DE3853636T2 - Antigene epitope, die sich ausschliesslich auf ige-tragenden b-lymphocyten befinden. - Google Patents

Description

Hintergrund
• Die Hypersensitivität vom unmittelbaren Typ, wie exogen-allergisches Asthma, Heuschnupf en und allergische Reaktionen gegen gewisse Nahrungsmittel oder Arzneimittel wird in erster Linie durch das Immunglobulin E (IgE) vermittelt. In einer IgE-vermittelten allergischen Reaktion bindet das Allergen an das IgE auf der Oberfläche von Mastzellen oder basophilen Leukocyten (Basophilen). Dieses Binden verursacht eine Quervernetzung der IgE-Moleküle und damit auch der zugrundeliegenden Rezeptoren für den Fc-Teil des IgEs (FcεR) und löst dadurch die Freisetzung von pharmakologischen Mediatoren, wie Histamin, langsam reagierende Anaphylaxie-Substanz und Serotonin aus. Die Freisetzung dieser Produkte aus Mastzellen und Basophilen verursacht die vielfältigen pathologischen Manifestationen der Allergie.
• Patienten, die unter IgE-vermittelten hypersensitiven Reaktionen leiden, werden zur Milderung der Symtome häufig mit Histaminantagonisten behandelt. Ferner werden während der Heuschnupfen-Saison Desensibilisierungsprozeduren angewandt, um hartnäckig andauernde allergische Reaktionen zu verhindern oder zu mildern. Bei diesen Prozeduren werden kleine Dosierungen des Allergens periodisch injiziert, um gewisse, nicht voll verstandene Immunantworten zu induzieren, die auf irgendeine Weise die IgE-vermittelten Antworten abschwächen. Desensibilisierungsprozeduren sind bei gewissen Patienten wirksam, haben bei anderen aber nur eine unbedeutende Wirkung.
• Es wurde vorgeschlagen, eine IgE-vermittelte Allergie durch Hemmen der Bindung von IgE an Mastzellen und Basophile zu behandeln. Zum Beispiel sind synthetische, verschiedene Bereiche des Fcs von IgE (FCε) repräsentierende Peptide als Konkurrenzinhibitoren zur Bindung von IgE an die auf Mastzellen oder Basophilen befindlichen Rezeptoren untersucht worden. Vergl. z.B. Stanworth, D.R., Molec. Immun. 21 (1984), 1183-1190; Stanworth, D.R. and Burt, D.S., Molec. Immun. 23 (1986), 1231-1235; Burt, D.S. et al., Molec. Immun. 24 (1987), 379-389; Hahn, U.S.-Patent 4,683,292; Hamburger, U.S.-Patente 4,171,299 und 4,161,522. Solche Peptide haben sich jedoch, vermutlich wegen ihrer verglichen mit Gesamt-IgE niedrigeren Affinität für den FcεR als nicht sehr wirksam bei der Behandlung einer Allergie erwiesen.
• In jüngster Zeit wurden zur Kartierung der verschiedenen antigenen und funktionellen Epitope auf IgE Verfahren angewandt, bei denen monoclonale Antikörper verwendet wurden. Baniyash und Eshhar (Eur. J. Immunol. 14 (1984), 799- 807) berichteten, daß unter den verschiedenen, gegen IgE hergestellten monoclonalen Rattenantikörpern drei das Binden von Maus-IgE an basophile Zellen von Ratten inhibierten. Da die Antikörper außerdem eine Freisetzung von Serotonin aus Basophilen auslösen konnten, die IgE gebunden hatten, banden die Antikörper vermutlich an Stellen auf dem Fc, die der Stelle, die an die Rezeptoren für IgE auf den Basophilen bindet, benachbart, nicht aber mit ihr identisch war. Später entwickelten dieselben Forscher einen monoclonalen Antikörper, der die Bindung des IgEs an basophile Zellen hemmen konnte, der das IgE auf der Oberfläche des Basophils jedoch nicht erkannte. Baniash et al., Molec. Immunol. 25 (1988), 705; Siraganian et al. (vgl. Fed. Proc. 40 (1981), 965 und Fed. Proc. 46 (1987), 1346) berichteten, daß unter den ungefähr 10, gegen menschliches IgE hergestellten monoclonalen Mausantikörpern einige kein IgE auf Basophilen binden konnten. Sie beschrieben ferner, daß einige dieser letzteren monoclonalen Antikörper das Binden von menschlichem IgE an Basophile hemmen konnten. Bei diesen Untersuchungen wurden die monoclonalen Antikörper dazu verwendet, die verschiedenen Epitope oder funktionell verwandte Peptidabschnitte auf dem IgE zu definieren.
• Kürzlich wurde von Whitaker ein für den IgE-Isotyp spezifisches Immuntoxin und dessen Verwendung bei der Behandlung einer Allergie beschrieben; U.S.-Patent 4,714,759. Das Immuntoxin umfaßt einen an ein Toxin gekoppelten anti-IgE-Antikörper. Der beabsichtigte pharmakologische Mechanismus der Behandlung besteht darin, daß das für den IgE-Isotyp spezifische Immuntoxin IgE-produzierende B-Zellen abtötet.
Zusammenfassung der Erfindung
• Die Erfindung betrifft einzigartige antigene Determinanten auf IgE-Molekülen, und sie betrifft Reagenzien und Arzneimittel zur Behandlung oder Prophylaxe einer IgE-vermittelten Allergie, basierend auf der Entdeckung dieser Determinanten. Die antigenen Determinanten sind auf IgE-tragenden B-Lymphocyten (B-Zellen), nicht aber auf Basophilen oder Mastzellen vorhanden.
• Obwohl IgE nur von IgE-tragenden B-Zellen produziert wird, ist es nicht nur auf diesen Zellen vorhanden, sondern befindet sich ebenfalls auf Mastzellen und Basophilen. IgE besitzt eine sehr hohe Affinität für den FcεR auf der Oberfläche von Basophilen und Mastzellen (die Assoziationskonstante, Ka, liegt im Bereich von 10&sup9; bis 10¹&sup0; Liter Mol&supmin;¹), und die Dissoziationsgeschwindigkeit ist sehr klein (die Halbwertszeit für das Assoziat (half life of "on time") beträgt ungefähr 20 Stunden). Somit ist IgE praktisch ein Oberflächenantigen von Basophilen und Mastzellen.
• Die erfindungsgemäßen antigenen Epitope auf IgE sind auf IgE-tragenden B-Zellen, nicht aber auf Basophilen oder Mastzellen vorhanden. Deshalb sind diese Epitope einzigartige Oberflächenmarker von IgE-tragenden B-Zellen. Die Epitope können mit ige.bl (bl bezeichnet B-Lymphocyten) bezeichnet werden. Bei dem IgE auf B-Zellen handelt es sich um die membrangebundene Form, die in der Membran dadurch verankert ist, daß sie sich durch die Lipid-Doppelschicht der Membran hindurch erstreckt; beim IgE auf Basophilen und Mastzellen handelt es sich um die sekretorische Form, die auf der Zelloberfläche durch Bindung an die FcεR-Moleküle verankert ist. Die Gesamtstrukturen der beiden IgE-Formen sind etwas unterschiedlich im Hinblick darauf, daß die membrangebundene Form einen zusätzlichen Abschnitt enthält. Die Topographie der Assoziation mit der Zelloberfläche ist beim IgE auf B-Zellen ebenfalls unterschiedlich von der des IgEs auf Basophilen. Eine Klasse der ige.bl-Epitope befindet sich im Fc-Bereich des IgE-Moleküls an oder nahe der Bindungsstelle des FcεRs. Diese Epitope werden durch Bindung des FcεRs verdeckt. Eine andere Klasse von ige.bl-Epitopen sind antigene Epitope, die Teile des extrazellulären Abschnittes des membrangebundenen (extracellular segment of membranebound) Bereichs der schweren ε-Ketten des Immunglobulins umfassen. Allgemein lassen sich diese Abschnitte verschiedener membrangebundener Immunglobuline mit mb/ec bezeichnen. Der mb/ec-Abschnitt des IgEs kann als ε.mb/ec-Abschnitt bezeichnet werden. Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung der Sequenz des ε.mb/ec-Abschnitts.
• Durch Identifizieren der ige.bl-Epitope werden verschiedene auf spezifisch an die Epitope bindenden Agenzien basierende Diagnose- und Therapieformen einer IgE-vermittelten Allergie bereitgestellt. IgE-vermittelte Allergien schließen solche allergische Krankheiten wie exogen-allergisches Bronchialasthma, allergischen Schnupfen oder Heuschnupfen, Nahrungsmittel- und Arzneimittelallergien ein. Die bevorzugten, spezifisch an die Epitope bindenden Agenzien sind monoclonale Antikörper oder deren Fragmente. In den erfindungsgeinäßen Arzneimitteln kann das spezifisch bindende Agenz jedoch jedes beliebige Molekül sein, das spezifisch an die Epitope bindet (und somit IgE-tragende B-Zellen, nicht aber Basophile bindet). Diese Reagenzien schließen synthetische Peptide ein, die identisch mit dem oder analog zum antigenbindenden Bereich (dein variablen Teil der hypervariablen Bereiche) der anti-iae.bl-Antikörper sind. Obwohl sich die nachstehende Beschreibung hauptsächlich auf anti-ige.bl-Antikörper konzentriert, ist das Konzept und sind die Verfahren gleichermaßen auf andere Moleküle anwendbar, die für die hier beschriebenen einzigartigen Epitope spezifisch sind.
• Die für ein ige.bl-Epitop spezifischen monoclonalen Antikörper können zur selektiven Zerstörung IgE-produzierender Zellen verwendet werden. Da das Epitop auf IgE-tragenden B-Zellen, nicht aber auf Mastzellen oder Basophilen vorhanden ist, binden die für ein ige.bl-Epitop spezifischen monoclonalen Antikörper an B-Zellen, nicht aber an Mastzellen oder Basophile. Diese differentielle Bindung erlaubt eine gezielte Ansteuerung und eine selektive Vernichtung von IgE- produzierenden B-Zellen. Die entweder in freier Form oder mit einem Toxin konjugierten Antikörper können zur gezielten Ansteuerung und Vernichtung von B-Zellen verwendet werden. Die monoclonalen Antikörper, die spezifisch für das ige.bl- Epitop an der oder nahe der FcεR-Stelle der Bindung an IgE sind, können zusätzliche therapeutische Wirkungen aufweisen. Die Antikörper binden IgE und bilden so Immunkomplexe, wodurch ein Entfernen des IgEs aus dem Immunsystem durch das retiendotheliale System erleichtert wird.
• Die Erfindung betrifft ferner paratop-spezifische, anti-idiotypische Antikörper gegen die Antikörper, die mit ige.bl-Epitopen reagieren, Peptide, die den Epitopen (z.B. der Stelle der FcεR-Bindung) nachgebildet sind, und sie betrifft die Verwendung der anti-idiotypischen Antikörper und der Peptide zur Behandlung IgE-vermittelter allergischer Erkrankungen.
Kurze Beschreibung der Figuren
• Figur 1 skizziert das Verfahren zur Bestimmung des mb/ec-Abschnitts von menschlichem IgE (ε.mb/ec).
• Figur 2 zeigt DNA-Sonden, die zum Absuchen einer cDNA-Bank auf Clone hin verwendet werden, die ε.mb/ec enthalten.
• Figur 3 zeigt den C-Terminus der CH&sub4;-Domäne der menschlichen ε-Kette und die Positionen der Sonden b und d.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung 1. Einzigartige Epitope des Ii iunglobulins E
• Die Erfindung beruht auf der Entdeckung einzigartig gelegener Epitope von IgE (ige.bl). Die Epitope sind auf IgE-tragenden B-Lymphocyten vorhanden, nicht aber auf Mastzellen und Basophilen. Eine Klasse der ige.bl-Epitope befindet sich an oder nahe der Bindungsstelle für FcεR. Das Vorhandensein dieser Epitope auflediglich IgE-tragenden B-Zellen ergibt sich aus der Tatsache, daß das Epitop verdeckt ist, wenn IgE an FcεR auf Basophilen oder Mastzellen gebunden ist. Die ige.bl-Epitope können möglicherweise aus mehreren antigen-getrennten Stellen zusammengesetzt sein, und jedes der Epitope läßt sich durch seine Reaktivität mit einem monoclonalen Antikörper (z.B. E8-5-3, E11-4-70, E101-1 und E10-12-55; siehe unten), der mit menschlichen IgE-tragenden B-Zellen, nicht aber mit Basophilen reagiert, definieren.
• Eine andere Klasse von ige.bl-Epitopen stellen die ε.mb/ec-Epitope dar. Diese Epitope sind auf der membranqebundenen Form von Immunglobulinen, nicht aber auf der sekretierten Form vorhanden. B-Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche Antikörpermoleküle, wie IgE, die während der immunologischen Induktion als Rezeptoren für Antigene dienen. Von den sekretorischen, löslichen Immunglobulinen, unterscheiden sich die von den gleichen Zellen synthetisierten membrangebundenen Immunglobuline dadurch, daß sie ein zusätzliches Peptidstück aufweisen, das sie auf der Oberfläche der B-Zellen verankert. Jedes der zehn membrangebundenen Immunglobuline auf B-Zellen aus verschiedene Spezies, deren Aminosäuresequenzen bekannt sind, weist einen zusätzlichen isotypisch-spezifischen Bereich auf, der das Immunglobulin in der Membran verankert. Diese Peptidbereiche haben Längen zwischen 41 und 72 Aminosäuren und können hinsichtlich ihrer Lage bezüglich der Plasmamembran in drei Abschnitte unterteilt werden. Die mittleren Abschnitte von 25 hydrophoben und ungeladenen Aminosäureresten bef inden sich in der Meinbran-Lipid-Doppelschicht; die C-terminalen hydrophilen Abschnitte von 3 bis 28 Aminosäureresten sind interzellulär; die zum N-Terminus gerichteten 13 bis 27 Aminosäurereste enthaltenden Abschnitte sind sehr sauer und hydrophil und befinden sich auf der extrazellulären Oberfläche der Plasmamembran. Dieser Teil des meinbrangebundenen Bereichs von Maus- und Ratten-IgE weist 19 Aminosäurereste auf, von denen 10 Glu- oder Asp-Reste sind. Die Länge und der hydrophile und hoch-geladene Charakter des extrazellulären Abschnittes weisen darauf hin, daß dieser Abschnitt exponiert und Antikörpern zugänglich ist.
• Da IgE im Körper auf der Oberfläche von nur drei Zelltypen, nämlich IgE-tragenden B-Zellen, Basophilen und Mastzellen vorhanden ist, sind diese ige.bl-Epitope praktisch einzigartige Zelloberflächen-Marker von TgE-tragenden B-Zellen. Diese neuen Marker stehen für verschiedene, auf der Verwendung monoclonaler Antikörper beruhender Arten einer Therapie von IgE-vermittelten allergischen Erkrankungen bereit.
2. Monoclonale Antikörper, die IgE-tragende B-Zellen, nicht aber Basophile binden
• Monoclonale, für ige.bl-Epitope spezifische Antikörper binden IgE auf der Oberfläche von IgE-produzierenden B- Zellen. Sie binden Basophile jedoch nicht. Diese differentielle Bindung IgE-tragender Zelltypen liefert eine Grundlage zur therapeutischen und diagnostischen Verwendung der Antikörper.
• Es ist entscheidend, daß die Antikörper keine Basophilen binden und keine Histaminausschüttung hervorrufen. Eines der wirkungsvollsten, eine Freisetzung von pharmakologischen Allergie-Vermittlern aus Mastzellen und Basophilen auslösenden Agenzien ist der anti-IgE-Antikörper. Ein herkömmlicher anti-IgE-Antikörper bindet IgE auf der Oberfläche von Mastzellen und Basophilen und löst die Freisetzung pharmakologischer Allergie-Vermittler aus. Die erfindungsgemäßen Antikörper können IgE auf diesen Zellen nicht binden, da das Erkennungsepitop maskiert ist. Sie rufen somit keine Histaminfreisetzung aus diesen Zellen hervor.
3. Eine auf der selektiven Beseitigung IgE-produzierender Zellen beruhende Therapie von IgE-veriittelter Allergie A. Antikörper, die für IgE-produzierende Zellen spezifisch sind.
• Die für IgE-produzierende B-Zellen spezifischen Antikörper, z.B. Maus-, menschliche oder chimere Maus- /menschliche Antikörper, können auf verschiedene Weise zur Behandlung IgE-vermittelter Allergien verwendet werden. Zu diesem Zweck können die Antikörper zur selektiven Zerstörung IgE-tragender B-Zellen verwendet werden. Die Antikörper können als ein eine Immunfunktion vermittelnder Wirkstoff oder, wie nachstehend dargelegt wird, als Trägeragens für Toxine oder cytotoxische Arzneimittel zur Bereitstellung eines Wirkstoffes verwendet werden.
• Unter den verschiedenen Immunfunktionen, die ein für ein Oberflächenantigen auf Zielzellen spezifischer Antikörper vermitteln kann, gibt es die antikörper- und komplementvermittelte Cytolyse und die antikörperabhängige zelluläre Cytotoxizität (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC). Der Antikörper kann außerdem immunregulatorische Funktionen vermitteln. Antikörper gewisser IgG-Subklassen, z.B. Maus-IgG2a und Human-IgG1 und -IgG3 können eine ADCC vermitteln, die durch bestimmte, Fc-Rezeptor tragende phagocytische Leukocyten ausgeführt wird. Zum Beispiel wird OKT3, ein für menschliches T-Zell-Oberflächenantigen spezifischer monoclonaler Maus-IgG2a-Antikörper (der erste von der FDA zur Vermarktung als Arzneimittel anerkannte monoclonale Antikörper) in Patienten verwendet, um für eine schnelle Beseitigung von T-Zellen im Blut zu sorgen und einen immunsupprimierten Zustand (bei der Nierentransplantation) hervorzurufen; Russel, P.S. et al., Annu. Rev. Med. 35 (1984), 63-79; Norman, D.J. et al., Transpl. Proc. 17 (1985), 39-41. OKT3 kann bei einer Dosierung von 5 mg/Tag/Individuum zirkulierende T-Zellen vollständig beseitigen. Die erfindungsgeinäßen Antikörper, besonders in der Form von Maus-gamma-2a-Antikörpern oder von chimeren human-gamma-1- oder -gamma-3-Ketten tragenden Antikörpern lassen sich zur Beseitigung von IgE-tragenden B-Zellen nach dem ADCC-Mechanismus verwenden. Die Antikörper können an IgE-vermittelter Allergie leidenden Patienten in Mengen verabreicht werden, die ausreichen, IgE-produzierende Zellen im wesentlichen zu eliminieren und dementsprechend IgE im wesentlichen zu beseitigen. Die Menge kann z.B. in einem Bereich von 1 - 50 mg/Dosis/Individuum liegen. Die Behandlung kann eine oder mehrere Injektionen beinhalten. Die zur Beseitigung der B-Zellen nötige Dauer der Antikörperanwesenheit und die nötige Menge des Antikörpers sind geringer als die, die zur fortwährenden Hemmung der Bindung von IgE an Basophile oder Mastzellen notwendig sind.
• Für die angegebenen therapeutischen Verwendungen bevorzugt man vor allem menschliche Antikörper. Menschliche Antikörper lassen sich jedoch schwer in großen Mengen herstellen. Alternativ werden chimäre oder "nahezu menschliche" Antikörper bevorzugt. Chimäre Antikörper umfassen einen variablen oder antigenbindenden (hypervariablen oder Komplementarität bestimmenden) Bereich, der aus dem Antikörper eines Tieres (z.B. einer Maus) abgeleitet ist, und die restlichen von einem menschlichen Antikörper abgeleiteten Bereiche. Verfahren zur Herstellung chimärer (z.B. Maus- /menschlicher) Antikörper werden nachstehend beschrieben. Chimäre Antikörper können in großen Mengen hergestellt werden, und sie sind im Menschen weniger immunogen als nichtmenschliche Antikörper. Dementsprechend sind sie besser für eine in vivo-Verabreichung geeignet als tierische Antikörper, insbesondere, wenn eine wiederholte oder eine über einen langen Zeitraum erfolgende Verabreichung notwendig ist. Antikörperfragmente der chimären Antikörpern können ebenfalls verwendet werden.
• Immuntherapien, bei denen die erfindungsgemäßen Antikörper verwendet werden, können in Kombination mit einer herkömmlichen Desensibilisierungs-Immuntherapie angewandt werden. Zum Beispiel kann man eine Desensibilisierung mit Allergenen in Verbindung mit der Verabreichung von anti- ige.bl-Antikörpern oder Immuntoxinen (siehe B, Abschnitt unten) zur substantiellen Beseitigung IgE-produzierender Zellen durchführen. Eine Hauptwirkung einer Desensibilisierung ist die Induktion von IgGs gegen das Allergen/Immunogen. Die Induktion einer IgG-Antwort kann besonders wirksam sein, wenn die IgE-produzierenden B-Zellen im wesentlichen beseitigt werden. Die Kombination von Antikörper- und Desensibilisierungstherapie stellt eine attraktive Therapieform dar. IgE-produzierende B-Zellen können vorübergehend (für einige Wochen oder Monate) durch den anti-ige.bl-Antikörper beseitigt werden und sich schließlich wieder etablieren. Die Desensibilisierung kann länger andauernde Wirkungen haben.
B. Immuntherapie, bei der ein ige.bl-spezifischer Antikörper und ein ADCC verstärkender Faktor kombiniert werden.
• Es ist bekannt, daß viele Faktoren, wie GM-CSF (Granulocyten-Monocyten-Koloniestimulierender Faktor) oder M-CSF (Monocyten-Koloniestimulierender Faktor) die Proliferation von Leukocyten induzieren, eingeschlossen solche, die eine ADCC vermitteln. In in vitro-Experimenten ist gezeigt worden, daß GM-CSF und H-CSF die ADCC-Aktivität gegen Tumorzellen erhöhen, die durch monoclonale Antikörper vermittelt wird, die spezifisch für die auf den Tumorzellen exprimierten Oberflächenantigene sind. Es ist vorstellbar, daß die therapeutische Wirkung von ige.bl-monospezifischen monoclonalen Antikörpern bei der Behandlung von Allergien durch eine Kombination mit Faktoren, die die ADCC-Aktivitäten erhöhen, verstärkt wird.
C. Immuntoxine, die für IgE-produzierende Zellen spezifisch sind.
• Die ige.bl-Epitope stellen hochspezifische Ziele für Immuntoxine bereit, die gegen IgE-produzierende B-Zellen gerichtet sind. Die für die Epitope spezifischen Immuntoxine binden an IgE-produzierende B-Zellen, nicht aber an Mastzellen oder Basophile. Auf diese Weise lassen sich in einem Patienten, der an einer IgE-vermittelten Allergie leidet, IgE- produzierende B-Zellen selektiv vermindern oder beseitigen. Die Verminderung von IgE-produzierenden Zellen reduziert den IgE-Spiegel im Blutkreislauf, was zu einer Verminderung der IgE-Menge führt, die für die Bindung an Mastzellen und Basophile zur Verfügung steht. Das Immuntoxin tötet weder Mastzellen noch Basophile ab und verursacht keine Freisetzung pharmakologischer Mediatoren aus diesen Zellen.
• Immuntoxine für die selektive Bindung an IgE-produzierende Lymphocyten enthalten cytolytische oder cytotoxische Agentien, die mit einem bindenden, für ein ige.bl- Epitop spezifischen Agens konjugiert sind. Die bevorzugten spezifischen bindenden Agentien sind anti-iae-bl-Antikörper oder deren Fragmente, (z.B. F(ab)'2, Fab, Fv oder deren Analoge oder Derivate). Als cytolytisches Agens kann man irgendeine der verfügbaren Substanzen, eingeschlossen Ricin, Pseudomonas-Toxin, Diphtherietoxin, Antiviruspeptid aus der Kermesbeere (pokeweed antiviral peptide), Trichothecene, Radionuclide und membranlysierende Enzyme wählen. Der Antikörper und das Cytotoxin können chemisch oder auf gentechnologischem Wege konjugiert worden sein.
• Die Immuntoxine werden dem an IgE-vermittelter Allergie leidenden Patienten in Mengen verabreicht, die ausreichen, die IgE-produzierenden Lymphocyten im Patienten zu vermindern oder zu beseitigen, wodurch die Symptome der IgE- vermittelten Allergie vermieden oder abgeschwächt werden.
• Die Immuntoxine können allein oder in Kombination mit freiem anti-IgE-Antikörper verwendet werden.
4. Beseitigung von IgE durch iionoclonale Antikörper, die weder IgE auf Basophilen noch auf Mastzellen binden.
• In besonderen Ausführungsformen binden die erf indungsgemäßen monoclonalen anti-IgE-Antikörper ein Ige.bl-Epitop, das sich an der oder nahe der FcεR-Bindungsstelle auf löslichem IgE befindet. Dadurch blockieren die Antikörper auf dein IgE die Bindungsstelle für Mastzellen und Basophile, und dies trägt zu ihrer therapeutischen Wirksamkeit bei. Um diesen möglicherweise günstigen zusätzlichen Mechanismus zu erreichen, müssen die Antikörper spezifisch mit einer Affinität an das Epitop binden, die größer als die Affinität ist als die, mit der das FcεR IgE bindet. Diese Kombination von Spezif ität und Aff inität sorgt bei pharmakologisch verträglichen Konzentrationen für eine wirksame Inhibition der IgE-Bindung an FcεR. Ferner kann der Immunkomplex aus IgE und dem monoclonalen Antikörper durch Zellen des reticuloendothelialen Systems schnell entf ernt werden. Bei intravenöser Injektion der monoclonalen Antikörper bilden die meisten IgE-Moleküle im Blutkreislauf wahrscheinlich Immunkomplexe und werden schnell entfernt. Diese Mechanismen senken den Spiegel an freiem IgE im Körper des behandelten Patienten, wenn immer die therapeutischen monoclonalen Antikörper in ausreichenden Mengen vorhanden sind. Diese verschiedenen Mechanismen sollten zu den kurzfristigen Wirkungen der therapeutischen Antikörper beitragen. Langfristige therapeutische Wirkungen können jedoch wahrscheinlich ohne diese Mechanismen erreicht werden. Da IgE mit einer Serum-Halbwertszeit von 3 Tagen schnell umgesetzt und regeneriert wird, ist eine auf ige.bl-Antikörpern gegründete Therapie wahrscheinlich besonders durch eine Beseitigung oder eine Verminderung der IgE-produzierenden B-Zellen wirksam.
• Die Affinität läßt sich durch die Affinitäts-oder Assoziationskonstante, Ka, repräsentieren. Das FcεR von Mastzellen und Basophilen hat eine geschätzte Ka im Bereich von 1 x 10&sup9; - 1 x 10¹&sup0; Liter/Mol; vgl. Kulczycki, A., New Trends in Allergy 11, Seiten 25-32, Herausgeber Ring, J. und Burg, G., Springer-Verlag, New York, 1986. Somit konkurriert ein monoclonaler anti-IgE-Antikörper effizient mit FcεR, wenn seine Aff initätskonstante für IgE ungefähr 1 x 10&sup9; Liter/Mol oder größer ist. Im allgemeinen haben monoclonale Antikörper eine Ka unter 1 x 10&sup9; Liter/Mol. Dementsprechend kann einem Antikörper, obwohl er in geeigneter Weise für das beschriebene Epitop (die beschriebenen Epitope) spezifisch und zur Beseitigung IgE-tragender B-Zellen nach den vorstehend beschriebenen Mechanismen geeignet ist, dieser zusätzliche therapeutische Eff ekt fehlen, wenn er keine ausreichende Ka besitzt, um bei pharmakologisch verträglichen Konzentrationen wirksam mit FcεR um IgE zu konkurrieren.
• In den bevorzugten Ausführungsformen haben die erf indungsgemäßen monoclonalen anti-IgE-Antikörper eine Ka für IgE, die vergleichbar oder größer ist als die Affinität von FcεR für IgE. Mastzellen und Basophile sind im Körper an IgE gebunden. In den meisten Individuen ist ein großer Anteil des FcεR mit IgE gesättigt. Die IgE-Moleküle haben sehr lange "on"- (Rezeptorbesetzungs-) Halbwertszeiten von ungefähr 20 Stunden; Kulczycki, A., J. Exp. Med. 140 (1974), 1976. Wenn die IgE-Moleküle von den Mastzellen oder Basophilen dissoziieren, binden die dem Patienten verabreichten hochaffinien anti-ige-bl-Antikörper diese IgE-Moleküle fest und hemmen ihre Reassoziation mit FcεR. Da IgE-Moleküle eine lange "on"-Zeit haben und langsam von Basophilen und Mastzellen dissoziieren, wird die therapeutische Wirkung wahrscheinlich erst einige Tage nach der Behandlung (oder sogar später) erreicht, wenn ein nennenswerter Anteil des IgES auf Basophilen und Mastzellen vom FcεR dissoziiert und durch den anti-IgE-Antikörper komplexiert oder entfernt wurde. Wenn dies erreicht ist, hat die Dichte der an FcεR-Moleküle auf Basophilen und Mastzellen gebundenen IgE-Moleküle wesentlich abgenommen, und Allergene sind dementsprechend nicht in der Lage, eine genügend große Anzahl von FcεR miteinander zu vernetzen, um Histamin zu induzieren.
5. Diagnostische Verwendung von Antikörpern, die spezifisch IgE-produzierende Zellen binden.
• Die gegen ige.bl-Epitope gerichteten Antikörper können zum Identifizieren und Spezifizieren IgE-tragender Lymphocyten in gemischten Leukocytenpopulationen verwendet werden. Zu diesem Zweck können die Antikörper in Standardtests zur Bestimmung von Zelloberflächenantigenen verwendet werden. Im allgemeinen wird der Antikörper mit einer zu testenden Leukocytenprobe unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die es dem Antikörper erlauben, IgE-tragende Zellen in der Probe zu binden. Die Zellen werden dann auf die Bindung des Antikörpers hin untersucht. Dies läßt sich durch herkömmliche Zell-Anfärbeverfahren erreichen. Zum Nachweis des Bindens des anti-IgE-Antikörpers kann z.B. ein fluoreszenzmarkierter zweiter Antikörper verwendet werden.
6. Anti-idiotypische Antikörper und Verfahren der aktiven Immunisierung gegen IgE
• Die bisher beschriebenen ige.bl-spezifischen monoclonalen Antikörper können zur Erzeugung von paratop-spezifischen, anti-idiotypischen Antikörpern verwendet werden, die eine andere Art der Behandlung von IgE-vermittelter Allergie bereitstellen. Antikörper gegen das Paratop der ige.bl-spezifischen Antikörper ähneln in ihrer Konformation dem Epitop, für das der anti-IgE-Antikörper spezif isch ist, d.h. sie ähneln einem ige.bl-Epitop. Diese anti-idiotypischen Antikörper können zur aktiven Immunisierung gegen ige.bl verwendet werden, und sie induzieren die endogene Erzeugung von Antikörpern gegen das ige.bl-Epitop. Die induzierten Antikörper vermitteln die verschiedenen therapeutischen Wirkungen ige.bl-spezifischer Antikörper.
• Da IgE ein "Eigen-Molekül" ist, ist es im allgemeinen nicht iminunogen. Eine aktive Immunisierung gegen IgE läßt sich jedoch durch Verwendung der erf indungsgemäßen paratopspezifischen Antikörper erreichen. Der paratop-spezifische Antikörper, der im Menschen eine Immunantwort gegen das Epitop hervorgerufen kann, teilt in seiner Konformation eine Ähnlichkeit mit dem Antigen - dem ige-bl-Epitop.
• Zur Induktion der ige.bl-Antikörpererzeugung werden Paratop-spezirische, anti-idiotypische Antikörper einem an IgE-verinittelter Allergie leidenden Patienten in einer immunogenen Menge verabreicht. Die anti-idiotypischen Antikörper werden bevorzugt als chimäre Antikörper verabreicht. Sie können ebenfalls als Antikörperfragmente (die ebenfalls eine chimäre Natur haben können) oder als Analoge verabreicht werden.
7. Peptide, die das FCεR von Mastzellen und Basophilen blockieren.
• Die Erfindung stellt ferner Peptide bereit, die die ige.bl-Epitope auf löslichem IgE umfassen. Die Peptide umfassen Aminosäuresequenzen, die mit der Aminosäuresequenz eines ige.bl-Epitops auf löslichem IgE identisch oder ihr äquivalent sind. Die Peptide können z.B. Sequenzen aufweisen, die mit den durch die Antikörper E8-5-3, E11-4-70, E101-1 und E10-12-55 oder durch andere, nachstehend beschriebene anti-ige.bl-Antikörper definierten Epitope korrespondieren. Peptide, die dieser Bindungsstelle des FcεR entsprechen, können zum Blockieren der Bindung von IgE an Mastzellen und Basophile verwendet werden
8. ε.mb/ec-Peptidanaloge und aktive Immunisierung gegen das ε.mb/ec-Epitop
• Obwohl ein menschliches ε.mb/ec-Peptid im Menschen wahrscheinlich nicht immunogen ist, können Peptide mit derselben Sequenz und mit Aminosäuresubstitutionen immunogen sein und Antikörper hervorruf en, die mit authentischem ε.mb/ec-Epitop kreuzreagieren. Diese ε.mb/ec-Peptidanaloge können Patienten, die unter IgE-verinittelten Allergien leiden, verabreicht werden. Die durch diese aktive Immunisierung induzierten Antikörper können die Funktionen erreichen, wie die hier beschriebenen Antikörper.
9. Ankerpeptid-Stück von membrangebundenen B-Zell- Immunglobulinen
• B-Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche Antikörpermoleküle, die während der immunologischen Induktion als Rezeptoren für Antigene dienen. Die membrangebundenen Immunglobuline unterscheiden sich von den durch dieselben Zellen synthetisierten sekretorischen Immunglobulinen dadurch, daß sie ein zusätzliches Peptidstück aufweisen, das die Immunglobulinmoleküle auf der Zelloberfläche verankert. Die Aminosäuresequenzdaten von 10 membrangebundenen Immunglobulinen aus verschiedenen Spezies sind bestimmt worden; siehe Ishida, N. et al. EMBO J 1 (1982), 1117; Steen, M. L. et al., J. Mol. Biol. 177 (1984), 19-32; Rogers, J. et al., Cell 26 (1981), 19-27; Yamawaki-Kataoka, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 79 (1982), 2008-2012; Kamaromy, M. et al., Nucl. Acids Res. 11 (1983), 6775-6785; Rogers, J. et al., Ce11 20 (1980), 303-312; Bernstein, K. E., J. Immunol. 132 (1984), 490-495; Cheng, H. et al., Nature 296 (1982), 410-415. Diese Sequenzen zeigen gewisse gemeinsame Merkmale der an die Plasmamembran gebundenen Peptidstücke auf. Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, weist das Peptid-Ankerstück drei Abschnitte auf, die im Hinblick auf ihre Lage bezüglich der Plasmamembran unterscheidbar sind. Obwohl diese Peptidstücke kurz sind - sie liegen in einem Bereich von 41 bis 72 Aminosäureresten - und sie häufig als "membrangebundene Domäne" bezeichnet werden, befinden dich die Peptide nicht vollständig in der Membran-Lipid-Doppelschicht. Tatsächlich befinden sich nur 25 im mittleren Teil des Peptids liegende Aminosäurereste, hauptsächlich hydrophobe Reste und Threonin- und Serinreste, in der Lipid-Doppelschicht. Die C-terminalen hydrophilen Abschnitte von 3 bis 28 Aminosäureresten liegen auf der cytoplasmatischen Seite der Membran. Die Abschnitte zum N-Terminus hin, die mit der dritten oder vierten konstanten Domäne der schweren Immunglobulinketten (CH&sub3; oder CH&sub4;) verbunden sind, sind sehr hydrophil und befinden sich auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran. Tabelle 1 Charakteristische Kennzeichen und Eigenschaften von Peptidabschnitten, die einzigartig für membrangebundene Immunglobuline auf B-Zellen sind Erster Abschnitt Mittlerer Abschnitt End-Abschnitt Gesamt Immunglobulin Klasse/Subklasse Länge Anzahl der Aminosäurereste Maus-IgE Ratten-IgE Maus-IgG&sub1; Maus-IgG2a Maus-IgG2b Maus-IgG&sub3; Maus-IgM Kaninchen-IgM Human-IgD Maus-IgD Eigenschaften physikalische Lage abgekürzte Symbole hydrophil sehr sauer auf äußerer Oberfläche mb/ec Abschnitt hydrophob, keine geladenen Reste in der Membran Lipid-Doppelschicht mb/tm Abschnitt auf Cytoplasmaoberfläche mb/ic Abschnitt * mb für membrangebunden; ec für extrazellulär; tm für transmembran und ic für intrazellulär
• Die kürzeste Länge des extrazellulären Abschnittes der membrangebundenen Stücke der Immunglobuline (als mb/ec- Abschnitte bezeichnet) weist 13 Aminosäurereste auf (Maus- und Kaninchen-u-Ketten); vgl. Tabelle 2. Die mb/ec-Abschnitte aller Immunglobuline enthalten hohe Anteile geladener Aminosäurereste, beinahe ausschließlich saurer Reste. Der Anteil geladener Aminosäurereste und polarer hydrophiler Reste macht einen hohen Prozentsatz der Aminosaurezusammensetzung des mb/ec-Abschnitts aus (Tabelle 3). Diese Parameter weisen darauf hin, daß alle mb/ec-Abschnitte exponiert und lang genug sind, um Antikörpern zugänglich zu sein. Untersuchungen zur Evolution der schweren Ketten von Immunglobulinen zeigen, daß die ε- und γ-Ketten stärker miteinander verwandt sind (jüngere gemeinsame Vorfahren besitzen) als mit anderen Ketten (Lien-Chin Lin and Frank W. Putnam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 78 (1981), 504-508. Ferner evolvierten die schweren Ketten, bevor die verschiedenen Säugetierarten Maus, Ratten und Menschen evolviert waren. Somit ist unter den zehn verschiedenen auf geklärten mb/ec-Abschnitten wahrscheinlich das Maus- oder Rattenε.mb/ec dem menschlichen ε.mb/ec, dessen Sequenz bisher nicht veröffentlicht ist, am verwandtesten. Die nächstverwandten Ketten sind die γ-Ketten. Das Maus- oder Ratten- ε.mblec weist 10 Aminosäurereste auf, unter den sich 8 Glu- und 2 Asp-Reste befinden. Diese Ergebnisse stützen die Vorstellung, daß der menschliche ε.mb/ec-Abschnitt exponiert und Antikörpern zugänglich ist. Tabelle 2 Die Aminosäuresequenzen des externen Anteils der für memembrangebundene Immunglobuline einzigartigen Abschnitte (mb/ec-Abschnitte) Mb/ec-Abscnitt Maus-IgE Ratten-IgE Maus-IgG&sub1; Maus-IgG2a Maus-IgG2b Maus-IgG&sub3; Maus-IgM Kaninchen-IgM Human-IgD Maus-IgD Tabelle 3 Zusammensetzung der geladenen und polaren hydrophilen Aminosäurereste im außen liegenden Teil der für membrangebundene Immunglobuline einzigartigen Peptidabschnitte (mb/ec-Abschnitte) Insgesamt Saure Reste Basische Reste Polare Reste Hydrophile Reste insgesamt Anteil der hydrophilen Reste Anzahl der Aminosäurereste Maus-IgE Ratten-IgE Maus-IgG&sub1; Maus-1gG2a Maus-IgG2b Maus-IgG&sub3; Maus-IgM Kaninchen-IgM Human-IgD Maus-IgD Saure Reste: E (Glu), D (Asp) Basische Reste: X (Lys), R (Arg), H (His); His ist partiell geladen Polare Reste: S (Ser), T (Thr), C (Cys), Q (Gin), N (Asn)
10. Bestimmung der Aiinosäuresequenz des mb/ec-Abschnittes von menschlichem IgE (ε.mb/ec-Abschnitt)
• Zur Bestimmung der mit dein menschlichen ε.mb/ec-Abschnitt korrespondierenden DNA-Sequenz kann man eine Reihe gut etablierter Verfahren anwenden. Bei einer Vorgehensweise (Figur 1) geht man von einer mRNA-Präparation aus einer menschlichen Myelomzellinie aus, die IgE auf der Oberfläche exprimiert. Hierzu können SK007-Zellen verwendet werden. Mit der mRNA-Präparation kann man unter Verwendung eines auf k- Phagen oder Plasmiden beruhenden Clonierungsvektors eine cDNA-Bank etablieren. Bei einem bevorzugten Verfahren zur Konstruktion der cDNA-Bank verwendet man den "cDNA-Library- Construction System Kit - Librarian I", der von Invitrogen (San Diego, Kalifornien) entwickelt und vertrieben wird.
• Eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung wird bereitgestellt für die RNA-Isolierung aus Zellen, für die reverse Transkription, die Synthese des zweiten Stranges, die Ligation der Linker, die Größenfraktionierung der cDNA auf Agarosegel, die Elektroelution zur Reinigung der cDNA, die Vektorligation und die Transformation von E. coli. Der für diese Bank verwendete Vektor ist pCDM8.
• Zum Absuchen der cDNA-Bank auf Clone hin, die den ε.mb/ec-Abschnitt enthalten, können mehrere Sonden verwendet werden. Wie in Fig. 2 gezeigt ist, kann man die Bank mit der DNA-Sonde a absuchen, bei der es sich um eine 1,1 kb lange U266-cDNA handelt, die den größten Teil der Länge von ε-mRNA (kein membrangebundener Abschnitt) ausmacht. Die positiven Clone, die sowohl sekretierte als auch membrangebundene Formen einschließen, lassen sich durch Verwendung zusätzlicher Sonden unterscheiden. Bei der Entwicklung der Sonde b nutzt man die sehr große Wahrscheinlichkeit aus, daß das Ende der CH&sub4;-Domäne in der menschlichen ε-Kette der membrangebundenen Form verstümmelt ist. Die Verstümmelung geschieht, wenn die Genabschnitte der CH&sub4;-Domäne und die membrangebundene Domäne transloziert sind. Der Verlust der C-Termini geschieht bei den membrangebundenen Formen der Immunglobuline, einschließlich ε und u, die CH&sub4;-Domänen enthalten. Der publizierten Information über die Nucleotidsequenz der menschlichen ε.CH&sub4;-Domäne zufolge, ist die wahrscheinlichste Donor-Stelle für das Splicing das innerhalb eines Codons liegende GT, 71 bp 5'-seitig des Terminationscodons TGA. Ein anderes GT, das nicht innerhalb eines Codons liegt und weniger wahrscheinlich eine Donor-Stelle für das Splicing ist, liegt näher am Terminus (24 bp 5' vom Terminationscodon).
• Die spezifische Position für die Sonde b ist in den Figuren 2 und 3 angegeben. Die Sonde reagiert mit dem Gen der sekretierten Form der ε-Kette und nicht mit dem Gen der Membranf orm der ε-Kette.
• Der Entwurf der Sonde c basiert auf dein Befund, daß der transmembrane Abschnitt der membrangebundenen Domäne (mb/tm-Abschnitt) unter allen bisher sequenzierten Immunglobulinen stark konserviert ist. Es gibt einen Peptidabschnitt und eine damit korrespondierende DNA innerhalb dieses mb/tm- Abschnittes, die unter allen Immunglobulinen nahezu identisch ist. Wie aus Tabelle 4 hervorgeht, wird die Konsensus-DNA-Sequenz mit den acht Kombinationen als Sonde c verwendet. Die Figur 2 zeigt die Position der Sonde. Tabelle 4 Konservierter Bereich im transieibranen Teil des Peptidabschnittes der membrangebundenen Immunglobuline (im mb/-Abschnitt) Maus-IgE Ratten-IgE Maus-lgG1 Maus-IgG2a Mau5-IgG2b Maus- IgG3 Maus-IgM Kaninchen-IgM Human-IgD* Maus-IgD* Konsensussequenz (Sonde C) * Human- und Maus-IgDs weisen ein Thr (ACXO) im 5. Aminosäurerest auf; Human-IgD hat außerdem ein Ile (ATC) im dritten Aminosäurerest. Dies sind die Variationen, die die Konsensussequenz nicht umfaßt.
• Die Sonde d, die einen Abschnitt stromaufwärts der wahrscheinlichsten Splicing-Donorstelle GT repräsentiert, besteht aus 36 bp (Figuren 2 und 3). Diese Sonde sollte mit dem Gen für die ε-Kette reagieren, und zwar sowohl mit dem der sekretierten als auch dem der membrangebundenen Form.
• Tabelle 5 faßt die Reaktivitätsmuster der vier Sonden mit den Clonen zusammen, die u-Gene der sekretierten oder membrangebundenen Formen enthalten. Tabelle 5 Reaktivität der ein ε-Gen enthaltenden cDNA-Clone mit den Sonden a, b, c und d ε sekretiert ε membrangebunden Sonde a Sonde b Sonde c Sonde d
• Die benötigte Größe der Bank zur Clonierung der membrangebundenen ε-Kette hängt davon ab, wie reichlich die mRNA vorhanden ist. Unter der Annahme, daß das sekretierte IgE 0,1 % der SK007 poly A&spplus;-RNA umfaßt, sollte die Bank ungefähr 5000 unabhängige rekombinante Clone aufweisen, um eine 99%ige Wahrscheinlichkeit für das Isolieren eines positiven Clons zu haben. Bei den IgE-produzierenden Ratten-Immuncytom-IR2- und -IR162-Zellen wurde festgestellt, daß die mRNA für die membrangebundene Form der ε-Kette mehr als 2 % der sekretierten Form betrug. Unter der Annahme, daß dieses Verhältnis von membrangebundenen/sekretierten Formen der ε- Kette auch für Human-IgE-produzierende SK007-Zellen gilt, ist die benötigte Größe der cDNA-Bank zum Isolieren der meinbrangebundenen ε-Kette ungefähr 250 000. In einer bevorzugten Prozedur wird eine größere Anzahl von Clonen (1 000 000) abgesucht.
• Eine Alternative zum herkömmlichen Vorgehen, eine cDNA-Bank zu etablieren und die Clone abzusuchen, die die zellulären mRNA-Arten repräsentieren, ist die Amplifikation der gewünschten mRNA durch die Produktion großer Mengen ihrer korrespondierenden DNA. Die resultierende DNA kann dann durch Gelelektrophorese gereinigt und dann einer Sequenzanalyse unterworfen werden. Die als Polymerase-Kettenreaktion(polymerase chain reaction, PCR) Amplifikation bezeichnete Methode ist in den letzten wenigen Jahren etabliert worden, und es sind vollständige Systeme einschließlich der Reagenzien und der Ausrüstung im Handel erhältlich. Ein bevorzugtes System wird von Perkin Elmer Cetus (Norwalk, CT) geliefert. Die Reagenzienpackung besteht aus dem GeneAmp-DNA-Amplifikations-Reagenzien-Kit und die Ausrüstung aus dem DNA- Thermal Cycler.
• Einige der bei diesem Vorgehen verwendeten spezifischen Reagenzien sind die gleichen wie die für das Clonieren der cDNA-Bank verwendeten. Da im membrangebundenen Abschnitt der ε-Kette keine Sequenz bestimmt wurde, besteht die Strategie darin, sowohl die sekretierte als auch die membrangebundene Form der ε-Ketten zu amplifizieren. Zwei Primer werden benutzt. Einer ist Oligo-dT (25-30mer), und der andere ist das Oligomer, das der Sonde d in den Figuren 2 und 3 entspricht. Die Sonde d liegt 5'seitig der wahrscheinlichsten Splicing-Donorstelle und funktioniert deshalb als Primer sowohl für die sekretierte als auch für die membrangebundene Form der ε-mRNA und -DNA. Nach ausreichender Amplifikation werden die beiden Populationen der DNA- Fragmente durch Gelelektrophorese getrennt. Die sekretierte Form der ε-Kette läßt sich durch ihre Reaktivität mit der Sonde b unterscheiden. Die gereinigten DNAs werden dann einer DNA-Sequenzierung unterworfen.
• Eine PCR-Amplifikation scheint für mRNA, die in der gesamten poly A&spplus;-RNA nur in geringer Menge vorkommt, ein wirksameres Verfahren zu sein, als das Clonieren der cDNA. Die cDNA der U266-ε-Kette läßt sich zur Ausarbeitung einiger vorläufiger Bedingungen für das Aneinanderlagern von Matrizen-DNA und Oligo-Primern verwenden.
• Eine andere Vorgehensweise zur Gewinnung eines Clons, der die Gene enthält, die die membrangebundenen Abschnitte codieren, ist es, menschliche genomische DNA-Banken abzusuchen. Eine menschliche genomische DNA-Bank ist ohne weiteres erhältlich. Eine bevorzugte Quelle ist die unter Verwendung von menschlichen Lungenfibroblasten, WI38-Zellen, konstruierte Bank, die von Stratagene (La Jolla, Kalifornien) geliefert wird. Die Gene befinden sich im λ-Vektor und die inserierte DNA weist eine Durchschnittslänge von 15 kbp auf. Ein Identifizieren der Clone läßt sich durch Hybridisieren mit der DNA des U266-cDNA-Clons erreichen. Die Lage des dem membrangebundenen Bereich entsprechenden Gen-Abschnittes läßt sich mit der Sonde bestimmen, die aus dem homologen Mausgen vom transmembranen Abschnitt präpariert wurde (Sonde c der Figur 2 und der Tabelle 4). Die Sequenz des membrangebundenen Abschnittes wird dann bestimmt.
10 A. Nucleotidsequenz der DNA, die das Membran-Ankerpeptid der menschlichen ε-Kette codiert.
• Es wurde die Nucleotidsequenz der genomischen DNA bestimmt, die die Abschnitte umfassen, die die Membran-Ankerpeptide der menschlichen membrangebundenen ε-Kette codieren. Sie ist zusammen mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz für Teile des Membran-Ankerpeptids nachstehend wiedergegeben. Die Zuordnung der Exons wurde durch ein Identifizieren der Nucleotide für die Splicing-Donoren und -Akzeptoren und durch einen Vergleich mit den publizierten homologen Sequenzen der membrangebundenen ε-Kette der Maus und der Immunglobuline anderer Klassen vorgenommen. Splicing-Akzeptor Membran Exon I Splicing-Donor Intron Membran Exon II
• Das menschliche ε.mb/ec-Peptid ist durch die ersten 15 durch das Membranexon I codierten Aminosäuren spezifiziert. Diesem geht eine Strecke von ungefähr 25 hydrophoben Aminosäuren voraus, die den transmembranen Bereich darstellen. Nachstehend werden zwei mögliche Strukturen von E.mblec gezeigt.
Mögliche Strukturen von menschlichem ε.mb/ec-Peptid Struktur I Struktur II
• Wie nachstehend näher beschrieben wird, kann man das ε.mb/ec-Peptid zur Induktion von Antikörpern verwenden, die spezifisch mit membrangebundenem Immunglobulin E reagieren. Hierzu können die Peptide nach Standardtechniken der Proteinsynthese chemisch synthetisiert werden. Ein bevorzugtes Verfahren zur Synthese der Peptide benutzt das Fmoc-Chemie verwendende RaMP-System (DuPont, Wilmington, DE). Alternativ kann man die Proteine unter Verwendung der die Peptide Codierenden Oligo-Desoxynucleotide durch Biosynthese herstellen. Die Nucleotidsequenz ist vorstehend als 5'-Teil des Membranexons I angegeben.
• Als Immunogene können die Proteine in einer der beiden vorstehend gezeigten strukturellen Formen, entweder der monomeren oder der dimeren Form, verwendet werden. Peptide, die den menschlichen ε.mb/ec-Abschnitt und die vier verbindenden Aminosäuren in der CH&sub4;-Domäne umf assen, können ebenfalls verwendet werden. Ferner können modifizierte Peptide, die im wesentlichen immunologisch äquivalent sind, verwendet werden. Zum Beispiel kann die vorstehend gezeigte Peptid-Aminosäuresequenz durch Deletion, Insertion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren, die im wesentlichen zu keiner Beeinträchtigung der iinmunologischen Eigenschaften des Peptids führen, modifiziert werden. Die Peptide können ebenfalls als Polymere verwendet werden, in denen die vorstehend gezeigte Aminosäuresequenz oder eine äquivalente Sequenz die sich wiederholende Einheit im Polymer darstellt.
11. Herstellung der erf indungsgemäßen monoclonalen Antikörper
• Die erfindungsgemäßen monoclonalen anti-IgE- und anti-idiotypischen Antikörper werden durch kontinuierliche (immortalisierte), stabile antikörperproduzierende Zellinien produziert. Die bevorzugten antikörperproduzierenden Zelllinien sind Hybridoin-Zellinien und Myelom-Zellinien. Im Prinzip können die Zellinien jedoch alle beliebigen Zellen sein, die funktionell rearrangierte Gene enthalten, und die in der Lage sind, diese Gene, die die variablen Antikörperbereiche der leichten und schweren Antikörperketten codieren, zu exprimieren. Bevorzugt sollte die Zellinie die Fähigkeit haben, die Ketten zu funktionellen Antikörpern oder Antikörperfragmenten zusaminenzusetzen. Somit werden am häufigsten lymphoide Zellen, die natürlicherweise Immunglobulin produzieren, verwendet. Zusätzlich zu den früher erwähnten Zellen sind Beispiele geeigneter lymphoider Zellen virusoder oncogen-transformierte lymphoide Zellen.
• Hybridomzellen, die die erfindungsgemäßen ige.bl- spezifischen Antikörper produzieren, lassen sich nach der Standardtechnik der somatischen Zellhybridisierung von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495) oder nach ähnlichen andere Mittel zur Fusion verwendenden Prozeduren herstellen. Kurz gesagt ist die Prozedur die folgende: Die monoclonalen anti-IgE-Antikörper werden durch Immunisierung eines Tieres mit menschlichem IgE oder mit Peptidabschnitten von menschlichem IgE (sekretorisch oder membrangebunden), die als potentielle Bestandteile des ige.bl-Epitops identifiziert worden sind, hergestellt. Die Peptide können synthetisiert und zur Verwendung als Immunogen mit einem Trägerprotein, z.B. Napfschnecken-Hämocyanin (Keyhole limpet hemocyanin) konjugiert werden. Lymphoide Zellen (z.B. Milzlymphocyten) werden dann aus dem immunisierten Tier gewonnen und zur Herstellung hybrider Zellen mit immortalisierenden Zellen (z.B. Myelom- oder Heteromyelomzellen) fusioniert. Die Hybridzellen werden zum Identifizieren solcher Zellen abgesucht, die den gewünschten anti-IgE-Antikörper produzieren.
• Menschliche Hybridoine, die Human-Antikörper sekretieren, können nach der Köhler- und Milstein-Technik produziert werden. Obwohl zur Behandlung von Menschen Human-Antikörper besonders bevorzugt werden, kann die Erzeugung stabiler Human-Human-Hybridome zur langfristigen Produktion menschlicher monoclonaler Antikörper schwierig sein. Die Hybridomproduktion in Nagetieren, besonders in der Maus, ist ein sehr gut etabliertes Verfahren. Stabile Maus-Hybridome stellen eine unbegrenzte Quelle für Antikörper mit selektiven Eigenschaften bereit. Maus-Antikörper können jedoch bei der Behandlung des Menschen einen begrenzten Nutzen haben, da sie hoch immunogen sind und selbst ungünstige allergische Reaktionen beim Empfänger induzieren. In einer bevorzugten erfindungsgeinäßen Ausführungsform werden die anti-IgE- und anti-idiotypischen Antikörper in einem Nagetiersystem produziert und nach den im Detail nachstehend beschriebenen, etablierten Verfahren in chimäre Nagetier- /Human-Antikörper überführt. Wie vorstehend erklärt wurde, werden diese "nahezu menschlichen" chimären Antikörper für die in vivo-Verabreichung bevorzugt, insbesondere wenn Vielfachdosierungen benötigt werden.
• Zur Herstellung der für die ige.bl-Epitope auf löslichem IgE spezifischen Antikörper kann man zur Immunisierung menschliches IgE aus menschlichem Serum reinigen werden. Alternativ kann menschliches IgE durch Kultivieren einer IgE- produzierenden Zellinie (z.B. der Zellinie U266, ATCC-Nummer CRL8033) hergestellt werden. Human-IgE kann durch Aff initätschromatographie gereinigt werden. Monoclonale Maus-Antikörper, die für menschliches IgE spezifisch sind, werden zur Bereitstellung eines IgE-spezifischen Immunadsorbens mit einer geeigneten Matrix (z.B. einer mit Bromcyan aktivierter Sepharose 4B) konjugiert. Die IgE-Präparation kann mit dem selektiv IgE-adsorbierenden Immunadsorbens in Kontakt gebracht werden. Danach kann das adsorbierte IgE im wesentlichen in reiner Form vom Immunadsorbens eluiert werden.
• In bevorzugten Ausführungsformen iminunisiert man die Tiere nach einem energischen Immunisierungsprotokoll, um eine große Menge von Lymphocyten zu erzeugen, die IgE-spezifische Antikörper produzieren. Aus den immunisierten Tieren werden Milzzellen gewonnen und mit immortalisierenden Zellen, bevorzugt Myelomzellen, fusioniert, die die Fähigkeit verloren haben, Immunglobulin zu sekretieren. Im Stand der Technik sind viele geeignete Myelomzellinien beschrieben. Ein Beispiel ist das Maus-Myelom NS-l. Die Fusion der Milz-Zellen mit dem Fusionspartner kann, etablierten Verfahren entsprechend, in Gegenwart von Polyethylenglykol durchgeführt werden. Es können ebenfalls Elektrofusionstechniken angewandt werden. Die resultierenden Hybridzellen werden auf das Erhalten von Clonen hin gezüchtet und dann auf die Produktion von anti-IgE-Antikörpern hin abgesucht.
• Hybridome, die Antikörper produzieren, die spezifisch für ein auf IgE-tragenden B-Zellen vorhandenes und auf Basophilen fehlendes Epitop sind und die eine genügend große Aff inität für IgE aufweisen, um die FcεR-Bindung an IgE zu blockieren, lassen sich wie folgt selektionieren. Hybridome werden zunächst auf die Produktion von Antikörpern hin abgesucht, die mit menschlichem IgE reagieren. Dies läßt sich mit einem enzymverknüpften Immun-Adsorptionstest (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) unter Verwendung von gereinigtem menschlichem IgE vornehmen, das an eine feste Phase adsorbiert ist.
• Eine Möglichkeit zur Gewinnung von Antikörpern mit im allgemeinen hoher Affinität ist die folgende. Die feste Phase für den ELISA wird mit einer sehr kleinen Menge menschlichem IgE beschichtet. Wenn man z.B. eine Standard-Nikrotiterplatte als feste Phase verwendet, werden ungefähr 50 ul einer 0,1 ug/ml-Lösung des IgES pro Vertiefung verwendet. Es werden die Hybri< 1e ausgewählt, die eine vergleichsweise hohe Enzymaktivität (Grad der optischen Dichte) im Test aufweisen. Die Kulturüberstände enthalten entweder relativ höhere Mengen von Antikörpern oder Antikörper mit einer relativ höheren Affinität oder beides gleichzeitig.
• Die Hybridome werden dann auf die Sekretion von Antikörpern hin abgesucht, die nicht mit an Basophile gebundenem IgE reagieren. Ein bevorzugtes Verfahren besteht darin, die Antikörper auf ihre Unfähigkeit hin abzusuchen, eine Histaminfreisetzung durch Basophile zu induzieren. Die Quelle für Basophile für solch einen Histaminfreisetzungs-Test sind Blutleukocyten aus Spendern, von denen bekannt ist, daß ihre basophilen Zellen sehr sensitiv bezüglich der Induktion einer Histaminfreisetzung sind. Ein alternatives und möglicherweise weniger empfindliches Verfahren ist ein Immunfluoreszenz-Anfärbeverfahren. Basophile Leukocyten können aus dem Blut isoliert werden. Frisch isolierte Basophile haben IgE auf ihrer Oberfläche. Monoclonale Antikörper, die an Basophile gebundenes IgE nicht binden, sind spezifisch für ein Epitop, das an der oder nahe der Stelle ist, die durch das basophile Fc&epsi;R besetzt ist (und deshalb für die monoclonalen Antikörper nicht zugänglich ist).
• Hybridome, die paratop-spezifische anti-idiotypische Antikörper produzieren, können durch Immunisieren eines Tieres mit anti-IgE-Antikörpern und durch Absuchen auf Antikörper hin hergestellt werden, die das Paratop des immunisierenden anti-IgE-Antikörpers binden. Die Immunisierung führt zur Produktion von Antikörpern gegen die antigenen Determinanten auf dem anti-IgE-Antikörper einschließlich des Idiotyps. Anti-idiotypische Antikörper werden zuerst auf ihre Bindung an anti-IgE-Antikörper und auf das Nicht-Binden an andere Maus-Antikörper hin abgesucht. Diejenigen Antikörper, die paratop-spezifisch sind, werden auf ihre Fähigkeit hin abgesucht, mit menschlichem IgE um die Bindung an den monoclonalen, zur Immunisierung verwendeten anti-IgE-Antikörper zu konkurrieren.
• Antikörperfraginente wie F(ab')&sub2;, Fab und Fv können nach Standardverf ahren durch enzyinatische Spaltung hergestellt werden. Zusätzlich können synthetische Fab und Fv Analoge repräsentierende Peptide durch Gen-Rekombinationsverfahren hergestellt werden; siehe z.B. Better, M. et al., Science 240 (1988), 1041; Huston J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 5879-5883.
• Die chimären anti-IgE-Antikörper enthalten individuelle chimäre schwere und leichte Immunglobulinketten. Die chimäre schwere Kette ist ein fortlaufendes Polypeptid, das einen variablen Bereich oder hypervariable Bereiche der schweren Kette eines Nagetiers (gewöhnlich einer Maus) und den konstanten Bereich einer menschlichen schweren Kette aufweist. Die chimäre leichte Kette ist ein zusammenhängendes Polypeptid, das die variablen oder hypervariablen Bereiche der leichten Kette eines Nagetiers und den konstanten Bereich einer menschlichen leichten Kette aufweist.
• Die chimären Antikörper können mono- di- oder polyvalent sein. Monovalente Antikörper sind Dimere (HL), die aus einer (über Disulfidbrücken) mit einer chimären leichten Kette assoziierten chimären schweren Kette gebildet sind. Divalente Immunglobuline sind Tetramere (H&sub2;L&sub2;), die aus zwei assoziierten Dimeren gebildet werden. Polyvalente Antikörper können z.B. durch Verwendung aggregierender konstanter Bereiche (z.B. konstanter Bereiche vom mu-Typ) einer schweren Kette produziert werden.
• Die variablen Bereiche der chimären Antikörper sind vom erfindungsgemäßen anti-IgE-Antikörper abgeleitet. Den konstanten Bereich der schweren Kette kann man aus jedem der fünf Isotypen alpha, delta, epsilon, gamma oder mu auswählen. Es können schwere Ketten der verschiedenen Subklassen (z.B. IgG-Subklassen) verwendet werden. Die unterschiedlichen Klassen und Subklassen der schweren Ketten sind für unterschiedliche Effektorfunktionen verantwortlich, und man kann somit durch Auswahl des gewünschten konstanten Bereichs der schweren Kette chimäre Antikörper mit der erwünschten Effektorfunktion herstellen. Der konstante Bereich der leichten Kette kann aus der kappa- oder lambda-Kette stammen.
• Im allgemeinen werden die chimären Antikörper durch die Präparation einer alle Komponenten der leichten und schweren Ketten des chimären Antikörpers codierenden DNA- Konstruktion hergestellt. Die Konstruktion umf aßt ein Fusionsgen, enthaltend einen ersten DNA-Abschnitt, der mindestens den funktionellen Teil des variablen Bereichs aus der Maus (z.B. funktionell rearrangierte variable Bereiche mit Verbindunqssegment) codiert und damit verknüpft einen zweiten DNA-Abschnitt, der mindestens einen Teil eines menschlichen konstanten Bereichs codiert. Jedes fusionierte Gen ist in einem Expressionsvektor montiert oder in einen solchen inseriert. Die zur Expression der Genprodukte fähigen Rezipientenzellen werden dann mit den Genen transfiziert. Die transfizierten Rezipientenzellen werden gezüchtet, und die exprimierten Antikörper werden gewonnen.
• Gene, die den variablen Bereich von leichten und schweren Ketten von Nagern codieren, lassen sich aus den Hybridomzellen erhalten, die anti-IgE-Antikörper produzieren. Beispielsweise liefern die Maus-anti-IgE-Antikörper produzierenden Maus-Hybridomzellinien eine Quelle für die Gene des variablen Bereichs.
• Die Gene von konstanten Bereichen lassen sich durch Standard-Clonierungstechniken aus menschliche Antikörper produzierenden Zellen erhalten. Alternativ sind, da die Gene, die die beiden Klassen leichter Ketten und die fünf Klassen schwerer Ketten repräsentieren, cloniert worden sind, die konstanten Bereiche mit menschlichem Ursprung ohne weiteres aus diesen Clonen verfügbar.
• Bevorzugt montiert man die fusionierten, die chimären leichten und schweren Ketten codierenden Gene in Expressionsvektoren, die zur Co-Transfektion einer Rezipientenzelle verwendet werden können. Geeignete Vektoren für die Gen-Konstruktionen schließen Plasmide des Typs pBR322, pEMBL und pUC ein. Jeder Vektor enthält zwei selektionierbare Gene - eines für das Selektionieren in einem Bakteriensystem und eines für das Selektionieren in einem eukaryontischen System - wobei jeder Vektor ein unterschiedliches Paar von Genen aufweist. Diese Vektoren gestatten die Produktion und die Amplifikation der fusionierten Gene in Bakteriensystemen und die nachfolgende Co-Transfektion eukaryontischer Zellen und das Selektionieren der co-transfizierten Zellen. Beispiele selektionierbarer Gene für das Bakteriensystem sind die eine Ampicillinresistenz vermittelnden Gene und das Gen, das eine Chloramphenicolresistenz vermittelt. Beispiele selektionierbarer Gene für Eukaryonten sind gpt und neo.
• Die bevorzugte Rezipienten-Zellinie ist eine Myelomzelle. Mit Antikörpergenen transfizierte Myelomzellen können Immunglobuline, die von den Antikörpergenen codiert werdenl synthetisieren, zusammensetzen und sekretieren. Ferner besitzen sie die Mechanismen zur Glykosylierung des Immunglobulins. Eine besonders bevorzugte Rezipientenzelle ist die Myelomzelle SP2/0, die kein Ig produziert; Shulman et al., Nature 276 (1978), 269. Die Zelle produziert nur das Immunglobulin, das durch die zur Transfektion verwendeten Immunglobulingene codiert wird. Myelomzellen können in Kultur oder im Peritoneum von Mäusen gezüchtet werden, wobei das sekretierte Immunglobulin aus der Ascitesflüssigkeit erhalten werden kann. Andere lymphoide Zellen, wie B-Lymphocyten oder Hybridomzellen können als geeignete Rezipientenzellen dienen.
• Lymphoide Zellen können auf verschiedene Weise mit Vektoren transfiziert werden, die Immunglobulin codierende Gene enthalten. Hierzu gehören Elektroporation, Protoplastenfusion und die Calciumphosphat-Präzipitationsprozedur. Die resultierenden transfizierten Zellen liefern kontinuierliche stabile Zellinien, die chimäre Antikörper produzieren.
• Die chimären Antikörper können in großen Mengen mit Hilfe von in großem Maßstab angelegten Gewebekultur-Systemen, wie verschiedenen kontinuierlichen Perfusionssystemen, Kapilarmembran-Systemen (hollow fiber systems), statischen Kulturerhaltungs-Systemen (static maintenance systems) oder anderen Systemen produziert werden.
• Nahezu menschliche Antikörper oder Antikörperfragmente können ferner durch Engineering von Gensequenzen menschlicher Antikörper produziert werden, die die hypervariablen (Komplementarität bestimmenden) Bereiche zur Bereitstellung der geeigneten anti-IgE-Spezifität codieren; siehe z.B. Robert, S. et al., Nature 328 (1987), 731-733; Better, M. et al., Science 240 (1988), 1041.
12. Entwickeln von Antikörpern gegen den mblec-Abschnitt
• Die &epsi;.mb/ec-Peptide können zur Immunisierung von Tieren für die Herstellung polyclonaler und monoclonaler Antikörper verwendet werden. Sie können ferner zum Absuchen auf spezifische monoclonale Antikörper hin oder zur Charakterisierung spezifischer polyclonaler Antikörper verwendet werden. Ferner kann man sie zur Reinigung monoclonaler und polyclonaler Antikörper verwenden.
• Bei der Präparation monoclonaler für das &epsi;.mb/ec-Peptid spezifischen Antikörper ist es nicht notwendig, das &epsi;.mb/ec-Peptid sowohl für die Immunisierung als auch für die Antikörperidentifizierung zu verwenden. Bei der Immunisierung von Mäusen kann z.B das aus der Plasmamembran von IgEtragenden Myelomzellen wie SK007-Zellen isolierte membrangebundene IgE das Immunogen für die Präparation von Milz-Immunzellen zur Fusion mit Myelomzellen sein. Als Immunogen kann man ferner die IgE-tragenden Myelomzellen verwenden.
• Bei der Verwendung des synthetischen E.mb/ec-Peptids als Immunogen ist es wirksamer, das Peptid mit einem Proteinträger zu konjugieren. Ein bevorzugtes Trägerprotein ist das Napfschnecken-Hämocyanin (Keyhole limpet hemocyanin, KLH). Wenn dem Peptidabschnitt ein Lys-Rest fehlt, oder wenn der Lys-Rest sich im mittleren Teil des Abschnittes befindet, ist es wünschenswert, einen Lys-Rest an das C-terminale Ende anzufügen. Da der N-Terminus bereits eine &alpha;-Aminogruppe besitzt, weist das modifizierte synthetische Peptid zwei Aminogruppen zur Verknüpfung auf. Jedes Trägerproteinmolekül kann mit einem Vielfachen von Peptidmolekülen konjugiert werden. Bei Verwendung von KLH beträgt das bevorzugte molare Verhältnis von Peptid zu KLH 10. Das Verfahren zur Konjugation ist sehr gut etabliert. Es werden Quervernetzungsmittel wie Glutaraldehyd oder Bis-(sulfosuccinimidyl)-suberat oder Disulfosuccinimidyltartrat (Pierce Chemical Co., Rockford, Il, Katalog Nr. 21579, 20591) verwendet. Ein bevorzugtes quervernetzendes Mittel ist das zuletzt genannte.
• Das Immunogen, z.B. das KLH-Konjugat, kann zum Immunisieren von Kaninchen, Ziegen, Ratten oder Mäusen zur Herstellung polyclonaler für das &epsi;.mb/ec-Peptid spezifischer Antikörper verwendet werden. Ferner können Lymphocyten aus der Milz oder den Lymphknoten immunisierter Mäuse oder Ratten zur Herstellung von Hybridomen verwendet werden, die monoclonale für das &epsi;.mb/ec-Peptid spezifische Antikörper sekretieren. Eine bevorzugte Vorgehensweise zur Herstellung der monoclonalen Antikörper ist es, Milz-Immunzellen von Mäusen mit nicht-sekretierenden Maus-Hyelomzellen wie NS-1- oder SP2/0-Zellen unter Verwendung von Polyethylenglykol zu fusionieren.
• Zur optimalen Immunisierung von Mäusen werden 50 ug des Peptid-KLH-Konjugats in vollständigen Freund's Adjuvans subkutan je einer Maus zum Primen injiziert. Zwei und vier Wochen später werden die gleichen Mengen Antigen in unvollständigem Freund's Adjuvans subkutan verabreicht. Nach ungefähr 6 Wochen wird die vierte Antigeninjektion in Salzlösung intraperitoneal verabreicht. Vier Tage nach der letzten Injektion werden die Mäuse getötet, und die Milz wird zur Präparation einer Einzelzell-Suspension für die Fusion mit Myelomzellen entnommen. Zur Immunisierung mit gereinigtem, nativem membrangebundenen Human-IgE, das eine angeheftete Membran-Ankerdomäne aufweist, und das aus der Plasma-Membran von IgE-tragenden menschlichen Myelomzellen, wie SK007-Zellen isoliert wird, kann man ebenfalls ähnliche Versuchsvorschriften verwenden. Wenn man menschliche IgE-tragende Zellen als Immunogen verwendet, werden 1x10&sup7;-Zellen intraperitoneal in Intervallen von 2 Wochen injiziert
• Die Fusionsprozedur mit Polyethylenglykol und die anderen verschiedenen Prozeduren, die das Clonieren und das Kultivieren der Hybridome betreffen, wurden in Abschnitt 11 beschrieben.
• Das Absuchen von Hybridomen auf monoclonale Antikörper hin oder das Identfizieren polyclonaler Antikörper, die mit dein &epsi;.mb/ec-Peptid reagieren, läßt sich mit enzymverknüpften Immunadsorptionstests (enzyme linked immunosorbent assays, ELISA) unter Verwendung des synthetischen &epsi;.mb/ec- Peptids als Festphasen-Antigen durchführen. Ein alternatives Festphasenantigen ist das Konjugat des &epsi;.mb/ec-Peptids mit einem anderen Trägerprotein, z.B. Rinderserumalbumin, das von dem im Immunogen verwendeten verschieden ist. Eine weitere Charakterisierung der monoclonalen und polyclonalen Antikörper ist in Tabelle 6 gezeigt. Die in diesen Untersuchungen gezeigten Tests sind ebenfalls angegeben. Die Tests werden nachstehend beschrieben. Tabelle 6 Reaktivität von &epsi;.mb/ec-Peptid spezifischen Antikörpern mit verschiedenen IgE-enthaltenden Zielen Reaktivität Tests Synthetisches &epsi;.mb/ec-Peptid lösliches IgE Basophile und Mastzellen SK007-Myelomzellen IgE-tragende B-Zellen ELISA Immunfluoreszenz-Anfärbung Histamin-Freisetzung
13. Experimente mit Tier-Modellen
• Die Substanzen und Verfahren werden in tierischen Modellsystemen getestet. Zwei der relevantesten Systeme werden nachfolgend beschriebenen.
A. Asthma-/Rhesusaffen-Modell
• Die monoclonalen Antikörper, die spezifisch für das menschliche &epsi;.mb/ec-Peptid sind und ihre verwandten erfindungsgemäßen Substanzen sind zur Verwendung für die Behandlung von Patienten mit verschiedenen IgE-vermittelten Allergien (siehe Abschnitt 6, nachstehend) vorgesehen. Unter diesen Allergien ist das exogen-allergische Asthma eine der ernstzunehmenderen Formen. Zum Studium des Asthmas wurde ein Experimental-Modellsystem mit Rhesusaffen etabliert.
• Ein kleiner Teil der mit der Nematode Ascaris suum infizierten Rhesusaffen entwickeln eine Empfindlichkeit gegen Ascaris-Extrakte. Wenn diesen sensitiven Affen ein Spray verabreicht wird, der Ascaris-Antigen enthält, entwickeln sie asthmaähnliche Atemprobleme; Patterson, R. J. Clini. Invest. 57 (1976), 586-593.
• Die verschiedenen erf indungsgemäßen Substanzen können im Asthma-/Rhesusaffen-Modellsystem experimentell untersucht werden. Die gegen Ascaris empfindlichen Affen werden dein Experiment oder einer Kontrollbehandlung unterworfen, und es werden Messungen vorgenommen, um festzustellen, ob
• (a) die durch Ascarisreizung verursachten Symptome abnehmen,
• (b) das IgE im Blutkreislauf abnimmt,
• (c) die IgE-tragende B-Zellen im Blutkreislauf abnehmen und
• (d) die IgE-Dichte auf Basophilen abnimmt
B. Das Maus-Modellsystem
• Es ist bekannt, daß Mäuse natürlicherweise keine allergischen Symptome entwickeln. Zur Demonstration der pharmakologischen Mechanismen der beabsichtigten Therapie bezüglich der Beseitigung von IgE-tragenden B-Zellen und von IgE kann die Maus als ein ausgezeichnetes Modell dienen.
• Der Maus-&epsi;.mb/ec-Abschnitt ist bereits seguenziert worden; Ishida, N. et al., EMBO J. 1 (1982), 1117-1123. Das aus 19 Aminosäureresten bestehende Peptid lautet:
• Glu-Leu-Asp-Leu-Gln-Asp-Leu-Cys-I le-Glu-Glu-Val- Glu-Gly-Glu-Glu-Leu-Glu-Glu.
• Das Peptid wird in verschiedenen Formen, einschließlich der am C-Terminus zusätzliche Leu-Lys-Reste aufweisenden Form, synthetisiert.
• Das Peptid und sein KLH-Konjugat werden als Antigene zur Immunisierung von Kaninchen und Ziegen verwendet. Die Antiseren werden gewonnen. Die antigenspezifischen Antikörper reinigt man unter Verwendung einer Säule mit Sepharose 4B, die mit dem Peptid (mit zusätzlichem Leu-Lys) oder mit Rinderseruinalbumin verknüpf tem Peptid konjugiert ist. Normalen Mäusen werden gereinigte Antikörper oder deren verwandte Substanzen intravenös oder intraperitoneal injiziert, um die folgenden Fragen zu untersuchen;
• (a) Nimmt die Gesamtmenge von IgE im Blutkreislauf ab?
• (b) Nimmt die Zahl der IgE-tragenden 13-Zellen ab?
• (c) Nimmt die Dichte von IgE auf der Oberfläche von Basophilen ab?
• (d) Verursacht das für das &epsi;.mb/ec-Peptid spezifische IgM bzw. IgG unterschiedliche Effekte? Der Sinn dieser Frage liegt darin, die Wirkungen der antikörperabhängigen zel lulären Cytotoxizität (ADCC) bei der Beseitigung von IgE-tragenden B-Zellen zu untersuchen. Es ist bekannt, daß IgG, nicht aber IgM eine ADCC vermittelt.
• Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
Beispiel I Präparation der Hybridome und der monoclonalen Antikörper a) Präparation von menschlichem IgE
• Menschliches IgE wurde käuflich erworben und gereinigt, um Mäuse zur Gewinnung von Immun-Milzzellen für die Fusion zu gewinnnen und auf Hybride hin abzusuchen. Das IgE wurde ferner zur Charakterisierung der verschiedenen monoclonalen anti-IgE-Antikörper verwendet. Es wurden zwei Präparationen von menschlichem IgE verwendet. Eine war polyclonales IgE, das aus menschlichem von Ventrex (Portland, Maine) bezogenem Serum gereinigt wurde. Dieses menschliche IgE wurde aus den Seren mittels Affinitätschromatographie gereinigt, wobei eine Säule mit Sepharose 4B verwendet wurde, die mit Human-IgE spezifischein Kaninchen-IgG konjugiert war. Kontaminierendes menschliches Albumin und Transferrin wurden durch eine Affinitätssäule, die mit Albumin und Transferrin spezifischen Antikörpern konjugiert war, entfernt. Ferner wurde monoclonales menschliches IgE aus Kulturüberständen der IgE-produzierenden U266-Zellinie hergestellt. Das IgE wurde auf einer Sepharose 4B-Säule, die mit einem Human-IgE spezifischen monoclonalen Antikörper konjugiert war, nach dem Affinitätsprizip gereinigt. Dieser monoclonale IgG-Antikörper wurde mit einer Protein A-konjugierten Säule aus den Ascitesflüssigkeiten von Mäusen gereinigt, die spezifische Hybridome trugen.
• Die polyclonalen und monoclonalen menschlichen IgEs wurden unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert. In beiden Fällen wurden charakteristische IgE-Moleküle (unter nicht-reduzierenden Bedingungen) und schwere und leichte Ketten (unter reduzierenden Bedingungen) beobachtet, und es waren lediglich Spuren relativ sehr leichter Banden einiger anderer kontaminierender Proteine vorhanden. Da die Zellinie U266 in serumfreiem, definiertem Medium gezüchtet wurde, gab es einige Anhaltspunkte für die Identifizierung der kontaminierenden Proteine in der Präparation von monoclonalem menschlichem IgE.
b. Immunisierungsprozedur 1. Prozedur
• Männliche Balb/c-Mäuse mit einem Eingangsalter von 6 bis 8 Wochen wurden zur Immunisierung verwendet, um Immun- Milzzellen zur Fusion mit Myelomzellen für die Produktion von Hybriden zu präparieren. Das aus den von Ventrex gelieferten Seren gereinigte polyclonale menschliche IgE wurde als Immunogen verwendet. Der Grund hierfür ist, daß das von der Zellinie U266 produzierte monoclonale IgE gewisse unbekannte Anomalitäten aufweisen könnte. Außerdem war es unerwünscht, monoclonale Antikörper gegen die ldiotypen des U266-IgEs zu erzeugen, und die Wahrscheinlichkeit, antiidiotypische Antworten gegen monoclonale Antikörper zu induzieren, wäre viel höher. Nach Durchführung dreier Fusionsexperimente mit Mäusen, die mit U266-abgeleitetem IgE immunisiert worden waren, wurde auf Fusionen mit Mäusen umgeschaltet, die mit polyclonalem, aus menschlichen Seren abgeleitetem IgE immunisiert worden waren.
• Zur Immunisierung wurden jeder Maus 50 ul menschliches IgE pro Injektion injiziert. Die erste Immunisierung wurde in vollständigem Freund's Adjuvants verabreicht. Die Mäuse wurden subkutan an Stellen mit einer hohen Konzentration von Lymphknoten, z.B. an der Unterseite der Schnittstelle der Glieder und des Rumpfes injiziert. Einen Monat und zwei Monate später erhielten die Mäuse an denselben Stellen subkutan Booster-Injektionen von 50 ug IgE. Die Booster-Injektionen wurden im wesentlichen genauso präpariert wie bei der ersten Injektion, außer daß das Emulgieren für die Booster in unvollständigem Freund's Adjuvants vorgenommen wurde.
• Nach spätestens einem weiteren Monat wurde jede Maus das letzte Mal (vierte Injektion) subkutan mit 50 ug IgE in PBS nachimmunisiert. Jeder Maus wurde subkutan an der Schnittstelle je eines Gliedmaßes mit dem Rumpf und intraperitoneal eine Injektion verabreicht. 3 Tage nach der letzten Injektion wurden die Mäuse getötet, und ihre Milz wurde entnommen. Die Milzzellen wurden dann mit Myelomzellen der nachfolgenden Prozedur gemäß fusioniert.
c) Fusion
• Es wurden Suspensionen hergestellt, die ein 5: 1-Verhältnis von Milz- zu Myelomzellen enthielten. Die gewählten Myelomzellen waren NS-1-Zellen. NS-1-Zellen wurden so konditioniert, daß sie eine Verdoppelungszeit von ungefähr 17 Stunden aufwiesen. Sie wurden zur Fusion verwendet, wenn sie sich in der 10g-Phase befanden. Die NS-1-Zellen wurden in Bakterienschalen (100 mm) bei einer Konzentration von 6 x 10&sup4; Zellen pro ml in 10 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), das 5 % fötales Rinderserum (FBS), 10 Einheiten/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin enthielt, subkultiviert. Das Medium wurde jeden dritten Tag gewechselt. Alternativ wurden die Zellen bei 1,5 x 10&sup5; Zellen/ml in 10 ml desselben Mediums subkultiviert, und das Medium wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Die Milzzellen wurden präpariert, indem man die Milz zum Lösen der Milzzellen auf eine Bakterienschale (100 mm) legte und 20 ml calcium- und magnesiumfreies PBS (CMF-PBS) in die beiden Enden der Milz injizierte. Die Milzzellen wurden dann in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt.
• Die Milzzellen wurden 5 Minuten bei 200 g zentrifugiert und dann zur Lyse der Erythrocyten in 5 ml 0,83%igem NH&sub4;Cl (0,155 M) 10 Minuten bei Raumtemperatur suspendiert. Zur Beendigung der Lyse wurden 5 ml CMF-PBS zum Röhrchen gegeben. Die Zellen wurden dann pelletiert und in 10 ml CMF- PBS resuspendiert.
• Die Konzentration der Lymphocyten wurde durch Zugabe von 40 ul einer Zellsuspension zu 10 ml Salzlösung zusammen mit 3 Tropfen Zap-oglobin bestimmt. Die Lymphocytenzahl wurde mit einem Hämacytometer ausgezählt, und die Konzentration der Zellen wurde bestimmt.
• Die NS-1-Zellen wurden von den Bakterienschalen (100 mm) in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Die Zellkonzentration wurde bestimmt. Die NS-1-Zellen wurden dann in 10 ml CMF-PBS suspendiert und in einem 50 ml Zentrifgugenröhrchen im Verhältnis 1:5 mit Milzzellen vermischt. Routinemäßig wurden 2-5 x 10&sup8;-Zellen aus der Milz eines immunisierten Tieres erhalten, und es wurden zwei Milzen für jedes Fusionsexperiment verwendet.
• Die Zellen wurden abzentrifugiert und einmal mit 10 ml CMF-PBS gewaschen. Vom Überstand wurde mit einer Glas-Pasteurpipette soviel wie möglich abgesaugt. Zum Ablösen der Zellpellets wurde vorsichtig gegen das Röhrchen geklopft.
• Vor der Präparation der Zellen wurde ein Fusionsgemisch wie folgt präpariert. 5 g Polyethylenglykol 1450 (Kodak) wurden mit 5 ml CMF-PBS und 0,5 ml DM50 vermischt. Dieses Gemisch wurde auf 56ºC erwärmt, auf einen pH-Endwert von 7,0 eingestellt und zum Sterilisieren durch ein 0,22 u Milliporefilter filtriert. 1 ml Aliquots wurden in "Cryotubes" gegeben, und diese wurden bei -70ºC aufbewahrt.
• Zur Vorbereitung für die Verwendung des Fusionsgemisches wurde eines der Aliquots in den "Cryotubes" durch Erwärmen auf 37ºC auf getaut. Getrennt davon wurde ein Röhrchen, das 10,0 ml DMEM (ohne Serum) enthielt, auf 37ºC erwärmt.
• Das 1,0 ml Aliquot des Polyethylenglykol-Fusionsgemisches wurde zur Zellsuspension gegeben, und die Suspension wurde gut gemischt. 45 Sekunden nach Zugabe des Polyethylenglykol-Fusionsgemisches wurden unter Mischen tropfenweise 2 ml des vorgewärmten DMEM (ohne Serum) zugegeben. Die restlichen 8 ml des vorgewärmten DMEM (ohne Serum) wurden dann zugegeben. Die Zellen wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.
• 2,0 ml FBS wurden zur Suspension gegeben, und die Suspensionen wurden gut gemischt. Die Kombination von FBS und CMF-PBS kann helfen, ein Haftenbleiben der Zellen an den Wänden des Teströhrchens zu verhindern. Die Suspensionen wurden dann 4 Minuten bei 400 g zentrifugiert.
• Nach dem Abzentrifugieren wurden die Zellen in ungefähr 120 ml eines modifizierten Mediums suspendiert, das mit 5 % FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin, 10 ug/ml Streptomycin und Hypoxanthin, Aminoptherin und Thymidin (HAT) vervollständigt war.
• Die Konzentration der Zellsuspension wurde auf 3,3 x 10&sup5; Milzzellen pro 200 ul Suspension eingestellt. 200 ul Aliquots der Suspension wurden dann in jede der Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben. Nachdem typischerweise 20-30 solcher Platten pro Fusion vorbereitet worden waren, wurden die Platten in einen Inkubator überführt und in 5 % CO&sub2; bei 37ºC gehalten.
• Die Zellen wurden 7 Tage in den Platten gezüchtet, dann wurde das Zuchtmedium entfernt und neues Medium zugegeben. 4 Tage danach wurde ein enzymverknüpfter Immunadsorptionstest (ELISA, siehe unten) mit den Antikörpern in den Vertiefungen durchgeführt, um festzustellen, welcher von ihnen menschliches IgE bindet.
2. Ergebnisse
• Unter Verwendung des vorstehenden Immunisierungsprotokolls wurden vier Fusionsexperimente mit Mäusen durchgeführt. Für diese Fusionen wurden 7, 15, 36 bzw. 15 Platten mit 96 Vertiefungen mit Fusionszellen vorbereitet. Mehr als 98 % der Vertiefungen zeigten Zellwachstum, und in jede Vertiefung enthielt durchschnittlich 3 bis 5 Hybridclone. Somit wurden in den vier Fusionen (ungefähr 7000 Vertiefungen) wahrscheinlich 21 000 bis 35 000 Clonen produziert.
d) ELISA-Prozedur 1. Prozedur
• Die Anfangsprozedur zum Absuchen der sehr großen Zahl von Hybriden, die aus den Fusions-Vertiefungen resultierten, wurde mittels eines ELISAs mit menschlichem IgG als Festphasen-Antigen durchgeführt. Als Antigen wurde das polyclonale, aus menschlichen Seren (Ventrex) gereinigte IgE verwendet.
• Eine wichtige und maßgebliche Strategie bei der vorliegenden Prozedur bestand darin, die 1000 bis 4000 Vertiefungen jedes Fusionsexperimentes generell auf hochaffine Antikörper hin abzusuchen. Dies wurde durch Beschichten jeder Vertiefung mit sehr kleinen Mengen, 50 ul mit 0,1 ug/ml menschlichen IgEs vorgenommen. Unter der Annahme, daß das gesamte IgE an die feste Phase bindet, befinden sich in jeder Vertiefung nur 5 ng. Wegen dieser kleinen Menge war die Wahrscheinlichkeit ebenfalls stark verringert, Hybride herauszusuchen, die für kontaminierende Proteine spezifisch sind. Ein anderer sehr wichtiger Punkt bei der Strategie war es, nur Vertiefungen, die eine hohe O.D.-Ablesung aufwiesen, für die weitere Charakterisierung und zum Clonieren zu wählen.
• Bei der Prozedur wurden 50 ul menschliches IgE mit 0,1 ug/ml in die Vertiefungen von Immunlon I-Platten mit 96 Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden bedeckt und 18 Stunden bei 4ºC inkubiert, um dem Protein die Gelegenheit zu geben, an die Platte zu binden.
• Der flüssige Inhalt der Platten wurde dann entfernt, und 200 ul 0,1 M NH&sub4;Cl wurden in jede Vertiefung gegeben, um alle restlichen Bindungsstellen auf den Platten abzusättigen. Die NH&sub4;Cl-Lösung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur in den Vertiefungen gelassen.
• Die NH&sub4;Cl-Lösung wurde dann entfernt, und die Vertiefungen wurden dreimal mit PBS und 0,05 % Tween 20 gewaschen. Etwas PBS/0,05 % Tween 20-Lösung wurde solange in den Vertiefungen gelassen, bis die nachstehend beschriebene Antikörpersuspension zugegeben wurde.
• 50 ul des Zellfusionsüberstandes jeder Vertiefung der Platten mit 96 Vertiefungen wurden zu jeder der Vertiefungen der Immulon I-Platten gegebenl und es wurde eine Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten zum Entfernen jedes ungebundenen Antikörpers dreimal mit PBS/0,05 % Tween 20 gespült.
• Der Zellfusionsüberstand enthält die durch die verschiedenen Hybridome produzierten Antikörper in den Platten mit 96 Vertiefungen. Der für menschliches IgE spezifische Antikörper bindet daran. Die an die feste Phase gebundenen Antikörpermengen wurden dann nach Routineverfahren unter Verwendung von Meerrettichperoxidase konjugiertem Ziegenanti-Maus-IgG und unter Verwendung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin als Substrat bestimmt.
2. Ergebnisse
• Von den insgesamt rund 7000 untersuchten Vertiefungen waren ungefähr 4000 Vertiefungen (ungefähr 60 %) im ELISA positiv. Die meisten dieser positiven Vertiefungen enthielten wahrscheinlich Hybride, die monoclonale Antikörper gegen menschliches IgE produzierten. Aus diesen ungefähr 4000 im ELISA positiven Vertiefungen wurden 53 Vertiefungen mit der höchsten O.D.-Ablesung zum Clonieren und zur weiteren Charakterisierung ausgewählt.
• Die 53 monoclonalen Antikörper wurden durch ELISA überprüft, wobei Vertiefungen von Platten verwendet wurden, die mit menschlichem Serum unterschiedlicher Verdünnungen beschichtet worden waren. Sie alle waren im ELISA negativ, was nahelegte, daß sie weder mit menschlichem Albumin, IgM, Transferrin oder mit anderen Haupt-Serumproteinen reagierten, die die als Immunogen für Mäuse und als das Antigen im ersten Screening-ELISA verwendeten IgE-Präparationen kontaminiert haben könnten.
d) Einzelzell-Clonierung
• Zellsuspensionen aus jeder der 53 Vertiefungen mit den höchsten O.D. Messungen im ELISA wurden in die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen gebracht, und die Zellsuspensionen wurden auf 30, 50 und 100 Zellen pro inl verdünnt. 0,1 ml der verdünnten Zellsuspensionen (durchschnittlich 3, 5 bzw. 10 Zellen enthaltend) wurden in die Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen gebracht Die Vertiefungen waren mit Histon beschichtet worden.
• Nachdem die Zellen gezüchtet worden waren bis sie Kolonien bildeten, wurden die Zellen unter dem Mikroskop untersucht. Die Zellen jeder Kolonie wanderten weder herum noch bildeten sie Kolonien. Die im ELISA am stärksten reagierenden Einzelzell-Clone wurden ausgewählt und in erweitertem Maßstab gezüchtet.
e) Herstellung und Reinigung monoclonaler Antikörper
• Zur Herstellung großer Mengen der gewünschten monoclonalen Antikörper wurde nach der £olgenden Prozedur verfahren.
• Einige der im ELISA hohe O.D.-Werte zeigenden Clone, die in den Vertiefungen der Platten mit 24 Vertiefungen gezüchtet worden waren, wurden in 100 mm Gewebekultur-Platten in erweitertem Maßstab gezüchtet. Die erweiterten Kulturen der ausgewählten Einzelzell-Clone wurden dann getrennt jeweils in die Peritonealhöhle von mit Prestan vorbehandelten Mäusen unter Verwendung von 5 Millionen Zellen pro Maus injiziert. Nach 7 Tagen wurde die Ascitesflüssigkeit jeder Maus gewonnen und eingefroren.
• Die monoclonalen Antikörper in der Ascitesflüssigkeit wurden wie folgt gereinigt. Die gefrorene Ascitesflüssigkeit wurde aufgetaut und durch ein Nylontuch filtriert, um visköses Material zu entfernen. Es wurde eine ausreichende Menge Phenylmethylsulfonylfluorid zur Ascitesflüssigkeit gegeben, so daß eine Endkonzentration von 0,1 mM erreicht wurde. Pro ml Ascitesflüssigkeit wurden 0,05 inl 1,2 M Acetatpuff er (pH 4,0) zugegeben. Die Endkonzentration des Acetatpuffers betrug 60 inM Der pH-Wert wurde auf 4,5 eingestellt.
• Pro ml behandelter Ascitesflüssigkeit wurden unter heftigein Rühren 25 ul Caprylsäure (Mol. Gew. 144,21, Dichte 0,91 g/ml tropfenweise zugegeben. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur gehalten und fortdauernd weitere 30 Minuten gerührt.
• Die Suspension wurde dann 10 Minuten bei 15 000 g zentrifugiert, um das Präzipitat zu entfernen. Der IgG enthaltende Überstand wurde durch Zugabe einer dem Zehntel des Volumens des Überstandes entsprechende Menge eines 1 M HEPES-Puffers (pH 8,9) neutralisiert. Das IgG wurde dann mit 50%igein (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; präzipitiert.
• Das Präzipitat wurde dann in HEPES-Salzpuffer gelöst. Diese Lösung wurde über Nacht gegen HEPES-Salzpuffer dialysiert, um das (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; aus dem IgG zu entfernen. Der HEPES- Salzpuffer wurde während der Dialyse zweimal gewechselt. Nach der Dialyse enthält der HEPES-Salzpuffer gereinigtes gelöstes IgG. Das gereinigte IgG wurde in bestimmten Charakterisierungstests verwendet.
• Einige monoclonale Antikörper wurden aus Ascitesoder Kulturflüssigkeit über ein zweifaches Säulenchroinatographie-Verfahren gereinigt. Zuerst wurden die Antikörper auf DE-52-Anionenaustauschharz (Whatman, Maidstone, England) unter Verwendung von 0,05 M Tris, pH 8,0, mit schrittweisen Erhöhungen der Natriumchloridkonzentration von 0,01 M bis 0,15 M chromatographiert. Antikörper enthaltende Fraktionen wurden durch einen Enzymimmuntest identifiziert, durch Amicon-Filtration (Amicon, Danver, MA, YM10-Membran) konzentriert und weiter über eine Hydroxylapatit-Säule (Bio-Gel HT; BioRad, Richmond, Kalifornien) unter Verwendung eines Stufengradienten von 0,01 bis 0,3 M Phosphatpuffer (pH 7,4) gereinigt. Die Reinheit wurde durch isoelektrische Fokusierung (13) und SDS-PAGE unter Verwendung des Pharmacia PHAST- Systems (Pharmacia, Piscatway, N.J.) untersucht, und die Konzentration wurde durch die Messung der OD280nm (1,5 = 1 mg/ml) bestimmt.
Beispiel II: Charakterisierung des erf indungsgemäßen monoclonalen Antikörpers a) Messung der Bindung an Basophile mittels eines Immunfluoreszenztests und eines Radio-Bindungstests
• Die monoclonalen IgE-reaktiven Antikörper wurden untersucht, um festzustellen, ob sie an Basophile binden, die aus peripherem Blut isoliert worden waren. Durch diesen zweiten Screening-Durchgang wurde der einen therapeutischen Wert aufweisende Antikörper ausgewählt. Der Antikörper darf Basophile und Mastzellen nicht binden und keine Freisetzung pharmakologischer Mediatoren verursachen.
• Zuerst wurde die Verwendung eines Immunfluoreszenz- Anfärbetests gewählt, da Basophile nur einen sehr geringen Prozentsatz (0,5 bis 2 %) der Leukocyten ausmachen. Es wurde angenommen, daß sogar mit angereicherten Basophilen-Präparationen eine Untersuchung von Zellen auf der Einzelzell-Ebene unter Verwendung einer Immunfluoreszenzanfärbung oder einer Biotin-Avidin-Enzym-Immunanfärbung wahrscheinlich eine genauere Bestimmung ergeben würde, als die Radioaktivitätsbindung oder ein ELISA, wenn man die Gesamt-Zellpopulationen untersucht.
1. Isolieren von Basophilen
• Basophile werden aus peripherem Blut von normalen gesunden Individuen durch Dichtezentrifugation auf Percoll nach einem angepaßten von P. Raghuprasad (J. Immunol. 129 (1982), 2128-2133) beschriebenen Verfahren hoch angereichert. Kurz gesagt, wurde eine Percoll-Stammlösung durch Vermischen von 90 ml einer 90%igen Percoll-Lösung mit 8,96 ml 10x Hanks-"ausbalanzierter" Salzlösung, 0,45 ml 1 N HCl und 1 ml 10x HEPES-Puffer (pH 7,6) hergestellt. Die benötigten Percoll-Dichten wurden durch Anwendung der folgenden Formel (8) präpariert:
• Percoll-Dichte (g/ml) = (% Percoll-Stammlösung x 0,001186) + 1,0041,
• wobei 0,001186 eine Konstante ist, und 1,0041 die Dichte von physiologischem Medium darstellt. Da sich die Dichte von Percoll durch Temperatur ändert, wird es am Tag vor dem Experiment präpariert und über Nacht bei Raumtemperatur gehalten.
• Von normalen Spendern frisch erhaltenes heparinisiertes Blut wurde im Verhältnis 1:1 mit Basis-Kulturmedium RPM1-1640 verdünnt und auf ein Ficoll/Hypague-Kissen (Dichte = 1,070 g/ml) zentrifugiert. Die mononuclearen Zellen in der Interphase wurden für andere Zwecke entnommen, und die weißliche Schicht oben auf den roten Zellpellets wurde gewonnen. Diese Granulocyten wurden gewaschen, in Basismedium resuspendiert und dann 15 Minuten durch zwei sorgfältig geschichtete Percollgradienten von 1,072 und 1,078 g/ml bei 600 g zentrifugiert. Die an der Interphase der Percollschichten und unterhalb der Interphase von Basismedium/obere Percollschicht erhaltenen Zellen wurden geerntet. Diese Zellen enthielten, abhängig von den speziellen individuellen Spendern 2 bis 10 % Basophile.
2. Testprozedur
• 50 ul der mit Basophilen angereichterten Suspension mit einer Konzentration von 5 x 106 Zellen/ml wurden jeweils zu einem 1,5 ml "microfuge"-Röhrchen gegeben, das spezifische Antikörper enthielt. 50 ul der Überstände der Hybridomclone, die mit menschlichem IgE als Antigen die höchsten O.D.-Werte im ELISA aufwiesen, wurden dann zu jedem Röhrchen gegeben. Mit einigen Clonen wurden wiederholte Tests durchgeführt. Wenn gereinigte Antikörper verfügbar waren, wurden diese in Konzentrationen von 20, 5 und 1 ug/ml eingesetzt. Wenn Ascitesflüssigkeiten verfügbar waren, wurden diese in 1:50-fachen Verdünnungen verwendet.
• Die Röhrchen mit Zellen und Antikörpern wurden dann 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert Nach der Inkubation wurden die Röhrchen zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, und die Zellen wurden zweimal mit einem 2 % fötales Kälberserum und 0,1 % Natriumazid enthaltendem RPMI 1640 gewaschen. Dann wurde gegen die Röhrchen geklopft, um das Zellpellet zu lockern.
• Zu jedem Teströhrchen wurden 10 ul des markierten Antikörpers (mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG) in einer Verdünnung von 1 zu 200 gegeben. Dieser markierte Antikörper bindet an alle beliebigen monoclonalen Antikörper, die an IgE auf Basophilen geheftet sind, und liefert eine Möglichkeit zur Identifizierung dieser monoclonalen Antikörper.
• Die Röhrchen wurden erneut 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhrchen wurden zentrifugiert, und die Zellen wurden mit demselben Medium wie zuvor gewaschen. Die Zellen wurden dann in 50 ul PBS resuspendiert, auf individuelle Objektträger gebracht und mit Deckgläschen zugedeckt. Die Zellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop durchgesehen.
• Wenn Zellen durch die Antikörper angef ärbt wurden, konnte man beobachten, daß einige der Zellen in jedem Blickfeld hell leuchtend angefärbt waren. Je nach Experiment lag der Prozentsatz der positiv angef ärbten Zellen im Bereich von 2 bis 10 %.
3. Radio-Bindungstest
• Viele der Schritte sind denen bei der Immunfluoreszenz-Anfärbung ähnlich. Die mit Basophilen angereicherte Leukocytenfraktion wird mit dem monoclonalen Maus-Antikörper und ungefähr 10 000 cpm ("counts per minute", gemessene Impulse pro Minute) 125I-Ziegen-anti-Maus-IgG in Anwesenheit von 1%igem Normal-Ziegenserum als Blockierungsmittel für die unspezifische Bindung inkubiert. Nach 30 Minuten wird das Inkubationsgemisch dann über (100%) Kälberserum in einem konischen Plastik-Zentrifugenröhrchen geschichtet. Nach der Zentrifugation zum Pelletieren der Zellen werden die obere Schicht und das Serum entfernt. Die Röhrchen werden umgedreht, um die Restflüssigkeit abfließen zu lassen. Die Spitzen der konischen Röhrchen, die das Zellpellet enthalten, werden dann mit einer scharfen Rasierklinge abgeschnitten. Diese Spitzen werden dann in Röhrchen gegeben und in einem Szintillationszähler auf ¹²&sup5;I hin gezählt. Durch Vergleich der gebundenen ¹²&sup5;I-Mengen, die von negativem monoclonalem Kontroll-Antikörper bzw. von monoclonalen menschlichen IgE- spezifischen Antikörpern gebunden worden waren, wird festgestellt, ob die Bindung posiv oder negativ war.
4. Ergebnisse
• Anfangs wurden mehrere Experimente unter Verwendung von Immunfluoreszenz-Tests durchgeführt. In jüngerer Zeit wurden Tests wiederholt, bei denen eine ähnliche Prozedur angewandt wurde, wobei ein mit Biotin markierter zweiter Antikörper (Ziegen-anti-Maus-IgG) und mit Peroxidase konjugiertes Avidin verwendet wurden. Die Ergebnisse der beiden Tests zeigten, daß die Hintergrundanfärbung von einem Antikörper zum anderen variierte. Die Ergebnisse zeigten ebenfalls, daß die Empfindlichkeiten dieser Tests nicht besser sind als die der Histamin-Freisetzungstests (siehe unten). Der Hauptgrund für die vergleichsweise geringeren Empfindlichkeiten in diesen Tests lag darin, daß der Prozentsatz von Basophilen in den Blutleukocyten aus den wenigen ausgewählten Spendern in allen Fällen sehr niedrig war. Für diese Immun-Bindungsexperimente werden Individuen mit einem relativ hohen Prozentsatz von Basophilen bevorzugt. Wenn man mit Leukocyten beginnt, die reich an Basophilen sind, kann man eine mit Basophilen angereicherte für diese Experimente geeignete Fraktion präparieren.
b) Induktion der Histaminfreisetzung aus Blutleukocyten
• Wenn ein für menschliches IgE spezifischer monoclonaler Antikörper an das an Basophile gebundene IgE bindet, quervernetzt er das IgE und aggregiert die zugrundeliegenden Fc&epsi;R-Moleküle und verursacht die Freisetzung von Histamin und anderen pharmokologischen Mediatoren. Die verschiedenen menschlichen monoclonalen IgE-spezifischen Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit hin getestet, die Freisetzung von Histamin aus gewaschenen peripheren menschlichen Blutleukocyten zu induzieren.
1. Verfahren
• Es wurde das von Siraganian und Hook im Detail beschriebene Verfahren angewandt. Durch den in vitro-Test wurde in der Leukocyten-Population der Prozentsatz von Gesamthistamin, das nach der Inkubation mit den Induktionsmitteln in das Kulturmedium hinein freigesetzt wurde, quantifiziert. Die Histaminbestimmung im Medium oder in Zellysaten wurde mit einem automatisierten Instrument vorgenommen, das Histamin mit n-Butanol extrahierte und zur Erzeugung eines fluoreszierenden Produktes mit einem Kopplungsreagens, o-Phthaldehyd, bei einem hohen pH-Wert umsetzte. Dieses Produkt wurde mit einem Fluorimeter bestimmt.
• Die Experimente zur Induktion der Histaminfreisetzung wurden durchgeführt, und nach der Inkubation mit den zu testenden Antikörpern und Kontrollantikörpern wurden die Medien von Leukocyten gesammelt und Zellysate präpariert, um die Histaminmengen insgesamt zu bestimmen.
• Kurz gesagt, wurde im wesentlichen das von Siraganian, R.P. und Hook W.A. (Manual of Clinical Chemistry, Herausgeber Rose, N.R. und Friedman, H., 2. Auflage, Seiten 208-321, American Society of Microbiology, Washington D.C.) beschriebene Verfahren als Testverfahren für die Histaminfreisetzung aus gewaschenen Leukocyten übernommen. Das Blut von normalen Freiwilligen wurde aus der Vene entnommen. Je 10 ml Blut wurden mit 1 ml 0,1 M EDTA und 2,5 ml Dextrandextrose-Lösung in konischen 50 ml-Röhrchen vermischt (alle hier genannten Lösungen und Reagenzien sind im Detail von Siraganian, siehe oben, beschrieben). Das Gemisch wurde 60 bis 90 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen, bis sich eine scharfe Interphase zwischen der Erythrocyten- und der Plasmaschicht ausgebildet hatte. Die Plasma-Leukocyten-Plättchen-Schicht wurde entnommen und 8 Minuten mit 1100 UpM bei 4ºC zentrifugiert. Die die Blutplättchen enthaltenden Überstände wurden entfernt, 2 bis 3 ml einer Lösung von kaltem PIPES A-EDTA zugegeben und die Zellen resuspendiert. Weitere 40 ml kaltes PIPES A-EDTA wurden zugegeben, und die Zellen wurden abzentrifugiert. Nachdem die Überstände verworfen worden waren, wurden die Zellen in 20 ml PIPES A resuspendiert. Die Zellen wurden dann erneut abzentrifugiert und in PIPES ACM mit einer Zelldichte von 4 x 10&sup6;/ml resuspendiert.
• Die 0,3 ml gewaschene Leukocyten enthaltenden Röhrchen und die 0,3 ml Hybridom-Kulturmedium enthaltenden Röhrchen wurden 6 Minuten auf 37ºC erwärmt. Die Inhalte der Röhrchen wurden dann miteinander vermischt und bei 37ºC inkubiert, wobei in 10minütigen Intervallen geschüttelt wurde. Nach 60 Minuten wurden die Zellen abzentrifugiert und die Überstände auf gehoben. Zur Bestimmung des Histamingehaltes insgesamt wurden 0,3 ml der gewaschenen Leukocyten mit 6 % Perchlorsäure vermischt.
2. Ergebnisse
• Angesichts der in der Natur der Histaminfreisetzung liegenden Unzuverlässigkeit bei den hier verfügbaren Blutspendern wurde der Histamintest einem außenständigen Labor übertragen, das routinemäßig Histamin-Freisetzungstests durchführt. Das Labor von Dr. Donald MacGlashan im Department für Klinische Chemie der John-Hopkins-Universität untersuchte die meisten unserer menschlichen monoclonalen IgE- spezifischen Antikörper auf ihre Fähigkeit hin, eine Histaminfreisetzung aus Basophilen zu induzieren. Die Schlüsselergebnisse, die diejenigen monoclonalen Antikörper, die keine Histaminfreisetzung induzierten, betrafen, wurden dann im Labor von Dr. Reuben Siraganian im National Institute of Health bestätigt. Beide Laboratorien haben durch das Absuchen einer großen Zahl von Blutspendern eine stabile Population von Individuen, die Histamin in hohem Außmaß freisetzen, etabliert. Die Ergebnisse der ausgedehnten von Dr. MacGlashan durchgeführten Studien, bei denen Leukocyten von sieben Spendern, einschließlich von mindestens vier, die viel Histamin freisetzen, verwendet wurden, sind in Tabelle I zusammengefaßt. Die Antikörper aus Ascitesflüssigkeiten oder die gereinigten Antikörper (1 bis 5 mg/ml) wurden 100, 10 000 oder 1 000 000-fach verdünnt. Die Histamin-Freisetzungsergebnisse stammten von einem repräsentativen "Superfreisetzer". Die Ergebnisse zeigten, daß unter den 41 monoclonalen Antikörpern 12 keine Histaminfreisetzung induzierten. Tabelle 1 Reaktivität von monoclonalen Human-IgE-spezifischen Maus-Antikörpern mit IgE-tragenden Zellen und ihre Fähigkeit, eine Histaminfreisetzung aus Basophilen zu induzieren Monoclonale Antikörper Binden an SK007-Zellen Durchflußcytometrie Histaminfreisetzung (% der Gesamtfreisetzung) Antikörperverdünnung Group Monoclonale Antikörper Binden an SK007-Zellen Durchflußcytometrie Histaminfreisetzung (% der Gesamtfreisetzung) Antikörperverdünnung)
• Durchfluß- Antikörperverdünnung
c) Bindung von monoclonalen Antikörpern an IgE- sekretierende Myelomzellen
• Es ist bekannt, daß einige Myelomzellen (bei denen es sich um Tumorzellen handelt, die sich aus Immunglobuline sekretierenden Plasmazellen ableiten in - verglichen mit dem Ausmaß der Expression auf der Oberfläche von ruhenden B-Zellen - geringem Ausmaß Immunglobuline auf ihrer Oberfläche exprimieren. IgE-Moleküle werden an die Oberfläche von Basophilen (oder Mastzellen) und B-Zellen mittels zwei verschiedener Mechanismen gebunden. IgE bindet an Basophile und Mastzellen über die Wechselwirkung von Fc&epsi;R-Molekülen auf diesen Zellen mit einer bestimmten Stelle auf dem Fc des IgEs. IgE wird durch B- oder Plasmazellen synthetisiert und an die Zelloberfläche transportiert. An der Oberfläche wird es durch einen besonderen Abschnitt einer konstanten schweren Kette festgehalten. Dieser Ankerabschnitt findet sich nur in membrangebundenen Immunglobulinen und nicht in den sekretierten Formen der Immunglobuline. Das differentielle Binden eines monoclonalen Antikörpers an IgE auf Basophilen und auf B-Zellen ist eine fundamentale Grundlage für die Verwendung von Antikörpern zur Therapie einer Allergie.
• Da es in der mononuclearen Leukocytenfraktion sehr wenig IgE-tragende B- und Plasmazellen gibt, und da die topographischen und strukturellen Eigenschaften von membrangebundenen IgE-Molekülen auf Plasmazellen, B-Zellen oder IgEsekretierenden Myelomzellen höchstwahrscheinlich dieselben sind, wurden Myelom SK007-Zellen (von der American Type Culture Collection) zur Untersuchung des Bindens von monoclonalen Antikörpern an IgE gewählt. Die Interaktion der monoclonalen Antikörper kann ebenfalls mit normalen IgE-tragenden B-Zellen und Plasmazellen untersucht werden.
1. Verfahren
• Menschliche SKO-007-, CCL-156- und CCL-159-Zellen, die oberflächengebundenes menschliches IgE-lambda, IgN- lambda bzw. IgGl-kappa exprimierten, wurden in RPMI-Medium 1640 gehalten, das mit 5 % fötalem Rinderseruin, 2 mM Glutamin (GIBCO) und 1 % antibiotisch-antimycotischer Lösung vervollständigt worden war. Periphere mononucleare Blutzellen, die aus der Vene von gesunden Spendern erhalten worden waren, wurden durch Ficoll-Hypaque- (Pharmacia, Piscataway, N.J.) Dichtegradientenzentrifugation präpariert. Das Binden von monoclonalen Antikörpern an Zelloberflächen wurde durch zwei Testtypen untersucht: Durch das Binden von Antikörpern an lebende Zellen mit einer anschließenden indirekten Analyse mittels der Fluoreszenz-Durchflußcytoinetrie, und durch einen enzymverknüpften Antikörpertest, wobei die Zellen an Mikrotiterplatten geheftet sind.
• Das Binden von Antikörpern an lebende Zellen wurde durch Pelletieren der Zellen durch 5minütige Zentrifugation bei 300 x g, Wegwaschen des Erhaltungsmediums von den Zellen mit PBS-BSA und Resuspendieren der Zellen in PBS-B auf eine Zelldichte von 20x10&sup6; durchgeführt. 50 ul der Zellsuspension und 50 ul Antikörper in PBS-B mit dem zweifachen der angegebenen Konzentrationen (l bis 10 ug/ml) wurden miteinander vermischt und auf Eis gehalten. Nach 30minütiger Inkubation wurden 2 ml eiskaltes PBS-B zu jedem Röhrchen gegeben, und die Zellen wurden bei 5ºC durch 5minütige Zentrifuqation bei 300 x g gesammelt. Der Überstand wurde dekantiert, die Zellpellets wurden durch Schütteln auf dem Vortex resuspendiert, und die Zellen einmal mit weiteren 2 ml PBS-B gewaschen. Nach dein Sammeln der Zellen durch Zentrifugation wurden 20 ul affinitätsgereinigtes Ziegen-F(ab')&sub2;-anti-Maus-IgG (H+L) (Boehringer Mannheim, Charge 52934, Code 60529), das 1:20 mit PBS-B verdünnt war, zu jedem Röhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden 20 Minuten auf Eis inkubiert und wie vorstehend mit PBS-B gewaschen. Schließlich wurden die Zellpellets in 0,5 ml 1%igem Paraformaldehyd (Polysciences, Inc., Warrington, PA) in PBS resuspendiert. Die Zellen wurden unter Verwendung eines EPICS-Profils (Coulter, Hialeah, Florida), der mit einem 5W bei 488 nm arbeitenden Argonlaser ausgerüstet war, mit 0,6 W bei Cytology Technology, Inc. (Houston, Texas), untersucht. Nach dem Setzen der Fenster (gating) bezüglich der Kombination der Geradeaus-Lichtstreuung und der senkrechten Lichtstreuung zur Unterscheidung lebender Zellen wurde die Fluoreszenzintensität mit einem eingebauten logarithmischen Verstärker aufgenommen.
• Der zellgebundene enzymverknüpfte Antikörpertest wurde durch Binden von MAbs an mit Glutaraldehyd fixierte Zellen nach dem Verfahren von Kennett, R.H. ("Monoclonal Antibodies", Herausgeber Kennett, R.H. et al., S. 376 ff, Plenum Press, New York (1980)) durchgeführt. Zu Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Falcon, #3072, Becton Dickinson Labware, Oxnard, Kalifornien) wurde Poly-L-lysin (100 ul/pro Vertiefung, 10 ug/ml in PBS) gegeben. Diese Lösung wurde nach 30 Minuten bei 22ºC aus den Vertiefungen abgeschleudert, und 50 ul Zellen wurden Init 2,5x10&sup6; Zellen/ml in calcium- und inagnesiumfreiem Dulbecco-modif iziertem PBS (GIBCO) zu jeder Vertiefung gegeben. Die Zellen wurden durch 5minütige Zentrifugation bei 300 g auf den Boden der Vertiefungen deponiert und 10 Minuten bei 22ºC durch Zufügen von 50 ul Glutaraldehyd, der mit eiskalten PBS auf 0,25 % verdünnt worden war, fixiert. Unspezifische Bindungsstellen wurden durch aufeinanderfolgende Inkubation mit 0,1 M Glycin-0,1 % BSA in PBS (200 ul/Vertiefung) und dann mit Blotto [5 % entfettete Trockenmilch (Carnation, LA, Kalifornien) in PBS mit 1 g/l Thiinerosal] blockiert. Die Blockierungslösungen wurden durch vorsichtiges Abschleudern von den Platten entfernt. Die Zellen wurden 1 Stunde bei 37ºC mit Kontroll- oder mit inonoclonalem Testantikörper in Blotto (50 ul pro Vertiefung) inkubiert. Nicht gebundener Antikörper wurde durch Abschleudern von der Platte entfernt, und die Platte wurde sechsmal mit je 200 ul/Vertiefung PBS unter Verwendung eines Transtar-Gerätes zum 96-fachen Pipettieren (Costar, Cambridge, MA) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen 1 Stunde mit 50 ul biotinmarkiertein, affinitätsgereinigtein Ziegen-anti-Maus-IgG (KPL, Gaithersburg, MD) mit 0,5 ug/ml (in Blotto) bei 37ºC inkubiert. Alle Vertiefungen wurden wie vorstehend gewaschen, Meerrettich-Peroxidase-Streptavidin (mit 0,5 ug/ml) (in Blotto) wurde zugegeben und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Nicht gebundenes Konjugat wurde wie vorstehend durch Waschen entfernt, und 100 ul TMB-Substrat wurden zugegeben. Die Platten wurden 30 Minuten im Dunkeln bei 22ºC gehalten, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 N H&sub2;SO&sub4; (50 ul/Vertiefung) gestoppt. Die optische Dichte bei 450 nm wurde mit einem Biotek-Mikrotiter-Platten-Lesegerät gemessen.
2. Ergebnisse
• Unter den mittels durchflußcytometrischer Analysen getesteten 41 monoclonalen Antikörpern färbten 35 SK007- Zellen an. Jeder der 29, eine Histaminfreisetzung aus Basophilen induzierenden monoclonalen Antikörper bewirkte eine Anfärbung. Unter den 12, keine Histaminfreisetzung induzierenden monoclonalen Antikörpern färbten 6 SK007-Zellen an, während 6 weitere dies nicht taten (Tabelle I). Die Ergebnisse der Enzym-Immunanfärbung waren mit denen der durchflußcytometrischen Tests identisch. In der analysierten Gruppe von monoclonalen Antikörpern weisen somit sechs genau die Kriterien auf, weder an Basophile zu binden, noch eine Histaminfreisetzung zu induzieren, jedoch an IgE-produzierende B-Zellen zu binden. Wie zuvor diskutiert, entwickelten Siraganian und seine Kollegen (Fed. Proc. 46 (1987), 1346) zwei monoclonale Maus-Antikörper ( E14C5IB1 und E11AC3IIC) gegen menschliches IgE, die die Bindung von IgE an Basophile inhibieren konnten. Diese beiden Antikörper wurden von Dr. Siraganian erhalten, und es wurde gezeigt, daß sie an SK007- Zellen binden und keine Histaminfreisetzung aus Basophilen induzieren.
d) Bestimmung der Affinität der Bindung an menschliches IgE 1. Prinzip und Verfahren
• Es ist bekannt, daß die Empfindlichkeit von Immuntests von der Affinität der Antikörper für die zu messenden Substanzen abhängt. Im Falle der Festphasen-Sandwich-Immuntests, bei denen zwei Antikörper, einer als das Festphasen-Adsorbens und einer als Tracer verwendet werden, sind die Affinitäten beider monoclonalen Antikörper für das Antigen wichtig. Der Einfluß der Antikörperaffinität auf die Durchführung der unterschiedlichen Antikörpertests und die Verwendung von Immuntests zur Berechnung der Antikörperaffinität sind systematisch untersucht; Nimmo et al., J. Immunol. Met. 72 (1984), 177-187; Muller J. Immunol. Met. 34 (1980), 345-352.
• Zur Bestimmung der Affinität eines monoclonalen Antikörpers für ein Antigen kann man bei einem Immuntest die feste Phase, z.B. die Vertiefungen einer 96 Vertiefungen aufweisenden ELISA-Mikrotiterplatte mit dein Antigen beschichten. Die relative Affinität eines monoclonalen Antikörpers in Relation zu der eines monoclonalen Referenz-Antikörpers für dasselbe Antigen auf der Festphase kann durch einen Vergleich der beiden monoclonalen Antikörper im Immuntest bestimmt werden. Die Affinitäts- oder Assoziationskonstante des monoclonalen Referenzantikörpers wurde durch irgendein anderes oder ein ähnliches Verfahren bestimmt. Das Ablesen der O.D. des inonoclonalen Antikörpers, dessen Affinität im Vergleich zu der des monoclonalen Referenzantikörpers bestimmt werden soll, gibt an, ob die Affinität des monoclonalen Antikörpers größer oder kleiner ist als die des monoclonalen Referenzantikörpers.
• Wenn ein monoclonaler Referenzantikörper nicht verfügbar ist, läßt sich die Analyse mit einem monoclonalen, für ein unterschiedliches Antigen spezifischen Referenzantikörper vornehmen. Durch Beschichten der festen Phase mit den gleichen molaren Antigenmengen und durch die identische An-Wendung aller anderer Testbedingungen und Parameter kann die relative Aff inität der beiden monoclonalen Antikörper aus den abgelesenen O.D.-Werten bestimmt werden.
• Bei der vorliegenden Bestimmung der Affinitäten der verschiedenen Human-IgE-spezifischen monoclonalen Antikörper, die an SK007-Zellen binden, aber keine Histaminfreisetzung aus Basophilen induzieren, wurde die Bindung verschiedener inonoclonaler Antikörper an Human-IgE mit der eines monoclonalen Antikörpers gegen Human-&beta;-HCG verglichen, dessen Aff inität mit 1 x 10¹¹ Liter/Mol bestimmt worden war. In den vorliegenden Tests wurden die Vertiefungen einer ELISA- Platte mit 50 ul (0,1 ug/ml) &beta;-HCG oder Human-IgE beschichtet, und der monoclonale anti-HCG-Antikörper und die verschiedenen monoclonalen Antikörper wurden gegen die entsprechenden Antigene auf der festen Phase titriert. Das Verfahren war im wesentlichen dasselbe, wie das für die ELISA-Prozedur in Beispiel 1 beschriebene. Unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-IgG und dein Substrat für das Enzym wurden die Titrationskurven bestimmt.
• Die Affinität der interessierenden inonoclonalen Antikörper läßt sich außerdem mit ¹²&sup5;I-markiertem Human-IgE bestimmen. Die Lösungen der Antikörper und ¹²&sup5;I-IgG mit bekannten Konzentrationen werden vermischt und dein Gemisch wird genügend Zeit (24 Stunden) gelassen, um ins Bindungsgleichgewicht zu gelangen. Die Immunkomplexe werden dann schnell durch Affinitätsadsorption unter Verwendung eines Überschusses von Sepharose 4B, die mit Ziegen-anti-Maus-IgG konjugiert ist, entfernt. Das freie ¹²&sup5;I-IgE wird schnell weggewaschen. Aus dem Verhältniß von freiem 1251-IgE und gebundenein ¹²&sup5;I-IgE läßt sich die Assoziationskonstante, Ka, des monoclonalen Antikörpers berechnen. Dieses Verfahren ist besonders für Antikörper mit einer hohen Affinität geeignet.
2. Ergebnisse
• Die sechs monoclonalen Antikörper, die keine Histaminfreisetzung aus Basophilen induzieren, und die an SK007-Zellen binden, haben eine Assoziationskonstante, Ka, die im Bereich von 3x10&sup8; bis 5x10&sup9; Liter/Mol liegt.

Claims (34)

1. Antikörper oder dessen Fragment, der/das

a) an IgE-tragende Lymphocyten bindet und

b) nicht an Basophile und Mastzellen bindet.

2. Antikörper oder dessen Fragment gemäß Anspruch 1, der/das nicht an lösliches IgE bindet.

3. Antikörper oder dessen Fragment gemäß Anspruch 1, der/das zusätzlich an lösliches IgE bindet.

4. Anitkörper oder dessen Fragment gemäß anspruch 2, der/das ein Antikörper der Maus-IgG2a-, Human IgG1- oder IgG3-Subklasse ist.

5. Antikörper oder dessen Fragment, der/das spezifisch an B-Zell-Membran gebundenes IgE, nicht aber an die lösliche Form des IgEs bindet.

6. Antikörper oder dessen fragment, der/das spezifisch an den extrazellulären Abschnitt der meinbrangebundenen Domäne einer IgE-Kette bindet.

7. Antikörper oder dessen Fragment geinäß Anspruch 5 oder 6, wobei das IgE menschliches IgE ist.

8. Antikörper oder dessen Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der/das ein menschlicher Antikörper oder dessen Fragment ist.

9. Antikörper oder dessen Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 8, der/das ein monoclonaler Antikörper oder dessen Fragment ist.

10. Monoclonaler anti-idiotypischer Antikörper oder dessen Fragment, der/das spezifisch ist für das Paratop eines Antikörpers oder dessen Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 9.

11. Antikörper oder dessen Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10, der/das ein chimärer Antikörper oder dessen fragment ist.

12. Antikörper oder dessen Fragment nach Anspruch 11, der/das ein chimärer Nagetier-/menschlicher Antikörper oder dessen Fragment ist, der/das einen Antigen-Bindungsbereich mit Nagetierursprung und einen konstanten Bereich menschlichen Ursprungs aufweist.

13. Antikörper oder dessen Fragment nach Anspruch 12, wobei das Nagetier eine Maus ist.

14. Chimärer Antikörper oder dessen Fragment nach Anspruch 12 oder 13, wobei der Antikörper oder dessen Fragment einen Maus-Antigen-Bindungsbereich und den konstanten Bereich einer menschlichen schweren gamma 1 oder gamma 3-Kette aufweist.

15. Immuntoxin umfassend einen Antikörper oder dessen Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 14, der/das mit einem cytolytischen oder cytotoxischen Agens konjugiert ist.

16. Immuntoxid nach Anspruch 15, wobei das cytolytische oder cytotoxische Agens Ricin, Pseudomonastoxin, Diphtherietoxin, antivirales pokeweed-Peptid, Trochothecenes, radioaktive Nuclide oder membranisierende Enzyme sind.

17. Kontinuierliche stabile Zellinie, die einen monoclonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 10 bis 14 sekretiert.

18. Zellinie nach Anspruch 17, die eine Hybridom-Zellinie ist.

19. Zellinie nach Anspruch 18, die ein Maushybridom ist.

20. Ein zum Auslösen einer Antikörperantwort fähiges Peptid, das die Aminosäuresequenz Glu Leu Asp Val Cys Val Glu Glu Ala Glu Gly Glu Ala Pro aufweist und Modifikationen des Peptids in denen Aminosäuren entfernt, inseriert oder substituiert worden sind, ohne dessen immunologischen Eigenschaften zu beeinträchtigen, wobei der produzierte Antikörper spezifisch mit membrangebundenein IgE reagiert.

21. Peptid nach Anspruch 20, konjugiert mit einem Trägerprotein.

22. Peptid nach Anspruch 21, wobei das Trägerprotein Hämocyanin der Napfschnecke ist.

23. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder deren Fragmenten entsprechend Anspruch 1, 2, 4, 5, 6, 7 oder 8, umfassend die Schritte des

(a) Immunisieren eines Tieres mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 20 bis 22, oder mit IgE-Molekülen, die mindestens den extrazellulären Abschnitt der membrangebundenen Domäne enthalten; und

(b) Gewinnen von Antikörpern oder Zellen, die für das Peptid oder den extrazellulären Abschnitt der meinbrangebundenen Domäne spezifische Antikörper produzieren, aus dem immunisierten Tier.

24. Antikörper, der mit einem Peptid nach einem der Ansprüche 20 bis 22 reagiert.

25. Antikörper nach Anspruch 24, der monoclonal ist.

26. Pharmazueutische Zusammensetzung, enthaltend einen Antikörper, ein Fragment des Antikörpers, ein Immuntoxin oder ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 16, 20- 22, 24 oder 25.

27. Pharmazeutische zusammensetzung nach Anspruch 26, ferner enthaltend einen Faktor, der die Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität verstärkt.

28. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 27, wobei der Faktor GM-CSF, M-CSF oder Makrophagen-Aktivierungsfaktor ist.

29. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 bis 28 zur behandlung oder Prophylaxe einer IgE-vermittelten Allergie.

30. Verwendung eines Antikörpers, eines Fragmentes von ihm, eines Immuntoxins oder eines peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 16, 20 bis 22, 24 oder 25 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder prophylaxe einer IgE-vermittelten Allergie.

31. Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms, das einen Antikörper sekretiert, der IgE-tragende B-Zellen, nicht aber Basophile bindet, umfassend:

(a) Immunisieren eines Tieres mit IgE;

(b) Gewinnen lymphoider Zellen aus dein immunisierten Tier;

(c) Fusionieren der lymphoiden Zellen und einer immortalisierenden Zelle, um Hybridzellen herzustellen; und

(d) Auswählen von Hybridzellen, die einen Antikörper produzieren, der:

(i) an der Oberfläche von Basophilen gebundenes IgE nicht bindet; und

(ii) spezifisch von IgE-tragenden B-Zellen exprimiertes IgE bindet.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das IgE Hulnan-IgE ist.

33. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, wobei das Tier eine Maus ist.

34. Verfahren zum Identifizieren von IgE-tragenden B-Lymphocyten in gemischten Leucocytenpopulationen, umfassend das Zusammenbringen einer Leicocytenprobe mit dem Antikörper oder einem Fragment davon, nach einem der Ansprüche 1 bis 14, 24 oder 25 und ein Feststellen, an welche Zellen der Antikörper oder dessen Fragment bindet, wobei ein Binden des Antikörpers IgE tragende Zellen kennzeichnet.