方法。

６４゜前記抗体がネズミ由来の抗原結合領域及びヒト由来の不変領域を有するキ メラ性のネズミ／ヒト抗体である請求の範囲第６２項記載の方法。

６５、ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可溶性 のＩｇＨには結合しない抗体のパロトーブに対する特異性を有する抗イデイオタ イプのモノクローナル抗体。

６Ｇ、請求の範囲第６５項記載のバロトープに対する特異性を有する抗イデイオ タイプの抗体であって、ネズミに由来する抗原結合領域及びヒトに由来する不変 領域を有するキメラ性の抗体。

６７、請求の範囲第６５項記載の抗イデイオタイプの抗体の抗原結合性フラグメ ント。

６８、請求の範囲第６５項記載のモノクローナル抗体を分泌する連続かつ安定な 株化細胞。

６９、　ＩｇＢに媒介されたアレルギの治療又は予防方法であって、ｉｇＢに媒 介されたアレルギ症の患者に対して、ＩｇＢ産出性のＢ細胞には結合するが好塩 基性細胞又は分泌された可溶性のＩｇＨには結合しない抗体のバロトーブに対す る抗体を投与する段階を有する方法。

７０、前記抗体がキメラ性の抗体である請求の範囲第６９項記載の方法。

７１、１ｇＢ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可溶性 のＩｇＥには結合しない免疫毒素。

７２、１ｇＥ産出性のＢリンパ球には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可 溶性のＩｇＥには結合しない抗体にリンクされた細胞毒素より成る免疫、毒素。

７３、前記細胞毒素がリチン、プソイドモナス毒、ジフテリア毒、アメリカやま ごぼうの抗ウイルス性ペプチド、トリコセシン、放射性核種及び膜溶菌酵素より 成る群から選択される請求の範囲第７２項記載の免疫毒素。

７４、　ＩｇＢに媒介されたアレルギの治療方法であって、アレルギ症の患者に 対して、ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可溶 性のＩｇＥには結合しない抗体に接合された細胞毒素より成る免疫毒素を投与す る段階を有する方法。

７５、前記細胞毒素がリチン、プソイドモナス毒、ジフテリア毒、アメリカやま ごぼうの抗ウイルス性ペプチド、トリコセシン、放射性核種及び膜溶菌酵素より 成る群から選択される請求の範囲第７４項記載の方法。

７６．８細胞表面上のＩｇＨの膜結合領域の細胞外セグメントに対応するアミノ 酸配列を有するペプチド。

７７、請求の範囲第７６項記載のペプチドであって、アミノ酸配列−Ｇｌｕ　Ｌ ｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ、　Ｐｒｏ−及びペプチドの変異を有し、前記ペプチドの 変異においてはアミノ酸がその免疫学的特性を実質的に損なうことなく欠失、挿 入又は置換されているペプチド。

７８、請求の範囲第７６項記載のペプチドであって、キャリアタンパクに接合さ れたペプチド。

７９、前記キャリアタンパクがキーホールを有するヘモシアニンである請求の範 囲第７８項記載のペプチド。

８０、１ｇＥ産出性のＢ細胞には特異的に結合するが好塩基性細胞又は分泌され た可溶性のＩｇＥには結合しない抗体を産生ずる細胞又は抗体の生成方法であっ て、 ａ）　Ｂ細胞表面上のＩｇＢの膜結合領域の細胞外セグメントに対応するアミノ 酸配列を有するペプチドを動物に接種する段階と、 ｂ）前記ペプチドに固有の抗体を産生ずる細胞又は抗体を前記接種された動物か ら得る段階と、 を有する方法。

８１、請求の範囲第８０項記載の方法であって、前記ペプチドがアミノ酸配列− Ｇｌｕ　Ｌｅｕ、　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ 　ＧｌｕＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ−及びペプチドの変異を有し、前記ペ プチドの変異においてはアミノ酸がその免疫学的特性を実質的に損なうことなく 欠失、挿入又は置換されている方法。

８２、前記ペプチドがキャリアタンパクに接合されている請求の範囲第８０項記 載の方法。

８３、前記キャリアタンパクがキーホールを有するヘモシアニンである請求の範 囲第８２項記載の方法。

８４、ペプチドと反応する抗体であって、前記ペプチドがアミノ酸配列−Ｇｌｕ 　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ 　ＧｌｙＧｌｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ−及びペプチドの変異を有し、前記ペプチドの 変異においてはアミノ酸がその免疫学的特性を実質的に損なうことなく欠失、挿 入又は置換されている抗体。

８５、前記抗体がモノクローナルである請求の範囲第８４項記載の抗体。

８６、１ｇＥ産出性のＢ細胞には特異的に結合するが好塩基性細胞又は分泌され た可溶性のＩｇＥには結合しない抗体を産生ずる細胞又は抗体の生成方法であっ て、 ａ）少な（とも膜結合領域の細胞外セグメントを有するＩｇＥ分子を動物に接種 する段階と、 ｂ）前記膜結合領域の細胞外セグメントに固有の抗体を産生ずる細胞又は抗体を 得る段階と、 を有する方法。

明　細　書 ＩｇＢ産出性Ｂリンパ球上の独特な抗原決定基ｌ肌旦宣盈 非本態性喘息、枯草熱、特定の食品または薬品に対するアレルギー反応などの即 時型過敏症は、主に免疫グロブリンＥ（ＩｇＢ）が媒介している。ＩｇＥ媒介ア レルギー反応では、アレルゲンがマスト細胞及び好塩基性白血球（好塩基球）の 表面上のＩｇＢと結合する。この結合により、ＩｇＢ分子の、従ってＩｇＢの結 晶化断片部位（ＰｃεＲ）に対する潜在的受容体の架橋が発生し、そのためヒス タミン、アナフィラキシ−症の遅反応性物質及びセロトニン等の薬物メディエー タの放出が引き起こされる。これらのマスト細胞及び好塩基球産出物の放出によ り、アレルギーの様々な病理的症状が発生する。

ＩｇＥ媒体過敏反応症にかかっている患者は、症状の軽減のために抗ヒスタミン 剤で治療　することが多い。また、枯草熱の季節には、長引くアレルギー反応を 防止または軽減するアレルギー源を定期的に注射することによって、十分には理 解されていないがＩｇＥ媒体反応を幾分軽減する特定の免疫反応を引き起こす。

減感作療法は特定の患者には効果的であるが、それ以外の患者にはあまり効果が ない。

ＩｇＥがマスト細胞及び好塩基球と結合することを阻止することによってＩｇＥ 媒体アレルギーを治療できると言われている。例えば、ＩｇＢの結晶化断片（Ｐ ｃε）の様々な領域を代表する合成ペプチドが、マスト細胞及び好塩基球上の受 容体とＩｇＥが結合するのを阻害する競合阻害物として開発されている。例えば スタン”ワース（Ｓｔａｎｗｏｒｔｈ）Ｄ、　Ｒ，のモレックィミューン（Ｍｏ ｌｅｃ　Ｉｍｍｕｎ）　２１　：　１１８３〜１１９０（１９８４）、スタンワ ースＤ、　Ｒ６及びバー）　（Ｂｕｒｔ）Ｄ、Ｓ、のモレイックィミューン２３ 　：　１２３１〜１２３５（１９８６）、バートＤ、　Ｓ、他のモレイックィミ ューン２４　：　３７９〜３８９（１９８７）　、バーン（Ｈａｈｎ）の米国特 許第４．６８３．２９２号、及びハンバーガーの米国特許第４．１７１．２９９ 号及び第４゜１６１、５２２号を参照されたい。しかし、恐らくはＩｇＢ全体に 較べてこれらのペプチドはＦｃεＲに対する親和性が極めて低いために、そのよ うなペプチドはアレルギーの治療にあまり効果的ではなかった。

近年、ＩｇＢ上の様々な抗原及び機能的抗原決定基の地図を作成するために単一 クローン性抗体法が用いられている。バニャシュ（Ｂａｎｉｙａｓｈ）及びアッ シー？−（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４　ニア９９〜８０７（１９８４） ）は、ＩｇＨに対して作られた幾つかのラット単一クローン性抗体の中の３つが マウスＩｇＥのラット好塩基性細胞との結合を阻害したと報告している。抗体は ＴｇＥと結体は恐らく好塩基球上のＩｇＥに対する受容体と結合する位置ではな いがその付近である結晶化断片上の部位に結合したのである。さらに最近では、 同研究者達は、ＩｇＢの好塩基性細胞との結合を阻害するが好塩基球表面上のＴ ｇＢを認識しない単一クローン性抗体を開発した。バニャシュ他のモレックィミ ューノル２５　：　７０５（１９８８）。シラガニアン及びその仲間は、ヒトＩ ｇＢに対して作られた約ｌＯのマウス単一クローン性抗体の中の２〜３が好塩基 球上のＩｇＥと結合できないことを報告している（Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ　、４０　 ：　９６５（１９８１）　、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ。４６　：　１３４６（１９８７ ）を参照されたい）。彼らはまた、これらの単一　クローン性抗体の一部がヒト ＩｇＥの好塩基球との結合を阻害できると書いている。これらの研究は、ＩｇＢ 上の様々な抗原決定基または機能的に関連したペプチドセグメントを明確にする ために単一クローン性抗体を使用することを提唱している。

最近では、ホイッタカ−（Ｗｈｉｔａｋｅｒ）が、ＩｇＥイソタイプに特異な免 疫毒素及びそれをアレルギーの治療に利用することについて述べている。米国特 許第４．７１４．７５９号を参照されたい。免疫毒素は、毒素と結合した抗１ｇ Ｅ抗体を有している。

この治療で意図されている薬理的機構は、ＩｇＥイソタイプに特異な免疫毒素が ＩｇＥ産出細胞を殺すことである。

泣ユニ皇１ 本発明は、ＩｇＥ分子上の独特な抗原決定基と、これらの決定基の発見に基づい たＩｇＥ媒体アレルギーの治療の試薬及び方法とに関している。これらの抗原決 定基はＩｇＥ産出性Ｂリンパ球（Ｂ細胞）上に存在するが、好塩基球及びマスト 細胞上には存在しない。

１ｉＥはＸｇＣ産出性Ｂ細胞だけによって産出されるが、それはこれらの細胞上 に存在するだけでな（、マスト細胞及び好塩基球上にも存在する。ＩｇＥは好塩 基球及びマスト細胞の表面上のＦｃｅＲに対する親和性が非常に高く（結合定数 Ｋａは１０″〜１０１０リットルモル一つ、解離速度は非常に遅い（「オン」期 間の半減期は約２０時間である）。このため、ＩｇＥは実質的に好塩基球及びマ スト細胞の表面抗原である。

本発明のＩｇＢ上の抗原決定基はＩｇＥ産出性Ｂ細胞上に存在するが、好塩基球 またはマスト細胞上には存在せず、このため、この抗原決定基はＩｇＢ産出性Ｂ 細胞の独特な表面マーカーである。この抗原決定基はｉｇｅ、　ｂｌ、　（ｂｌ はＢリンパ球を表す）と呼ばれる。Ｂ細胞上のＩｇＥは、膜脂質二重層に渡るよ うにして膜に固定された膜結合型であり、好塩基球及びマスト細胞上のＩｇＥは 、ＦｃｅＲ分子に結合することによって細胞表面上に固定された分泌型である。

これらの２種類のＩｇＥの全体構造は幾分具なっており、膜結合型はエキストラ セグメントを備えている。細胞表面との結合の全体的特徴も、Ｂ細胞上のＩｇＥ と好塩基球上のＩｇＢとでは異なっている。あるクラスのｉｇｅ、　ｂｌ、抗原 決定基は、ＩｇＢ分子の結晶化断片領域内のＦｃｅＲの結合部位またはその付近 に位置している。これらの抗原決定基はＦｃｅＲとの結合によって目立たなくな る。別のクラスのｉｇｅ、　ｂｌ、抗原決定基は、免疫グロブリンεＨ鎖の膜結 合領域の細胞外セグメントの部分を包囲する抗原決定基である。一般的に、様々 な膜結合免疫グロブリンのこれらのセグメントはｍｂ／ｅｃと呼ばれる。ＩｇＥ のｍｂ／ｅｃセグメントはεｍｂ／ｅｃセグメントと呼ばれる。本発明は、εｍ ｂ／ｅｅセグメントの配列決定に関するものである。

ｔｇｅ、ｂｌ、抗原決定基の識別により、ｉｇｅ、　ｂＬ抗原決定基と特異的に 結合する試薬に基づいたＬｇＥ媒介アレルギーの様々な形式の治療及び診断を行 うことができる。これらには非本態性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、枯草熱等 のアレルギー性疾患及び植物及び薬品アレルギーが含まれる。ｉｇｅ、　ｂｌ、 抗原決定基と特異的に結合する好適な試薬は単一クローン性抗体及びそれのフラ グメントである。しかし、本発明の治療方法では、特異的に結合する試薬は、ｉ ｇｅ、ｂｌ、抗原決定基と特異的に結合する（従って好塩基球とは結合しないで ＩｇＥ産出性Ｂ細胞と結合する）ものであればどの分子でもよい。これらの試薬 には、抗ｉｇｅ、ｂ１．抗体の抗原結合領域（可変または超可変領域）と同一ま たはそれに類似した合成ペプチドが含まれる。以下の説明は主に抗ｉｇｅ、ｂ１ ．抗体に焦点を合わせているが、概念及び方法はここに記載する独特な抗原決定 基に特異なその他の分子にも同様に適用可能である。

ＩｇＢ産出性細胞を選択的に破壊することができる。ｉｇｅ、　ｂｌ。

抗原決定基はＩｇＥ産出性Ｂ細胞上に存在するがマスト細胞または好塩基球上に 存在しないので、ｉｇｅ、ｂｆ、抗原決定基に特異な単一クローン性抗体はＢ細 胞と結合するが、マスト細胞または好塩基球とは結合しない。この結合の差異に より、ＩｇＥ産出性Ｂ細胞を狙って選択的に排除することができる。遊離型また は毒素結合型のいずれかの抗体を用いて、Ｂ細胞を狙って選択的に排除すること ができる。単一クローン性抗体は、ＩｇＨに結合するＦｃｅＲの結合部位または その付近のｉｇｅ。

ｂｌ、抗原決定基に特異であるので、さらなる治療効果を持つことができる。抗 体はＩｇＥと結合して免疫複合体を形成するので、網内皮糸による免疫系からの ＩｇＢの排除が容易になる。

本発明はさらに、ｉｇｅ、ｂｌ、抗原決定基と反応する抗体のバロトーブ（ｐａ 、ｒｏｔｏｐｅ）特異的、抗イデオタイブ性抗体、及び抗゛原決定基（例えばＦ Ｃ６Ｒ結合部位）をモデルとして形成されたペプチドに関し及び、ＩｇＥ媒介ア レルギー疾患の治療にこれらの抗イデオタイブ性抗体を使用すること及びこれら のペプチドを使用することとにも関している。

Ｒ亙旦里！ム旦朋 第１図は、ヒトＩｇＥのｍｂ／ｅｃセグメント（ε１ｍｂ／ｅｃ　）を決定する 方法を説明している。

第２図は、ｃＤＮＡライブラリからε、　ｍｂ／ｅｃを含有しているクローンを 選別するために使用されるＤＮＡプローブを示している。

第３図は、ヒトＥ鎖のＣＨ４ドメインのＣ末端と、プローブｂ及びｄの位置を示 している。

及五旦二■旦盈墨 １、免疫グロブリンＥの独特な抗原決定基本発明は、ＩｇＨに特有に存在する抗 原決定基（ｆｇｅ、ｂｌ、　）の発見に基づ（ものである。これらの抗原決定基 はＩｇＢ産出性Ｂリンパ球上に存在するが、マスト細胞及び好塩基球上には存在 しない。あるクラスのｉｇｅ、ｂｌ、抗原決定基はＦＣｅＲの結合部位またはそ の付近に位置している。これらの抗原決定基カ月ｇＥ産出性Ｂ細胞上のみに存在 することによって、ＩｇＢが好塩基球及びマスト細胞上のＦｃεＲと結合した時 にはこの抗原決定基は目立たなくなる。ｉｇｅ、　ｂｌ、抗原決定基は恐らく幾 つかの抗原的に異なった部位からなり、その各々は、ヒトＴｇＥ産出性Ｂ細胞と 反応するが好塩基球とは反応しない単一クローン性抗体、例え゛ばＥ８−５−３ ．　Ｅｌｌ−４−７０，Ｅｌｏｌ−１及びＥＩＯ−１２−５５（以下を参照され たい）との反応性によって区分けすることができる。

別のクラスのｉｇｅ、ｂｌ、抗原決定基はεｍｂ／ｅｃ抗原決定基である。これ らの抗原決定基は、免疫グロブリンの膜結合型上に存在するが、分泌型には存在 しない。Ｂ細胞は表面上に、免疫学的誘発時に抗原の受容体として機能するＩｇ Ｅなどの抗体分子を出している。膜結合免疫グロブリンは、Ｂ細胞表面Ｂ細胞上 のＩＯの膜結合免疫グロブリンはすべて、免疫グロブリンを膜に固着させるエキ ス、トライ−ツタイブ特異領域を備えている。これらのペプチド領域は４１〜７ ２個のアミノ酸を並べた長さであり、細胞膜に対する位置で３つのセグメントに 分割することができる。２５個の親水性かつ非極性アミノ酸残基からなる中間セ グメントは膜の脂質二重層内にあり、３〜２８個のアミノ酸残基からなるＣ末端 疎水性セグメントは細胞内にあり、１３〜２７個のアミノ酸残基を含有している Ｎ末端側のセグメントは酸性及び疎水性が高く、細胞膜の外側表面上にある。マ ウス及びラット１ｇＥの膜結合領域のこの部分には１９個のアミノ酸残基があり 、その中の１０個はＧｌｕまたはＡｓｐ残基である。細胞外セグメントの長さ及 び疎水性及び高い極性は、このセグメントが抗体に露出して接触しやすいことを 示している。

ＩｇＥは体内の３種類の細胞、すなわちＩｇＥ産出性Ｂ細胞、好塩基球及びマス ト細胞の表面上にだけ存在するので、これらのｉｇｅ、ｂｌ、抗原決定基はｉｇ ｅ、ｂｌ、産出性Ｂ細胞の実質的に独特な細胞表面マーカーである。これらの新 しいマーカーにより、ＩｇＥ媒体アレルギー疾病の幾つかの形式の単一クローン 性抗体による療法が可能となる。

２．１ｇＢ産出性Ｂ細胞と結合するが好塩基球とは結合しない単一クローン性抗 体 ｉｇｅ、　ｂｌ、抗原決定基に特異な単一クローン性抗体は、ＩｇＢ産出性Ｂ細 胞の表面上のＩｇＥと結合するが、好塩基球とは結合しない。ＩｇＢ産出性細胞 タイプのこの結合の差異が、抗体に対する治療及び診断に利用する根拠である。

抗体が好塩巣球と結合してヒスタミンの放出を誘発しないことが極めて重要であ る。マスト細胞及び好塩基球からのアレルギーの薬物メディエータの放出を引き 起こす最も強力な試薬の１つは抗１ｇＥ抗体である。従来の抗１ｇＥ抗体はマス ト細胞及び好塩基球の表面上のＩｇＥと結合してアレルギーの薬物メディエータ の放出を引き起こす。本発明の抗体はこれらの細胞上のＩｇＢと結合しないが、 それは同族抗原決定基がマスクされているためにこれらの細胞からのヒスタミン の放出を誘発しないからである。

３．１ｇＥ産出性細胞の選択的排除によるＩｇＥ媒介アレルギーの治療 Ａ、　ＩｇＥ産出性細胞に特異的な抗体ねずみ、ヒトまたはマウス／人キメラ抗 体等のＩｇＢ産出性Ｂ細胞に特異な抗体はＩｇＢ媒介アレルギーの治療に幾つか の方法で用いることができる。このため、抗体はＩｇＥ産出性Ｂ細胞を選択的に 排除するために使用することができる。抗体は、免疫機能を媒介する作動試薬と して、あるいは以下に記載するように作動物質を運ぶための毒素または細胞毒剤 のキャリヤ試薬として使用することができる。

標的細胞上の表面抗原に特異な抗体が媒介できる様々な免疫機能の中に、抗体及 び補体媒介細胞分解と、抗体依存細胞ＩｇＧサブクラスの抗体、例えばマウスＩ ｇＧ２ａ及びヒトＩｇＧ　１及びＩｇＧ　３は、ある結晶化断片受容体産出性食 細胞リンパ球によって実施されるＡＤＣＣを媒介することができる。例えば、ヒ トＴ細胞表面抗原に特異なマウスＩｇＧ２ａ単一クローン性抗体である０ＫＴ３ 　（治療薬として市販することを米国食品医薬品間によって認可された最初の単 一クローン性抗体）を患者に使用すると、血液中のＴ細胞が急激に消失して（腎 臓移植に対する）免疫抑制状態が誘導される。ラッセルＰ、　Ｓ、他のＡｎｎｕ 。

Ｒｅｖ、　Ｍｅｄ、３５：６３−７９（１９８４）；ノーマンＤ、　Ｊ、他の［ 移植プロセスＪ　（Ｔｒａｎｓｌ）１．Ｐｒｏｃ、）１７：３９−４１（１９８ ５）。０ＫＴ３を一患者に５ｍｇＺ日の割合で投与することにより、循環中のＴ 細胞を完全になくすことができる。本発明の抗体、特にマウスガンマ２ａ抗体ま たはヒトガンマ−１ま、たはガンマ−３鎖を産出するキメラ抗体を使用すれば、 ＡＤＣＣ機構によってＩｇＢ産出性Ｂ細胞をなくすことができる。抗体は、Ｉｇ Ｅ媒介アレルギー疾患の患者にＩｇＥ　産出性細胞をほどんど排除し、従ってＩ ｇＥをほとんどなくすことができるだけの量を遊離抗体として投与する。

例えば、−患者の投与量を１〜５０ｍｇにすることができる。

この処置は１回または数回の注射で行うことができる。Ｂ細胞を排除するために 必要な抗体の存在期間及び抗体の量は、ために必要なもの以下である。

上記治療目的には、ヒト抗体が最適である。しかし、ヒト抗体は大量に産出する ことが難しい。その代わりとして、キメラ性すなわち「近ヒト」抗体が好適であ る。キメラ抗体は、動物（例えばマウス）抗体から誘導された可変または抗原結 合（超可変または相補性決定）領域と、ヒト抗体から誘導された残りの領域とを 有している。キメラ性（例えばネズミ／ヒト）抗体を産出する方法を以下に説明 する。キメラ性抗体は大量に産出することができ＼非ヒト抗体よりも人間での免 痴性が少ない。従って、これらは、特に長期に渡って繰り返し投与する必要があ る時、動物抗体よりも生体内投与に適している。キメラ性抗体の抗体フラグメン トも使用することができる。

本発明の抗体を用いた免疫療法は、従来の減感作免疫療法と組み合わせて用いる ことができる。例えば、アレルギー原の減感作を抗Ａｇｅ、　ｂｌ。抗体または 免疫毒素の投与と組み合わせて実施することにより（次項Ｂを参照）　、ＩｇＥ 産出性細胞をほとんどなくすことができる。減感作の１つの大きな効果は、Ｉｇ Ｇがアレルギー原／免疫原に対して誘発されることである。ＩｇＢ産出性Ｂ細胞 がほとんどな（なった時、ＩｇＧ反応の誘発が最も効果的である。抗体と減感作 療法の組合せは魅ツノ的な療法形式である。ＩｇＥ産出性Ｂ細胞は抗ｉｇｅ、　 ｂｌ、抗体によって一時的に（２〜３週間または２〜３力月）消失するが、最終 的には再び発生ずる。減感作療法はもっと長く持続する効果を持っている。

Ｂ、　ｉｇｅ、ｂｌ、特異抗体とＡＤＣＣ促進因子とを組み合わせた免疫療法 多くの因子、例えばＧＭ−Ｃ３Ｆ　（顆粒球単核球一群体刺激因子）またはＭ− Ｃ３Ｆ　（単核球一群体刺激因子）が、ＡＤＣＣを媒介するものを含めて白血球 の増殖を誘発することが知られている。試験管内実験では、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＭ −Ｃ３Ｆが、腫瘍細胞上に現れた表面抗原に特異な単一クローン性抗体によって 媒介された腫瘍細胞に対するＡＤＣＣ活性を増加させるとわかっている。

アレルギー治療におけるｉｇｅ、ｂｌ、特異単一クローン性抗体の治療効果は、 ＡＤＣＣ活性を高める因子の使用を組み合わせることによって増強できると考え られる。

Ｃ，ＩｇＥ産出性細胞に特異な免疫毒素ｉｇｅ、　ｂｌ、抗原決定基は、ＩｇＢ 産出性Ｂ細胞を攻撃する免疫毒素にとって非常に特異的な標的となる。抗原決定 基に特異な免疫毒素はＩｇＢ産出性Ｂ細胞と結合するが、マスト細胞または好塩 基球とは結合しない。このようにして、ＩｇＢ産出性Ｂ細胞をＩｇＥ媒介アレル ギーの患者内で選択的に減少させるか、なくすことができる。ＩｇＥ産出性細胞 の減少により、循環中のＩｇＢ値が減少する結果、マスト細胞及び好塩基球と結 合することができるＩｇＨの量が減少する。免疫毒素は、マスト細胞または好塩 基球を殺してこれらの細胞からの薬物メディエータの放出を引き起こすことはな い。ＩｇＢ産出性リンパ球と選択的に結合する免疫毒素は、ｉｇｅ、　ｂｌ、抗 原決定基に特・異な結合剤と複合化した細胞溶解または細胞素剤からなる。

好適な特異的な結合剤は、抗ｉｇｅ、−ｂ１．抗体またはそのフラグメント（例 えばＦ（ａｂ）’２　、Ｆａｂ　、　Ｆｖ、またはそれらの類似体または誘導体 ）である。細胞溶解剤は、リシン、シュードモナス菌毒素、ジフテリア毒素、ア メリカヤマゴボウ抗ウイルスペプチド、トリコセシーン（ｔｒｊｃｈｏｔｈｅｃ ｅｎｅ）　、放射性核種、及び膜分解酵素を含む入手可能な物質のいずれかから 選択できる。抗体と細胞毒素とは、化学的または遺伝工学的技法によって複合さ せることができる。

免疫毒素は、患者内のＩｇＥ産出性リンパ球を減少させるかなくすことができる 量をＩｇＢ媒介アレルギーの患者に投与することにより、ＩｇＥ媒介アレルギー の症状を防止するか軽減することができる。免疫毒素は単独で使用したり、ある いは遊離抗１ｇＢ抗体と組み合わせて使用することもできる。

４、好塩基球及びマスト細胞上のＩｇＢと結合しない単一クローン性抗体による ＩｇＥの除去 ある実施例では、本発明の単一クローン性抗１ｇＢ抗体が溶性１ｇＢのＦｃｅＲ 結合部位またはその付近に位置しているｉｇｅ。

ｂｌ、抗原決定基と結合する。それにより、抗体がマスト細胞及び好塩基球に対 するＩｇＢ上の結合部位を塞ぎ、これも治療効果の一部を担う。この効果的と思 われるさらなる治療機構を達成するため、ＦＣｅＲがＩｇＥと結合する親和力よ りも大きい親和力で抗体が抗原決定基と特異的に結合しなければならない。この ように特異性と親和性とを組み合わせることにより、薬学的実現可能濃度でＩｇ ＥがＦｃεＲと結合することを効果的に阻止できる。また、ＩｇＢ及び単一クロ ーン性抗体の免疫複合体は、網内皮糸の細胞によって急速に除去される。単一ク ローン性抗体を静脈注射すると、恐らくは循環中のほとんどのＩｇＢ分子が免疫 複合体を形成して、急速に除去される。

これらの機構により、治療単一クローン性抗体が十分なレベルで存在している限 り、被治療患者の体内の遊離１ｇＨの値が減少する。これらの様々な機構は、治 療抗体の短期的効果に役立つはずである。しかし、長期的な治療効果はこれらの 機構以外で達成されるのであろう。３日間の血清半減期でＩｇＥが始動して急速 に再生するので、ｉｇｅ、　ｂｌ、抗体に基づいた治療はＩｇＥ産出性Ｂ細胞を なくすか減少させることが最も効果的であろう。

親和性は親和または結合定数Ｋａで表すことができる。マス０１１ノットル１モ ルである。クルジツキ（Ｋｕｌｃｚｙｃｋｉ）　Ａ、の「アレルギーにおける新 しい流れＩＩＪ　（リング　Ｊ、　及びバーブ　６１編）ｐｐ、２５〜３２、ニ ューヨーク、スプリング−バーラグ、（１９８６）、このように、単一クローン 性抗１ｇＥ抗体は、それのＩｇＨに対する親和定数がおよそｌＸｌ０’　リット ル１モルかそれ以上である場合、ＦｃεＲと効果的に競合する。

一般的に、単一クローン性抗体のＫａはｌＸｌ０’　リットル１モル以下である 。その結果、抗体が上記抗原決定基に対して適当な特異性を備え、上記機構によ ってＩｇε産出性Ｂ細胞をなくすことができるとしても、薬学的実現可能濃度で ＩｇＢに対してＰｃεＲと効果的に競合できる値のＫａでなければ、このさらな る治療効果を持つことができない。

好適な実施例では、本発明の単一クローン性抗１ｇＢ抗体のＩｇＢに対するＫａ は、ＩｇＢに対するＦｃεＲの親和性に匹敵するか、それ以上である。体内のマ スト細胞及び好塩基球はＩｇＢと結合し、はとんどではＦｃεＲの大部分がＩｇ Ｅで飽和されている。ＩｇＢ分子の「オン」　（受容体占有）期間の半減期は約 １９７６（１９７４）。１ｇ８分子がマスト細胞または好塩基球から解離すると 、患者に投与された親和性が高い抗ｉｇｅ、　ｂｌ、抗体がそれらとしっかり結 合して、それらがＦｃεＲと再結合することを阻止する。１ｇ８分子は「オン」 期間が長く、好塩基球及びマスト細胞からゆっくり解離するから、治療効果が得 られるのは、好塩基球及びマスト細胞上のＩｇＨの大部分がＦｃεＲから解離し て抗ＩｇＥ抗体と複合化されて除去される処置後２〜３日してからである（また はそれ以上に長くかかる）。これが達成されれば、好塩基球及びマスト細胞上の ＦｃεＲ分子と結合した１ｇ８分子の密度は大幅に減少し、その結果、アレルゲ ンはヒスタミンを誘発できるだけの数のＦｃεＲの架橋ができない。

５．１ｇＥ産出性細胞と特異的に結合する抗体の診断的使用ｉｇｅ、　ｂｌ、抗 原決定基に対する抗体を使用して、混合白血球集団内のＩｇＢ産出性リンパ球を 識別して数えることができる。

このためには、抗体は細胞表面抗原を決定するための標準アッセイフォーマット で使用できる。一般的に、テストしようとする白血球のサンプルに抗体を、その 抗体がサンプル中のＩｇＥ産出性細胞と結合できる状態で接触させる。次に、抗 体の結合について細胞を調べる。・とれは従来の細胞着色方法で実施できる。例 えば、蛍光色を付けた第２抗体を用いて、抗ＩｇＢ抗体の結合を検出する。

６、抗１′デオタイプ性抗体及びＩｇＢに対する活性免疫化以上に記載したｉｇ ｅ、ｂｌ、特異性単一クローン性抗体を用いて、ＩｇＥ媒介アレルギーを治療す る別の方法を提供するパロトーブ特異性抗イデオタイブ性抗体を産生ずることが できる。

ｉｇｅ、　ｂｌ特異性抗体のパロトーブに対する抗体は、抗１ｇＥ抗体が特異的 である抗原決定基と構造的に類似している、すなわちそれらはｉｇｅ、　ｂｌ、 抗原決定基と類似している。これらの抗イデオタイプ性抗体を用いて、ｉｇｅ、 　ｂｌ、に対して能動的に免疫を生゛じて、ｉｇｅ、ｂｌ、抗原決定基に対する 抗体の内因性形成を誘発する。この誘発された抗体がｉｇｅ、ｂｌ、特異性抗体 の様々な治療効果を媒介するのである。

ＩｇＢは「自己分子（ｓｅｌｆ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）　Ｊであるから、それは一 般的に免疫を生じない。しかし、本発明のパロトーブ特異性抗体を用いれば、Ｉ ｇＨに対する活性免疫化が可能になる。

バロトーブ特異性抗体は、抗原決定基に対する免疫反応を人間に引き出すことが できる抗原、すなわちｉｚｅ、　ｂｌ、抗原決定基と構造的に類似している。

パロトープ特異性抗イデオタイプ性抗体は、ｉｇｅ、ｂｌ、抗体抗体として投与 する。それらは抗体フラグメント（性質はやはりキメラ性でもよい）または類似 体にしてもよい。

７、マスト細胞及び好塩基球のＦｃεＲをブロックするペプチド 本発明はさらに、溶性ＩｇＢ上のｉｇｅ、ｂｌ、抗原決定基をモデルとしたペプ チドを提供している。ペプチドは、溶性１ｇＥのｉｇｅ、　ｂｌ、抗原決定基の アミノ酸配列と同一または同等のアミノ酸配列を有している。例えば、ペプチド は、抗体Ｅ８−５−３、Ｅｌｌ−４−７０、Ｅｌｏｌ−１及びＥｌｏ−１２−５ ５または以下に記載するその他の抗ｉｇｅ、　ｂｌ、抗体によって定義された抗 原決定基に相当する配列にすることができる。ＦｃεＲの結合部位に対応するペ プチドを用いて、ＩｇＨのマスト細胞及び好塩基球との結合を阻止することがで きる。

８、εＸｌ１ｂ／ｅｃペプチド類似体及びεｍｂ／ｅｃ抗原決定基に対する活性 免疫化 ヒトεｍｂ／ｅｃペプチドは恐らく人間には免疫を生じないが、同じ配列のペプ チドおよびアミノ酸置換体は免疫を生じて、本物のεｍｂ／ｅｃ抗原決定基と交 さ反応する抗体を産生ずることができる。これらのεｍｂ／ｅｃペプチド類似体 をＩｇＢ媒介アレルギーの患者に投与することができる。この活性免疫化によっ て産生された抗体は、本説明に記載の抗体としての機能を果たすことができる。

９．８細胞膜績合免疫グロブリンのペプチド片の固着Ｂ細胞はその表面に抗体分 子を出しており、これらが免疫的誘発時に抗原の受容体として機能する。膜結合 免疫グロブリンは、細胞表面上に免疫グロブリン分子を固着させるエキストラペ プチド片を備えている点で、同じ細胞で合成される分泌性免疫グロブリンと異な っている。

幾つかの種類の１０の膜結合免疫グロブリンのアミノ酸配列データが確認されて いる。イシダ　Ｎ、他のＥＭＢＯＪ。

１　：　１１１７（１９８２）、スティーン（Ｓｔｅｅｎ）Ｎ、Ｌ　、他のＪ、 Ｍｏ１、　Ｂｉｏｌ、　１？７　：　１９〜３２　（１９８４）、ロガーズ（Ｒ ｏｇｅｒｓ）Ｊ　、他のセル２６：１９〜２７　（１９８１）、ヤマワキーカタ オカＹ、他のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＭＳＡ、　７９　：　２ ００８〜２０１２（１９８２）、カマロミイ（Ｋａｍａｒｏｍｙ）Ｍ　、他のＮ ｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、ｌｌ：６７７５〜６７８５（１９８３）、ロガー ズＪ、他のセル２０　：　３０３〜３１２（１９８０）、バーンスタイン（Ｂｅ ｒｎｓｔｅｉｎ）Ｋ、　Ｅ、のＪ、　Ｅｍｍｕｎｏｌ、１３２：４９０〜４９５ 　（１９８０）、チェノ（Ｃｈｅｎｇ）　Ｈ−他のＮａｔｕｒｅ２９６　：　４ １０〜４１５（１９８２）を参照されたい。これらの配列は細胞膜結合ペプチド 片のある共通の特徴を表している。第１表に示すように、ペプチド固着片は、細 胞膜に対するそれらの位置に基づいて識別できる３つのセグメントを備えている 。これらのペプチド片は短く、４１〜７２のアミノ酸残基を並べた長さであり、 「膜結合ドメイン」と呼ばれることも多いが、ペプチド全体が膜脂質二重層内に あるわけではない。事実、ペプチドの中央部分に位置している２５のアミノ酸残 基、疎水性が高い残基及びトレオニン及びセリン残基だけが脂質二重層内にある 。３〜２８のアミノ酸残基からなるＣ末端親水性セグメントは膜の細胞質側にあ る。免疫グロブリンＨ鎖の第３または第４定ドメイン（ＣＨｓまたはＣＨ４）に 接続しているＮ末端側のセグメントは親水性が非常に高く、細胞膜の細胞外にあ る。

第１表　Ｂ細胞上の膜結合免疫グロブリンに特有のペプチドセグメントの重要な 特徴及び性質筒１　中央　最終　合計 セグメント　セグメント　セグメント マウスＩｇＥ１９　２５　２８　７２ ラットＩｇＥ１９　２５　２８　７２ マウスＩｇＧ１１８　２５　２８　７１マウスＩｇＧ２ａ　１．８　２５　２　 ｇ　７１マウスＩｇＧ２ｂ１８　２５　２８　７１マウスＩｇＧ３１８　２５　 ２８　７１マウスＩｇＭ３１３　２５　３　４１ ラビットＩｇＭ１３　２５　３　４１ ヒトＩｇＤ　２７　２５　３　５５ マウスＩｇＤ２６　２５　３　５４ 性質　親水性　親水性　疎水性 強い酸性　非極性残基 物理的位置　外表面上　膜脂質二重層内　細胞質表面上省略記号　ｍｂ／ｉｃ　 ｍｂ／ｅｃ　ｍｂ／１ｍセグメント　セグメント　セグメント ネｍｂ−膜結合；ｅｃ−細胞外；　ｔｍ＝膜内；　ｉｃ＝細胞内免疫グロブリン の膜結合片の細胞外セグメント（ｍｂ／ｅｃセグメント）の最短長さは１３のア ミノ酸残基（マウス及びラットμ鎖）の長さである。第２表を参照されたい。す べての免疫グロブリンのｍｂ／ｅｃセグメントは、はとんどすべて酸性残基であ る帯電アミノ酸残基を高い割合で含んでいる。帯電アミノ酸残基及び極性親水性 残基の割合から、アミノ酸組成物の中のｍｂ／ｅｅセグメントの比率が非常に高 いことがわかる（第３表）。これらのパラメータは、すべてのｍｂ／ｅｃセグメ ントが露出して抗体と接触できる長さであることを示している。免疫グロブリン μ鎖の進化の研究から、ε及びγ鎖がその他の鎖よりも互いに関連性が強い（新 しい共通の祖先を持っている）ことがわかっている（リン（Ｌｉｎ）　Ｌ、Ｃ， 及びビュートナム（Ｐｕｔｎａｍ）Ｆ、Ｗ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ 、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ、１９８１　）　。また、マウス、ラット及びヒトなどの様 々なは乳類が進化する前にμ鎖は進化していた。このため、確認されているｌＯ の様々なｍｂ／ｅｃセグメントの中で、配列がまだ報告されていないヒトε、　 ｍｂ／ｅｃと最も関連性があるものはネズミまたはラットεｍｂ／ｅｃであろう 。次に最も関連性が強いものはγ鎖である。ネズミまたはラットεｍｂ／ｅｅに は１９のアミノ酸残基が含まれ、その中に８のＧｌｕ及び２のＡｓｐが含まれて いる。

これらのデータからも、ヒトεｍｂ／ｅｃが露出して抗体と接触可能であること がわかる。

第２表　膜結合免疫グロブリンに特有のペプチドセグメントの外側部分（ｍｂ／ ｅｃセグメント）のアミノ酸配列 ｍｂ／ｅｃセグメント マウスＩｇＥ　ＥＬＤｌ、　ＱＤＬＣｌ、　ＥＥＶＥＧ、　ＥＥＬＥＥラットＩ ｇＥ　ＥＬＤｌ、　ＱＤＬＣＴ、　ＥＥＶＥＧ、　ＥＥＬＥＥマウスＩｇＧ　Ｉ 　ＧＬＱ、ＬＤＥＴＣ，ＡＥＡＱＤ、ＧＥＬＤＧマウスＩｇＧ　２　ａ　ＧＬＤ 、ＬＤＤＶＣ，ＡＢＡＱＤ、ＧＥＬＤＧマウスＴｇＧ　２　ｂ　ＧＬＤ、ＬＤＤ ＩＣ，ＡＥＡＫＤ、ＧＥＬＤＧマウスＩｇＧ　３　ＥＬＥ、ＬＮＧＴＣ，ＡＥＡ ＱＤ、ＧＥＬＤＧｖ　ウスＮｇＭ　ＥＧＥ、　ＶＮＡＥＥ、　ＥＧＦＥＮラビッ トＩｇＭ　ＥＧＥ、　ＶＮＡＥＥ、　ＥＧＦＥＮヒトＩｇＤ　ＹＬ、　ＡＭＴＰ Ｌ、　Ｉ　ＰＱＳＫ、　ＤＥＮＳＤ、　ＤＹＴＴＦ、　ＤＤＶＧＳマウスＩｇＤ 　Ｉ、ＶＮＴＩＱ、　Ｈ３ＣＩＭ、　ＤＥＱＳＤ、　ＳＹＭＤＬ、　ＥＥＥＮＧ 第３表　膜結合免疫グロブリンに特有のペプチドセグメントの外側部分（ｍｂ／ ｅｃセグメント）の帯電アミノ酸残基及び極性親水性アミノ酸残基の組成合計　 酸性　塩基　極性　合計親水　親水仕残残基　残基　残基　性残基　基の割合 ＃アミノ酸残基　％ マウスＩｇＥ　１９　１０　０　２　１２　６３ラットＩｇＥ　１９　１０　０ 　２　１２　６３マウスＩｇＧ１１８　６　０　４　１０　５６マウスＩｇＧ２ ａ１８　７　０　２　９　５０マウスＩｇＧ２ｂ１８　７　１　１　９　５０マ ウスＩｇＧ３１８　６　０　４　１０　５６マウスＩｇＭ１３　６　０　２　８ 　６１ラビットＩｇＭ１３　６　０　１　７　５４ヒトＩｇＤ　２７　６　１　 ８　１５　５６マウスＩｇＤ　２６　７　０．５　９　１６．５　６３酸性残基 ：　Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｄ（Ａｓｐ）塩基性残基：　Ｋ（Ｌｙｓ）、　Ｒ（Ａｒｇ） 、　Ｈ（Ｈｉｓ）；　Ｈｉｓは部分的に帯電している。

極性残基：　５（Ｓｅｒ）、　Ｔ（Ｔｈｒ）、　Ｃ（Ｃｙｓ）、　Ｑ（Ｇｉｎ） 、　Ｎ（Ａｓｎ）１０、ヒトＩｇＥのｍｂ／ｅｃセグメント（ｔ　、　ｍｂ／ｅ ｃセグメント）のアミノ酸配列の決定 ヒトε、　ｍｂ／ｅｃセグメントに対応したＤＮＡ配列の決定には多くの十分に 確立された方法を用いることができる。１つの方法（第１図）では、始点で表面 上にＩｇＢが出ているヒト骨髄腫細胞系のｍＲＮＡの準備をする。これには５Ｋ ＯＯ７細胞を使用できる。ｍＲＮＡを準備すれば、λファージまたはブラズミド を含むクローンベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを形成することができる 。ｃＤＮＡライブラリーを形成する好適な方法として、インビトロアン（Ｉｎｖ ｉｔｒｏｇｅｎ）　（米国カリフォルニア州、サンディエゴ）が開発、市販して いるｃＤＮＡライブラリー構造システムキット−ライブラリアン（Ｌｉｂｒａｒ ｉａｎ）　Ｉを用いる。

段階的な詳細指示マニュアルが、細胞からのＲＮＡ分離、逆転写、第２ストラン ド合成、リンカ−ライゲーション、ｃＤＮＡのアガロースゲルサイジング、ｃＤ ＮＡを精製するための電気溶離、ベクターライゲーション、及び大腸菌の転換に 対して準備されている。このライブラリーに使用されるベクターはｐＣＤＭ８で ある。

ε、　ｍｂ／ｅｃセグメントを含んでいるクローンをめてｃＤＮＡライブラリー をスクリーニングする際に、幾つかのプローブを使用することができる。第２図 に示すように、ライブラリーはεｍＲＮＡ　（非膜結合セグメント）の長さのほ とんどの部分をカバーするｉ、　ｉｉ＜ｂ長さのＬＩ２６６　ｃＤＮＡであるＤ ＮＡプローブでスクリーニングすることができる。分泌型及び膜結合型の両方を 含む正のクローンは、さらなるプローブを用いて区別することができる。プロー ブｂは、膜結合型のヒトε鎖においてＣ）１４ドメインの端部が切り取られてい るという非常に有望な性質を利用して開発されたものである。ＣＨ４ドメインお よび膜結合ドメインの遺伝子セグメントが移動した時に切形が発生する。Ｃ末端 の喪失は、ＣＨ，ドメインを含む、免疫グロブリンのε及びμの膜結合型で発生 する。ヒトε、　ＣＨ４ドメインのヌクレオチド配列について発行されている情 報から、最も可能性のあるスプライシング供給部位は、終止コドンＴＧへのイン トラコドン（ｉｎｔｒａｃｏｄｏｎ）ＧＴ、　７１　ｂｐ　５°である。イント ラコドンではなく、スプライシング供給部位である可能性が低い別のＣＴＧ方が 末端に近い（終止コドンまで２４ｂｐ５′）。

プローブｂに対する特異的位置が第２及び第３図に示されている。プローブはε 鎖遺伝子の分泌型と反応するが、ε鎖遺伝子の膜結合型とは反応しない。

プローブＣの構造は、以上のような配列のすべての免疫グロブリン遺伝子におい て膜結合ドメインの膜内セグメント（ｍｂ／１ｍセグメント）が非常にうまく保 存されるという発見に基づいている。このｍｂ／１ｍセグメント内にペプチドセ グメント及びそれに対応してコードしているＤＮＡがあり、これはすべての免疫 グロブリンにおいてほぼ同一である。第４表に示すように、８組の同意義のＤＮ Ａ配列をプローブＣとして使用できる。第２図はプローブの位置を示している。

第４表　膜結合免疫グロブリンのペプチドセグメントの膜内部分（ｍｂ／Ｌｍセ グメント）における保存領域マウスＩｇＥ　Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｌｅａ、 　Ｓｅｒ。

ラットＩｇＥ　ＣＴＧ、ＴＴＣ，ＣＴＧ、ＣＴＣ，ＡＧ。

マウスＩｇＧ　Ｉ　ＣＴＧ、ＴＴＣ，ＣＲＧ、ＣＴＣ，ＡＧ。

マウスＩｇＧ２ａ　ＣＴＣ，ＴＴＣ，ＣＴＧ、ＣＴＣ，ＡＧ。

マウスＩｇＧ２ｂ　ＣＴＣ，ＴＴＣ，ＣＴＧ、ＣＴＣ，ＡＧ。

マウスＩｇＧ３　ＣＴＣ，ＴＴＣ，ＣＴＧ、ＣＴＣ，ＡＧ。

マウスＩｇＭ　ＣＴＣ，ＴＴＣ，ＣＴＣ，ＣＴＧ、　ＡＧ。

ラビットＩｇＭ　ＣＴＧ、ＴＴＣ，ＣＴＧ、　ＣＴＧ、　ＡＧ。

ヒトＩｇＤ＊　ＣＴＣ，ＴＴＣ，ＡＴＣ，ＣＴＣ，ＡＣ。

マウスＩｇＤ＊　ＣＴＣ，ＴＴＣ，ＣＴＧ、ＣＴＣ，ＡＣ。

ＣＧＣ 同意義配列　ＣＴ、ＴＴＣ，ＣＴ　、ＣＴ　、ＡＧ（プローブｃ）　Ｇ　ＣＧ ＊ヒト及びマウスＩｇＤ’は第５アミノ酸残基にＴｈｒ（ＡＣＸＯ）を有してい る。ヒトＩｇＤはさらに第３アミノ酸残基にｌ１ｅ（ＡＴＣ）を有してる。これ らは同意義配列によってカバーされない変異体である。

最も可能性のあるスプライシング供給部位ＧＴよりも上流側のセグメントを表す プローブｄは３６ｂｐからなる（第２及び第３図）。このプローブは分泌型及び 膜結合型の両方のε鎖遺伝子と結合しなければならない。

第５表は、４つのプローブでの分泌型または膜結合型のε遺伝子を含むクローン の反応性のパターンをまとめたものである。

第５表　プローブａ、ｂ、ｃ及びｄでのε遺伝子含有ｃＤＮＡクローンの反応性 ε分泌型　ε膜結合型 膜結合ε鎖含有クローンに必要なライブラリーサイズは、ｍＲＮＡがどの程度に 多いかによって決まる。分泌型ＩｇＥが０．ｌＸの５ＫＯＯ７ポリＡ　＋ＲＮＡ 　を含有しているとすると、正のクローンを９９％の確率で分離できるようにす るためには、ライブラリーサイズは約ｓ、　ｏｏｏの独立組換え遺伝子でなけれ ばならない。ＩｇＥ産出性ラットイムノサイト−７（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍａ ）ＩＲ２及び！Ｒ１，６２細胞では、ε鎖の膜結合型に対するｍＲＮＡが分泌型 の場合の２％以上であることがわかった。ε鎖の膜結合型／分泌型のこの割合が ヒ）ＩｇＥ産出性５ＫＯＯ７細胞についても同じであるとすると、膜結合型ε鎖 を分離するために必要なｅＤＮＡライブラリーサイズは約２５０．０００である 。好適な方法では、それより多い１．０００．０００のクローンがスクリーニン グされる。

ｃＤＮＡライブラリーを形成して細胞ｍＲＮＡ種を表すクローンのスクリーニン グを行う従来方法の変更例として、ｍＲＮＡを増幅してそれらの対応のＤＮＡを 高い割合で産出するものがある。

これによって得られたＤＮＡをゲル電気泳動によって精製してから、配列分析を 行う。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅と呼ばれるこの方法は、２〜３年前 に確立されたものであり、試薬及び装置を含む完全なシステムが市販されている 。１つの好適なシステムがパーキン・エルマー・セタス（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅ ｒ　Ｃｅｔｕｓ）　（Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）から提供されている。試薬キット はジェネアンブ（ＧｅｎｅＡｍｐ）ＤＮＡ増幅試薬キットであり、装置はＤＮＡ サーマルサイクラ−である。

この方法に使用される特殊な試薬の一部は、ｃＤＮＡライブラリーのクローニン グに使用されているものと同じである。ε鎖の膜結合セグメントの配列はいずれ も確認されていないので、この方法ではε鎖の分泌型及び膜結合型の両方を増幅 する。２つのプライマー、すなわちオリゴ　ｄＴ　（２５−３０−メラーズ（ｍ ｅｒｓ））と第２及び第３図のプローブｄに対応するオリゴマーとが用いられて いる。プローブｄは最も可能性があるスプライシング供給部位に５°で位置決め され、従ってεｍＲＮＡ及分析する。ε鎖の分泌型はプローブｂに対するそれの 反応性で区別できる。次に、精製されたＤＮＡに対してＤＮＡ配列決定を行う。

ＰＣＲ増幅は、ポリＡ　＋ＲＮＡブールにはうまく表されないｍＲＮＡに対する ｅＤＮＡクローニングよりも効果的な方法に思われる。

Ｕ２６６ε鎖ｅＤＮＡを用いて、鋳型ＤＮＡとオリゴプライマーとの間に幾つか の予備アニーリング状態を作り出すことができる。

膜結合セグメントに符号を付ける遺伝子を含むＤＮＡクローンを得る別の方法と して、ヒトゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングがある。ヒトゲノムＤＮ Ａライブラリーは容易に入手可能である。好ましい供給源は、ストラドジエン（ Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅ）　（米国カリフォルニア州、う・ジョラ）によって提供 されたヒトの肺繊維芽細胞Ｗ１３８細胞を用いて形成されたライブラリーである 。遺伝子はλベクター内にあり、挿入されたＤＮＡの平均ザイズは１５Ｋｂｐ　 である。クローンの識別は、０２６６ｃＤＮＡクローンＤＮＡとの交配によって 可能となる。膜結合領域に対応した遺伝子セグメントの位置は、膜内セグメント の相同マウス遺伝子から準備されたプローブを用いて決定できる（第２図のプロ ーブＣ及び第４表）。次に、膜結合セグメントの配列が決定される。

１０Ａ、ヒトε鎖のペプチドを固着させる膜をコードしているＤＮＡのヌクレオ チド配列 ヒト膜結合ε鎖のペプチドを固着させる膜に対してコードしているセグメントを 包含するゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列が確認されており、それを膜のペプチ ド固着部分の推定アミノ酸配列と共に以下に示す。ｊ−クソンの指定は、ドナー 及びアクセプターを接合するためのヌクレオチドを識別し、またマウス膜結合ε 鎖及び他のクラスの免疫グロブリンの公表の相同配列と比較することによって行 われた。

、、　、　、　、　、　ＣＧＣＴＧＣＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＧＧ ＣＣＴＧＡＣＴＧＧＣＣＡＧスプライスアクセプタ ＧＴＣＣＣＣＣ罰ＡＧ、　ＣＴＧ、　ＧＡＣ，ＧＴＧ、　ＴＧＣ，ＧＴＧ、　Ｇ ＡＧ、　ＧＡＧ、　ＧＣＣ，ＧＡＧ。

Ｇｌｕ、　Ｌｅｕ、　Ａｓｐ、　Ｖａｌ、　Ｃｙｓ、　Ｖａｌ、　Ｇｌｕ、　Ｇ ｌｕ、　Ａｌａ、　Ｇｌｕ。

ＧＧＣ，ＧＡＧ、　ＧＣＧ、　ＣＣＧ、　ＴＧＧ、　ＡＣＧ、　ＴＧＧ、　ＡＣ Ｃ，ＧＧＣ，ＣＴＣ，ＴＧＣ，ＡＴＣ。

Ｇｌｙ、　Ｇｌｕ、　Ａｌａ、　Ｐｒｏ、　Ｔｒｐ、　Ｔｈｒ、　Ｔｒｐ、　Ｔ ｈｒ、　Ｇｌｙ、　Ｌｅｕ、　Ｃｙｓ、　ｌｉｅ膜エクソンエ ＴＴＣ，ＧＣＣ，ＧＣＡ、　ＣＴＣ，ＴＴＣ，ＣＴＧ、　ＣＴＣ，ＡＧＣ，ＧＴ Ｇ、　ＡＧＣ，ＴＡＣ，ＡＧＣ。

Ｐｈｅ、　Ａｌａ、、　Ａｌａ、　Ｌｅｕ、　Ｐｈｅ、　Ｌｅｕ、　Ｌｅｕ、　 Ｓｅｒ、　Ｖａｔ、　Ｓｅｒ、　Ｔｙｒ、　Ｓｅｒ。

スプライスドナー ＧＣＣ，ＧＣＣ，’ＣＴＣ，ＡＣＧ、　ＣＴＣ，ＣＴＣ，ＡＴＧ、口ＧＧＧＣＡ ＣＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＡ１．ａ、　Ａｌａ、　Ｌｅｕ、　Ｔｈｒ、　Ｌｅｕ 、　Ｌｅｕ、　Ｍｅｔ。

ＧＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧ ＡＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣイントロン スプライスアクセプタ ＣＡＣＧＣＣＣＴＣＣＣＣＴＣＫＥ］ＧＴＧ、　ＣＡＧ、　ＣＧＧ、　ＴＴＣ， ＣＴＣ，ＴＣＡ、　ＧＣＣ，ＡＣＧ。

Ｖａｌ、　Ｇｉｎ、　Ａｒｇ、　Ｐｈｅ、　Ｌｅｕ、　Ｓｅｒ、　Ａｌａ、　Ｔ ｈｒ。

ＣＧＧ、　ＣＡＧ、　ＧＧＧ、　ＡＧＧ、　ＣＣＣ，ＣＡＣ，ＡＣＣ，ＴＣＣ， ＣＴＣ，ＧＡＣ，ＴＡＣ，ＡＣＣ。

Ａｒｇ、　Ｇｉｎ、　Ｇｌｙ、　Ａｒｇ、　Ｐｒｏ、　Ｇｌｎ、　Ｔｈｒ、　Ｓ ｅｒ、　Ｌｅｕ、　Ａｓｐ、　Ｔｙｒ、　Ｔｈｒ。

膜エクソンＩＩ ＡＡＣ，ＧＴＣ，ＣＴＣ，ＣＡＧ、　ＣＣＣ，ＣＡＣ，ＧＣＣ，ＴＡＧ、　ＧＣ ＣＧＣＧＧＧＣＡＣＴＣＡＣＡｓｎ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、　Ｇｌｎ、　Ｐｒｏ 、　Ｈｔｓ、　Ａｌａ、終わりＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＣＣ ，、、、。

ヒトε、　ｍｂ／ｅｃペプチドは膜エクソン１によってコードされた最初の１４ のアミノ酸として識別される。これは、膜内領域である−続きの約２５の疎水性 アミノ酸よりも上位である。ε、　ｍｂ／ｅｃの２つの予想構造を以下に示す。

ヒトε、　ｍｂ／ｅｃペプチドの予想構造構造　■ Ｈ 、、、、、Ｇｌｕ、　Ｌｅｕ、　Ａｓｐ、　Ｖａｔ、　Ｃｙｓ、　Ｖａｔ、　Ｇ ｌｕ、　Ｇｌｕ、　Ａｌａ、　Ｇｌｕ、　Ｇｌｙ。

Ｇｌｕ、　Ａｌａ、　Ｐｒｏ、、、、。

構造　■ 、、、、、　Ｇｌｕ、　Ｌｅｕ、　Ａｓｐ、　Ｖａｌ、　Ｃｙｓ、　Ｖａｌ、　 Ｇｌｕ、　Ｇｌｕ、　Ａｌａ、　Ｇｌｕ、　Ｇｌｙ。

Ｓ　Ｇｌｕ、　Ａｌａ、　Ｐｒｏ、、、　、。

、、、、　、　Ｇｌｕ、　Ｌｅｕ、　Ａｓｐ、　Ｖａｌ、　Ｃｙｓ、　Ｖａｌ、 　Ｇｌｕ、　Ｇｌｕ、　Ａｌａ、　Ｇｌｕ、　Ｇｌｙ。

Ｇｌｕ、　Ａｌａ、　Ｐｒｏ、、、、。

以下にさらに詳細に説明するように、ε、　ｍｂ／ｅｃペプチドを用いて、膜結 合免疫グロブリンＥと特異的に反応する抗体を産生ずることができる。このため に、ペプチドを標準的タンパク質合成法で化学的に合成する。ペプチドを合成す る好適な方法は、エフモック（Ｆｍｏｃ）化学を応用したＲａＭＰシステム（デ ュポン、ウイルミントン、ＤＨ）である。あるいは、タンパク質は、ペプチドを コードしているオリゴジオキシヌクレオチドを用いて生合成することもできる。

ヌクレオチド配列は、上記膜エクソンＩの５°部分として与えられて（Ｘる。

免疫原として、タンパク質を上記の一価または二価の構造体のいずれかで使用で きる。ヒトε、　ｍｂ／ｅｃセグメント及び連結した４つのアミノ酸をＣＨ４ド メインに有して（するペプチドも使用することができる。また、免疫学的にほぼ 等価である変性ペプチドを使用することもできる。例えば、上記のペプチドアミ ノ酸配列は、ペプチドの免疫学的性質を本質的（こ減しないアミノ酸の１つまた は複数を欠失、挿入または代用することによって変更することができる。上記の アミノ酸配列または等価配列がポリマーの繰り返し単位である場合、ペプチドを ポリマーとして使用することもできる。

１１、　本発明の単一クローン性抗体の産出単一クローン性抗ＩｇＥ及び抗イデ オタイプ抗体は連続的な（不死化した）安定した抗体産出性株化細胞によって産 出される。好適な抗体産出性株化細胞ハイブリドーマ株化細胞及び骨髄腫株化細 胞である。しかし、原則的には、抗体のＬ鎖及びＨ鎖の抗体可変領域をコードし ているように機能的に組換えされた遺伝子を含んでそれらを表現できるものであ ればどの様な細胞でもよい。好ましくは、株化細胞は鎖を組み合わせて機能的抗 体または抗体フラグメントにできるものとする。このため、本来的に免疫グロブ リンを産出するリンノ（様細胞が最もよく用いられる。前述したものに加えて、 適当なリンパ様細胞としてウィルスまたは腫瘍遺伝子的に転換されたリンパ様細 胞などがある。

本発明のｉｇｅ、　ｂｌ、特異性抗体を産出する）１イブリドーマ細胞は、ケー ラー（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）のＮａｔｕｒｅ　 ２５６：４９８（１９７５）の標準的体細胞ハイブリダイゼーション技術、また は別の融合剤を用いた同様な方法によって形成することができる。簡単に説明す ると、この方法は次の通りである。ｉｇｅ、　ｂｌ、抗原決定基の潜在的成分と して識別されているヒトＩｇＢまたはヒトＩｇＥのペプチドセグメント（分泌型 または膜結合型）で動物を免疫化することによって単一クローン性抗１ｇＥ抗体 を産出する。ペプチドは、合成されてからキーホールドリンペット（ｋｅｙｈｏ ｌｄ　ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニンなどのキャリヤタンパク質と共役化されて、 免疫原として使用される。次に、リンパ様細胞（例えば牌臓すンノく球）を免疫 動物から得て、不死化細胞（例えば骨髄腫または異形骨髄腫）と融合することに より、ハイブリッド細胞を作り出す。ノ＼イブリッド細胞のスクリーニングによ って、所望の抗１ｇＥ抗体を産出するものを識別する。

ヒト抗体を分泌するヒトハイブリドーマは、ケーラー及びミルスタインの技法に よって作り出すことができる。ヒト抗体は人の治療に特に好ましいが、一般的に 長期に渡ってヒト単一クローン性抗体を産出できる安定したヒトーヒトハイブリ ドーマの産生は難しい。げつ歯頚、特にマウスでのハイブリドーマの産生は十分 に確立された方法である。安定したネズミハイブリドーマは所定の特徴の抗原の 無限的供給源となる。゛しかし、ネズミ抗体は、免疫性が非常に強く、それ自身 が受容体に不都合なアレルギー反応を誘発するので、人の治療に使用できる範囲 が限られている。本発明の好適な実施例では、抗１ｇＥ及び抗イデオタイプ抗体 がげっ歯頚で作られて、以下に詳細に説明する確立された技法によってキメラ性 げっ柑類／ヒト抗体に変換される。前述したように、これらの「近ヒト」キメラ 性抗体は、特に繰り返し投与が必要な場合、生体投与に好適である。溶性ＩｇＢ 上のｉｇｅ、　ｂｌ、抗原決定基に特異な抗体の産出のため、免疫化のためのヒ トＩｇＥをヒト血清から精製する。あるいは、ヒトＩｇＥはＩｇＥ産出性株化細 胞（例えば株化細胞Ｕ２６６、ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ８０３３）を培養すること によって作り出すこともできる。ヒトＩｇＥは親和性クロマトグラフィーによっ て精製できる。ヒトＩｇＨに特異なマウス単一クローン性抗体を適当なマトリッ クス（臭化シアン−活性化セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂなど） と結合させることによって、ＩｇＥ特異性免疫吸着剤にすることができる。準備 したＩｇＢを、ＩｇＥを選択的に吸着する免疫吸着剤と接触させる。

その後、吸着されたＩｇＥは免疫吸着剤からほぼ純粋な状態で溶離することがで きる。

好適な実施例では、ＩｇＢ特異性抗体を産出するリンパ球を高い頻度で作り出す ため、動物を活性免疫プロトコルで免疫化する。免疫化した動物から牌臓細胞を 取り出して、不死化した細胞、好ましくは免疫グロブリンを分泌する能力を失っ た骨髄腫細胞と融合させる。この方法において、多くの適当な骨髄腫株化細胞が 知られている。例えばネズミ骨髄腫Ｎ５−１がある。脛臓細胞と融合パートナ− との融合は、確立された方法によってポリエチ１／ングリコールの存在下で行わ れる。

電気融合の技法も使用できる。これによって得られたハイブリッド細胞はクロー 　ン的に培養されてから、抗ＩｇＥ抗体の産出性についてスクリーニングが行わ れる。

ＩｇＢ産出性Ｂ細胞上に存在するが好塩基球上には存在しない抗原決定基に特異 であって、ＰＣ，ＥＲカ月ｇＥと結合しないようにできるだけのＩｇＥに対する 親和力を有している抗体を産出するバイブロドーマは以下のようにして選択でき る。ハイブリドーマは、最初にヒトＩｇＢと反応する抗体の産出性についてのス クリーニングが行われる。これは、固相に吸着された精製ヒトＩｇＢを用いた酵 素−結合型免疫溶媒（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ）アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に よって実施できる。

一般的に親和性が高い抗体を得る１つの方法は次の通りである。ＥＬＩＳＡのた めの固相をごく僅かなヒトＩｇＢで被覆する。

例えば、固相として標準的なマイクロウェルプレートを使用した場合、ウェル毎 に０．１μｌ　／ｄのＩｇＥ溶液を約５０μｌ使用する。アッセイ時において酵 素活性（光学密度レベル）が比較的高いハイブリッドを選択する。培養物の上澄 みには量の多い、抗体か親和力が比較的高い抗体、の′いずれ１か、またはそ（ の両方が含まれている。

次に、好塩基球−結合１．ｇ’Ｅと反応しな・い抗体の分、泌についてハイブリ ドーマのスフ・リーニングを実施する。好適す方、法は、好塩基球によるヒスタ ミンの放出を誘発する能力がないことについて抗体をスクリーニングすることで ある。そのようなヒスタミン放出アッセイに対する好塩基球の供給源は、好塩基 球がヒスタミン放出の誘発に対して非常に敏感であることが知られているドナー から取った白血球である。恐らくは感度が低い別の方法として、免疫蛍光着色法 がある。好塩基性白血球は血液から分離できる。分離されたばかりの好塩基球は 表面にＩｇＥを有している。好塩基球−結合１ｇＥと結合しない単一クローン性 抗体は、好塩基球Ｆ（／：Ｒが占めている部位またはその付近にある（従って単 一クローン性抗体が接触できない）抗原決定基に特異である。

パロトープ特異性抗イデオタイブ抗体を産出するハイブリドーマは、動物を抗１ ｇＥ抗体で免疫化し、免疫化抗１ｇＥ抗体のパロトープと結合する抗体のスクリ ーニングを行うことによって形成できる。免疫化により、イデオタイブを含む抗 ｒｇＥ抗体上のアレルギー決定基に対する抗体が産出される。抗イデオタイプ抗 体はまず、抗１ｇＥ抗体と結合するが他のマウス抗体とは結合しないことによっ てスクリーニングが行われる。パロトープ特異性であるものについては、免疫化 に使用された抗１ｇＥ単一りローン性抗体に対するヒトＩｇＨの結合力と競合す る抗体の能力に基づいてスクリーニングが行われる。

Ｆ（ａｂ’）２．　Ｆａ、ｂ及びＦｖなどの抗体フラグメントは酵素消化、の標 準的方１．法゛によって形成できる。また、Ｆａｂ及びＦｖ類似体を表す合成ペ プチドは遺伝子工学技術によって形成できる。

例えば、ペターＭ、他の（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０４１　；　 ハストンＪ−３，他の（１９８８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８５：５８７９〜５８８３を参照されたい。

キメラ性抗１ｇＢ抗体は、個々のキメラ性Ｈ及びＬ免疫グロブリン鎖からなる。

キメラ性Ｈ鎖は、げっ歯類（一般的にネズミ）のＨ鎖の可変領域または超可変領 域と、ヒ）Ｈ鎖の不変領域とを有している連続ポリペプチドである。キメラ性り 鎖は、げっ歯類のＬ鎖の可変領域または超可変領域と、ヒトＬ鎖の不変領域とを 有している連続ポリペプチドである。

キメラ性抗体は一価、二価または多価でもよい。−価の抗体は、キメラ性り鎖と （二亜硫酸塩架橋によって）結合したキメラ性Ｈ鎖からなる二量体（）ＩＬ）で ある。二価の免疫グロブリンは、２つの結合した二量体からなる四量体（Ｈ２Ｌ ２）である。

多価の抗体は、例えば凝集したＨ鎖不変領域（例えばμ形の不変領域）を用いる ことによって形成される。

キメラ性抗体の可変領域は本発明の抗１ｇＥ抗体から引き出される。Ｈ鎮定領域 は５つのイソタイプ、すなわちアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、または ミュウの何れかから選択できる。様々なサブクラス（例えばＩｇＥサブクラス） のＨ鎖を用いることができる。各クラス及びサブクラスのＨ鎖はそれぞれの作動 物質機能を備えており、従って所望のＨ鎖不変領域を選択することによって、所 望の作動物質機能を備えたキメラ性抗体を形成することができる。Ｌ鎮定領域は カッパまたはラムダ鎖にすることができる。

一般的に、キメラ性抗体は、キメラ性抗体のし及びＨ鎖成分の各々をコードして いるＤＮＡ構造を作成することによって製造される。この構造は、ネズミ可変領 域の少なくとも機能部分（例えば接合セグメントで機能的に組換えられた可変領 域）をコードしている第１　ＤＮＡセグメントと、これに連結してヒト不変領域 の少なくとも一部分をコードしている第２ＤＮＡセグメントとを有する融合遺伝 子を有している。各融合遺伝子は表現ベクターに組み込むか、それに挿入する。

次に、遺伝子生成物を表現できる受容細胞を遺伝子に感染させる。

感染した受容細胞を培養して、表現された抗体を回収する。

げっ歯類し及びＨ鎖の可変領域をコードしている遺伝子は、抗ＩｇＥ抗体を産出 するハイブリドーマ細胞から得られる。例えば、ネズミ抗１ｇＥ抗体を産出する ネズミハイブリドーマ株化細胞は可変領域遺伝子の供給源となる。

不変領域遺伝子は、標準的クローニング技法によってヒト抗体産出性細胞から得 られる。あるいは、２クラスのＬ鎖及び５クラスのＨ鎖を表す遺伝子がクローン 化されたのであるから、ヒト原点（ｏｒｉｇｉｎ）の不変領域はこれらのクロー ンから容易に入手できる。

好ましくは、Ｌ及びＨキメラ性鎖をコードしている融合遺伝子は、受容細胞を同 時感染させるために使用される表現ベクターに組み込む。遺伝子構造に適したベ クターには、ｐＢＲ３２２、ｐＥＭＢＬ及びｐＵＣ型のプラズミドが含まれる。

各ベクターには２つの選択可能な遺伝子、すなわちバクテリア系で選択するもの と、真核細胞系で選択されるものとを含み、各ベクターは別々の一対の遺伝子を 有している。これらのベクターにより、バクテリア系で融合遺伝子の産出及び増 幅ができ、その後に真核細胞の同時感染及び同時感染した細胞の選択が行われる 。バクテリア系として選択できる遺伝子の例は、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌ ｌｉｎ）耐性を与える遺伝子及びクロラムフェニコール耐性と結合する遺伝子で ある。真核細胞として選択できる遺伝子にはｇｐｔ及びｎｅｏなどがある。

好適な受容株化細胞は骨髄腫細胞である。骨髄腫細胞は、感染した抗体遺伝子に よってコードされた免疫グロブリンの合成、組合せ及び分泌を行うことができる 。さらに、それらには免疫グロブリンのグリコシレージョン（ｇ　１ｙｃｏｓｙ 　ｆａｔ　ｔｏ口）を行う機構がある。特に好適な受容細胞は、１ｇ非産出性骨 髄腫細胞５Ｐ２１０である。シュルマン（Ｓｈｕ　１ｍａｎ　）他のＮａｔｕｒ ｅ２７６：２６９（１９７８）を参照されたい。この細胞は、感染した免疫グロ ブリン遺伝子でコードされた免疫グロブリンだけを産出する。

骨髄腫細胞は、培養で、または分泌された免疫グロブリンを腹水から得ることが できるマウスの腹膜内で成長させることができる。８９２３球などのその他のリ ンパ様細胞やハイブリドーマ細胞も、適当な°受容細胞として機能する。

リンパ様細胞は幾つかの方法で免疫グロブリンをコードしている遺伝子を含有す るベクターに感染させることができる。

これらには、ニレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｆｏｎ）、原 形質融合、及びリン酸カルシウム沈降法が含まれる。このようにして得られた感 染細胞は、キメラ性抗体を産出する連続した安定株化細胞となる。

キメラ性抗体は、様々な連続還流装置、中空繊維装置、静止維持培養装置などの 大型組織培養装置で大量に産出できる。

近ヒト抗体または抗体フラグメントも、適当な抗１ｇＥ特異性を与えることがで きるように超可変（相補性決定）領域をコードしている゛ヒト抗体の遺伝子配列 を操作することによって製造できる。例えば、ロバートＳ、他のＮａｔｕｒｅ　 ３２８ニア３１〜７３３（１９８７）　；ペターＭ、他の（１９８８）　５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４０：１０４１を参照されたい。

゛１２．抗体をｍｂ／ｅｃセグメントに発展ε、　ｍｂ／ｅｃペプチドを動物の 免疫化に用いて、多クローン性及び単一クローン性抗体を作成することができる 。それらはまた、特異な単一クローン性抗体のスクリーニングまたは特異な多ク ローン性抗体の特徴付けに利用される。それらは、単一クローン性及び多クロー ン性抗体の精製にも用いられる。

ε、　ｍｂ／ｅｃペプチドに特異な単一クローン性抗体を作成する工程において 、ε、　ｍｂ／ｅｃペプチドを免疫化及び抗体識別の両方に使用する必要はない 。例えば、骨髄腫細胞と融合する免疫肺臓細胞を作成するためにマウスを免疫化 する際、免疫原は、ＩｇＥ産出性骨髄腫細胞例えば５ＫＯＯ７細胞の細胞膜がら 分離された膜結合型１ｇＥでよい。免疫原はＩｇＥ産出性骨髄腫細胞でもよい。

プチドをタンパク質キャリヤと共役させればさらに効果的である。好適なタンパ ク質キャリヤはキーホールリンピットヘモシアニン（ＫＬＨ）である。ペプチド セグメントにＬｙｓ残基がない場合、あるいはＬｙｓ残基がセグメントの中央部 にある場合、Ｃ末端にＬｙｓ残基を付は加えることが望ましい。Ｎ末端にはすて にα−アミノグループがあるので、修飾された合成ペプチドは結合用に２つのア ミノグループを持つことになる。

ペプチドの多数の分子をキャリヤタンパク質の個々の分子と共役させることがで きる。　ＫＬＨの場合、ペプチド／　Ｋｌ、Ｈに対する好適な分子比は１ｏであ る。共役方法は十分に確立されている。グルタルデハイド（ｇｌｕｔａｌｄｅｈ ｙｄｅ）、ビス（ｂｉｓ）（スルフォスフシンイミジル）スペリン酸、またはジ スルフォスクシイミジル酒石酸（ロックフォード　ＩＬ　のピアス・ケミカル社 のカタログ＃　２１５７９．２０５９１　）などの架橋剤が使用されている。好 適な架橋剤は後者である。

ＫＬ）Ｉ複合体などの免疫原を使用してウサギ、ヤギ、ラットまたはマウスを免 疫化することによって、ε、　ｍｂ／ｅｃペプチドに特異な多クローン性抗体を 作成することができる。免疫マウス及びラットの肺臓またはリンパ節から取り出 したリンパ球も、ε、　ｍｂ／ｅｃペプチドに特異な単一クローン性抗体を分泌 するハイブリドーマの作成に利用できる。単一クローン性抗体の作成に好適なプ ロトコルは、マウスの免疫肺臓細胞を非分泌型マウス骨髄腫細胞、例えばＮＳ　 −１または５Ｐ２１０細胞とポリエチレングリコールを用いて融合するものであ る。

マウスの最適な免疫化には、ペプチド−ＫＬＨ複合体５０μｇを完全なロインド アシュバンドに入れ、各マウスに皮下注射して開始する。２週間後及び４週間後 に、同量の抗原を不完全フロインドアジュバントに入れて皮下注射する。約６週 間後に、４回目の抗原注射を腹膜内に生理食塩水を用いて行なう。最後の注射か ら４日後にマウスを殺し、肺臓を取り出して、骨髄腫細胞と融合させる単細胞懸 濁液を作成する。ＩｇＥ産出性ヒト骨髄腫細胞、例えばＳＫ　００７細胞の細胞 膜から分離した精製天然ヒト膜結合型１ｇＥ　（付属膜固着ドメインを備えてい る）で免疫化する場合にも同様なプロトコルを使用できる。ヒトＩｇＢ産出性細 胞を免疫原として使用した場合、ｌ×１０７の細胞を２週間間隔で腹膜内注射し た。

クローニング及びハイブリドーマ培養に関するポリエチレングリコールを用いた 融合方法及びその他の様々な方法は、第１１項に説明されている。

１１、単一クローン性抗体に対するハイブリドーマのスクリーニングまたはε、 　ｍｂ／ｅｃペプチドと反応する多クローン性抗体の識別は、固相抗原として合 成ε、　ｍｂ／ｅｃペプチドを使用して酵素連結型免疫溶媒アッセイ（ＥＬＩＳ Ａ）で実施できる。

別の固相抗原として、免疫原に使用したものとは異なるウシ血清アルブミンなど の異なったキャリヤタンパク質とε、　ｍｂ／ｅｃペプチドとの複合体がある。

単一クローン性及び多クローン性抗体の特徴が第６表に示されている。これらの 研究で用いられたアッセイも示されている。アッセイは以下に説明する。

第６表　ε、、　ｍｂ／ｅｃペプチドに特異な抗体の、別のＩｇＥ含有標的との 反応性 叉皇牲　アッセイ 合成ε、　ｒｎ、ｂ／ｅｃペプチド　十　ＥＬＩＳＡ溶性ＩｇＥ　ＥＬＩＳＡ 好塩基球及びマスト細胞　免疫蛍光着色ヒスタミン放出 ５ＫＯＯ７骨髄腫細胞　＋　免疫蛍光着色ＩｇＥ産出性Ｂ細胞　＋　免疫蛍光着 色１３、動物モデルでの実験 物質及び方法を動物モデルシステムで実験する。最も関連性のあるシステムの中 の２つは次のものである。

Ａ、喘息／アカゲザルモデル 本発明によるヒトε、　ｍｂ／ｅｃペプチドに特異な単一クローン性抗体及びそ れらの関連物質は、様々なＩｇＥ媒介アレルギーの患者の治療に使用するもので ある（後述の第６項を参照されたい）。これらのアレルギーの中、非本態性喘息 は重症のアレルギーである。喘息を研究するための実験用モデルシステムがアカ ゲザルについて確立されている。

線虫類、回虫病（Ａｓｃａｒｉｓ　ｓｕｕｍ）に感染させたアカゲザルの一部は 、回虫病の抽出液に対して敏感になる。これらの敏感なサルに回虫病抗原を含ん だスプレーをかけると、それらは喘息に似た呼吸障害を引き起こす。パダーリン Ｒ８，。■。Ｃ１ｕｎｉ、　Ｉｎｖｅｓｔ、５７：５８６〜５９３（１９７６） 。

本発明の様々な物質を喘息、／アカゲザルモデルシステムで実験できる。回虫病 に敏感なザルに対して実験的治療すなわち制御治療を施して、以下の項目の決定 を行うための測定をする。

（ａ）回虫病刺激に対する喘息症状が軽減するか。

（ｂ）循環中のＩｇＥが減少するか。

（ｃ）循環中のＩｇＥ産出性Ｂ細胞が減少するか。

（ｄ）好塩基球上のＩｇＢ密度が減少するか。

Ｂ、マウスモデルシステム マウスが本来的にアレルギー症状を引き起こすことは知られていない。しかし、 ＩｇＢ産出性Ｂ細胞及びＩｇＨの減少に関する目的治療の薬学的機構の説明には 、マウスは優れたモデルになる。

マウスのε、　ｍｂ／ｅｃセグメントはすでに配列がわかっている。イシダＮ、 他のＥＭＢＯＪ、　ｌ：１１１７〜１１２３（１９８２）。１９のアミノ酸残基 ペプチドは Ｇ　１ｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ　−Ａｓ　ｐ−Ｌｅｕ−Ｃｙ　ｓ −１１ｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇｌｕ−Ｖａ　ｌ−Ｇ　１ｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ− Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕである。

ペプチドは、Ｃ末端に余分にＬｅｕ−Ｌｙｓ残基を有するものを含めて、幾つか の形態に合成される。

ペプチド及びそのＫＬＩ（複合体を、ウサギ及びヤギを免疫化するための抗原と して使用する。抗血清を集める。抗原特異性抗体を、ペプチドと（追加の１ｅｕ −Ｌｙｓと）、またはウシ血清アルブミンに連結したペプチドと複合化したセフ ァローズ４Ｂのカラムを用いて精製する。正常なマウスに精製抗体またはそれら の関連物質を静脈注射または腹膜内注射して、以下の項目について調べる。

（ａ）循環中の総１ｇＥが減少するか。

（ｂ）　ＩｇＥ産出性Ｂ細胞の数が減少するか。

（ｃ）好塩基球上のＩｇＢの密度が減少するか。

（ｄ）ε、　ｍｂ／ｅｃペプチドに特異なＩｇＭ及びＩｇＧが異なった効果を引 き起こすか。この項目は、ＩｇＥ−産出性Ｂ細胞の減少時の抗体依存性細胞毒性 （ＡＤＣＣ）の効果を示すためのものである。ＩｇＭではなく　ＩｇＧがＡＤＣ Ｃを媒介することがわかっている。

本発明を以下の実験によってさらに説明する。

ａ）ヒトＩｇＢの調製 ヒトＩｇＥは市販の供給源から入手して、融合及びハイブリッドのスクリーニン グのための免疫肺臓細胞を得られるようにマウスを免疫化するために精製した。

ＩｇＥは、様々な単一クローン性抗１ｇＢ抗体に特性を与えるためにも利用され る。

２種類のヒトＩｇＥを使用した。一方はヒト血清から精製された多クローン性１ ｇＥであって、これはベントレックス（Ｖｅｎｔｒｅｘ）　（米国メーン州、ポ ートランド）から入手した。このヒト、、Ｉ　ｇ　Ｅは、ヒトＩｇＥに特異なウ サギＩｇＧとを結合したセファローズ４Ｂのカラムを用いて親和性クロマトグラ フィ・−によって血清から精製した。混在しているヒトアルブミン及びトランス フェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）をアルブミン及びトランスフェリンに特異 な抗体と結合した親和性カラムによって除去した。単一クローン性ヒトＩｇＥも 、ＩｇＢ産出性Ｕ２６６細胞系の培養物の上澄みから産出された。ＩｇＥは、ヒ トＩｇＨに特異な単一クローン性抗体と結合したセファローズ４Ｂカラム上で親 和性により精製した。この単一クローン性抗体１ｇＧは、タンパク質Ａ結合カラ ムによって特異性ハイブリドーマを産出するマウスの腹水から精製された。

多クローン性及び単一クローン性ヒトＩｇＥを、減少状態及び非減少状態下でＳ Ｏ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。いずれの場合も、は っきりした１ｇ８分子（非減少状態下）とＨ及びＬ鎖（減少状態下）とが観察さ れ、他の混在タンパク質は小集団が僅かに存在するだけであった。

Ｕ２６６株化細胞は血清外の規定媒介物内で成長したのであるから、単一クロー ン性ヒトＩｇＥ内に混在しているタンパク質の識別については幾つかの手がかり がある。

ｂ）免疫化の手順 １、手順 最初の段階で生後６〜８週間の雄のＢａｔｂ／ｃマウスを用いて、骨髄腫細胞と 融合させてハイブリッドを形成するための免疫肺臓細胞を形成できるように免疫 化した。ベントレックスによって供給された血清から精製された多クローン性ヒ ）　ＩｇＢを免疫原として使用した。これの原理は、Ｕ２６６株化細胞によって 産出された単一クローン性１ｇＥは一定の未知の異形を産出するであろうという ことに基づいている。また、ｔＪ２６６１ｇＢのイデオタイプに対抗する単一ク ローン性抗体の発生を我々は望んでおらず、単一クローン性抗体に対抗する抗イ デオタイプ反応を誘発する可能性の方がはるかに高いであろう。Ｕ２６６産出１ ｇＢで免疫化したマウスで３つの融合実験をした後、我々は多クローン性ヒト血 清産出１ｇＢで免疫化したマウスとの融合に切り換えた。

免疫化するため、各マウスにヒトＩｇＥを毎回５０μｇ注射した。１度目の免疫 化は完全なフロインドアジュバント中で行った。マウスのリンパ節が集まってい る部位、例えば肢と胴の交差部分の下側に皮下注射した。１力月後及び２力月後 にマウスの同じ部位に１ｇ８５０ｇｇを皮下に追加免疫注射した。追加免疫注射 液は、１度目の注射とほぼ同様にして調製されたが、補助免疫注射液の場合には 不完全フロインドアジュバント中で乳化が行われた。

少なくともさらに１力月後、各マウスにＰＢＳ内で５０ｇｇのＩｇＥで最後の（ ４度目の）皮下注射で免疫を更新した。各マウスは、各肢と胴との交差部に皮下 または腹膜内に注射した。最後の注射から３日後にマウスを殺して肺臓を取り出 した。次に、その肺臓細胞を以下の手順で骨髄腫細胞と融合した。

Ｃ）融合 肺臓細胞と骨髄腫細胞とを５：ｌの割合で含有する懸濁液を調製した。選択した 骨髄腫細胞はＭＳ−１であった。Ｎ５−１細胞は、約１７時間毎に増倍するよう に調節した。それらはログ相の時に融合に使用した。Ｎ５−１細胞は、ウシの胎 児の血清（ＦＢＳ）　５％、ペニシリン１００ユニツト／１ｎｌ及びストレプト マイシン１００　μｇ／ｙｄを含有しているデルベッコ（Ｄｕ　Ｉｂｅｃｃｏ　 ）のＭｏｄ　１ｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（Ｄλ（ＥＭ）　１０　ＴＩ中に ６ＸＩＯ’細胞／−の濃度で細菌プレート（１００ｍｍ）内で継代培養した。培 地は３日毎に換えた。あるいは、細胞を同じ培地１０ｙＪ中で１．５Ｘ１０５細 胞／ｄで継代培養し、培地を２日毎に換えた。

肺臓細胞は、肺臓を細菌プレー）　（１００ｍｍ）に載せて、肺臓の両端部にカ ルシウム、マグネシウムを含まないＰＢＳ（ＣＭＦ−ＰＢＳ）２０−を注入する ことによって肺臓細胞を単離させて準備した。次に、肺臓細胞を５０１ｎｌの遠 心分離管へ移した。

肺臓細胞を２００ｇで５分間遠心分離してから、０．８３％ＮＨ，ＣＬ（０，１ ５５Ｍ）５−中で室温で１０分間懸濁することにより、赤血球を溶解した。ＣＭ Ｆ−ＰＢＳ　５−を管に加えて、溶解を中止させた。次に、細胞をＣＭＦ−ＰＢ Ｓ　１０−内で小粒状にして再び懸濁させた。

細胞懸濁液４０μｌを２ａｐ−ｏｇｌｏｂｉｎＴＭ　３滴と共に生理食塩水］０ １ｆＬｌに添加することにより、リンパ球の濃度を測定した。

リンパ球の数をヘマシトメータ（ｈｅｍａｃｙ　ｔ　ｏｍｅ　ｔ　ｅｒ　）で数 えて、細胞濃度を決定した。

Ｎ５−１細胞を細菌プレー）（１００ｍｍ）から５０ｍ６の遠心分離管へ移した 。細胞濃度を測定した。次に、Ｎ５−１細胞をＣＭＦ−ＰＢＳ１０ｄ内で懸濁し て、５（７！の遠心管内で肺臓細胞と１＝５の割合で混合した。一般的に、１つ の免疫肺臓から２〜５×１０”の細胞が得られ、各融合実験に２つの肺臓を用い る。

細胞を回転させ、ＣＭＦ−ＰＢＳ　１０−で一度洗浄した。上澄みをガラスパス ツールピペットでできる限り多く吸引した。管を軽く叩いて、細胞小粒を分離し た。

細胞を準備する前に、融合混合物を次のようにして調製した。ポリエチレングリ コール１４５０　（コダック）５ｇをＣＭＰ−ＦＢＳ５−及びＤＭＳＯＯ，５ｙ ｄと混合した。この混合物を５６℃まで加熱し、最終ｐｌが７．０になるまで適 意してから、０．２２μｍの孔のフィルターで濾過することによって殺菌した。

アリコツト１．０７ｎｌを低温管（Ｃｒｙｏｔｕｂｅ）に加えて、これらを−７ ０°Ｃで保存した。

使用する融合混合物の調製のため、低温管内のアリコツトの１つを３７℃に加熱 して　溶かした。別に、ＤＭＥＭ　（血清無し）１．ＯＪを入れた管を３７℃に 加熱した。

ポリエチレングリコール融合混合物のアリコツト１．０７ｎｌを細胞懸濁液に添 加して、その懸濁液を十分に混合した。ポリエチレングリコール融合混合物を添 加してから４５秒後、余熱したＤＭＥＭ　（血清無し）２．０−を混ぜながら滴 下した。それから、余熱したＤＭＥＭ　（血清無し）の残りの８−を添加した。

細胞を室温で１０分間保持した。

ＦＢＳ２．０ｉを懸濁液に添加して、その懸濁液を十分に混ぜた。

ＦＢＳとＣＭＦ−ＰＢＳとを組み合わせることにより、細胞が試験管壁に付着し ないようにすることができる。次に、懸濁液を４００ｇで４分間遠心分離した。

細胞は、回転させた後、ＦＢＳ　５％、ペニシリン１００Ｉツ）　／−、ストレ プトマイシン１００μｇ／ｍｌ及びヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジ ン（ＨＡＴ）を補充した変性媒体約１２０ｄ内で懸濁した。

細胞懸濁液の濃度は、懸濁液２００マイクロリットル当りの肺臓細胞が３．３Ｘ ｌＯ″になるように調節した。次に、アリコツト懸濁液２００マイクロリツター を９６ウエルマイクロチター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレートの各ウェルに分 配した。各融合に対してそのようなプレートを２０〜３０枚用意した後、プレー トを定温器に移して、５％のｃｏ、内で３．７℃に保持した。

細胞をプレートで７日間成長させてから、成長媒体を取り出し、新しい媒体を加 えた。それから４日後、酵素連結型免疫溶媒アッセイ（ＥＬＩＳＡ）をウェル内 の抗体に対して実施して、ヒトＩｇＢと結合しているものを測定した。

２、結果 上記の免疫プロトコルを用いたマウスでの４つの融合実験を実施した。これらの 融合のため、融合細胞の９６ウエルからなるプレートをそれぞれ７．１５．３６ および１５用意し平均し７て３〜５のクローンのハイブリッドがあった。このた め、４つの融合で約７．０００のウェルを作り、およそ２１．０００〜３５、０ ００クローンを得た。

ｄ）Ｅｌ、ＵＳＡの手順 １、手順 融合ウェルから得られた非常に大量のハイブリッドの中心的なスクリーニングの 手順は、固相抗原としてヒトＩｇＢを用いたＥＬＮＳＡであった。ヒト血清（ベ ントレックス）から精製した多クロー・ン性１ｇＢを抗原として使用した。

我々のスクリーニング手順の中の１つの重要で決定的な方法は、各融合実験から 得られたｉ、　ｏｏｏ〜４．０００のウェルから全体的に親和性が高い抗体をス クリーニングすることであった。これには、各ウェルをごく小量のヒトＩｇＢで 、すなわち０．１Ｍｇ／−の１ｇＢ５０ｕｌで被覆した。すべてのＩｇＥが固相 と結合したとすると、各ウェル内は僅かに５ｎｇとなる。このように小量である から、混在しているタンパク質に特異なハイブリッドをスクリーニングする可能 性も非常に小さくなる。

別の非常に重要な方法は、外径の数値が大きいウェルだけを選択して、さらなる 特徴付は及びクローニングを行うものであった。

手順として、０．１Ｍｇ／−のヒトＩｇＥ　５０μｌを９６ウエルのイミュンロ ン（Ｉｍｍｕｎｌｏｎ）　Ｉプレートのウェルに添加した。

プレートに蓋をして、１８時間４℃で製置して、タンパク質をプレートに結合さ せた。

次に、プレートの液体内容物を取除き、０．１Ｍ　ＮＨ４Ｃ１２００ｕｌを各ウ ェルに添加して、ブＩノーＩ・の残留結合部位を飽和させた。ＮＨ４Ｃｌ溶液を 室温で３０分間ウェル内に保持した。

次に、ＮＨ４Ｃｌ溶液を取り除いてから、ウェルをＰＢＳ及び０゜０５％のツイ ーン（Ｔｗｅｅｎ）　２０で３度洗浄した。後述の抗体懸濁液を添加するまで、 ＰＢＳ　１０．０５％ツイ〜ン２０溶液の一部をウェルに保持した。

９６ウエルプレートの各ウェルから得た細胞融合物上澄み５０μｌをイミュロン Ｉプレートの各ウェルに添加して、１時間製置した。製置後、そのプレートをＰ ＢＳ　１０．０５％ツイーン２０で３度洗浄して、未結合抗体を取り除いた。

９６ウエルプレートの各ウェルから得た細胞融合物上澄み５０μｌをイミュロン ■プレートの各ウェルに添加して、１時間製置した。製置後、そのプレートをＰ ＢＳ　１０．０５％ツイーン２０で３度洗浄して、未結合抗体を取り除いた。

細胞融合物上澄みには、９６つ諷ルプレート内の様々なハイブリドーマによって 産出された抗体が含まれているであろう。ヒトＩｇＨに特異な抗体はそれと結合 するであろう。次に、固相と結合した抗体の量を、基質として３．３’、５，５ °：テトラメチルベンジジンを用いたワサビダイコンのペルオキシダーゼ（ｐｅ ｒｏｘｉｄａｓｅ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧを用いたルーチン手順によって測定 した。

２、結果 スクリーニングを行った全部で約７．０００のウェルの中、約４、０００のウェ ル（約６０％）がＥＬＩＳＡでプラスであった。これらのプラスのウェルのほと んどは、ヒトＩｇＥに対する単一クローン性抗体を産出するハイブリッドを含ん でいるのであろう。ＥＬＩＳＡでプラスのこれらの約４．０００のウェルの中、 外径の数値が最も大きい５３のウェルを選択して、クローニング及びさらなる特 徴付けを行った。

これらの５３の単一クローン性抗体を、様々な希釈度のヒト血清で被覆したプレ ートのウェルを用いてＥＬＩＳＡで検査した。これらはすべてＥＬＩＳＡでマイ ナスであり、それらがヒトアルブミン、ＩｇＥ　、　ＩｇＭ　、トランスフェリ ンまたは、マウスに対する免疫原として、また−次スクリーニングのＥＬＩＳＡ での抗原として使用したＩｇＥ調製物に混在しているその他の主要な血清タンパ クと反応しないことを暗示している。

ｄ）　単細胞のクローニング ＥＬｒＳＡで外径の数値が最も大きい５３のウェルの各々から得た細胞懸濁液を ２４ウエルのプレートのウェル内に広げて、ｌｄ当りの細胞が３０．５０及び１ ００になるように細胞懸濁液を希釈した。細胞懸濁液（平均してそれぞれ３．５ 及び工０の細胞を含んでいる）０．ｌ−を９６ウエルプレートのウェルに入れた 。これらのウェルはヒストンで被覆しておいた。

細胞が成長してコロニーになった後、細胞を顕微鏡で調べた。各コロニーの細胞 は動き回らず、コロニーを形成した。

ＥＬＩＳＡで最も強い反応を示す単細胞クローンを選択して、広げて培養した。

ｅ）単一クローン性抗体の産出及び精製所望の単一クローン性抗体を多量に産出 するため、以下の手順を実施した。

２４ウエルプレートのウェル内で成長した、ＥＬＩＳ’Ａで大き。

い外径数値を示したクローンの一部をさらに１００ｍｍ組織培養プレート内で広 １ｆた。所定の単細胞クローンの拡張培養物を清潔に取り扱われたマウスの腹腔 に、１匹当り５百万細胞の割合で別々に注射した。７日後、各マウスの腹水を集 めて冷凍した。

腹水内の単一クローン性抗体を以下のようにして精製した。

冷凍腹水を溶かして、ナイロン布で濾過して粘性物を取り除いた。十分なフェニ ールメチルスルフォニルフルオライドを腹水に添加して、最終濃度を０．１ｍＭ にした。１．２Ｍアセテートバッファ（１））１４．０）０．０５ｄを腹水１ｄ 毎に添加した。アセテートバッファの最終濃度は６０…Ｍであった。ｐＨは４． ５に調節した。

１ｇ／　ｍＤ　２５μｌを激しく攪拌しながら滴下した。懸濁液を室温に保ち、 さらに３０分間攪拌し続けた。

次に、懸濁液を１５．０００ｇで１０分間遠心分離して沈澱物を取り除いた。Ｉ ｇＥを含む上澄みにその上澄みの体積の１７１０の量のＩＭへペスバッファ（ｐ Ｈ８，０）を添加して、上澄みを中和た。

次に、沈澱物をヘベスバツファに溶解した。この溶液を一夜中ヘペスバッファで 透析することにヨ’０、（ＮＨ４）　ｔ　Ｓ０４をＩｇＥから取り除いた。ヘペ スバ・ソファは透析中に２度交換した。透析後、ヘペスバツファは精製溶解１ｇ Ｅを含有している。この精製１ｇＥをある特徴付はア・ソセイに使用した。

一部の単一クローン性抗体は複式カラムクロマトグラフィ法によって腹水または 培養液から精製した。まず、ＮａＣ１を０゜０１Ｍから０．１５Ｍまで段階的に 増加させながら０．０５Ｍ　）リス（Ｔｒｉｓ）ｐＨ８，０を用いて、抗体をＤ Ｂ−５２陰イオン交換樹脂（英国メートストンのホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ 　））上でクロマトグラフィ分離した。抗体含有フラクションは酵素免疫ア・ソ セイで識別し、アミコン濾過（米国マサチューセ・ソツ州、ダンノ（−ズのアミ コン、ＹＭＩＯ膜）で濃縮し、さらに０．Ｏｌから０．３Ｍまでのリン酸バッフ ァ（ｐＨ７，４）の段階グラジェントを利用してヒドロキシラバタイト（ｈｙｄ ｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅ）コラム（米国カリフォルニア州すッチモンドのリオ ラド（ＲｉｏＲａｄ）　；ノくイオゲルＨＴ）で精製した。純度は等電集束（ｉ ｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ）（１３）及びファーマシアＰＨＡＳ Ｔ装置（米国ニューシャーシー州ビスカットウェイのファーマシア）を用いた５ ＤＳ−ＰＡＧＥで評価し、濃度はＯＤ　２８０ｎｍ（１，５＝　１ｍｇ／ｌｎり で測定した。

実験　■：　本発明の単一クローン性抗体の特徴付けａ）免疫蛍光アッセイ及び ラジオパインディングアッセイを用いた好塩基球との結合 ＩｇＥ反応型単一クローン性抗体が末梢血液から分離された好塩基球と結合する かどうかを調べる研究が行われた。この二次スクリーニングから、治療価値のあ る抗体を選択した。

それらの抗体は、好塩基球及びマスト細胞と結合して、薬学的メディエータを放 出するものでなければならない。

好塩基球は白血球中に非常に低い割合（０，５〜２％）を占めるだけであるから 、まず免疫蛍光着色アッセイを使用することを選択した。濃縮好塩基球でも、免 疫蛍光着色またはビオチン−アビジン酵素免疫着色法を用いた単細胞レベルでの 細胞の検査は、細胞集団全体を検査するラジオパインディングまたはＥＬＩＳＡ よりも正確な測定を行うことができるであろうと考えた。

１、好塩基球の分離 好塩基球は、Ｐ、ラウブラサッド（Ｒａｇｈｕｐｒａｓａｄ）のＪ、　Ｉｍｍｕ ｎｏｌ　、１２９：２１２８〜２１３３（１９８２）に記載されている手順によ ってバーコル（Ｐｅｒｃｏｌｌ）上で密度遠心分離を利用して正常で健康な個体 の抹消血液から高濃度に濃縮した。簡単に説明すると、９０％パーコル溶液９０ −にｌＯ×ハンクス（Ｈａｎｋｓ）均衡塩水８゜９６−１ＩＮ　ＨＣＩ　Ｏ，４ ５−及びＩＯＸへペスバッファ（ｐＨ７，６）ｌｄを混合してバーコル保存溶液 を調製した。パーコルの必要密度は次式（８）を用いて準備した：パーフル密度 （ｇ／ｄ）＝（パーコル保存溶液の％Ｘ　Ｏ，００１１８６）　＋　１．００４ １但し、０．００１１８６は定数、１．００４１は生理媒体の密度である。ノく 一コルの密度は温度変化するため、実験日の前日に調製して一夜室温に保持した 。

正常なドナーから新しく得られたヘノ々リン処理済みの血液を培養基ＲＰＭＩ− １６４０でｌ＝１に希釈してから、フイコル／ノ１イパークカシオン（Ｆｉｃｏ ｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ　ｃｕｓｉｏｎ）上で遠心分離した（密度＝　１．０７０ ｇ／ｙｄ　）。接合部の単核細胞は別の用途のために取り除き、赤血球、小粒の 上部の上の白みが力）つた層を回収した。これらの顆粒細胞を洗浄して培養基内 で再び懸濁してから、注意深く層状にした１、　０７２及び１．０７８ｇ／　Ｊ 　の２つのバーコルグラジェントで１５分間遠心分離した。ノ（−コル層の接合 部及び培養基／パーコル上層の接合部の下側に集まった細胞を採集した。これら の細胞は、個々のドナーに応じて２〜１０％の好塩基球を含んでいた。

２、アッセイの手順 を特定の抗体を入れた各１．５ｄマイクロフユージ管（こ加えた。

次に、ヒＩ−ＩｇＥを抗原としたＥＬＩＳＡで外径数値が最も大き力１ったハイ ブリドーマクローンから取った上澄み５０ｕｌを各管に添加した。一部のクロー ンでアッセイを繰り返し実施した。

精製された抗体が得られたら、２０．５及び１μｇ／ｍｌを使用した。腹水が得 られたら、１：５０の希釈度で使用した。

細胞及び抗体を入れた管を次に室温で３０分間インキュベーションした。インキ ニベーション後、管を回転させて、上澄みを取り出し、ウシの胎児の血清２％ど アジ化ナト１ノウム０．１％を含有するＲＰＭ１１６４０の混合液で細胞を２度 洗浄した。

次に、管を軽く叩いて細胞小粒を分離させた。

フルオレシンインチオシアネート（ＦＩＴＣ）と共役したヤギ抗マウス■ｇＧの 標識を付けた抗体１０μｌを各試験管に１＝２００の希釈度で添加した。この標 識抗体は、好塩基球上のＩｇＨに付着していた単一クローン性抗体と結合し、こ れらの単一クローン性抗体を識別する手段となる。

管を再び室温で３０分間定温保持した。管を遠心分離して、細胞を上記媒体で洗 浄した。次に、細胞をＰＢＳ５０ｕｌ内で再び懸濁して、個別のスライドに載せ 、カッく一グラスを被せた。

細胞を蛍光顕微鏡で観察した。

抗体で細胞に着色した時、各視野内の細胞の一部が明るく着色されていることを 観察できた。確実に着色された細胞の割合は実験によって異なり、約２〜ｌＯ％ である。

３、ラジオパインディングアッセイ これに使用される段階の多くは、免疫蛍光着色法のもの艦こ類似している。濃縮 した好塩基球を含む白血球フラクションを、非特異性結合を阻止する阻止剤とし て機能する正常なりギ血清１％の存在下でマウス単一クローン性抗体及び′！１ ■ヤギ抗マウＸＩｇＧ約１０．０００ｃｐｍと共に温室した。３０分後、温室混 合物を円錐型プラスチック遠心分離管内のウシ血清（１００Ｘ）の上に載せた。

細胞を小粒状に遠心分離した後、上層と血清を取り除いた。管を逆さにして残留 液を排水した。次に、細胞小粒を含んでいる円錐の先端部を鋭利な剃刀の刃で切 り取った。次に、これらの先端部を管に入れて、シンチレーションカウンターで １ｆｆｉｓ１を数えた。負の制御単一クローン性抗体とヒ）ＩｇＥ特異性単一ク ローン性抗体との間で結合ｌ■Ｉの量を比較することによって、結合の正負を決 定した。

４、結果 最初は、免疫蛍光アッセイを用いて幾つかの実験を行った。

もっと最近では、ビオチン標識第２抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ）及びペロキシダ ーゼ−共役アビジンを用いた同様な手順による試験が繰り返された。２つのアッ セイから得られた結果から、バックグラウンド着色が抗体毎に異なることがわか った。その結果から、これらのアッセイの感度がヒスタミン放出アッセイ（次項 ）はどによくないこともわかった。これらのアッセイで感度が比較的低くなる主 な理由は、選択された２〜３のドナーからの白血球内の好塩基球の割合がすべて 非常に低いことであった。これらの免疫結合実験では、好塩基球の割合が非常に 高い個体が好適である。好塩基球の割合が高い白血球で始めれば、これらの実験 に適した好塩基球濃縮フラクションを作成することができる。

ｂ）白血球からのヒスタミン放出の誘発ヒ）　ＩｇＥに特異な単一クローン性抗 体が好塩基球上に結合したＩｇＥと結合すると、ＩｇＢが架橋して、下にあるＦ ｃεＲが凝集してヒスタミン及びその他の薬学的メディエータの放出を引き起こ す。様々なヒトＩｇＥ特異性単一クローン性抗体を、洗浄したヒト末梢血液の白 血球からのヒスタミン放出を誘発する能力について調べた。

１゜手順 使用した方法は、シラガニアン及びフックによって詳細に説明さ・れている方法 と同じであった。イン・ビトロ・アッセイで、誘発要因の製置時に培地内へ放出 された白血球集団内のヒスタミン総量の割合を計量した。培地内のヒスタミンす なわち細胞溶解因子の測定は、ｎ−ブタノールでヒスタミンを抽出してそれを高 ｐＨにてカップリング化合物である０−フタルアルデヒドと反応させることによ り、蛍光物を生成し、それをフルオロメータで測定する自動機器で実施した。

ヒスタミン放出誘発実験を実施して、被験抗体及び標準抗体と共にインキュベー ションした後、白血球から培地を集めて、ヒスタミン総量を測定するための細胞 溶解因子を調製した。

洗浄した白血球からのヒスタミン総量の試験手順を簡単に説明すると、シラガニ アンＲ，Ｐ、及びフックＷ、Ａ、の「臨床化学のマニュアル」ローズＮ、　Ｒ， 及びフリート７２８１編、第２版ｐｐ２０８〜３２１（米国ワシントンＤ、　Ｃ ，のアメリカン・ソサイエティ・オブ・マイクロバイオロジー）に記載されてい る手順を実質的に採用した。血液は正常な提供者から静脈注射器で引き出した。

５０ｄの円錐管内で、それぞれ１０１１！の血液を０．１Ｍ　ＥＤＴＡ　１１ｄ 及びデキストランデキストローゼ溶液２．５−と混合した。（ここに述べる溶液 及び試薬はすべて上記シラガニアンに詳細に記載されている。）赤血球層と血し ょう層との間にはっきりした接合部ができるまで、混合物を室温で６０〜９０分 間保持した。血しょう一赤血球−血小板層を取り除いてから、４℃で８分間１． １１００ｒｐで回転させた。血小板を含んでいる上澄みを取り除いて、低温ＰＩ ＰＥＳ　Ａ−ＢＤＴＡの溶液２〜３１ｎｌを加えて、細胞を再び懸濁した。さら に、低温ＰＩＰＥＳ　Ａ−ＢＤＴＡ４０−を加えて、細胞を回転させた。

上澄みを取り除いてから、細胞を２０−のＰＩＰＥＳ　Ａ内で再び懸濁した。次 に、細胞を４ＸＩＯ’／ｍｊの細胞密度でＰＩＰＢＳＡＣＭ内で再び回転させて 懸濁した。

洗浄白血球０．３−を入れた管及びハイブリドーマの培地０゜３７ｎｌを入れた 管を３７℃に６分間加熱した。これらの管を混合して、１０分毎に攪拌しながら ３７℃でインキュベーションした。６０分経過した時点で、細胞を回転させて、 上澄みを保存した。ヒスタミン含有総量に対して、洗浄白血球０．３−を６％過 塩素酸と混合した。

２、結果 入手できる血液ドナー間でヒスタミン放出性に信頼性が無いことを認めながらも 、日常的にヒスタミン放出アッセイを実施している外部研究所にヒスタミンアッ セイを委託した。

ジョーンズ・ホブキンズ大学の臨床化学科のＤｒ、ドナルド・マツグラシャン（ ＭａｃＧｌａｓｈａｎ）研究所が、我々のヒトＩｇＥ−特異性単一クローン性抗 体のほとんどについて好塩基球からのヒスタミン放出を誘発できる能力を確認し た。ヒスタミン放出を誘発しなかった単一クローン性抗体に関する重要な結果に ついて、国立健康協会のＤｒ、ルーベン・シラガニアン研究所で確認した。これ らの両研究所は、多数の血液ドナーのスクリーニングによって高ヒスタミン放出 体の安定集団を作成なくとも４つ含む７のドナーからの白血球を用いた広範な研 究の結果を第１表にまとめた。抗体は、腹水または精製抗体（１〜５　ｍｇ／　 ｍｌ）から１００倍、１０．０００倍または１．０００．０００倍に希釈した。

ヒスタミン放出データは、１つの代表的「超放出体」からのものである。その結 果から、４１の単一クローン性抗体の中、１２がヒスタミン放出を誘発しないこ とがわかった。

第１表（その１） ＩｇＢ産出性細胞との反応性、及びヒトＩｇＢに特異なマウス単一クローン性抗 体の好塩基球によるヒスタミン放出を誘発する能力 単一クローン　５ＫＯＯ７細胞　ヒスタミン放出抗体希釈フローシトメリー　（ 総放出に対する％）第１表（その２） 単一クローン　５ＫＯＯ７細胞　ヒスタミン放出抗体希釈性抗体　との結合　１ ／１０”　１／１０’　１／１０’フローシトメリー　（総放出に対する％）Ｃ ）単一クローン性抗体のＩｇＢ産出性骨髄腫細胞との結合（免疫グロブリン分泌 型プラズマ細胞から得た腫瘍細胞である）一部の骨髄腫細胞は、その表面上に表 出している免疫グロブリンが他のＢ細胞の表面上のものに較べて低レベルである ことが知られている。ＩｇＢ分子は２つの異なった機構で好塩基球（またはマス ト細胞）及びＢ細胞と結合する。ＩｇＢは、好塩基球及びマスト細胞上のＦｃε Ｒ分子とＩｇＢの結晶化断片上の特定の部位との相互作用によって好塩基球及び マスト細胞と結合する。ＩｇＥはＢ細胞またはプラズマ細胞によって合成されて から細胞表面へ運ばれ、エキストラネ変Ｈ鎖セグメントによって表面上に保持さ れる。この固着セグメントは膜結合型免疫グロブリンだけに発見され、分泌型の 免疫グロブリンには見つからない。好塩基球上のＩｇＢとＢ細胞上のＩｇＥとで は単一クローン性抗体との結合に差異があることが、アレルギーの治療に抗体を 用いる基本的根拠である。

ＩｇＥ産出性Ｂ細胞及びプラズマ細胞は単核白血球フラクション内で非常に少な く、また膜結合型ＩｇＥ分子の全体的輪郭及び構造特徴がプラズマ細胞、Ｂ細胞 またはＩｇＢ分泌型骨髄腫細胞上のものと最もよく似ているので、単一クローン 性抗体のＩｇＢ骨髄腫５ＫＯＯ７（アメリカ式培養コレクションから）細胞との 結合について研究することにした。単一クローン性抗体と正常なＩｇＢ産出性Ｂ 細胞及びプラズマ細胞との相互作用についても調べた。

１、手順 表面結合型ヒトＩｇＥラムダ、ＩｇＭラムダ及びＩｇＧ１カッパをそれぞれ表出 しているヒト５Ｋ６−ｏｏ７、ｃｃ＋、−１ｓｓ及びＣＣＬ−１５９細胞を、５ ％のウシの胎児の血清、ＧＩＢＣＯから得たグルタミン内に維持した。健康なド ナーから静脈注射で得た末梢血液の単核細胞をフィコルーパーク（米国ニューシ ャーシー州、ビスカッタウェイのファーマシア）密度勾配遠心分離によって調製 した。細胞表面との単一クローン性抗体の結合は２種類のアッセイ、すなわち抗 体を生きた細胞に結合させてから間接的蛍光フローシトメトリー分析を行うアッ セイと、細胞をマイクロチタープレートに付着させた状態での酵素連結抗体アッ セイとを用いて評価した。

抗体と生きた細胞との結合は、３００ｘｇで５分間遠心分離して細胞を小粒状に し、細胞から維持培地をＰＢＳ−ＢＳＡで洗浄し、細胞をＰＢＳ−Ｂ内で２０Ｘ １０’で再び懸濁して実施された。

細胞懸濁液５０μｍをＰＢＳ−Ｂ内で定濃度の２倍（１−１０μｇ／ｍ／）の抗 体５０μｍと混合して、氷の上に保持した。３０分間インキュベーションした後 、氷で冷却したＰＢＳ−８２１ｎｌを容管に加えて、５°Ｃで５分間３００ｘｇ で遠心分離をして細胞を集めた。上澄みを静かに移動して、細胞小粒を渦流で再 び懸濁させ、細胞をさらなるＰＢＳ−Ｂ’　２−で一度洗浄した。遠心分離で細 胞を集めてから、ＰＢＳ−Ｂ内でｌ：２０に希釈した親和性による精製ヤギＦ（ ａｂ’　）２抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）　（ボーリンガ−・マンハイム（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　、ｏ−ｔト５２９３４５、クー・ドロ ０５２９　）　２　Ｏμｍを容管に加えた。これらの管を氷」二に２０分間イン キ−ベージ」ンした後、上記のようにＰＢＳ−■で洗浄（７，た１、最後に、細 胞小粒を、ＰＢＳに入れた１％バラホルムアルデヒド（米国ベンＳフルバニア州 、つＡリント・ンのポリザイエンス社）０、Ｓ　ｙｙｉｊ内で再び懸濁した。シ トロジ・−・デクノ′ロジー社（米国テキサス州１、ヒユーストン）の４８８ｎ ｒｉ＋。

０４６Ｗで進む５Ｗアルゴンレーザを備えたＥＰＩＣＳプロファイル（米国フロ リダ州、ハイアリーアのコールクー）を用いて細胞を分析した。蛍光強さは、前 方光散乱と垂直方向光散乱とを組み合わせたものでゲート制御した後に組み込み 式対数増幅器で集めて、これによって生存細胞を判別した。

ケネットＲ，Ｈ，の「単一クローン性抗体」　にューヨークのプリナムプレス発 行（１９８０）、編集ケネットＲ，Ｈ，他）９、３７６に記載されている方法に 従ってグルタルアルデヒド固定細胞にＭＡｂｓを結合させることによって細胞結 合型酵素一連結抗体アッセイを実施した。ポリＬ−リシン（１００μｌ／ウエル 、ＰＢＳ内に１０μｇ／ｙｒｌ　）を平底のマイクロチタープレート（米国カリ フォルニア州、オックスナードのベクトン・ディッキンソン・ラブウェアのファ ルコン＃　３０７２）に加えた。

この溶液を３０分後に２２℃でウェルから取り除き、カルシウム及びマグネシウ ム遊離ダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）変性ＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ’）内に２．５ Ｘ１０’細胞／−で存在する細胞５０μｌを各ウェルに加えた。５分間３００ｘ ｇで遠心分離して細胞をウェルの底部に沈降させてから、氷温のＰＢＳ内に０． ２５％に希釈したグルタルアルデヒド５０μｌを加えることによって細胞を２２ ℃で１０分間固定した。ＰＢＳ　（２００μｌ／ウエル）内での０．１Ｍグリシ ン−〇。ＩＸＢｓＡ　、続いてブＵＪツｌ−（Ｉｇ／ｌのヂメｌ：Ｊす・−ルを 加えたＰ　Ｉｌｌ　Ｓ内での５％脱脂粉乳（米国カリフォルニア州、ロヅンゼル スのカー・ネーション）の連続インキュベーションによって、非特異的結合部位 をブロック１．た。プレートを緩やかに揺らしながらブロッキング溶液を取り除 いた。

細胞をプロット内の５０μｌ／ウエルの制御または試験単一クローン性抗体に１ 時間３７℃で接触させた。ブし・−１・を揺らし、トランスター９６ピペツト装 置（米国マサチューセッツ州、ケンブリッジのコスタ−）を用いて２００μｌ／ ウエルのＰＢＳで６度洗浄して未結合抗体を取り除いた。続いて、細胞を０．５ μｇ／−のビオチン標識親和性精製ヤギ抗マウスＩｇＧ（米国メリーランド州、 ゲイテルスバーグのＫＰＬ　）と共にプロット内で３７℃で１時間インキュベー ションした。すべてのウェルを上記のようにして洗浄してから、ワサビダイコン で未結合複合体を取り除き、ＴＭＢ基体１００μｌを加えた。プレートを暗所に ２２℃で３０分間保持してから、５０μｌ／ウエルの４ＮＨ＊ＳＯ４を加えて反 応を中止させた。バイオチックマイクロチタープレートリーグを用いて４５０ｎ ｍの光学密度を測定した。

２、　結果 フローサイトメトリー分析で試験した４１の単一クローン性抗体の中の３５が５ ＫＯＯ７細胞を着色することがわかった。

好塩基球からのヒスタミン放出を誘発する２９の単一クローン性抗体はすべて着 色した。ヒスタミン放出を誘発しなかった１２の単一クローン性抗体の中の６が ５ＫＯＯ７細胞を着色し、６は着色しなかった（第１表）。酵素免疫着色の結果 は、フローサイトメトリーアッセイの結果と同じであった。このため、分析を行 った単一クローン性抗体群の中の６が、好塩基球と結合してヒスタミン放出を引 き起こすことがなく、またＩｇＥ産出性Ｂ細胞と結合する基準に適合する。前述 したように、シラガニアン及びそのグループは、ＩｇＢが好塩基球と結合するこ とを阻止するヒトＩｇＥに対する２つのマウス単一クローン性抗体（Ｅ１４Ｃ５ ＩＢ１及びＥ１１ＡＣ３１１Ｃ）を開発した（Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｅ、４６：１３ ４６　；　１９８７）。我々はシラガニアン博士からこれらの２つの抗体を入手 して、それらが５ＫＯＯ７細胞と結合し、好塩基球からのヒスタミン放出を誘発 しないことを確認した。

ｄ）ヒトｌ１ｉＥとの結合親和力の決定１、　原理及び手順 イムノアッセイの感度が、測定する物質に対する抗体の親和力によって決まるこ とはよく知られている。２つの単一クローン性抗体（固相吸着剤としての抗体と トレーサとしての抗体）を用いた固相サンドウィッチイムノアッセイの場合、２ つの単一クローン性抗体の抗原に対する両方の親和力が重要である。各抗体アッ セイを実施する際の抗体の親和力の影響及び抗体の親和力を計算する際のイムノ アッセイの使用が系統的に研究されている。ニムノ他のＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 ！＋！ｅｔ、７２：ＩＩ７〜１８７（１９８４）及びミューターのＪ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、　Ｍｅｔ、　３４＋３４５〜３５２（１９８０）。

抗原に対する単一クローン性抗体の親和力を決定するため、イムノアッセイの同 相、例えば９６ウエルのＥＬＩＳＡプレートのマイクロチターウェルに抗原を塗 布する。固相上の同じ抗原に対する基準単一クローン性抗体の親和力に対比した ある単一クローン性抗体の親和力は、２つの単一クローン性抗体をイムノアッセ イで比較して決定できる。基準単一クローン性抗体の親和力すなわち会合是数は 一定の別の方法又は同一の方法で決定しておく。親和力を測定しようとする単一 クローン性抗体の外径の数値を基準単一クローン性抗体の数値と比較することに よって、その単一クローン性抗体の親和力が基準単一クローン性抗体よりも大き いか小さいかがわかる。

基準単一クローン性抗体を入手できない場合、別の抗原に特異な基準単一クロー ン性抗体に対して分析を行う。同じ分子量の抗原を固相に塗布し、その他のアッ セイ状態及びパラメータをすべて同じにすることにより、２つの単−多ローン性 抗体の相対親和力を外径の数値から決定することができる。

５ＫＯＯ７細胞と結合し、好塩基球からのヒスタミン放出を誘発しない幾つかの ヒトＩｇＥ−特異性単一クローン性抗体の親和力を決定する際に、ヒトＩｇＨに 対する様々な単一クローン性抗体の結合力を１１、親和力がｌＸｌ０”リットル １モルであることか確認されているヒトβ−ＨＣＧに対する単一クローン性抗体 の結合力と比較した。我々のアッセイでは、０．１μｇ／−のβ−ＨＣＧまたは ヒトＩｇＥ　５０μｌをＥＬＩＳＡプレートのウェルに塗布してから、抗ＨＣＧ 単一りローン性抗体及び固相上の各抗原に対する様々な単一クローン性抗体を滴 定した。この手順は、実験■のＥＬｊＳＡの手順で説明したものと実質的に同じ であった。ワサビダイコンペロキシダーゼ−共役ヤギ抗マウスＩｇＧ及び酵素基 質を用いて、滴定曲線を決定した。

単一クローン性抗体の親和力は１！′Ｉ標識ヒトＩｇＢによっても決定できる。

抗体の溶液と既知の濃度の＋［１１ｇＢの溶液とを混合して、均衡状態になるま で十分な時間（２４時間）結合させる。次に、ヤギ抗マウスＩｇＧと結合化した 過剰のセファローズ４Ｂを用いた親和性吸着によって免疫複合物を迅速に取り除 く。遊離１２８１１ｇＢを迅速に洗い流す。遊離＋２Ｊ１ｇＢと結合ｌ！ｓＩＩ ｇＥとの比率から単一クローン性抗体の会合定数Ｋａを計算する。この方法は、 親和力が高い抗体に特に適している。

２、　結果 好塩基球からのヒスタミン放出を誘発せず、５ＫＯＯ７細胞と結合する６つの単 一クローン性抗体は、会合定数Ｋａが３Ｘ１０８〜５Ｘ１０’　リットル１モル であることが確認された。

均等物 日常的実験以外にも上記の本発明の特定の実施例の様々な均等物を使用できるこ とは当業者には明かであろう。そのような均等物は本発明の範囲に入る。

ＦＩＧ、１ 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年６月３０日 ”ＦＦｆ？！ｔ　＊ＥＥｉａ　ｊｌ　図１、国際出願番号　ＰＣＴ／ＵＳ　８８ １０４７０６２、発明の名称　１ｇＢ産出性Ｂリンノ（珠玉の独特な抗原決定基 。

ステラ・リンク１０３０１　。

名称　タノックス・バイオシステムズ・インコーホレーテッド代表者　チャン、 ツエ・ウエン （国籍）アメリカ合衆国 請求の範囲 １．　ＩｇＥに媒介されるアレルギの治療又は予防に使用する薬剤調合物であっ て、Ｉ’ｇＥ産出性の８９２８球には結合するがヒスタミン放出を誘起しない抗 体又はそのフラグメントと、薬理学上受容しうる媒体とを含有する薬剤調合物。

２、　前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１項記載の薬剤調合物 。

３、前記抗体がＥＩＯＩ−１，ＥＩＯ−１２−５５，Ｅ８−５−３．　ＥＩＯ− ２１−１５，ＥｌＯ−８−１２０及びＥｌｌ−４−７０より成る群から選択され る請求の範囲第１項記載の薬剤調合物。

４、　前記抗体がネズミ由来の抗原結合領域及びヒト由来の不変領域を有するキ メラ性のネズミ／ヒト抗体である請求の範囲第１項記載の薬剤調合物。

５、　前記抗体がネズミＩｇＧ２Ａ、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ３サブクラス に対するネズミ、ヒト又はキメラ性の抗体である請求の範囲第１項記載の薬剤調 合物。

６、　前記抗体がヒト又はヒト類似の抗体である請求の範囲第１項記載の薬剤調 合物。

７、　抗体依存の細胞毒性を向上させる因子をさらに含有する請求の範囲第１項 記載の薬剤調合物。・８、　前記ファクタがＧＭ−Ｃ３Ｆ、　Ｍ−Ｃ３Ｆ及びマ クロファージ活性因子より成る群から選択される請求の範囲第７項記載の薬剤調 合物。

１０、　ＩｇＥに媒介されたアレルギ反応の治療又は予防に使用する薬剤調合物 であって、モノクローナル抗体又はそのフラグメントを含有し、前記モノクロー ナル抗体が、ａ）ＩｇＢ産出性の８９２８球には結合し、かつｂ）ＦｃεＲによ るＩｇＥの結合をブロックするのに十分な親和性を有してヒトのＩｇＥに結合す るものである薬剤調合物。

１３、１ｇＥ産出性の８９２８球には結合するがヒスタミン放出を誘起しないキ メラ性のモノクローナル抗体又はそのフラグメント。

１４、前記モノクローナル抗体がプツシ類由来の抗原結合領域及びヒト由来の不 変領域を有するキメラ性のプツシ類／ヒト抗体である請求の範囲第１３項記載の キメラ性のモノクローナル抗体。

１５、前記プツシ類がマウスである請求の範囲第１４項記載のキメラ性のモノク ローナル抗体。

１６、前記抗原結合領域が８１０１−１．　ＥＩＯ−１２−５５，Ｅ８−５−３ ．　Ｅｌｏ−２１７１５、Ｅｌｏ−８−１２０及びＥｌｌ−４−ＴＯより成る群 から選択される抗体から誘導される請求の範囲第１５項記載のキメラ性のモノク ローナル抗体。

１７、１ｇＢ産出性のＢ細胞には結合するがヒスタミン放出を誘起しない抗１ｇ Ｂ抗体のＬ鎖又はＨ鎖の可変領域を機能的にコードしているように再配列された 遺伝子を有する単離ＤＮＡ　。

１８、ヒトのＬ鎖又はＨ鎖の不変領域をコードしているＤＮＡに結合された請求 の範囲第１７項記載のＤＮＡを含むＤＮＡ構成物。

１９、キメラ性の抗体を分泌する請求の範囲第１８項記載のＤＮＡ構成物で感染 された細胞。

２４、　１ｇＢ産出性のＢ細胞には結合するがヒスタミン放出を誘起しない免疫 毒素。

２５、１ｇＥ産出性の８９２８球には結合するが細胞溶解性すなわち細胞毒性物 質に接合されたマスト細胞すなわち好塩基性細胞には結合しない特定の結合物質 を含む免疫毒素。

２Ｇ、前記特定の結合物質がモノクローナル抗体又はそのフラグメントである請 求の範囲第２５項記載の免疫毒素。

２７、前記物質がリチン、プソイドモナス毒、ジフテリア毒。

アメリカやまごぼうの抗ウイルス性ペプチド、トリコセシン。

放射性核種及び膜換散性酵素より成る群から選択される請求の範囲第２５項記載 の免疫毒素。

２８、１ｇＥ産出性のＢ細胞には結合するがヒスタミン放出を誘起しない抗体の フラグメント。

３１、　ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するがヒスタミン放出を誘起しない抗体 のバロトープに対する特異性を有する抗イデイオタイプのモノクローナル抗体。

３２、請求の範囲第３１項記載のパロトーブに対する特異性を有する抗イデイオ タイプの抗体であって、プツシ類に由来する抗原結合領域及びヒトに由来する不 変領域を有するキメラ性の抗体。

３３、請求の範囲第３１項記載の抗イデイオタイプの抗体の抗原結合性フラグメ ント。

３４、１ｇＥ産出性のＢ細胞には結合するがヒスタミン放出を誘起しない抗体の バロトープに対する特異性を有するモノクローナル抗体を分泌する連続かつ安定 な株化細胞。

３５、ハイブリドーマ株化細胞である請求の範囲第３４項記載の株化細胞。

３６、　ＩＲＥ産出性のＢ細胞には結合するがヒスタミン放出を誘起しない抗体 によって特定される抗原決定基に事実上等価なアミノ酸配列を有するペプチド。

３７、前記抗原決定基がＩＥ１０’ｌ−１，ＥＩＯ−１２−５５，Ｅ８−５−３ ．　ＥＩＯ−２１−１５、Ｅｌｏ−８−１２０及びＥｌｆ−４−７０より成る群 から選択される抗体によって特定される請求の範囲第３６項記載のペプチド。

３８、混合された白血球群内のＩｇＢ産出性の８９２８球の識別方法であって、 白血球の試料とＩｇＢ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞には結合しな い抗ＩｇＥ抗体とを接触させる段階と、どの細胞に前記抗体が結合したかを測定 する段階とを有し、前記抗体と結合したものカ月ｇＥ産出性のＢ細胞と認定され る方法。

３９、Ｂ細胞の膜に結合された免疫グロブリンに対して特異的に結合するがこの 免疫グロブリンの分泌型には結合しない抗体の調製。

４０、前記免疫グロブリンがヒトＩｇＥである請求の範囲第３９項記載の抗体の 調製。

４１、前記抗体がモノクローナルである請求の範囲第３９項記載の抗体の調製。

４２、免疫グロブリン鎖の膜結合領域の細胞外のセグメントに特異的に結合する 抗体の調製。

４３．前記免疫グロブリンがヒトＩｇＥである請求の範囲第４２項記載の抗体の 調製。

４４、前記抗体がモノクローナルである請求の範囲第４２項記載の抗体の調製。

４５．８細胞の表面のヒトＩｇＥに結合するが好塩基性細胞の表面のヒ）ＩｇＢ には結合せず、かつ分泌された可溶性のＩｇＨにも結合しないモノクローナル抗 体。

４６、マウスＩｇＧ２Ａ、ヒトＩｇＧ１　又はＩｇＧ３サブクラス抗体である請 求の範囲第４５項記載のモノクローナル抗体。

４７、キメラ性の抗体である請求の範囲第４５項記載のモノクローナル抗体。

４８．８細胞の表面のヒ）ＩｇＨに特異的に結合するが好塩基性細胞の表面のＩ ｇＢには結合せず、かつ分泌された可溶性のＩｇＥにも結合しないキメラ性の抗 体であって、前記抗体がネズミ抗原結合領域及びヒトのガンマ１又はガンマ３の Ｈ鎖不変領域を有するキメラ性の抗体。

４９、Ｂ細胞の表面のヒ）ＩｇＨに特異的に結合するが好塩基性細胞の表面のヒ トＩｇＨには結合せず、かつ分泌された可溶性のＩｇＥにも結合しないモノクロ ーナル抗体を産生ずる連続かつ安定な株化細胞。

５０、ハイブリドーマである請求の範囲第４９項記載の株化細胞。

５１、ネズミハイブリドーマである請求の範囲第５０項記載の株化細胞。

５２、　ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可溶 性のＩｇＨには結合しない抗体のＬ鎖又はＨ鎖の可変領域を機能的にコードして いるように再配列された遺伝子を有する単離ＤＮＡ　。

５３、ヒトのＬ鎖又はＨ鎖の不変領域をコードしているＤＮＡに結合された請求 の範囲第５２項記載のＤＮＡを含むＤＮＡ構成物。

５４、前記Ｈ鎖の不変領域がガンマｌ又はガンマ３タイプである請求の範囲第５ ３項記載のＤＮＡ構成物。

５５、請求の範囲第５４項記載のＤＮＡ構成物でトランスフェクトされたミエロ ーマ細胞であって、キメラ性の抗体を分泌するミエローマ細胞。

８’５．　Ｉｌｌ！ε産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌され た可溶性のＩｇＨには結合しない抗体のバロトーブに対する特異性を有する抗イ デイオタイプのモノクローナル抗体。

６６、請求の範囲第６５項記載のバロトープに対する特異性を有する抗イデイオ タイプの抗体であって、ネズミに由来する抗原結合領域及びヒトに由来する不変 領域を有するキメラ性の抗体。

６７、請求の範囲第６５項記載の抗イデイオタイプの抗体の抗原結合性フラグメ ント。

６８、請求の範囲第６５項記載のモノクローナル抗体を分泌する連続かつ安定な 株化細胞。

７１、１ｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可溶性 のＩｇＢには結合しない免疫毒素。

７２、１ｇＢ産出性の８９７３球には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可 溶性のＩｇＨには結合しない抗体に結合された細胞毒素より成る免疫毒素。

７３、前記細胞毒素かりチン、プソイドモナス毒、ジフテリア毒、アメリカやま ごぼうの抗ウイルス性ペプチド、トリコセシン、放射性核種及び膜溶菌酵素より 成る群から選択される請求の範囲第７２項記載の免疫毒素。

７６．８細胞表面上のＩｇＨの膜結合領域の細胞外セグメントに対応するアミノ 酸配列を有するペプチド。

７７、請求の範囲第７６項記載のペプチドであって、アミノ酸配列−Ｇｌｕ　Ｌ ｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｙ　Ｇｌｕ　ＡＩａ　Ｐｒｏ−及びペプチドの修飾を有し、前記ペプチドの修 飾においてはアミノ酸がその免疫学的特性を実質的に損なうことなく欠失、挿入 又は置換されているペプチド。

７８、請求の範囲第７６項記載のペプチドであって、キャリアタンパクに接合さ れたペプチド。

７９、前記キャリアタンパクがキーホールを有するヘモシアニンである請求の範 囲第７８項記載のペプチド。

８０、１ｇ１ｌ：産出性のＢ細胞には特異的に結合するが好塩基性細胞又は分泌 された可溶性のＩｇＨには結合しない抗体を産生ずる細胞又は抗体の生成方法で あって、 ａ）　Ｂ細胞表面上のＩｇＢの膜結合領域の細胞外セグメントに対応するアミノ 酸配列を有するペプチドを動物に接種する段階と、 ｂ）前記ペプチドに固有の抗体を産生ずる細胞又は抗体を前記接種された動物か ら得る段階と、 を有する方法。

８１、請求の範囲第８０項記載の方法であって、前記ペプチドがアミノ酸配列− Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　 ＧｌｕＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ−及びペプチドの修飾を有し、前記ペプ チドの修飾においてはアミノ酸がその免疫学的特性を実質的に損なうことなく欠 失、挿入又は置換されている方法。

８２、前記ペプチドがキャリアタンパクに接合されている請求の範囲第８０項記 載の方法。

８３、前記キャリアタンパクがキーホールを有するヘモシアニンである請求の範 囲第８２項記載の方法。

８４、ペプチドと反応する抗体であって、前記ペプチドがアミノ酸配列−Ｇｌｕ 　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｔ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ 　ＧｌｙＧｌｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ−及びペプチドの修飾を有し、前記ペプチドの 修飾においてはアミノ酸がその免疫学的特性を実質的に損なうことなく欠失、挿 入又は置換されている抗体。

８５、前記抗体がモノクローナルである請求の範囲第８４項記載の抗体。

８６、１ｇＥ産出性のＢ細胞には特異的に結合するが好塩基性細胞又は分泌され た可溶性のＩｇＥには結合しない抗体を産生ずる細胞又は抗体の生成方法であっ て、 ａ）少なくとも膜結合領域の細胞外セグメントを有する１ｇ８分子を動物に接種 する段階と、 ｂ）前記膜結合領域の細胞外セグメントに固有の抗体を産生ずる細胞又は抗体を 得る段階と、 を有する方法。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＩｇＥに媒介されるアレルギの治療又は予防の方法であって、ＩｇＥ産出性 のＢ細胞には結合するがマスト細胞すなわち好塩基性細胞には結合しない抗体を 患者に投与する段階を有する方法。 ２．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１項記載の方法。 ３．　前記抗体がＥ１０１−Ｉ，Ｅ１０−１２−５５，Ｅ８−５−３，Ｅ１０− ２１−１５，Ｅ１０−８−１２０及びＥ１１−４−７０より成る群から選択され る請求の範囲第１項記載の方法。 ４．前記抗体がネズミ由来の抗原結合領域及びヒト由来の不変領域を有するキメ ラ性のネズミ／ヒト抗体である請求の範囲第１項記載の方法。 ５．　前記抗体がネズミＩｇＧ２Ａ，ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ３サブクラス のネズミ，ヒト又はキメラ性の抗体である請求の範囲第１項記載の方法。 ６．前記モノクローナル抗体の投与とともに従来の脱感作免疫療法が行われる請 求の範囲第１項記載の方法。 ７．前記抗体が抗体依存の細胞毒性を向上させる因子とともに投与される請求の 範囲第１項記載の方法。 ８．前記因子がＧＭ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ及びマクロファージ活性因子より成る 群から選択される請求の範囲第７項記載の方法。 ９．ＩｇＥに媒介されたアレルギ反応の治療又は予防方法であって、ＩｇＥに媒 介されたアレルギ症の患者に対して、ヒトのＩｇＥ産出性のＢリンパ球には結合 するが好塩基性細胞には結合しないモノクローナル抗体又はそのフラグメントを 投与する段階を有する方法。 １０．ＩｇＥに媒介されたアレルギ反応の治療又は予防方法であって、モノクロ ーナル抗体又はそのフラグメントをＩｇＥに媒介されたアレルギ症の患者に対し て投与する段階を有し、前記モノクローナル抗体が、 ａ）ＩｇＥ産出性のＢリンパ球には結合するが好塩基性細胞には結合せず、かつ ｂ）ＦｃεＲによるＩｇＥの結合をブロックするのに十分な親和性を有してヒト のＩｇＥに結合するものである方法。 １１．前記抗体がネズミ由来の抗原結合領域及びヒト由来の不変領域を有するキ メラ性のネズミ／ヒト抗体である請求の範囲第１０項記載の方法。 １２．前記ネズミ抗原結合領域がＥ１０１−１，Ｅ１０−１２−５５，Ｅ８−５ −３，Ｅ１０−２１−１５，Ｅ１０−８−１２０及びＥ１１−４−７０より成る 群から選択される抗体から誘導される請求の範囲第１１項記載の方法。 １３．ＩｇＥ産出性のＢリンパ球には結合するが好塩基性細胞には結合しないキ メラ性のモノクローナル抗体又はそのフラグメント。 １４．前記モノクローナル抗体がゲッシ類由来の抗原結合領域及びヒト由来の不 変領域を有するキメラ性のゲッシ類／ヒト抗体である請求の範囲第１３項記載の キメラ性のモノクローナル抗体。 １５．前記ゲッシ類がマウスである請求の範囲第１４項記載のキメラ性のモノク ローナル抗体。 １６．前記抗原結合領域がＥ１０１−１，Ｅ１０−１２−５５，Ｅ８−５−３， Ｅ１０−２１−１５，Ｅ１０−８−１２０及びＥ１１−４−７０より成る群から 選択される抗体から誘導される請求の範囲第１５項記載のキメラ性のモノクロー ナル抗体。 １７．ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞には結合しない抗Ｉｇ Ｅ抗体のＬ鎖又はＨ鎖の可変領域を機能上コードしているように再配列された遺 伝子を含む単離ＤＮＡ。 １８．ヒトのＬ鎖又はＨ鎖の不変領域をコードしているＤＮＡに結合された請求 の範囲第１７項記載のＤＮＡを含むＤＮＡ構成物。 １９．キメラ性の抗体を分泌する請求の範囲第１８項記載のＤＮＡ構成物で感染 された細胞。 ２０．ＩｇＥに媒介されたアレルギの治療方法であって、ＩｇＥ産出性のＢリン パ球には結合するがマスト細胞すなわち好塩基性細胞には結合しない免疫毒素を アレルギ症の患者に投与する段階を有する方法。 ２１．前記免疫毒素がＩｇＥ産出性のＢリンパ球には結合するが細胞溶解性又は 細胞毒性物質に接合されたマスト細胞又は好塩基性細胞には結合しない特定の結 合物質を含む請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２．前記特定の結合物質がモノクローナル抗体又はそのフラグメントである請 求の範囲第２１項記載の方法。 ２３．前記細胞毒性物質がリチン，プソイドモナス毒，ジフテリア毒，アメリカ やまこぼうの抗ウィルス性ペプチド，トリコセシン，放射性核種及び膜溶菌酵素 より成る群から選択される請求の範囲第２１項記載の方法。 ２４．ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞には結合しない免疫毒 素。 ２５．ＩｇＥ産出性のＢリンパ球には結合するが細胞溶解性又は細胞毒性物質に 接合されたマスト細胞又は好塩基性細胞には結合しない特定の結合物質を含む免 疫毒素。 ２６．前記特定の結合物質がモノクローナル抗体又はそのフラグメントである請 求の範囲第２５項記載の免疫毒素。 ２７．前記物質がリチン，プソイドモナス毒，ジフテリア毒，アメリカやまごぼ うの抗ウィルス性ペプチド，トリコセシン，放射性核種及び膜溶菌酵素より成る 群から選択される請求の範囲第２５項記載の免疫毒素。 ２８．ＩｇｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞には結合しない抗体 のフラグメント。 ２９．ＩｇＥに媒介されたアレルギの治療又は予防方法であって、ＩｇＥに媒介 されたアレルギ症の患者に対して、ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基 性細胞には結合しない抗体のパロトープに対するモノクローナル抗体を投与する 段階を有する方法。 ３０．前記抗体がキメラ性の抗体である請求の範囲第２９項記載の方法。 ３１．ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞には結合しない抗体の パロトープに対する特異性を有する抗イディオタイプのモノクローナル抗体。 ３２．請求の範囲第３１項記載のパロトープに対する特異性を有する抗イディオ タイプの抗体であって、ゲッシ類に由来する抗原結合領域及びヒトに由来する不 変領域を有するキメラ性の抗体。 ３３．請求の範囲第３１項記載の抗イディオタイプの抗体の抗原結合性フラグメ ント。 ３４．ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞には結合しない抗体の パロトープに対する特異性を有するモノクローナル抗体を分泌する連続かつ安定 な株化細胞。 ３５．ハイブリドーマ株化細胞である請求の範囲第３４項記載の株化細胞。 ３６．ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞には結合しない抗体に よって特定される抗原決定基と事実上等価なアミノ酸配列を有するペプチド。 ３７．前記抗原決定基がＥ１０１−１，Ｅ１０−１２−５５，Ｅ８−５−３，Ｅ １０−２１−１５，Ｅ１０−８−１２０及びＥ１１−４−７０より成る群から選 択される抗体によって特定される請求の範囲第３６項記載のペプチド。 ３８．混合された白血球群内のＩｇＥ産出性のＢリンパ球の識別方法であって、 白血球の試料とＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞には結合しな い抗１ｇＥ抗体とを接触させる段階と、どの細胞に前記抗体が結合したかを測定 する段階とを有し、前記抗体と結合したものがＩｇＥ産出性のＢ細胞と認定され る方法。 ３９．Ｂ細胞の膜に結合された免疫グロブリンに対して特異的に結合するがこの 免疫グロブリンの分泌型には結合しない抗体の調製。 ４０．前記免疫グロブリンがヒトＩｇＥである請求の範囲第３９項記載の抗体の 調製。 ４１．前記抗体がモノクローナルである請求の範囲第３９項記載の抗体の調製。 ４２．免疫グロブリン鎖の膜結合領域の細胞外のセグメントに特異的に結合する 抗体の調製。 ４３．前記免疫グロブリンがヒトＩｇＥである請求の範囲第４２項記載の抗体の 調製。 ４４．前記抗体がモノクローナルである請求の範囲第４２項記載の抗体の調製。 ４５．Ｂ細胞の表面のヒトＩｇＥに結合するが好塩基性細胞の表面のヒトＩｇＥ には結合せず、かつ分泌された可溶性のＩｇＥにも結合しないモノクローナル抗 体。 ４６．マウスＩｇＧ２Ａ，ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラス抗体である請求 の範囲第４５項記載のモノクローナル抗体。 ４７．キメラ性の抗体である請求の範囲第４５項記載のモノクローナル抗体。 ４８．Ｂ細胞の表面のヒトＩｇＥに特異的に結合するが好塩基性細胞の表面のＩ ｇＥには結合せず、かつ分泌された可溶性のＩｇＥにも結合しないキメラ性の抗 体であって、前記抗体がネズミ抗原結合領域及びヒトのガンマ１又はガンマ３の Ｈ鎖不変領域を有するキメラ性の抗体。 ４９．Ｂ細胞の表面のヒトＩｇＥに特異的に結合するが好塩基性細胞の表面のヒ トＩｇＥには結合せず、かつ分泌された可溶性のＩｇＥにも結合しないモノクロ ーナル抗体を産生する連続かつ安定な株化細胞。 ５０．ハイブリドーマである請求の範囲第４９項記載の株化細胞。 ５１．ネズミハイブリドーマである請求の範囲第５０項記載の株化細胞。 ５２．ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可溶性 のＩｇＥには結合しない抗体のＬ鎖又はＨ鎖の可変領域を機能上コードしている ように再配列された遺伝子を含む単離ＤＮＡ。 ５３．ヒトのＬ鎖又はＨ鎖の不変領域をコードしているＤＮＡに結合された請求 の範囲第５２項記載のＤＮＡを含むＤＮＡ構成物。 ５４．前記Ｈ鎖の不変領域がガンマ１又はガンマ３タイプである請求の範囲第５ ３項記載のＤＮＡ構成物。 ５５．請求の範囲第５４項記載のＤＮＡＡ構成物でトランスフェクトされたミエ ローマ細胞であって、キメラ性の抗体を分泌するミエローマ細胞。 ５６．ＩｇＥに媒介されるアレルギの治療又は予防の方法であって、ＩｇＥ産出 性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可溶性のＩｇＥには結合 しない抗体を患者に投与する段階を有する方法。 ５７．前記抗体がネズミ由来の抗原結合領域及びヒト由来の不変領域を有するキ メラ性のネズミ／ヒト抗体である請求の範囲第５６項記載の方法。 ５８．前記不変領域がＩｇＥ又はＩｇＧ３タイプである請求の範囲第５７項記載 の方法。 ５９．前記抗体の投与とともに従来の脱感作免疫療法が行われる請求の範囲第５ ６項記載の方法。 ６０．前記抗体が抗体依存の細胞毒性を向上させる因子とともに投与される請求 の範囲第５６項記載の方法。 ６１．前記因子がＧＭ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ及びマクロファージ活性因子より成 る群から選択される請求の範囲第６０項記載の方法。 ６２．ＩｇＥに媒介されたアレルギの治療又は予防方法であって、ＩｇＥに媒介 されたアレルギ症の患者に対して、Ｂ細胞表面のＩｇＥの細胞外膜結合領域に特 異的に結合するモノクローナル抗体を投与する段階を有する方法。 ６３．前記アレルギが直接型の超過敏症である請求の範囲第６２項記載の方法。 ６４．前記抗体がネズミ由来の抗原結合領域及びヒト由来の不変領域を有するキ メラ性のネズミ／ヒト抗体である請求の範囲第６２項記載の方法。 ６５．ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可溶性 のＩｇＥには結合しない抗体のパロトープに対する特異性を存ずる抗イディオタ イプのモノクローナル抗体。 ５６．請求の範囲第６５項記載のパロトープに対する特異性を有する抗イディオ タイプの抗体であって、ネズミに由来する抗原結合領域及びヒトに宙来する不変 領域を有するキメラ性の抗体。 ６７．請求の範囲第６５項記載の抗イディオタイプの抗体の抗原結合性フラグメ ント。 ６８．請求の範囲第６５項記載のモノクローナル抗体を分泌する連続かつ安定な 株化細胞。 ６９．ＩｇＥに媒介されたアレルギの治療又は予防方法であって、ＩｇＥに媒介 されたアレルギ症の患者に対して、ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基 性細胞又は分泌された可溶性のＩｇＥには結合しない抗体のパロトープに対する 抗体を投与する段階を有する方法。 ７０．前記抗体がキメラ性の抗体である請求の範囲第６９項記載の方法。 ７１．ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可溶性 のＩｇＥには結合しない免疫毒素。 ７２．ＩｇＥ産出性のＢリンパ球には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可 溶性のＩｇＥには結合しない抗体にリンクされた細胞毒素より成る免疫毒素。 ７３．前記細胞毒素がリチン，プソイドモナス毒，ジフテリア毒，アメリカやま ごぼうの抗ウィルス性ペプチド，トリコセシン，放射性核種及び膜溶菌酵素より 成る群から選択される請求の範囲第７２項記載の免疫毒素。 ７４．ＩｇＥに媒介されたアレルギの治療方法であって、アレルギ症の患者に対 して、ＩｇＥ産出性のＢ細胞には結合するが好塩基性細胞又は分泌された可溶性 のＩｇＥには結合しない抗体に接合された細胞毒素より成る免疫毒素を投与する 段階を有する方法。 ７５．前記細胞毒素がリチン，プソイドモナス毒，ジフテリア毒，アメリカやま ごぼうの抗ウィルス性ペプチド，トリコセシン，放射性核種及び膜溶菌酵素より 成る群から選択される請求の範囲第７４項記載の方法。 ７６．Ｂ細胞表面上のＩｇＥの膜結合領域の細胞外セグメントに対応するアミノ 酸配列を有するペプチド。 ７７．請求の範囲第７６項記載のペプチドであって、アミノ酸配列−【配列があ ります】 −及びペプチドの変異を有し、前記ペプチドの変異においてはアミノ酸がその免 疫学的特性を実質的に損なうことなく欠失、挿入又は置換されているペプチド。 ７８．請求の範囲第７６項記載のペプチドであって、キャリアタンパクに接合さ れたペプチド。 ７９．前記キャリアタンパクがキーホールを有するヘモシアニンである請求の範 囲第７８項記載のペプチド。 ８０．ＩｇＥ産出性のＢ細胞には特異的に結合するが好塩基性細胞又は分泌され た可溶性のＩｇＥには結合しない抗体を産生する細胞又は抗体の生成方法であっ て、 ａ）Ｂ細胞表面上のＩｇＥの膜結合領域の細胞外セグメントに対応するアミノ酸 配列を有するペプチドを動物に接種する段階と、 ｂ）前記ペプチドに固有の抗体を産生する細胞又は抗体を前記接種された動物か ら得る段階と、 を有する方法。 ８１．請求の範囲第８０項記載の方法であって、前記ペプチドがアミノ酸配列− 【配列があります】 −及びペプチドの変異を有し、前記ペプチドの変異においてはアミノ酸がその免 疫学的特性を実質的に損なうことなく欠失、挿入又は置換されている方法。 ８２．前記ペプチドがキャリアタンパクに接合されている請求の範囲第８０項記 載の方法。 ８３．前記キャリアタンパクがキーホールを有するヘモシアニンである請求の範 囲第８２項記載の方法。 ８４．ペプチドと反応する抗体であって、前記ペプチドがアミノ酸配列−【配列 があります】 −及びペプチドの変異を有し、前記ペプチドの変異においてはアミノ酸がその免 疫学的特性を実質的に損なうことなく欠失、挿入又は置換されている抗体。 ８５．前記抗体がモノクローナルである請求の範囲第８４項記載の抗体。 ８６．ＩｇＥ産出性のＢ細胞には特異的に結合するが好塩基性細胞又は分泌され た可溶性のＩｇＥには結合しない抗体を産生する細胞又は抗体の生成方法であっ て、 ａ）少なくとも膜結合領域の細胞外セグメントを有するＩｇＥ分子を動物に接種 する段階と、 ｂ）前記膜結合領域の細胞外セグメントに固有の抗体を産生する細胞又は抗体を 得る段階と、 を有する方法。