JPH03502577A - 修飾ｄｎａの化学合成のためのホスホラミダイト試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 修飾ＤＮＡの化学合成のためのホスホラミダイト試薬発　　明　　の　　分　　 野 本発明は修飾シトシン塩基、主に翫６−シヒドロー５＝アザシトシンおよび５− アザシトシンを含むＤＮＡの合成、セしてよシ脣に配列の特定部位での前記塩基 の組入れを可能とする修飾ＤＮＡの化学合成に使用するための試薬に関する。

発　　明　　の　背　景 所望のヌクレオチド配列ｔＷするポリヌクレオチオフラグメン）ｆ合成する能力 は、研究および応用分子生物学の双方において有用な手段である。短い合成ポリ ヌクレオチド、ま之はオリゴヌクレオチドは、より長いＤＮＡセグメントを結合 するのにアダプターまたはリンカ−として、ま几ハイブリッド形成プローブおよ びＤＮＡ合成ブライマーとして有用である。より長いポリヌクレオチドは重複付 着端！−有するより短いセグメントより構築することができセして構造遺伝子、 調節領域例えばプロモーター、ターミネータ−、オペレーター、および同様のも のとして使用しうる。したがって合成りＮＡフラグメントｖ高収率で相対的に短 時間で生成するための好都合な自動化技術ｔ−提供することは大変重要なことで ある。

ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡの機能、構造および化学的仕上げの理解は発展 してきたので、遺伝子工学の実用性と実行可能性の認識もまた深まった。しかし 、これら工学的成果は細胞中の化学的および生物学的反応の完全な理解を必要と する。これら反応の一つｒｉ特特約的ＤＮＡメチラーゼより酵素的に行われると ころの一定のシトシン残基の選択的メチル化により新九に合成されたＤＮＡの複 製後修飾である。真核ＤＮＡにおける脣異メチル化様式の形成を支配する要素全 理解することは、形質発現の機構を理解しようとする場合大変重要である。

かかる遺伝子工学の努力を基礎とするものは、単一のモノヌクレオチドよりの所 望のヌクレオチド鎖の合成である◎これに関して、出発ヌクレオチドに対する逐 次リンキングを経由して所望のオリゴヌクレオチド配列を合成する几めの眠気機 械的器具が開発されてきた。

現在で框、ポリヌクレオチド合成の九〇に様々な接近法が利用できる。これら接 近法はいくつかの基準金基礎とすることで特徴付けることができる。第一に、合 成は通常固相基質上または浴液中のいずれかで行なう。固相合成は−１で基質に 付着し几成長鎖へのモノヌクレオチドの逐次付加による。固相は反応体の簡単な 分離を許すが、この方法は過剰量の反応体全必要としかつ通常少量（１１９未満 ）の所望配列のみを提供する。溶液相合Ｗ、ハ、より少量の高価試薬全必要とし そしてより大量の生成物配列ｔ−提供できるものの、全ての付加後に中間生成物 の単離と精製を必要とする。実際には全ての自動操作のポリヌクレオチド系は固 相合成による。

現在のところ自動操作のポリヌクレオチド合成のために広（便用されている二つ の合成化学がある。トリエステル法に、Ｃａｔｌｉｎ　＆よびＣｒａｍｅｒ　Ｊ 、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、旦＝２４５−２５０（１９７３）およびＩｔａｋｕｒ ａ等、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ。

５１　：　５６４９−５６５１（１９７３）により記載される通り、一般に安価 でかつ安定であるところの適当なブロック化ホスフェート−トリエステル中間体 の付加による。ホスフィツト−トリエステＮ法は、ＬｅｔａｉｎｇｅｒおよびＬ ｕｎ５ｆｏｒｄＬと、艷３．影じ、旦：５６５５（１９７５）　　により記載さ れる通り、いくらかより複雑であるが、一般にホスフェート　トリエステＮ法／ 法より高収量を供給する。ホスフィツト−トリエステＮ法の有用性は、当初用い られたリン−クロロダイト中間体よりもより安定なＮ、Ｎ−ジアルキルアミノ　 ホスフィツト（アミダイト）の便用によって大いに向上しｔ０ホスフィツト−ト リエステＮ法は各ヌクレオチド付加でより高い収量が故によく好まれる一方、ホ スフェート−トリエステＮ法もまた自動操作のポリヌクレオチド合成に適する。

ポリヌクレオチドを合成するのに使用できる反応器系のうち、密ベッドカラム、 疎ベッドカラム、またはバッチ反応器のいずれか全使用する固相反応器系がある 。密ベッドカラムは固相支持材で密に充填されておりそして反応体は単一の通路 中にまたは再循環流により導入される。

疎ベッドカラムはこれら間層１ｔ一部分的に緩和するように導入されてきた。反 応体ｔカラムにゆっくりと通すこと罠より、より高い質量移動速度が達成されそ して高価な反応体の利用が改良される。ま九、固相充填にそこを通る流れ分布を 一様にするように転するので、チャンネル化に減少する。

バッチ反応器においては、支持体マトリックスは密封容器中に入れられる。反応 体は導入されそして容器内容物は、象徴的には不活性ガスを反応器中の液体に通 し泡立てることにより、攪拌される。かかる系は反応器中の保持時間を増すこと により反応体の大変有効な利用を提供できる反面、相対的に大容量の反応体およ び溶媒が反応器を満たすのに必要とされる・ Ｕｒｄｅａ等は、米国特許第４５１７４３８号において、個々のヌクレオチドを ヌクレオチド鎖に所定の順序で加えることにより分散された固相支持体に付着さ れた線形ポリマー分子の逐次修飾のための方法および系を開示する。

分散さ九た固相支持体は試薬の導入と除去のための接近部位を備えた反応器帯域 の中に保持される。試薬は少くとも一つの接近部位全通して試薬マニホールドに より反応器帯域に選択的に配給さｎる。

選択さｎたヌクレオチド配列？プログラム通りに合成するための別の装置は、Ｚ ｅｌｉｎｋａ等、米国特許第４５９８０４９号に記載されて＾る。

５−アザシトシン　デオキシリボヌクレオシドのトリアジン環のよく知られ九と ころの不安定性に、上述の自動操作のＤ　Ｎ　Ａ−＆成に２いて薄条ブロックと しての使用を不適当なものにする。この欠点にも拘らず、５−アザシトシン残基 金含有する−１２工び二１ストランドのＤＮ人フラグメントの合成における利益 はこの薬の作用機構の理解において１喪なゴールｔ−Ｓ成する。生存細胞におけ る５−アザシトシンのＤＮＡ組入れｆｌＤＮＡメチラーゼ活性の抑制およびこれ に続く遺伝子活性化に関連してきた。

５−アザシトシン残基のＤＮＡ組入れと遺伝子活性化の間に存在する関係に十分 に確立されているので、それは、この非天然塩ｉｔ金含有るオリゴヌクレオチド 　フラグメントの合成のための方法論全発展させるのに役立つであろう。これら 修飾オリゴヌクレオチドは、翫６−シヒドロー５−アザシトシン残基と５−７ザ シトシン残基ヲ特異部位に含むものであるが、選択的な遺伝子活性化の機構およ びこれらトリアジン塩基の存在とＤＮＡメチル化の抑制との［５に存在する関係 を解明するための道具として役立つであろう。ＤＮＡ合成において２′−デオキ シ−５−アザ−シチジンのホスホラミダイトの直接組入れは、２′−デオキシ− ５−アザ−シチジンが酸またはアルカリ条件に極端に鋭敏であるので、失敗に帰 するであろう。

発　　明　　の　　要　　約 本発明の目的は、上記に述べ友ような従来技術の欠点を克服することにある。

本発明の別の目的は、翫６−シヒドロー５−アザシトシン塩基または５−アザ７ トシン塩基のいずれかを配列の特異部位に含む修飾オリゴヌクレオチドの合成方 法を提供することにある。

１　本発明のもう一つの目的は、翫６−シヒドロー５−アザシトシンおよび５− アザシトシン塩基の組入れを達成するＤＮＡの自動操作合成用の試薬を提供する ことＫあるＯ また本発明の目的は、オリゴヌクレオチド構造におい）て翫６−シヒドロー５− ７ザーシトシンｔ５−７ザシトシンに変換する方法を提供することにある。

さらに本発明の別の目的は、選択的な遺伝子活性化の機構全研究するのに使用す るための化合物を提供することにある。

＋　　ＤＮＡ合成において２′−デオキシ−ジヒドロ−５−アザ−シチジンのホ スホラミダイトの使用は、それがＤＮＡ合成に用いる全ての化学的段階と全体的 に適合するので、所望のインターヌクレオチド結合の満足な形成という結果とな プそして修飾ＤＮＡフラグメントの合成を可能にする。合成の最後に２いて、大 変特異的でかつ容易に行われる酸化が、所望の５−アザ−シトシン部分を生せし める。５−アザシトシン　ヌクレオシドにおいてトリアジン環の加水分解不安定 性は十分よく文献に示されているので、５−アザシドシンデオキクリボースの慣 用のホスホラミダイト誘導体、化合物１０使用は、それが合成の脱保護段階のう ちにトリアジン環の塩基触媒開裂の結果となろうから、非芙用的である。本発明 の方法は、オリゴヌクレオチドの合成の終了の漫所望の５−アザシトシン塩基の 再生成を可能にする５−７ザシトンンデオ中シリボースの安定なホスホラミダイ ト前駆体と使用することによりこの問題を克服するものである。

保護され几５，６−シヒドロー５−アザシチジン　ホスホラミダイト（Ｓ、　６ −　ｄｉｈｙｄｒｏ−５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｍｉ ｄｉｔｅ　）、化合物９は、七の親ヌクレオシドと同様、大変安定なトリアジン 環ｔ−有する。

本発明による反応は次の反応図式において示す。

図　　式　　Ｉ Ｋ　ＲＩＩＲ’　＝８　ｉ（ＣＨＭｅ、　）、　０８１（ＣＨＭｅ、　）、　Ｒ Ｆ”ＲＦ”Ｈ６、ＦＵＮ　＝８ｉ（ＣＨＭｅ、）、　０８ｉ（ＣＨＭｅ、）、　 Ｒ”８番；Ｍｅ、ＣＨＣＯ ａ）２．ｚ当量−５−シクロロー−ｔ４５−テトライソプロピルジシロキテン、 ピリジン室温　１時間９７　＊　ｂ）　８当量ｕ　ＮａＢＨ４、Ｔ）ｌＦ、　　 室温１時間ｙａｓｃ）Ｉ−８当量塩化インブチリル、ピリジン／クロロホルム、 　Ｏ’　ｌｉ　、　ＭｅＯＨ，室温１６時間８４％、ｄ）ｉ、４０当量グリオキ プール、ピリジン。

室温乾燥１元３回０．クロロホルム／水抽出ｅ）　２当量塩化インブチリル、ピ リジン、室温２時間６１９Ｇ、　ｆ）１．２当量　フッ化テトラブチルアンモニ ウム、　Ｔｉ（Ｆ、室温り時間６０％、ｇ）ｔ２当量塩化４４′−ジメトキシト リチル。

ピリジン、室温２時間５０チ、ｈ）２．２当量クロロ−Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピ ルアミノ　メトキシホスフィン４．２当量テトラゾール、クロロホルム室温１５ 分７１憾図式１は５−アザ−シトシンデオキシリボースより出発する５−アザシ チジンホスホラミダイトの合成の概略を示す。Ｌ５−ジクロロ−ＬＬ１５−テト ライングロビルジ７０キ丈ン金用いた保護、続いて化合物２の水素化ホウ素還元 により、所望のジヒドロ類似体、化合物５を、酢醗メチル中の５僑メタノールを 用いたシリカゲルフラッジ島　クロマトグラフィーによる精製の後に与えた。

化合物３の　Ｈ−ＮＭ几スペクトルは新たに生成し九〇−６メチレンプロトンｆ 　Ｌ４０　ｐｐｍを中心としたＡＢ四重線として示す。その後化合物３の環側鎖 アミノ基をインブチルアミド、化合物４、として保護しそしてヘキサン中の５０ ９６酢醗エチルを用いたシリカゲルフラッフ＆　クロマトグラフィーにより精製 した。トリアジン環の完全な保護はビス（インブチリルオキシ）エチレン轟の導 入により達成し、２′−デオキシグアノクンについても同様の方法により行なっ た。しかして、化合物４とグリオキテールの反応より単離された、中間体ジオー ル、化合物５を塩化ジブチリルと反応させ℃化合物６を与え、これをへキサン中 の１５％酢酸エチルを用いたシリカゲルフラッシェクロマトグラフィーにより精 製し九。フッ化テトラブチルアンモニウム全用＾た化合物６中のテトライソグロ ピルジシロキサンゑの除去により、塩化メチレン／水中の簡単な抽出に続いて、 化合物７會与え友。５′−ヒドロキシル基の保護を、塩化４４′−ジメトキシト リチルを用いた標準的手順により完了して化合物８ｔ−結晶性固体として得た。

融点８９−９１°Ｃ（ヘキサン）・最後に、クロロ−Ｎ、Ｎ’−ジインブロビル アミノメトキ７ホスフィットｖ用い良化合物８のホスフィチル化により、ヘキサ ン中の２５憾酢酸エチルを用い九シリカゲルフラッシエクロマトグラフィーによ る精製の後に、所望のホスホラミダイト、化合物９を白色固体、融点６７−６９ ℃として与えた。

新規なホスホラミダイト、化合物９の反応性を初めに、ＤＮＡ合成に用いる標準 条件の下、図式２に示されるように、典型的な、３’−０−アセチル−チミジン とのテトラゾール触媒の縮合反応において試験した。１５分後に、反応は完了し 、セして即その場で酸化して定量される収量の、完全に保護された二量体、化合 物１１ｖｉ−与えた。

トリクロロ酢１１に用いたジメトキシトリチル基の除去、そして濃厚水酸化アン モニウムを用いた残基の更なる処理により完全にブロック化した二量体、化合物 １２Ｑ得た。

図　　式　　２ ａ）１．５当量ホスホラミダイト９，５当量テトラゾール、ＭｅＣＮ、室温、１ ５分、ｂ）−ｉつ素３ｓ；水２＊：２，６−ルチジン２憾、ＴＨＦ９３慢：室温 １０分ｅ　　ｃ）ジクロロメタン中の２鳴トリクロロ酢酸、室温、１０分、　　 ｄ）濃縮ＮＨ４０）Ｌ　５０’　、　１５時間、　　ｅ）１．２５０当量ビス（ トリメチルシリル）−トリフルオロアセトアミド、ＭｅＣＮ、還流、１時間−１ 水中の５０−メタノール、室温、１時間。

新試薬全試験するために、位置３および６のシトシン塩基が翫６−シヒドロー５ −アザシトクン部分により置換された二個のデカ−ｒ　−ｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　 Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｍｏｄｅ１３８０人の自動操作ＤＮ五人合成器中合成し た。トリチル分析資料に基づき、１段階毎の収率はそれぞれ、９＆５慢および９ ａ４僑であり、非修飾デカマーについての９９．０９嘩と対比される。

ジヒドロトリアジン塩基の芳香族トリアジンへの最後の変換は、ビス（トリメチ ルシリ／Ｌ／）トリフルオロ−アセトアミド（ＢＳＴＥ人）および塩化トリメチ ルシリル全フリル化試薬として、そして退散化トリメチルシリルｔ−酸化試薬と して使用することにより満足になし遂げた。形質転換のために二量体化合物１２ ｔ−原型として使用しそして生じる二量体１ｓｔ定量される収量で生成した。

図面の簡単な説明 第１図は醸イオンＦＡＢ質量スペクトル計により得られ九二量体１２のフラグメ ント化パターンを相対強度灯ｍ／ｚでプロットして示す・ 第２図は５′−末端標識とポリアクリルアミドゲル電気泳動の後に得られ九合成 オリゴヌクレオチドのオートラジオグラフィーを示す。

レーン１　：　（ＣＡ）３．ヘキテマー標識体レーン２．　　（ＡＴ）４．オク タマー標識体レーンｓ、　　ＴＡＣＧＴＣＧＣＡＧ、親デカマーｖ　−ｙ　４　 、　ＴＡＸＧＴＣＧＣＡＧ、ｓ−修飾デカマーｖ　−ｙ　５　、　　ＴＡＣＧＴ ＸＧＣＡＧ、　　６−　修飾テカマーＸ−＼６−シヒドロー５−アザシチジン・ 発明の詳細な説明 詳細な反応図式は次の通りに示される。

図　　式　　５ ％式％ 本発明に従うホスホラミダイトの合成ハ２′−デオキクよりなし遂けた。化合物 ４とグリオキザールの反応により、無水ピリジン中塩化インブチリルによる環化 中間体の処理に続いて、ヘキサン中１５４酢酸エチル金用いたシリカゲルカラム クロマトグラフィーによる精製の後化合物６を与えた。化合物６全泡体として６ １鳴収率で単離した＠ 図式５に参照されるように、室温にてＴＨＦ中でフッ化テトラブチルアンモニウ ムを用いて糖テトラインプロピル・ノシロキサン保護基金除去することにより化 合物７を製造した。反応混合物を還元乾固し水と塩化メチレンに配分した後この 化合物を塩化メチレン中よシ簡単な抽出によりｍａして化合物７を泡体として５ ９憾収率で与えた。

ＤＮＡ合成に必要とされるところの、５′−ヒドロキシ基の選択的保護ヲ、乾燥 ピリジン中塩化４４′−ジメトキシトリチル全使用した標）的な手１祇によりな し遂げて、化合物８を５０−収＄で結晶性固体として得た。融点８９−９１℃。

図式ｂｎ、Ｊインプロピルアミンの存在下塩化メチレン中クロロ（ジイソプロピ ルアミノ）メトキシ　ホスフィンによる化合＠８のホスフィチル化により、ヘキ サン中の２５チ酢酸エチルを用いたシリカゲル　カラムクロマトグラフィーによ る精製の後に７１チ収率の化合物９ｔガラス状物質として与えたことを示すＯ 本発明のホスホラミダイト、化合物９ＨＤＮＡｉ合成するために特徴的な縮合灰 石に便用した。

図式７に示されるように、Ｐｆ　１ｅｉｄｅｒｅｒお工びＳｃｈｗａｒ！（Ｔｅ ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｉｔｅｒｓ、　２５：　５５１５．１９８４　）の手 順１ｃ従って、ホスホラミダイトｔ−アセトニトリル中縮合触媒としてテトラゾ ールの存在下でＳ′−〇−アセチルチミジン、化合物１０と混合した。薄層クロ １トグラフィーニラ５分後に反応完了を示し、七し℃二量体生Ｍ、物ｔ−ｅたち にその場でヨウ素、ルチジン、ＴＨＦおよび水の混合物により酸化して、定量さ れる収量の完全保護された二量体ホスフェート、化合物１１ｉ与えた。ジクロロ メタン中トリクロロ酢酸によるこの二量体溶液の処理によりジメトキシトリチル 基を除去し、セして、図式８に示されるように、濃厚水酸化アンモニウムにより ５５℃で１５時間の間残渣？処理すると、十分に脱ブロックされた目的二を体を 漫た。脱ブロツク化二量体の分析状料金、Ｊ、Ｔ。

Ｂａｋｅｒ　Ｃ−１８シリカゲル上、４０マイｙｏメーター、水中５曝メタノー ルの逆相クロマトグラフィーの役得、セして第１図に示すように、ＦＡＢ／Ｍ８ は予測の構造と一致していた。

最後に、ジヒドロ−５−アザシチジン含有の二量体、化合物１２を無水アセトニ トリル中で懸濁させそして、図式９に示すように、過剰量のビス（トリメデルシ リル）トリフルオロ　アセトアミド、塩化トリメチルシリルおよび過酸化トリメ チルシリルで還流下、−夜中処理したＯ質量スペクトル計においてｍ／ｚ５３１ にてＭ−Ｈピークが優勢であることより評価されるように、５−７ザクチジンへ の酸化が定量的に起きた。仕上けは大変簡単であり揮発性溶媒と試薬の蒸発、そ して残りの酸素と窒素全シリコン結合より脱ブロックする几めの水による残留物 の処理が含まれる。水溶液の凍結乾燥により所望の二重体、化合物１５を得た。

新試薬のＭ剛性全試験するために、第２図において、レーン４および５で示され る二つの二量体は、位置５２よび６でシトシン塩基が＼６−シヒドロー５−アザ シトシン部分により置換されている本のだが、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ　ｍｏｄｅｌ　５８０人自動操作ＤＮＡ合底器中で合成し友。トリチル分析 資料に基づいて、１段階毎の収率は夫々、９ａ５嘔および９＆４鴫であシ、非修 飾デカマーについての９９．０９唾と対比される（第２図、レーン３）。

本発明はある特定の実施態様に関して以上記載されているが、多くの変法が可能 であり、かつ別の材料および試薬を本発明から離れることなく使用することがで きると理解さｔ″Ｌ九い。ある場合において七のような変法および置換にいくつ かの実験全必要とさｎるが、それらは日常的な試験のみが含まｎるであろう。

特定の実施態様についての上述の記載は、本発明の一般的性實を十分く表わして いるので、現今の細織全適用することにより、誰もがかかる特定の実施態様を包 括的概念から離ルずに種々の用途のために容易に変更および／ま７ｔｄ適合させ ることができるであろう。そして従りて、かかる適合および変更は開示された実 施態様の均等物の定義および範囲の甲に包含されること全意味する。

ここにおける表現法および用語に記載の几めの本のであり制限されるものではな いと理解すべきである。

耶　鵞壓郷 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）修飾ＤＮＡの合成に使用するのに適する５，６−ジヒドロ−５−アザシチ ジンホスホラミダイト・（２）５−アザーシトシンデオキシリボースを、シロキ サンで保護すること、 保護された５−アザーシトシン−デオキシリボースを還元すること、 還元、保護された５−アザーシトシンデオキシリボースの環側鎖アミノ基とトリ アジン環を保護すること、 シロキサン基を除去しそして保護された５−アザーシトシン−デオキシリボース のヒドロキシル基を保護すること、 生じた化合物をホスフィチル化して５−アザシトシンホスホラミダイトを生成す ること、 よりなる５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンホスホラミダイトの製造方法。 （３）シロキサンが１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジ シロキサンである請求項２記載の方法。 （４）環側鎖アミノ基をイソブチリルアミドとして保護する請求項２記載の方法 。 （５）ビス（イソブチリルオキシ）エチレン基を導入することによりトリアジン 環を保護する請求項２記載の方法。 （６）３′−Ｏ−アセチルチミジンを５，６−ジヒドロ−５−アザシトシンホス ホラミダイトと反応させることよりなる二量体オリゴヌクレオチドの製造のため の縮合反応。 （７）５，６−ジヒドロ−５−アザシチジンホスホラミダイトを５，６−ジヒド ロ−５−アザシトシン残基および５−アザシトシン残基として使用することより なるＤＮＡフラグメントの合成方法。 （８）オリゴヌクレオチドにおいて５，６−ジヒドロ−５−アザシトシン残基を ５−アザシトシン残基に変換するための酸化方法。 （９）前記５，６−ジヒドロ−５−アザシトシン残基は、ビス（トリメチルシリ ル）トリフルオロアセトアミドおよび塩化トリメチルシリルよりなる群から選択 された少くとも一種のシリル化剤を使用してシリル化により生成し、そしてオリ ゴヌクレオチド中の前記５−アザシトシン残基を生成するように過酸化トリメチ ルシリルとの反応により酸化される請求項８記載の方法。