JPH03502455A - Ａ４アミロイドペプチドに対する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ４アミロイドペプチドに対する抗体 発明の背景 本発明は、合衆国政府の資金を利用してなされた。合衆国は、本発明に対しここ に世界的に使用料不要、払い込み済み、非独占実施権を設定する。

発明の分野 本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者の脳中に発見されたＡ４アミロイドペ プチドに特異性をもつ抗体、および、その、特に、ＡＤ老人性プラーク亜型の神 経病理学の定義に、ならびにＡＤ脳組織の細かく詳細なイメージングへの使用に 関する。

背景技術の概説 アルツハイマー病患者のプラーク中にアミロイドが存在することは、６０年以上 前（ディブリイ４９２７）知られたが、老人の脳中にアミロイドが生成し、アル ツハイマー病中にこのひも状物質の付着が増大する分子メカニズムは依然として 知られていない。

また、もしあるとすれば、アミロイドが、わずかに実質悪化の最終段階を示すと いう二次的およびそれ以上の消極的役割に関してプラーク形成の能動プロセスに 貢献していることも述べられていない。

最近、アミロイド原線維蛋白の部分構造の決定にいくらかの進展があった。ブレ マー等（１９８４ａ）は、アミロイドを、ＡＤ脳の髄膜組織から精製した。即ち 、４．２ＫＤポリペプチドが分離され、独特の２４アミノ酸配列（β−ポリペプ チド、第１図）を有することが示された。次いで同様の配列のポリペプチドが、 ダウン症候群層の脳血管アミロイドから分離された（ブレマー等、１９８４ｂ） 。即ち、−個のアミノ酸置換、１１位のグルタミンの代りにグルタミン酸、によ って２つのポリペプチドが識別された。同様の結果は、マスターズ等（１９８５ ａ）により、別個に得られ、彼らは、ＡＤ脳皮質からアミロイドプラークコアを 精製し、分析した。即ち、２８アミノ酸配列のＧｌｕ変異体が得られた（Ａ４配 列、第１図）。Ａ４配列は、ブレマー等（ＵＳＰ４，６６６．８２９）により明 らかにされたβ−ポリペプチドとは、１１．２７および２８位の３つのアミノ酸 が異なる、本報告の重要性は、Ａ４がＡＤの品質照明特徴であるアミロイドプラ ークコアから誘導されたことである。Ａ４のアミノ酸配列は、血管アミロイドか ら誘導されたβ−ポリペプチドのそれと異なる（第１図参照）。

残基ｌから１０（第１図）を含む合成β−アミロイドポリペプチドに対するポリ クロナル抗血清を用いて、神経炎プラークアミロイドが、脳血管の同様の原線維 外傷と抗原決定基を共有していることが認められた（ロング等、１９８５）。同 じ抗血清は、神経原線維細胞内の線維濃縮体（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌｏｒｙ 　　ｔａｎｇｌｅｓ（ＮＦＴｓ）を検出できなかった。対照的に、Ａ４ポリペプ チドの残基１−１１に対して作られた抗血清は、血管プラークまたは神経炎プラ ークを検出できなかったが、むしろＮＦＴに排他的特異性を発揮し、残基１１− ２３に拡がるＡ４ペプチドに対する抗血清は、プラークと血管を染めた（マスタ ー等１９８５ｂ）。かくして、β−ペプチドおよびＡ４ペプチドに対する抗体は 、その特異性によって同定できないということが信じられる旧例゛をなす。

グレナー等Ｕ、Ｓ、Ｐ、４．６６６．８２９は、β−アミロイドポリペプチドの 最初の１０アミノ酸（第１図）を用いる抗体製造を明らかにした。

本発明の要約 老人のＡＤ痴呆の脳中の線維蛋白蓄積に関する分子メカニズムの研究を促進し、 ＡＤ亜型の鑑別のため改善された神経病理学目的を提供するため、我々は、既知 の２８アミノ酸Ａ４配列（マスターズ等１９８５ａ、第１図）に対する抗体、ポ リクロナルおよびモノクロナル（Ｍ　ａｂｓ）の両方、を調製した。Ｍａｂｓは 、ＡＤ皮質および海馬部分にごく一般に特徴づけられ、アルツハイマー型アミロ イドの個々のエピトープ部位の分析を行なうのに有用であることが示された。

３つのＭａｂｓは、特異的に広く特徴づけられ、下記の情報が当然のように得ら れている。（ａ）個々の標的エピトープにより明らかにされたプラークアミロイ ドの詳細な形態学的特１ｋ（ｂ）ＡＤ脳中のアミロイド蓄積の新しい亜型の同定 。（ｃ）エピトープの蓄積に対するプラーク成熟の関係。後者の研究は、コンピ ュータ補助イメージングおよび微量密度測定により可能となった。

抗体は、ＡＤ−アミロイド用インビボイムノアッセイ手法に用いることができる 。それらは、また、ＡＤ−アミロイドの証拠としてノイロンのイメージング（例 えば細胞化学的またはインビボ）に用いることができる。イムノアッセイおよび ／またはイメージングのため、抗体は、たとえば放射、酵素または蛍光標識で検 出可能に標識を付することかできる。それらは、また、不溶性担体に固定させる ことができる。

Ａ４２８個ペプチドに対し調製されたＭａｂｓの著るしい局面は、それらがＡＤ 脳中でこれまで記述されていなかったアミロイド形成を明らかにすることである 。従ってこれらのＭａｂｓは、Ｍａｂｓの特異な分類を示す。

図面の簡単な説明 第１図は、β−ポリクロナル（グレナー等、　１９８４ａ、ｂ）、本発明におい て抗原として用いた合成アミロイドＡ４ペプチド（マスターズ等、１９８５ａ） およびグレンナー等により明らかにされたポリペプチド（Ｕ、Ｓ、特許４，６６ ６，８２９（１９８７））のアミノ酸配列を示す。Ａ４ポリペプチドと他の２つ のポリペプチドとの違いは、アンダーラインを引くことにより（アミノ酸１１． ２７および２８）描く。

好ましい実施態様の記載 本発明の抗体は、第１図に示されるＡ４２８個ペプチド上に存在するｌまたはそ れ以上のエピトープに特異性を有する。本発明の抗体は、それらが免疫源として Ａ４２８個ポリペプチドで作られるのであればポリクロナルまたはモノクロナル であり得る。これらの型の抗体は、共に、以下に記載する多くの説明において用 いられうる。

本発明において用いられる用語「エピトープ」は、抗体分子との特異的相互反応 に関係するいかなる決定基をも含む意味である。エピトープ決定基は、通常、分 子、例えばアミノ酸または糖側鎖の化学的に活性表面化学基よりなり、特異的電 荷特質と同様、特異的三次元構造特質を有する。

ポリクロナル抗体は、適当な動物、例えばマウス、ウサギまたはヤギ等中に作る ことができる。Ａ４−アミロイド２８−ペプチドは、それ自体を注射し、または 適当な免疫活性を有する担体、例えばＫＬＨに結合することができる。免疫プロ トコールのさらに詳細な記載は、実施例中に見ることができる。

モノクロナル抗体は、本分野の当業者によりよく理解され、ここにくり返さない 手段を用いる種々の方法で製造することができる。

これらの手段の詳細は、ロジャー・エッチ・ゲネット等により編集され、プレナ ム　プレスにより出版された、モノクロナル　アンチボデイズーハイプリドーマ スラア　ニュー　ディメンジョン　インバイオロジカル　アナリシス（１９８０ ）のような本に記載されている。

例えば、本発明において特異的に明らかにされたこれらに対する付加的ハイブリ ドーマ、これらはＡ４アミロイドの同定を可能にするモノクロナル抗体を製造す る、は、容易に製造し、且つ最小スクリーニングで分離することができる。

Ａ４２８個ペプチドに発見され、エピトープに特異的なモノクロナル抗体を製造 するハイブリドーマは、まず、ハイブリドーマが製造されうるような動物、例え ばＢａ１ｂ／ｃマウスに、フロインドアジュバント中の２８個ペプチドの皮下注 射で免疫し、次いで数日以内にブースター注射することにより最も有利に製造さ れる。溶解は、この分野の当業者が普通に知っているどのような手段を用いても 実施しうる。ハイブリドーマが２８個ペプチドに特異的なモノクロナル抗体を製 造していることを同定するためのハイブリドーマのスクリーニングは、まわりく どくなく、標準ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡフォーマットのいずれかでなしうる。例 えば、ＲＩＡスクリーニングフォーマットで、モノクロナル抗体を製造している ハイブリドーマからの培養上清または腹水をｌ！Ｊ　　２８個ペプチドと反応さ せる。

本発明の抗体は、液体または半液体ヒト試料を含めて、Ａ４−アミロイドポリペ プチドの同定用イムノアッセイに用いることができる。イムノアッセイは、抗体 −抗原免疫複合体の形成によるものであれば、鏡台またはサンドイッチが可能で ある。これらのアッセイは、この分野の当業者によく知られているので、ここで これ以上詳細には記載しない。

アッセイの目的のため、抗体は固定化または標識化しうる。

抗体を固定のために結合することができ、本発明に使用しうる多くの担体が存在 する、よく知られた担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポ リエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース 、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が含まれる。これら当分野でよ く用いられるものとしては、抗体結合用の多くの他の適切な担体が知られ、また はそのようなごく普通の実験を用いて確めることができる。

本発明の特別の実施態様において、１またはそれ以上の抗体を、検出可能な標識 、例えば酵素、放射活性、アイソトープ、蛍光化合物、化学ルミネッセンス化合 物またはバイオルミネッセンス化合物と結合しうる。

これらの当分野で普通の技術は、抗体結合のための他の適当な標識として知られ 、またはそのようなごく普通の実験を用いて確かめることができる。さらに、抗 体にこれらの標識を結合するには、この分野での当業者に通常知られている標準 的手段を用いて実施することができる。

抗体は、酵素に結合させうる。この酵素は、順に、基質にもつと後にさらされた 場合、化学部分を製造するような手順で基質に反応させ、化学部分は、例えば分 光光度または蛍光手段により検出しうる。検出可能な標識に用いうる酵素の例と しては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフイロコブカスヌクレアーゼ、デルタ −５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファー グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アルカリホ スアターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベーターガラクトシ ダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、ウタラーゼ、グルコース−６−リン酸 デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼである 。

抗体の存在は、また、放射活性アイソトープでそれを標識することにより検出で きる。放射活性アイソトープの存在は、次いでガンマカウンターまたはシンチレ ーションカウンターを用いるような手段により検出しうる。特に有用なアイソト ープは、’Ｈ，”’１．３ｔｐ。

５ｌＩＰ、”Ｃ，”Ｃｒ、”Ｃ１２，”Ｃｏ、”Ｃｏ、”Ｆｅ、”Ｓｅ、および １５鵞ＥＤである。

蛍光化合物で標識化することにより抗体の存在を検出することも可能である。蛍 光で標識された抗体は、適当な波長の光にさらされると、その存在が染料の蛍光 にもとづき検出されうる。最も重要なフルオレセイン標識化合物の中には、フル オレセインイソチオシアナート、ロークミン、フィコエリスリン、フィコシアニ ン、アロフィコシアニン、０−フタルデヒドおよびフルオレサミンがある。

抗体が検出可能に標識されうる他の方法としては、これを化学ルミネセンス化合 物と結合することによるものがある。化学ルミネセンス化合物−結合抗体は、次 いで化学反応工程の間に起こるルミネセンスの存在を検出することにより同定さ れる。特に有用な化学ルミネセンス標識化合物の例には、ルミノール、イソルミ ノール、芳香族−アクリジンエステル、イミダゾール、アクリジン塩およびシラ 酸エステルがある。

同様に、バイオルミネセンス化合物もまた、抗体を標識するのに用いられる。バ イオルミネセンスは、化学ルミネセンスの特別の形で、生物学的系統において見 出され、そこで触媒蛋白は、化学ルミネセンス反応の効率を増加する。バイオル ミネセンス結合相手の存在は、ルミネセンスの存在を検出することにより同定さ れる。標識を目的とする重要なバイオルミネセンス化合物として、ルシフェリン 、ルンフェラーゼおよびアニコリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）がある。

本発明のアッセイに用いられる抗体は、キットの調製に理想的に適している。か かるキットは。厳密にとにこめられた中に受入れを区別している担体手段、１ま たはそれ以上の容器手段、例えばバイアル、管などよりなり、該容器手段は各々 、この方法で用いられるべき各成分の一つを含んでいる。

例えば、一つの容器手段は、不溶または部分的に可溶な担体と結合する第一の抗 体を含む。第二容器は、可溶で検出可能な標識第二抗体を、凍結乾燥の形でまた は溶液で含む。容器手段は、また、検出可能な標識第三抗体を、凍結乾燥の形で 、または溶液で含んでいる第三容器を含んでもよい。かかるキットは、サンドイ ッチアッセイ用に用いることができる。例えばダビド等、ＵＳＰ４．３７６．１ １０参照。これを引用して明細書記載の一部とする。

加えて、担体手段は、また、各容器が異なる、予め定められた量の既知Ａ４−ア ミロイド抗原を含む多数の容器を含んでもよい。これら後者の容器は、次いで標 準曲線を作成するのに用いることができ、そこに、未知量のＡ４−アミロイド抗 原を含む試料から得られる結果を補間することができる。

イメージングは、インビトロまたはインビボで実施しうる。インビトロイメージ ングは、既に説明した標識で行なうことができる。

インビボイメージングは、診断に有効な標識抗体で行なわれる。用語「診断に有 効な」は、検出可能な標識抗体の投与量が、バックグランド信号と比べたときア ミロイド存在の部位を検出するのに充分であることを意味する。

一般に、診断用の検出可能な標識抗体は、事柄、例えば、轡者の、年齢、状態、 性および病気の程度、反対標示、もしあれば個々の生体によって調整されるべき 他の変りやすい性質により変化する。用量は、０　、０１１９７に９から２，０ ００ス９／ｋｇまで、好ましくは、０゜ｌズ９／に９−１　、　　ＯＯＯｕ／ｋ ｇに変りうる。

用語「診断標識ヨとは、イムノグロブリンが診断検出可能な標識を結びつけるこ とを意味する。

多くの異なるイメージング標識および標識方法は、この分野の当業者が既に知っ ている。本発明で用いうる標識の形の例としては、放射活性アイソトープおよび 常磁性アイソトープが含まれる。

診断インビボイメージング用には、入手しうる検出機器の形として、与えられた 放射核種の検出における大きな因子がある。選ばれた放射核種は、与えられた形 の機器用に検出が可能な壊変の型を持たねばならない。一般に、診断イメージン グを視覚化するいかなる普通の方法も、本発明に従って用いうる。

インビボ診断用の放射核種を選択するのに他の重要な因子としては、放射核種の 半減期が十分に長くて、標的による最大取込み時間でもなお検出可能であるが、 ホストへの有害な放射は最小であるように短かいことである。理想的には、イン ビボイメージングに用いられる放射核種は、粒状放射はないが、普通のガンマカ メラにより直ちに検出される、１４０−２００ＫｅＶ範囲で多数の光子をするも のである。

インビボ診断用には、核種は、中間官能基を用いることにより、直接または間接 のいずれかで、抗体に結合する。抗体に対する金属イオンとして存在する放射ア イソトープ結合するのにしばしば用いられる中間官能基は、アミンペンタ酢酸（ Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ）およびエチレンジアミンテトラ酢酸（Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ）である 。イムノグロブリンと結合しうる金属イオンの典型例は、９８ｍ’ｆ、　ｌｆｆ １Ｓ　１．　ＩＩＩ　ｉ　ｎ、　！３１１　、ｉ？Ｒｕ４ｆｆＣｕｔ”Ｇａ、” Ｊ　、”Ｇａ、”Ａｓ、”Ｚｒ、および鵞＠ＩＴＱである。

本発明の方法で用いられる抗体も、また、インビボ診断の目的に常磁性アイソト ープで標識しうる。この方式で特に有用な成分（磁気共鳴イメージング（ＭＨＩ ）手法として）は、”’Ｃａ、”Ｍｎ、””Ｄｙ。

”Ｃｒおよび５＠　Ｆｅを含む。

非経口投与用イメージング抗体の調製には、無菌水性または非水性溶液、懸濁液 およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、ポリプロピレングリコール、ポ リエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ浦および注射可能な有機エステ ル例えばオレイン酸エチルなどである。水性担体は、水、アルコール性／水性溶 液、エマルジョンまたは懸濁液を含み、それらは生理的食塩水および緩衝媒体、 塩化ナトリウム溶液、リンガ−デキストロース、デキストロースおよび塩化ナト リウム、乳酸化リンガ−液または不揮発性油を含有する非経口伝播体を含む。静 脈内伝播体は、溶液および栄養補液、電解質補液、例えばリンガ−デキストロー スなどをベースとしたものを含む。防腐剤および他の添加剤例えば、殺菌剤、抗 酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなども存在してよい。一般に、レミント ンズ　ファーマシューティカル　サイエンス、　１６版、Ｍａｃ　　Ｅｄｓ。

１９８０参照。

実施例 材料および方法 全ホルマリン−固定、剖検筋は、マクレーン　ホスピタル　プレイン　ティシュ −リソース　センターから入手された。前頭葉前方皮質（ＰＣ）または海馬セク ションを用いた。

合成アミロイドポリペプチドの製造および特性２８残基のＡ４アミロイドポリペ プチド（第１図）、これはマスターズ等（１９８５ａ）の既に報告された配列に 相当する、は、メリフィールド（１９６３）の一般的手法を用いてバイオサーチ ＳＡＭ２シンセサイザーで合成された。精製は、セファデックスＧ５０（１０− ４０μ）の３Ｘ６５ｃｍカラムで実施した。一部をとり、ＴＬＣフ０レートにス ポットし、フルオレサミンを噴霧して蛋白を定着させた。

材料を集めて、分析用ＨＰＬＣカラム（ビデツクＣ１８，カタログＮｏ。

２１８ＴＰ５４）に詰めた。溶出は、Ｉ　、　７　ｘＱ／１ａｉｎの流速で、０ ．０５％トリフロロ酢酸／水を５分間、次いで５−１００％直線勾配の０．０５ ％ＴＦＡ／ＣＨｓＣＨ１７分間で行なった。２３０ｎｍでの光学濃度プロフィル で、単一の大きなピークが現れ、これをさらに分析した。アミノ酸分析は、１％ フェノール含有６ＭＨＣＱ中、１８時間１１０℃で行なった。試料はＮ、下に乾 燥し、クエン酸緩衝液に溶かし、ＬＫＢ４１５１アルファプラスアミノ酸アナラ イザーで分析した。アミノ酸分析は、発表された配列と一致し、９５−９８％の 近似収量を示した。ペプチド試料は、使用するまで乾燥粉末として一２０℃で貯 蔵した。いくつかの実験用に、ペプチドは、使用の前にケホール　リンペット　 ヘモシアミン（バブコ、バークレイ。

カリフォルニア）と結合した。

ポリクロナル抗体（Ｐａｂｓ）の調製 ニューシーラント白雌ウサギを、合成アミロイドペプチドに対するポリクロナル 抗体の製造用に用いた。ある場合、ＫＬＨに結合したＡＰを抗原として用いた。

皮下注射は、フロイント完全アジュバント中に乳化した１ｊＩ９のＡＰを用いて 行なった。３週間後、動物から採血し、反応性を試験した。動物は、３週間後、 フロイント不完全アジュバント中１ｕのＡＰを用いて再び注射した。２週間後、 血清を試験し、１／１，０００希釈でプラスの反応を示すことが観察された。次 いでウサギは、２ケ月間１１ｇＡＰを注射し、その後血清は、免疫プロットによ りアッセイすると、１／１，０００よりも大の希釈で陽性であった。

モノクロナル抗体（Ｍａｂｓ）の調製 Ｂａ１ｂ／ｃマウスを、フロイント完全アジュバント中各１１１？のＡＰで皮下 注射した。３週間後、血清は、記載したアッセイを用いてｌ／１．０００の希釈 で陽性であった。溶解の５および４日前に、１００μこのＡＰをリン酸緩衝生理 食塩水中で皮下および腹腔的注射した。膵臓細胞を分離し、形質細胞腫瘍Ｐ３Ｎ ＳＩ／１−４ＡＣ−１細胞（ガルフレ等１９７７）と融合した。上清の抗体活性 を１０−１４日後、下記のアッセイ手段を用いて試験した。陽性コロニーを限界 希釈によりサブクローンし、次の実験に用いた。１０Ｈ３と名付けられる一つの ハイブリドーマは、本出願の出願日前に、アメリカン　タイプ　カルチャー　コ レクンジン、ロックビル、メリーランドに、ブタペスト条約の条文下に寄託され 、寄託番号ＨＢ９５４２が与えられた。

ドツトプロットアッセイ 抗体のＡＰに対する反応性を、製造者の手引きに従ってバイオラド　ドツト　プ ロット装置を用いて試験した。最初のスクリーニング用に、１９のＡＰを、０　 、５　ｘＱの水中１％ドデシル硫酸ナトリウム中で音波処理し、同量の、２５％ トリメントー１００，０．３ＭＮａＣ（！、４０ｍＭ）リスＨＣＬｐＨ７，４に 加えた。１μ９ＡＰを各ウェルに加え、次いで５０μθの１０％ＢＳＡを加えた 。Ｍａｂアッセイ用に、１５０μＱの培養上清を各ウェルに加えた。Ｐａｂアッ セイは、１５０μＱの０．１５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ）リス含有緩衝生理 食塩水（ＴＢＳ）ｐＨ７，４中に、ｌ１５００．１／１，０００およびｌ／１０ ，０００に希釈した血清を用いた。濾過後、ＴＢＳは、抗体添加と基質添加前の 間の中間流降に用いた。５０μｅの、西洋ワサビペルオキシダーゼ接合親和性の 精製ヤギ抗マウスまたは抗ウサギＩｇＣ（キャップａ）、５％ＢＳＡ、０．５％ トリスＸ−１゜Ｏｌｏ　、　１５　ＭＮａＣｆ２．　２０　ｍＭ　トリス塩酸、 ｐＨ７，４中にｌ／２゜０００希釈を各ウェルに加えた。反応生成物を、ジアミ ノベンチジン０　、５　ｘ９／ｘ（１、イミダゾールｌｘｐ／ｘＱおよびＨｔｏ ｔｏ、０１５％を用いて視覚化した。ネガティブコントロールは、組織培養媒体 または前免疫血清、ＡＰの省略およびＡＰ以外の蛋白に特異的なモノクロナル抗 体上清の添加より構成した。続くアッセイ用に、ウェル当りの抗体量を、０．０ ０１−１μ９の範囲にわたって変化させ、抗体を異なる希釈で試験した。このア ッセイで、種々の量の抗体を含むニトロセルロースの各ストリップを、ブラウン 等（１９８３）により記載されたように免疫染色した。

ＰＡＧＥ手法 ＰＡＧＥ手法は、既に記載された（ブラウン等、１９８１，１９８２）ように実 施された。発表された手法からの変更は明細書中に記載した。

イムノプロットアッセイ ニトロセルロースへの蛋白の電気泳動転移および免疫染色手法は、既に記載され た（ブラウン等、１９８３）ようにして実施した。

免疫組織学 ホルマリン固定ヒト剖検脳組織は振動分節（ビブロトーム）で５０μｍに切断し た。全セクションの材料は染色前にｌＯ分間１％Ｈ，０、中にインキュベーショ ンすることにより前処理した。反応は、水中にセクションを置くことにより７分 後に停止した。組織をゼラチン塗布ガラスシライド上にのせ、空気乾燥しそして バーマウント（フィッシャー）を用いてカバーグラスした。免疫血清を１／１， ０００希釈で、免疫前血清は１／２００の希釈で適用し、Ｍａｂ培養上清は希釈 しなかった。

チオフラビンＳ染色 ホルマリン固定セクションを、０．１％のチオフラビンＳ（シグマ）のＴＢＳ溶 液中に１０分間置、いた。過剰の染料は、組織セクションを７０％エタノール中 に１−２分間、次いで水中に置くことにより除去した。セクションを、２０％ポ リビニルアルコール（シグマ）、１０％グリセリンおよび５０ｍＭ）リスＨＣＱ を含む溶液、ｐＨ８、５を用いてカバーグラスした。明細書に示したものは、二 重染色を同一組織に実施した。チオフラビンＳで染色したセクションは、次いで 上記した免疫細胞化学手法の方法により染色した。

コンピューター補助イメージ増加 アミロイド蛋白用に免疫染色した前頭葉前方皮質の検体を、コンピューターと界 面したＭ０１６５テレビデオカメラをそなえたタイプ　ラボラックス１２光学顕 微鏡で視覚化した。免疫染色したアミロイド沈着物の伝達されたイメージは、疑 似色吸光度コードづけをそなえたソフトウェアを用いるコンピューターにより処 置した。伝達されたイメージは、イメージ中の各レベルの灰色に特定されたそれ ぞれの色に従って分離モニターに再構成された。かくして、アミロイド沈着物内 の内部密度変化を評価し得た。

結果 ペプチド調製および特性表示 計算分子量３．２ＫＤの、２８アミノ酸の合成アミロイドベプチド（Ａ　Ｐ　Ｘ 第１図）を合成し、次いで免疫学的研究の前にＰＡＧＥ手法により分析した。Ａ Ｐを、２％ＳＤＳ、５％メルカプトエタノールおよび９．５Ｍ尿素含育ＰＡＧＥ 試料緩衝液に溶解し、０．１％ＳＤＳ含有ｌＯ％ゲル上で電気泳動した。クーフ シ−ブルー染色後、ペプチドは約２３−２５ＫＤで広いバンドおよび細いバンド として現れ、細いバンドは電気泳動中にゲルフロントに移動した。より高分子量 の種が集合体として現れたがそれは分離ゲルに尿素を加えることにより除去され た。ＡＰは、９．５Ｍ尿素含有試料緩衝液に溶解し、６％尿素および２％ＳＤＳ を含有する１０％または１５％ゲル上で電気泳動した。クーマシーブルーで染色 後、主な種が３−４ＫＤバンドとして現れ、それは変性ポリペプチドの固りより なる。

かくして、合成ＡＰは、集合ポリペプチドを有し、天然に生成する４ＫＤのアミ ロイド蛋白（マスターズ等、１９８５ｂ）に似ていなくはない。続〈実施で、Ａ Ｐに対する抗体は、集合および変性形の両方に関して特性をみた。

ポリクロナル抗体（Ｐａｂｓ）の特性表示血清を、Ａｐに対して免疫したウサギ から集め、種々のイムノアッセイ手法により試験した。迅速ドツトブラットスク リーニング手法を用いて、非接合ポリペプチドに調製された抗血清スカーレット −１が０．Ｏ１μ９レベルで反応し、上記背景で０゜００１μ９の抗原により染 色を生成した。この抗体レベルで、免疫前血清からの反応生成物は、わずかに視 覚できた。スカーレット＝１を、ＡＰのＫＬ）（−結合誘導体で免疫したウサギ からの血清よりもより強力にした。

スカーレット−１は、ＡＰの集合状態に関し特性を明らかにした。

ドブドブロットアッセイは、第一にポリペプチドの集合複合体を含有するが、こ の可能性がさらにページにより試験された。ＡＰを２％ＳＤＳ含有ゲルで集合体 を形成する条件下に電気泳動した。電気的プロトを同じゲルから調製し、スカー レットーで免疫染色した。

抗血清は集合種だけでなく低分子量体を検出した。かくして、アミロイドポリペ プチドに対応して生成された抗血清は、ＡＰ集合状態全く関係がなかった。

モノクロナル抗体（Ｍａｂｓ）の特性表示２４ハイブリドーマの上清は、ドツト プロットアッセイにより示されたようにＡＰに陽性であった。その、特に強い結 合性質を有する３つのＭａｂｓは、さらに特性を調べた。ドツトプロットは、４ Ｅ１２．５Ｅ２およびｌ　ＯＨ３と名付けられた３つのＭａｂｓが、少くともポ リクロナル抗血清と同程度に反応性であることを示した。いくつかの免疫細胞化 学実験において（下記参照）、同量の３つのＭａｂｓ混合物を用いた。というの は混合調製物も、また、合成ペプチドに対し強力に反応性であったからである。

ポリクロナル血清とは、各Ｍａｂｓは、電気泳動前に、前もってＳＤＳで置処し たＡＰと強く反応した。

ポリクロナル抗血清によるアミロイドの免疫検定最初の免疫染色研究は、ＡＰに 対するポリクロナル抗血清を用い、得られたデータは、Ｍａｂｓを用いる後の実 験と比較のためベースとした。ＡＤ症例の前頭葉前方皮質（Ｐ　Ｃ）は大量のプ ラークとインターフエロンＮＦＴｓを含み、それらはチオフラビンＳによる染色 により容易に視、覚化された（ケレニイ、１９６７）。同一組織をスカーレット ーで免疫染色すると鮮かにアミロイドプラークが現れ、それは、ＰＣおよび４つ のＡＤ症例の海鳥中に見られた典型例であった。

同じ結果は、免疫前にＫＬＨと結合した、合成アミロイドポリペプチドに対して 調製した抗血清で得られた。スカーレット−１の免疫前血清はＡＤ脳組織を染色 できず、免疫血清は、正常コントロール中、たまに神経炎プラークを検出し得た 。

メカ−レット−１抗血清は、ＡＤ脳の血管系に強く結合した。チオフラビンＳで 、および免疫血清で染色される管の縦セクションは、抗ＡＰ血清が蛍光染料で視 覚ししうる最も強い染色特徴を検出することが示された。さらに免疫染色により 、柔組織中、アミロイド材料と血管アミロイドとの強い結合が明らかになった。

断面に切られた血管適用された二重標識手法により、チオフラビンＳと結合する 全ての血管層はメカ−レット−１免疫血清で検出できることが確認された。

モノクロナル抗体は、ＡＤ脳アミロイドから誘導されたＡ４２８アミノ酸ポリペ プチドに調製された（マスターズ等、１９８５ａ、第１図）。２４ハイブリドー マの上清は陽性で、この、特に強い結合性質を有する３つのＭａｂｓをさらに特 徴づけた。ドツトプロットは、４ＥＩ２，５Ｅ２および１０Ｈ３と名づけられる ３つのＭａｂｓがきわめて高希釈でさえポリペプチドに対し強く反応性であるこ とを示した。いくつかの免疫細胞化学実験で（下記参照）、３つのＭａｂｓの同 量混合物を用いた。

最初の研究は、アビジン−ビオチン　西洋ワサビペルオキシダーゼ手法を用いる ＡＤ脳セクンヨンの免疫染色および通常のイメージング方法によるエピトープ分 布の分析によって、Ｍａｂｓの特異性を確立することを目的とした。前頭葉前方 皮質を用いた。チオフラビンＳで染色したセクション、それは脳アミロイドと反 応することが知られている、は、Ｍａｂｓ　５　Ｅ　２で逆染色した。抗体は、 蛍光染料と重複する分布でアミロイド沈着物と結合した。他の研究では、３つの Ｍａｂｓで染色されたおびただしいプラークを観察して、これらの抗体が、ＡＤ 脳アミロイド沈積物についてのこれまでの報告よりももっと多くの詳細な構築情 報を提供したことを示した。Ｍａｂｓは、標的エピトープが異なる大きさおよび 異なる形態の沈積をおこすことを示した。例えば、１０Ｈ３エピトープはコア内 および末梢環状構造（リング）に局在したにもかかわらず、他の例では、同じエ ピトープがもっとまちまちに分布した。これらの研究経緯の間の、リングにより 囲まれるアミロイドコアの免疫検定は、独自の発見で、他の形態を次に示す。

考慮中の３つのＭ　ａｂｓがＡ４２８個アミロイドポリペプチド配列の同一また は異なるエピトープ部位に特異的かどうかは知られていないが、共に混合すると 、それらは、組織の特に強い染色を与え、けれども暗反応生成物が低背景染色と 鮮かに対立している。コントロール研究で、神経病理学的に正常なコントロール に適用したＭａｂＳ混合物では明るい背景染色以上には染色しなかった。混合Ｍ ａｂｓによるアミロイドの特異的で強い染色は、老人性プラークの他の成分から インターフェイスすることなくエピトープ分布を分析するためのコンピューター 増強イメージング方法を用いるより詳細な研究のための選択方法であることが明 らかになった。

予期されたように、Ｍａｂｓは、アミロイドの実質沈積と反応し、また血管のア ミロイドを検出し、二重染色実験（チオフラビンおよびＭａｂｓ）により指示し た。

免疫染色様式の視覚化を改良し、種々のアミロイド構造中のエピトープ分布につ いての詳細な情報をさらに集めるために、我々は、コンピューター増強イメージ ング手段を用い、これは、立体構造の分析を増強させた。

Ｍａｂ混合物で免疫染色した前頭葉前方皮質のセクションは、通過イメージを作 るためのコンピューターとインターフェイスしたテレビビデオカメラを施した光 学顕微鏡の手段によって観られる。イメージを数字に表わし、大きさ評価をし、 そして疑似カラーグレイ目盛を用いて異なるレベルの密度を表示した。主要な型 のアミロイド沈積物が大きさ、内部体制および内部密度の点から明らかにされた 。

４つのクラスの異なる大きさのアミロイド沈積物が同定された、小さい点状アミ ロイド沈積物（９，０６±０．２μｌ直径）は、最も普通に観察される免疫染色 立体構造であった。点状沈積物にしばしば近接して見られたのは、微小量の物質 で、それは前駆体を表すかも知れない。斑点状アミロイド沈積物（３０，８７± １．２８μｌ直径）と言われるアミロイド蓄積は、それらがより大きな直径でも のと区別されるので、全体として１つのクラスとして考えられた。−例では、多 重フォーカスの密集沈積物が、場の至るところに存在した。即ち類似の大きさの 第二の斑点構造は、わずかに拡散反応生成物を含有した。他の例は、アミロイド の暗い染色蓄積として現れた。

また、リング状アミロイド沈積物（４０，５１±４．６５μ瀧直径）で観察され 、その中の中央部分はアミロイドを僅かに含むか全く含まなかった。最もまれな 立体構造は、リング士コアアミロイド沈積物（明確で別のアミロイドコアを含む リングのアミロイド、リングは４８．７３±７．３６μ！直径を示し、コアは１ ２．８５±２゜２０μ夏直径を示した）であった。合成ポリペプチドに対する、 ポリクロナル血清によるアミロイド沈積物のこれまでの免疫染色では、リングま たはコアを伴うリングパターン検出されなかった（マスターズ等、１９８５ｂ； ロング等、１９８５）。

新生皮質に関して、点状沈積物は、主に層！に局在し、それらの出現の度合は、 皮質外膜内のそれらの深さと逆に関係した。対象的に、斑点状沈積物は、異なる 分布をもった。点状沈積物と比べると、斑点状タイプは、層Ｉにはより少ない範 囲で現れたが、層■からではより多い程度に現れた。リング形は、全ての層に現 れた。コアを伴うリング構造は、他の形態よりも少ない頻度で出現した。この異 なるアミロイドクラスの層分布は、これまで記載されていない。

免疫ベルカキシダーゼー染色アミロイドは、コンピューター増強イメージング方 法によるパターン分析を可能とし、これは、その密度分布に従って種々のエピト ープ部位を視覚化した。この研究を用いて、我々は、ＡＤ脳中のアミロイドにつ いてこれまで認められてしたよりも、より大きな程度の不均質さを観察した。点 状沈積物は、その小さな直径にもかかわらず、反応生成物密度の内部勾配に関係 なく見られた。全ての形態学的タイプは、類似のアミロイド免疫反応性成分を示 した。これらの反応生成物の成分は、ペルオキシダーゼ段階の間、溶解に関係し なかった。というのは、短時間（３−４分）および長時間（７−８分）のいずれ のインキュベーションも類似の大きさおよび内部不均質性の沈積物を示したから である。４つのグループのアミロイド沈積物間の全ての形態学的変化と関係なく 、通常の特徴は、高密度の多重フォーカスが存在することである。

本研究で用いたＭａｂｓがアミロイドに高い特異性を示し、銀染色法により検出 しうる単一プラークに必ずしも示さないことは、強調されるべきことである。こ の免疫特異性に基づき、観察は、アミロイドに加えて、種々の細胞および亜細胞 成分を含む（ライスニュースキイおよびテリー、１９７３）単一プラークそのも のに関してはなされず、代って、我々の試みは、アミロイドに対し高特異性をも つＭａｂｓにより同定しつる形態学的変化に焦点を合わせた。他の研究で、我々 は、ビールコラスキー染色が、層■および■は、最も多数の老人性プラークを含 むが、一方類似の組織セクション中の層■または他層の点状外傷が見られないこ とを示すことを観察した。この理由のために、免疫検出可能なアミロイド沈積物 と以前に明らかにされた老人性プラークとの間にわずかに一部重複するところが あるということを強調することは重要である。

斑点状アミロイド沈積物は老人性プラーク内アミロイドの以前の記載（ライスニ ュースキイおよびテリー、１９７３）に相当するのかも知れないが、我々が記載 した残存形は独特であることが明らかである。特にＡ４２８個ポリペプチドに対 するＭａｂｓは、既に記載されているもの示されていないＡｂ脳中の一連のアミ ロイド沈積物を視覚化した。即ち、点状の、それぞれ内部密度勾配を有するリン グおよびリング士コアアミロイド沈積物は、独創的発見である。これらのＭａｂ ｓの独特の局面は、これらをＡＤの亜型を詳しく研究するための強力な反応剤と して使用することを示唆する。

上で論じた手法は、独特なＭａｂｓの製造によく適し、ＡＤの分子発病学を実験 するための新しい道具を提供する。それ故、我々は、抗体を調製するため２つの 付加ペプチドを作るため同一方法を用いた。カング等（１９８７）は、胎児脳か ら取ったＡ４アミロイドｃＤＮＡプレカーサーを報告した。配列は、２つのポリ ペプチド部分を予報し、そのポリペプチド部分はこの分子に対し独特であること を示す。独特さは、バイオレットデータベースによる研究ののち、確認された。

２つのペプチドは次の通りである。

１、　Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔ ｈｒ　−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ　−Ｉ　Ｉｅ−Ａｌａ−Ｔｈ ｒ−Ｔｈｒ−ＴｈｒＩＩ　、　Ａｒｇ　−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ−Ｐｈｅ　−Ａｓｎ −Ｍｅｔ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ｖａｌ　−Ａｒｇ　− Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｉｎ　−１ｙｓ　−Ａｓりペプチドは、合成され 、精製された。マウスおよびウサギへの注入により、既にＡ４ペプチドに適用さ れた手法を用いるポリクロナルおよびモノクロナル抗体を生成する。

引用文献 オールソップ、ディー等、プレイン・リサーチ２５９巻３４８−３５２頁（１９ ８３） ブラウン、ビー・エイ等、ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー４０巻２９ ９−３０８頁（１９８３）ブラウン、ビー・エイ等、ジャーナル・オブ・ニュー ロケミストリー３６巻！４３−１５３頁（＋９８１）ブラウン、ビー・エイ等、 ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー９４巻１５９−１６４頁（１９Ｂ　２） デイブリイ、ビー、ジャーナル・オブ・ニューロロジー、二二一口す−ノエリー ・アンド・サイキアトリイ２７巻６４３−６５７頁（１ガルフレ、ジー等、ネイ チャー２６６巻５５０−５５２頁（１９７グレナー、シイ−・シイ−等、バイオ ケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション１２０巻８８５− ８９０頁（１９８４ａ） グレナー、シイ−・シイ−等、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・ コミュニケーション１２２巻１１３１−１１３５頁（１９８４ｂ） カング、ジェイ等、ネイチャー３２５巻７３３−７３６頁（１９８ケレニイ、シ イ−、アクタ・ノイロパソロジカ７巻３３６−３４８頁（＋９６７） マロツタ、シー・エイ等、プログ・プレイン・レス・インプレス８２巻４２４５ −４２４９頁（１９８５ａ）マスターズ、シー・エル等、プロシーディング・ナ ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ニーニスエイ８２巻４２ ４５−４２４９頁（１９８５ａ） マスターズ、シー・エル等、エムボ・ジャーナル４巻２７５７−２７６３頁（１ ９８５ｂ） メリフィールド、アール・ビー、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・フ サイエティー８５巻２＋４９−２１５４頁（１９６３）メルフ、ビー・エイ等、 アクタ・ノイロバソロジカ（ベルリン）６０巻１１３−１２４頁（１９８３年） ウイスニュウスキイ、エイチ・エム等、アナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・ア カデミイー・オブ・サイエンス３９６巻１１９−１２９頁（１９８２） ウイスニュウスキイ、エイチ・エム等「リイグザミネイション・オブ・バソゲネ シス・オブ・ザ・セナイル・プラーク」イン・エイチ・エム・チンマーマン（エ ディター）、ブロクレス・イン・ニューロバソロジー１−２６頁、グルーン・ア ンド・ストラットン・ニューヨーク（＋９７３） 本発明を今十分記載したことで、同じことが広く同等の程度のパラメーター、条 件等のなかで、本発明またはそのいかなる実施態様の精神または範囲に影響を及 ぼすことな〈実施できることは、容易に明らかである。

１９８９年４月８日受理 微生物 微生物に関するその用紙は明細書１３頁３１行に引用した。

寄託機関の名称 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション寄託機関の住所 アメリカ合衆国２０８５２　　メリーランド、ロックビル、バークローン・ドラ イブ　１２３０１番寄託の日付　　　　　　　　　寄託番号１９８７年１１月１ ６日　　　　　ＨＢ　　９５４２付加表示 マウス・ハイブリドーマ、１０　　Ｈ３ヨーロツパ特許が求められている指定回 に関し、寄託された微生物の試料は、ヨーロッパ特許の付与の告示の公表まで、 または出願が拒絶されまたは取り下げられもしくは取り下げられたとみなされる 日まで試料を請求している者より指定された専門家にのみ試料が発行され、入手 可能となる（ＥＰＣ２８条（４））ＦＩＧ、１ 補正口の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成２年４月９日 １ｆｆｉｌｉｊｆｆｌ　　　　　　　　　　　曜１、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０３５９０ ２、発明の名称 Ａ４アミロイドペプチドに対する抗体 ３、特許出願人 名称　ザ・マクリーン・ホスピタル・コーポレイション（ほか１名） ４、代理人 住所　〒５４０　大阪府大阪市中央区域見２丁目１番６１号ツイン２１ＭＩＤタ ワー内　電話（Ｏ６）９４９−１２６１（１）　　補正口の翻訳文　　　　　　 　　　　　ｌ　通請求の範囲 ２、下記ポリペプチド配列内のエピトープに特異性を有する抗体。

Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔｙｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ 　ｌｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−８ ｅｒ　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ３、下記ポリペプチド配列内 のエピトープに特異性を有する抗体。

Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ− Ｔｙｒ　−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ４、ポリ クロナル抗体である、請求項２または３の抗体。

５、モノクロナル抗体である、請求項２または３の抗体。

６、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル。

ＭＤに寄託され、寄託番号ＨＢ９５４２を有する１０Ｈ３と名付けられたハイブ リドーマから得られた抗体の特異性特性を有するモノクロナル抗体。

７．１０Ｈ３と名付けられたハイブリドーマ、ＡＴＣＣＮｏ、ＨＢ９５４２から 誘導される、請求項６の抗体。

８　ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ９５４２゜９、検出可能に標識された形の、請 求項２または３の抗体。

１０、該検出可能な標識が、放射標識、酵素標識、補助因子標識、化学ルミネセ ンス標識、バイオルミネセンス標識、蛍光標識、常磁性標識および金属標識から なる群から選ばれる、請求項９の抗体。

１１、高分子担体に結合している、請求項２または３の抗体。

１２、試料中のＡ４−アミロイドの決定または検出用イムノアッセイにおいて、 該試料をＡ４−アミロイドに対する抗体と接触させて、免疫複合体が該抗体と該 Ａ４−アミロイドの間に形成されているか否か決定することによりなり、該抗体 として請求項２または３の抗体を用いることよりなる改良。

１３、組織をイメージング有効量の請求項９の検出可能な標識抗体と接触させる こと、および 標識を検出すること、それにより、組織試料中にＡ４−アミロイドの存在を確立 することよりなる、組織中のＡ４−アミロイドの存在検出方法。

１４、組織試料が組織セクションである、請求項１３の方法。

１５、検出がインビボでイメージングすることにより行なわれる、請求項１４の 方法。

国際調査報告 ””ｌｌｌ−ｎ１ａ＊＊＋・ｃ−”ｘ−、ＰＣＴ／’ＪＳ８９１００３５９０

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．下記ポリペプチド配列内のエピトープに特異性を有する抗体。 【配列があります】
2. ２．下記ポリペプチド配列内のエピトープに特異性を有する抗体。 【配列があります】
3. ３．下記ポリペプチド配列内のエビトープに特異性を有する抗体。 【配列があります】
4. ４．ポリクロナル抗体である、請求項１、２または３の抗体。
5. ５．モノクロナル抗体である、請求項１、２または３の抗体。
6. ６．請求項１の抗体が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，ロッ クビル，ＭＤに寄託され、寄託番号ＨＢ９５４２を有する１０Ｈ３と名付けられ たハイブリドーマから得られた抗体の特異性特性を有するモノクロナル抗体。
7. ７．１０Ｈ３と名付けられたハイブリドーマ、ＡＴＣＣＮｏ．ＨＢ９５４２から 誘導される、請求項６の抗体。
8. ８．ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ９５４２。
9. ９．検出可能に標識された形の、請求項１、２または３の抗体。
10. １０．該検出可能な標識が、放射標識、酵素標識、補助因子標識、化学ルミネセ ンス標識、バイオルミネセンス標識、蛍光標識、常磁性標識および金属標識から なる群から選ばれる、請求項９の抗体。
11. １１．高分子担体に結合している、請求項１、２または３の抗体。
12. １２．試料中のＡ４−アミロイドの決定または検出用イムノアッセイにおいて、 該試料をＡ４−アミロイドに対する抗体と接触させて、免疫複合体が該抗体と該 Ａ４−アミロイドの間に形成されているか否か決定することによりなり、該抗体 として請求項１、２または３の抗体を用いることよりなる改良。
13. １３．組織をイメージング有効量の請求項９の検出可能な標識抗体と接触させる こと、および 標識を検出すること、それにより、組織試料中にＡ４−アミロイドの存在を確立 することよりなる、組織中のＡ４−アミロイドの存在検出方法。
14. １４．組織試料が組織セクションである、請求項１３の方法。
15. １５．検出がインビボでイメージングすることにより行なわれる、請求項１４の 方法。